ES2898616T3 - Imágenes de alta resolución de volúmenes extendidos - Google Patents
Imágenes de alta resolución de volúmenes extendidos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2898616T3 ES2898616T3 ES13716348T ES13716348T ES2898616T3 ES 2898616 T3 ES2898616 T3 ES 2898616T3 ES 13716348 T ES13716348 T ES 13716348T ES 13716348 T ES13716348 T ES 13716348T ES 2898616 T3 ES2898616 T3 ES 2898616T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- light sheet
- diffractive
- light
- optical system
- invariant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 49
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 33
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 12
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 claims description 5
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000000554 iris Anatomy 0.000 description 3
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 2
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000143247 Idaea intermedia Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 238000003332 Raman imaging Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 238000012984 biological imaging Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 230000003534 oscillatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000010363 phase shift Effects 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 230000001179 pupillary effect Effects 0.000 description 1
- 238000001454 recorded image Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/06—Means for illuminating specimens
- G02B21/08—Condensers
- G02B21/10—Condensers affording dark-field illumination
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
- G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
- G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
- G02B27/09—Beam shaping, e.g. changing the cross-sectional area, not otherwise provided for
- G02B27/0927—Systems for changing the beam intensity distribution, e.g. Gaussian to top-hat
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
- G02B27/09—Beam shaping, e.g. changing the cross-sectional area, not otherwise provided for
- G02B27/0938—Using specific optical elements
- G02B27/0944—Diffractive optical elements, e.g. gratings, holograms
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
- G02B27/09—Beam shaping, e.g. changing the cross-sectional area, not otherwise provided for
- G02B27/0938—Using specific optical elements
- G02B27/0988—Diaphragms, spatial filters, masks for removing or filtering a part of the beam
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
- G02B27/58—Optics for apodization or superresolution; Optical synthetic aperture systems
-
- H—ELECTRICITY
- H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
- H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
- H04N7/00—Television systems
- H04N7/18—Closed-circuit television [CCTV] systems, i.e. systems in which the video signal is not broadcast
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Multimedia (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Signal Processing (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Microscoopes, Condenser (AREA)
- Nonlinear Science (AREA)
- Tents Or Canopies (AREA)
- Optical Elements Other Than Lenses (AREA)
Abstract
Un sistema óptico de lámina de luz que comprende un elemento de generación de lámina de luz (LSG) y un elemento de modulación (MK1), en donde el elemento de generación de lámina de luz (LSG) y el elemento de modulación (MK1) están configurados para crear una lámina de luz invariante no difractiva o cuasi no difractiva y/o de propagación con un perfil de intensidad asimétrica en una dirección que es transversal tanto a una dirección de propagación de la lámina de luz como a una dirección en la que se expande un haz para formar la lámina de luz, y en donde el elemento de modulación (MK1) está situado en una trayectoria de iluminación del sistema óptico de lámina de luz antes o después del elemento de generación de lámina de luz (LSG), o en donde el elemento de modulación (MK1) está integrado con el elemento de generación de lámina de luz (LSG).
Description
DESCRIPCIÓN
Imágenes de alta resolución de volúmenes extendidos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método y sistema para la formación de imágenes de alta resolución de volúmenes extendidos.
Antecedentes de la invención
Las aplicaciones de la formación de imágenes volumétrica pueden encontrarse en todos los sectores de la sociedad desde la salud, a la fabricación, investigación básica y defensa. Más a menudo que no, la tecnología actual limita el volumen de adquisición y la resolución que pueden capturarse en un período de tiempo determinado. Tomando el ejemplo de la microscopía óptica, el escaneo confocal era hasta hace poco el estándar de oro, sin embargo, su tiempo de adquisición está limitado por la velocidad de escaneo que a su vez está limitada por la potencia del láser y el umbral de daño de la muestra. Diversas formas de microscopía de lámina de luz tales como el seccionamiento óptico en plano ortogonal, la microscopía de iluminación de plano selectivo (SPIM), la ultramicroscopía o microscopía de lámina láser digital escaneada (DSLM), abordan esta cuestión. La señal de fondo no deseada y el daño fotográfico se evitan iluminando el volumen a fotografiar de una manera escalonada mientras se captura rápidamente la mayor cantidad de información posible de las partes iluminadas, por ejemplo, usando un conjunto de detectores colocado adecuadamente tal como una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD). Con sus diversas implementaciones, esta técnica permite un seccionamiento óptico en cuatro dimensiones rápido de alto contraste y ya ha revolucionado el estudio de los organismos vivos.
Un problema con la microscopía de lámina de luz convencional, basado en haces gaussianos, es que una alta resolución isotrópica exige una lámina de luz bien enfocada y, por lo tanto, una iluminación con una alta apertura numérica (NA). Sin embargo, esto restringe la distancia sobre la que puede mantenerse una lámina de luz estrechamente enfocada, limitando de este modo el campo de visión utilizable. La capacidad de formar imágenes de grandes volúmenes de manera eficiente con un solo escaneo de una lámina de luz gaussiana convencional es, por lo tanto, incompatible con la formación de imágenes de alta resolución.
La formación de imágenes de grandes volúmenes a máxima resolución es clave para muchas áreas de investigación tales como obtener la formación de imágenes para estudios biológicos, si se trata de arqueobacterias, procariotas o eucariotas y en el tejido subcelular y celular, y en todo el nivel del organismo. Los ejemplos incluyen embriología, mapeo de destino celular tanto en estudios de células madre como en biología del desarrollo, neurobiología, esferoides celulares. La formación de imágenes de alta resolución de grandes volúmenes también puede usarse en el área de la física coloidal y para la formación de imágenes de nanoestructuras tales como los metamateriales tridimensionales.
Se han propuesto varias soluciones. En general, estas están restringidas a la excitación de dos fotones o necesitan un mayor número de exposiciones de muestras con las consecuencias asociadas para la velocidad de formación de imágenes y el daño fotográfico que pueden dificultar los escaneos repetidos. Se han usado haces de Bessel para extender el volumen de la formación de imágenes en la microscopía de lámina de luz. El perfil de intensidad transversal de un haz de orden cero de Bessel tiene un punto central y una serie de anillos concéntricos alejados del centro del haz. Estos anillos deterioran significativamente la resolución axial.
La detección confocal del núcleo del haz de Bessel puede mejorar la resolución axial. Sin embargo, su ventaja sobre la microscopía confocal regular es pequeña, ya que se rechaza una fracción significativa de la luz por la detección confocal del haz de lámina de luz, y la velocidad de escaneo está limitada por la cámara debido a que las imágenes se adquieren línea por línea en lugar de plano por plano. Si bien el trabajo anterior ha demostrado que el volumen de escaneo puede extenderse usando haces de Bessel no difractantes de propagación-invariantes, para la excitación de fotón único, la compensación es una pérdida significativa en la relación señal/ruido y en la potencia de resolución que puede lograrse a niveles de irradiación compatibles con la formación de imágenes biológicas.
Florian O. Fahrbach et al., "Microscopy with self-reconstructing beams", Fotónica de la naturaleza, Vol. 4, N.° 11, 12 de septiembre de 2020, págs. 780-785, el documento XP055065900 describe un microscopio con haces autoreconstruibles y muestra que un haz de Bessel escaneado formado holográficamente, no solo reduce los defectos de dispersión, sino que también aumenta simultáneamente la calidad de la imagen y la profundidad de penetración en un medio denso.
Sumario de la invención
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema óptico de lámina de luz de acuerdo con la reivindicación 1.
El sistema óptico de lámina de luz proporciona unos medios para crear una lámina de luz con un perfil de intensidad
asimétrica en la dirección de escaneo, por ejemplo, la función de Airy al cuadrado. Una lámina de luz de este tipo puede ser no plana y puede usarse para manipulación óptica o para formación de imágenes de alta resolución de volúmenes extendidos. La lámina de luz asimétrica puede crearse a partir de un haz invariante de propagación no difractivo, definido en este caso como cualquier haz que mantenga aproximadamente el mismo perfil de intensidad en el plano transversal a su dirección de propagación. El perfil puede trasladarse o acelerarse transversalmente a la dirección de propagación. La naturaleza no difractiva de la lámina de luz puede usarse para extender el campo de visión y, por lo tanto, el volumen de formación de imágenes de la microscopía de lámina de luz.
El uso de una lámina de luz asimétrica permite una alta resolución en todo el volumen de formación de imágenes. Perfectamente los haces invariantes de propagación no difractivos existen solo en teoría. Sin embargo, existen aproximaciones cuasi no difractivas adecuadas de tales haces que aún permiten una extensión significativa del campo de visión. Por ejemplo, una haz de Airy asimétrico, generado fácilmente con una transformada de Fourier de una modulación de fase cúbica, es capaz de extender el campo de visión en un orden de magnitud, mientras se mantiene una alta resolución isotrópica.
Como alternativa, la lámina de luz invariante asimétrica y/o de propagación puede crearse a partir de cualquier lámina de luz simétrica modulando la trayectoria de iluminación después de la generación de la lámina de luz. La posición del elemento de modulación puede colocarse en cualquier lugar conveniente en la trayectoria de iluminación, incorporándose en cualquiera de sus componentes ópticos, el objetivo de iluminación, el elemento de generación de lámina de luz, o formar parte de la fuente láser. También puede crearse un perfil de intensidad asimétrica modulando en el tiempo la intensidad de una lámina de luz invariante simétrica y/o de propagación mientras se la escanea transversalmente a la dirección de propagación.
El sistema óptico de lámina de luz puede configurarse para su uso como un sistema de formación de imágenes de lámina de luz y/o un sistema de espectroscopia de lámina de luz, por ejemplo, un sistema de espectroscopía de Raman y/o un sistema de microscopía de lámina de luz y/o un sistema de lámina de luz para ejercer una fuerza óptica sobre una partícula, tal como cualquier partícula o célula inerte o biológica, por ejemplo, un sistema de captura óptica o un sistema de guiado óptico.
La expresión "lámina de luz" se usa en el presente documento en el sentido genérico de un patrón o conjunto de patrones de iluminación o irradiación. La expresión "microscopía de lámina de luz" o "formación de imágenes de lámina de luz" se usa independientemente de cómo se proyecta la "lámina de luz" en el volumen o de cómo se recopila la información de la o las partes irradiadas, incluso si esto no es necesariamente a escala microscópica.
Preferentemente, el haz asimétrico no difractivo de propagación-invariante, tiene propiedades de autocuración, es decir, el haz puede repararse a sí mismo después de pasar obstáculos (véase, por ejemplo, "Optically mediated particle clearing using Airy wavepackets" de Baumgartl et al Fotónica de la naturaleza, 2 de Noviembre de 2008). De manera ideal, el haz debería tener un número mínimo o nulo de ceros para las frecuencias espaciales bajas en su función de transferencia de modulación (MTF).
La lámina de luz tiene un perfil de intensidad transversal asimétrica tal como la función de Airy al cuadrado. El campo asimétrico no difractivo de propagación-invariante, puede tener una transformada de Fourier que incluye un término de fase que tiene un componente de segundo orden o superior, por ejemplo, un componente de tercer orden o superior, en su expansión polinomial de Taylor. El haz de Airy, por ejemplo, tiene un término de fase cúbica en su transformada de Fourier. Los perfiles de intensidad simétricos tendrían una función de transferencia óptica real que, bajo desenfoque, se volverán oscilatorios y pasarán por cero. Dichos ceros representan una pérdida irrecuperable de información de imagen y, por lo tanto, limitan el campo de visión de las láminas de luz simétricas. En cambio, cualquier perfil asimétrico produce una función de transferencia óptica de valor complejo, lo que hace que sea extremadamente improbable que tanto la parte real como la imaginaria sean simultáneamente cero, incluso si la función de transferencia se vuelve oscilante bajo el desenfoque.
Cuando se usa para la formación de imágenes, la lámina de luz asimétrica invariante no difractiva o cuasi no difractiva y/o de propagación puede aumentar el campo de visión sin ceros de MTF, preservando de este modo tanta información como sea posible. La secuencia de imágenes registradas no necesita ser nítida y puede parecer borrosa para el observador humano. Si contiene la información necesaria, las imágenes nítidas pueden reconstruirse por medios digitales, tal como una simple, unidimensional, deconvolución lineal, normalmente manejada en tiempo real. La libertad adicional dada este enfoque óptico-digital híbrido puede aprovecharse para diseñar la lámina de luz de tal manera que se maximice la calidad de la imagen final procesada. La etapa de deconvolución de imagen solo es necesaria cuando se adquieren imágenes para un observador humano. Aplicaciones de visión artificial, tales como la inspección automatizada de muestras, pueden omitir la etapa de deconvolución de imagen y obtener la información deseada directamente de los datos registrados.
De acuerdo con una realización, se proporciona un microscopio de lámina de luz para la formación de imágenes de un volumen que comprende medios para formar una lámina de luz usando un haz asimétrico no difractivo de propagación-invariante, tal como un haz de Airy. Aunque la microscopía de lámina de luz de excitación de fotones múltiples puede beneficiarse de los haces asimétricos, preferentemente se usa excitación de fotón único.
El uso de un haz de Airy para la formación de imágenes de láminas de luz proporciona una alta resolución para la excitación de un solo fotón y a lo largo de un gran campo de visión. Solo se requiere una sola exposición por sección de imagen; sin embargo, un conjunto de secciones de imágenes registradas vecinas contiene información sobre cada porción bidimensional del volumen de imagen reconstruida. Por lo tanto, la nitidez óptima solo se obtiene usando la deconvolución digital. La técnica permite, por ejemplo, especímenes en resolución subcelular a estudiar, al tiempo que proporciona una visión holística de las interacciones. El carácter lineal de esta técnica facilita su extensión más allá de la formación de imágenes de fluorescencia a otras modalidades de formación de imágenes tal como la dispersión y la espectroscopia tal como la formación de imágenes de Raman y la dispersión de Raman coherente anti-Stokes (CARS).
Un paquete de ondas de Airy se ha mostrado teóricamente por Berry, M. V. y Balazs, N. L. Paquetes de ondas que no se propagan. Am. J. Phys. 47, 264-267 (1979) para ser una solución "libre de difracción" de la ecuación de Schrodinger para una partícula libre. En ausencia de cualquier potencial externo, el paquete de ondas puede acelerar libremente transversal a su dirección de propagación. La analogía matemática entre la ecuación de Schrodinger y las ecuaciones de ondas paraxiales puede usarse para realizar haces de Airy de energía finita en el dominio óptico como se ha visto recientemente, véase Siviloglou, G. A., Broky, J., Dogariu, A. & Christodoulides, D.N. "Observation of Accelerating Airy Beams" Phys. Rev. Lett. 99, 213901 (2007). El haz tiene la forma de un máximo central y un número de lóbulos laterales que muestran el movimiento transversal.
Contra todo razonamiento, un haz de Airy tiene una aceleración transversal a su dirección de propagación asociada a su campo de luz [Berry, M.V. y Balazs, N.L. Paquetes de ondas que no se propagan Am. J. Phys., 47, 264-267 (1979)]. Las trayectorias de partículas pueden inducirse a seguir trayectorias parabólicas, que corresponden con esa aceleración transversal. Además del o los haces Airy, pueden usarse otros haces parabólicos o combinaciones apropiadas de haces/conjuntos de haces/haces escaneados. Se describen ejemplos de haces parabólicos en Davis, J.A. et al, Observation of accelerating parabolic beams. Opt. Express 16, 12866-12871 (2008).
La lámina de luz asimétrica invariante no difractiva o cuasi no difractiva y/o de propagación puede formarse usando cualquier forma de refracción estática o dinámica, el elemento óptico reflectante o difractivo o el haz puede emitirse directamente desde un láser especializado. La modulación dinámica con, por ejemplo, un modulador de luz espacial ofrece la ventaja adicional de que la lámina de luz puede corregirse para detectar aberraciones inducidas por el sistema o la muestra; sin embargo, la modulación estática puede lograrse a bajo coste en la forma de un elemento óptico transmisivo o reflectante con la modulación de índice de refracción/superficie apropiada o red de difracción. El elemento de modulación puede realizar múltiples funciones, por ejemplo, puede estar integrado en el elemento de generación de lámina de luz, el láser, una lente, o cualquier otro componente que se irradie.
Pueden proporcionarse medios para mover o colocar la lámina de luz asimétrica para capturar imágenes en diferentes posiciones a lo largo de un volumen de muestra, y para garantizar que el plano focal del objetivo de detección esté bien localizado con respecto a la lámina de luz de haz asimétrico.
La lámina de luz puede consistir en múltiples superficies de luz, formadas por la estructura transversal de la lámina de luz, desde la que puede recopilarse información en paralelo usando un conjunto de detectores. Pueden formarse múltiples superficies por los lóbulos laterales de una lámina de luz asimétrica como la creada a partir de la lámina de luz de Airy.
Para ayudar en la alineación, puede colocarse un segundo objetivo y un detector en la trayectoria de la lámina de luz en el eje de iluminación.
Aunque la lámina de luz de elección puede ser curva, esto no es un requisito para extender el campo de visión del sistema de formación de imágenes. Sin embargo, la curva puede usarse para aplicar fuerzas de "flexión" ópticas a objetos microscópicos.
Breve descripción de los dibujos
Un sistema óptico de lámina de luz se describirá a continuación a modo de ejemplo únicamente y haciendo referencia a los dibujos adjuntos, de los que:
la figura 1 muestra un esquema simple de un microscopio de lámina de luz de haz de Airy;
la figura 2 ejemplifica una geometría alternativa del microscopio de lámina de luz de haz de Airy con varios elementos opcionales;
las figuras 3 muestran la función de transferencia de modulación para diferentes tipos de láminas de luz;
las figuras 4 muestran las mismas cuatro láminas de luz diferentes junto con imágenes simuladas y experimentales obtenidas con los tipos de láminas de luz respectivos. Las imágenes muestran proyecciones de máxima intensidad en el eje y tanto para los datos en bruto registrados como para los volúmenes de datos deconvolucionados; la figura 5 muestra las mitocondrias fluorescentes de un grupo de células renales embrionarias humanas fotografiadas con diversas láminas de luz, y
la figura 6 muestra diversos tipos alternativos de láminas de luz asimétricas que pueden usarse para extender el volumen de formación de imágenes de un microscopio de láminas de luz.
Descripción detallada de los dibujos
La figura 1 es un esquema simple de los principios de operación de un microscopio de lámina de luz. Esto muestra la dirección de propagación de iluminación (x), la dirección en la que se expande el haz para formar la lámina de luz (y) y el eje de detección (z). Un detector colocado a lo largo del eje z registra una secuencia de imágenes de "planos" iluminados mientras la lámina de luz se desplaza con respecto a la muestra.
El haz de salida de un láser pasa a través de las lentes L1 y L2 y se convierte en una lámina de luz con un elemento de generación de lámina de luz (LSG), que puede ser una lente cilíndrica o un dispositivo de escaneo tal como un deflector acústico-óptico (AOD). Las lentes L1 y L2 ajustan el haz para el diámetro LSG. A continuación, el haz pasa a través de las lentes L3 y L4 y se conforma en un volumen de formación de imágenes que extiende una lámina de luz con la ayuda de una máscara, MK1. Esto puede ser un modulador de luz espacial (SLM) estático o dinámico que puede ser extraíble o conmutable. Esta modulación puede introducirse en cualquier punto de la trayectoria de iluminación, antes, después, o integrarse con otros elementos ópticos tales como el elemento de generación de lámina de luz. En esta configuración específica, las lentes L3 y L4 ajustan el haz al tamaño de la máscara MK1. Las lentes L5 y L6 ajustan la salida del haz de la máscara MK1 a un objetivo OBJ1.
La luz transmitida a través del modulador de luz espacial MK1 ilumina la muestra y se enfoca por la lente objetivo OBJ1 en una región de muestra específica. Se captura una pila de imágenes de la muestra usando el mismo o una segundo lente objetivo OBJ2 y una cámara (CAM1). De manera opcional, pueden usarse una tercera lente objetivo OBJ3 y una segunda cámara (CAM2), para la calibración del sistema. Pueden usarse unas lentes de tubo (TL1 y TL2) para enfocar la luz procedente de los objetivos (OBJ2 y OBJ3) en el área activa de las cámaras (CAM1 y CAM2), respectivamente. La máscara, MK1, crea un haz tal como el haz de Airy, que es cuasi no difractivo, es decir, propagación invariante y autocuración. Esto permite una extensión del volumen de formación de imágenes a lo largo del eje x en al menos un orden de magnitud con respecto al que puede lograrse con la lámina de luz gaussiana convencional.
Una máscara opcional MK2 , puede insertarse en o cerca de la apertura trasera de la segunda lente objetivo OBJ2 para aumentar la profundidad de campo de la trayectoria de detección, facilitando de este modo la alineación y que puede conducir a una reducción de los costes de fabricación. Los elementos ópticos adicionales también podrían introducir intencionalmente la curvatura de plano focal para mejorar la coincidencia del foco de detección con la lámina de luz.
La figura 2 muestra un esquema de una geometría alternativa que permite la formación de imágenes de muestras sumergidas en agua en una superficie horizontal tal como un portaobjetos o plato de microscopio convencional. Esto se permite colocando los objetivos de iluminación y detección a 45 grados con respecto a la platina de muestra horizontal, como se muestra en la figura 2. Trasladando la muestra diagonalmente como indica la flecha "dir. escaneo", puede registrarse una imagen volumétrica tridimensional como se ha descrito anteriormente en la figura 1.
Más específicamente, la figura 2 muestra un láser que emite un haz de luz que se expande mediante las lentes L1 y L2 para que coincida con la máscara MK1 (la máscara MK2 no se usa en este ejemplo). Como antes, la máscara puede ser un modulador de luz espacial (SLM) estático o dinámico que puede ser extraíble o conmutable. Habiendo pasado por la máscara MK1, el haz pasa a continuación a través de una lente L3, donde se enfoca sobre un iris I1 y a través de otra lente L4 , donde se conforma al diámetro de un elemento de generación de lámina de luz (LSG). El lSg puede ser una lente cilíndrica o un dispositivo de escaneo tal como un deflector acústico-óptico (AOD). La lámina de luz que se forma por el LSG se pasa a continuación a través de una lente L5 , donde se enfoca sobre un iris I2 y a través de otra lente La, que colima la lámina de luz sobre una placa de cuarto de onda, que proporciona un control de polarización. Desde allí, la lámina de luz se refleja en un primer espejo M1 sobre un segundo espejo M2 y de ahí a un objetivo de iluminación OBJ1, que se coloca a 45 grados con respecto a la platina de muestra horizontal. La luz que ha atravesado una muestra en el platina atraviesa a través de un objetivo de detección OBJ2 sobre un tercer espejo M3 y de ahí a un cuarto espejo M4 , donde se dirige a una cámara CAM1.
Los espejos M1 a M4 pueden usarse para facilitar la alineación vertical de los objetivos con la muestra. En un ejemplo, los espejos M2 y M3 pueden fijarse con respecto al eje de los objetivos OBJ1 y OBJ2 , respectivamente. La alineación adecuada de los espejos M1 y M4 permite una traslación vertical de ambos objetivos OBJ1 y OBJ2 y espejos M2 y M3 con respecto a la platina de muestra sin alterar la alineación. Las platinas de traslación axial de los objetivos pueden facilitar el ajuste fino de la alineación.
La trayectoria de iluminación de la figura 2 es una variación de la mostrada en la figura 1. Se incluyen diversos elementos opcionales para controlar la polarización y para filtrar la luz. El orden diferente de MK1 y LSG en las figuras 1 y 2 demuestra que puede reorganizarse el orden de muchos elementos ópticos. Los iris opcionales, I1 y I2 , en la figura 2, seleccionan los primeros órdenes de difracción para permitir más flexibilidad y evitan la iluminación no deseada de la muestra. Como en la figura 1, las lentes L1 a La forman telescopios para transmitir la luz entre los diversos componentes. Un elemento de control de polarización opcional, A/4, puede introducirse para controlar la polarización de la luz, por ejemplo, convirtiendo luz polarizada lineal en luz circularmente polarizada que produce una
excitación de fluorescencia más uniforme. Pueden introducirse unos filtros de luz, F, por ejemplo, para bloquear la luz de excitación y seleccionar la emisión de fluorescencia entre OBJ2 y la cámara, CAM1. Si es necesario o conveniente, los elementos de la trayectoria de iluminación y la trayectoria de detección pueden acercarse más que los espejos a OBJ1 y OBJ2 , respectivamente.
La figura 3: para evaluar el rendimiento de diversos tipos de haz para microscopía de lámina de luz, se ha realizado un estudio de la función de transferencia de modulación (MTF). El contraste relativo de franja como una función de la frecuencia espacial, dado por la MTF, proporciona conocimiento sobre la relación entre el contraste y la resolución para diversos tipos de iluminación. La MTF se calcula como el valor absoluto de la función de transferencia óptica, definida en el presente documento como la transformada de Fourier de una sección del eje z de la intensidad de la lámina de luz normalizada. La figura 3 muestra la MTF para diversos tipos de lámina de luz, (a) en la posición focal de iluminación, y (b) en un plano desenfocado (x = 25 |jm). La frecuencia espacial (uz), se normaliza a la frecuencia espacial transmitida más alta: 2NAM, dónde A y NA son, respectivamente, la longitud de onda de iluminación y la apertura numérica. Se comparan dos aproximaciones del haz de Bessel: "Bessel 10 %" y "Bessel 5 %", que se generan usando aperturas anulares con una fracción relativa abierta del radio del 10 % y el 5 %, respectivamente.
La figura 3(a) muestra que la MTF de un gaussiano con aperturas proporciona el mayor contraste en la cintura de la lámina de luz (línea punteada con trazos negros). Sin embargo, como puede verse en la figura 3(b), el contraste cae significativamente e incluso tiene muchos valores de cero lejos de la cintura de la lámina de luz. Por lo tanto, la lámina de luz gaussiana de apertura tradicional solo es valiosa cerca de la cintura de lámina de luz. Los haces de Bessel y Airy muestran mucha menos variación dentro y fuera de foco y, por lo tanto, no están restringidos para la formación de imágenes cerca de la cintura de lámina de luz, produciendo la mejora de campo de visión asociada. Sin embargo, la MTF de los haces de Bessel (línea azul sólida y roja punteada) es significativamente más baja que la asociada al haz de Airy (línea verde continua). Además, el haz de Bessel con la fracción abierta más pequeña del 5 % muestra una reducción proporcional en el contraste, en última instancia, limitar la resolución que puede lograrse en la práctica; además, puede demostrarse que el contraste converge a cero para el haz de Bessel teórico. Esto es desafortunado, debido a que los haces de Bessel generados con los anillos más estrechos producen el campo de visión más grande. En general, solo puede obtenerse un gran campo de visión con la lámina de luz de haz de Bessel compensando la resolución. El haz de Airy está libre de una compensación tan restrictiva. Debido a la asimetría del haz de Airy, su función de transferencia no es estrictamente real y tiene un argumento complejo dependiente de la frecuencia espacial. El carácter complejo de la función de transferencia hace que sea muy poco probable que los cambios inducidos por el desenfoque provoquen que sus partes real e imaginaria se vuelvan cero simultáneamente. Por consecuencia, para los haces asimétricos, los valores de MTF bajos solo se producen para un gran desenfoque y en altas frecuencias espaciales. A diferencia de la reducción significativa de contraste asociada al haz de Bessel, un cambio de fase no afecta a la relación señal/ruido y, por lo tanto, puede explicarse fácilmente mediante una simple deconvolución lineal.
Un haz de Airy mantiene su perfil de intensidad transversal durante la propagación, hasta cierto punto, incluso en presencia de obstáculos tales como los dispersores ("autocuración o autoreparación"). Como tiene lóbulos laterales y sigue una trayectoria parabólica, es posible que el haz de Airy no parezca atractivo para la formación de imágenes de láminas de luz. Sin embargo, en la práctica, se ha descubierto que usando un haz de Airy no difractivo de propagacióninvariante, extiende el campo de visión efectivo para la formación de imágenes de láminas de luz al menos en un orden de magnitud más allá de lo que puede lograrse usando el haz de Gauss con apertura convencional.
La conversión de un microscopio de lámina de luz convencional en un microscopio de lámina de luz de Airy podría hacerse simplemente incorporando una modulación de fase cúbica, por ejemplo, usando una pieza de material transparente con un espesor óptico que varía espacialmente, en la trayectoria de iluminación de un microscopio de lámina de luz convencional. Matemáticamente, la modulación de fase cúbica puede escribirse como a(uy3 +uz3), dónde a es un parámetro que permite ajustar la invariancia de propagación de la lámina de luz para que coincida con el campo de visión necesario, mientras que Uy y Uz son coordenadas cartesianas normalizadas alineadas con el eje y y el eje z respectivamente. Sería posible hacer la lámina de luz de haz de Airy plana orientando la máscara de tal manera que la curva de haz de Airy permanezca en el plano de la lámina de luz. Ya que la función de dispersión de puntos se forma promediando en el tiempo la intensidad del haz en la dirección y, la MTF de lámina de luz es una sección a través del origen de la MTF bidimensional del haz de Airy. Puede calcularse que una rotación de máscara de 45 grados para mantener la trayectoria de propagación dentro del plano de lámina de luz reduciría el contraste a prácticamente cero a una frecuencia espacial baja. Esto no debería ser del todo sorprendente ya que, aunque se usa un haz asimétrico para crear la lámina de luz, la lámina de luz en sí sería simétrica debido al promedio de tiempo a lo largo del eje y.
Se han realizado diversos experimentos para probar la eficiencia de un haz de Airy para la microscopía de lámina de luz (o cualquiera de sus diversas implementaciones) en comparación con otros tipos de haz. En estos experimentos, se expandió un haz láser convencional (Coherent Verdi V6, 6W 532 nm) para llenar la apertura de un deflector acústico-óptico (AOD, Neos AOBD 45035-3) y se creó la lámina de luz escaneando el enfoque láser a lo largo del eje y con un período de 2 s, considerablemente más corto que el tiempo de adquisición más corto (840 s). A continuación, la apertura de AOD se volvió a fotografiar con un telescopio de aumento para sobrellenar el área activa de un modulador de luz espacial (SLM, Hamamatsu LCOS X10468-04). El uso de un SLM permitió un cambio dinámico rápido entre los diversos tipos de láminas de luz bajo investigación y permitió que se registraran cubos de datos para
los distintos tipos de haces en paralelo, minimizando la influencia del blanqueamiento fotográfico y el movimiento de la muestra. Esto permitió la eliminación de aberraciones residuales en el sistema, garantizando que los haces se asemejen mucho a las descripciones teóricas.
El área activa del SLM se fotografió sobre la apertura posterior del objetivo de iluminación (Mitutoyo 20x/0,42, distancia de trabajo 20 mm), usando un telescopio de aumento (0,5x) con una apertura de hendidura en su enfoque para seleccionar el primer orden de difracción. El haz se enfocó dentro de la muestra, contenido en un capilar de vidrio de borosilicato de perfil cuadrado (Vitrocell 8250-100, 1 mm de lado, espesor de pared 200 pm). El capilar se llenó con perlas de poliestireno fluorescente (Duke R900) inmovilizadas en PDMS y se montó en una platina piezo-xyz (Mad City Labs, Nano-LP200) para permitir la colocación automática de la muestra con respecto a la lámina de luz y el plano focal del objetivo de detección.
La fluorescencia se detectó usando una cámara CCD (Basler piA640-210gm) a través de un objetivo montado ortogonalmente (Newport 20x/0.40) con una lente de tubo apropiada y un filtro de fluorescencia. Obsérvese que un objetivo colocado ortogonalmente es típico, sin embargo, otras configuraciones pueden ser más convenientes tal como la iluminación inclinada a través de la lente de detección o una lente secundaria o guía de ondas colocada de otro modo. Las láminas de luz se escanearon a través de la muestra en etapas de 100 nm usando una combinación de traslación de platina piezoeléctrica y deflexión holográfica con el SLM.
El posprocesamiento digital a menudo se ve obstaculizado por un conocimiento limitado de la función de dispersión de puntos, que puede dar lugar a un cambio de imagen y a defectos de timbre, por ejemplo, cuando la distancia al plano focal del haz de Airy es incierta. Sin embargo, esto no es un problema en la microscopía de lámina de luz, debido a que la detección lateral significa que existe una relación directa entre la distancia de propagación de la lámina de luz y la posición en el conjunto de detectores. Por lo tanto, la deconvolución lineal puede corregir con precisión tanto la amplitud como la fase de la función de transferencia óptica, anular efectivamente la curvatura de la lámina de luz del haz de Airy, así como cualquier defecto de fase residual que se origine en la apertura finita usada para crear el haz de Airy. Es más, el conocimiento preciso de la función de dispersión de puntos significa que la lámina de luz no tiene que ser invariante de propagación, es suficiente que la MTF no tenga ceros para las frecuencias espaciales y el campo de visión requeridos. Por consecuencia, puede usarse una gran familia de haces asimétricos para extender el campo de visión de un microscopio de lámina de luz. En la figura 6 se representan diversos ejemplos.
La figura 4 muestra datos experimentales y simulados para la iluminación de láminas de luz con diversos tipos de haz. Los haces se muestran en la fila superior. Las proyecciones de intensidad máxima a lo largo del eje y se muestran para (de izquierda a derecha) el gaussiano abierto, dos láminas de luz de haz de Bessel, respectivamente con una anchura de apertura anular del 10 % y 5 % del radio de apertura, y la lámina de luz de haz de Airy. La fila 2 muestra la simulación del rendimiento del microscopio de lámina de luz con los mismos parámetros que se usaron en los experimentos. La fila 3 muestra la deconvolución de los datos simulados. La fila 4 muestra los datos experimentales de una muestra de PDMS que contiene microesferas fluorescentes. La fila 5 muestra la deconvolución de los datos experimentales. Todas las imágenes tienen la misma escala y sistema de coordenadas en el que el plano focal está en x = 0. Para mayor claridad, la codificación de falso color se usa para las imágenes experimentales y los perfiles de láminas de luz (escala invertida).
La figura 4 muestra la alta resolución y el gran campo de visión que puede obtenerse usando la lámina de luz de haz de Airy con respecto a la iluminación de haz convencional y de Bessel a lo largo del eje x, para la lámina de luz gaussiana convencional. Para la microscopía de lámina de luz convencional, las perlas fluorescentes no pueden resolverse más allá de los 10 pm desde la cintura de lámina de luz. Más lejos del plano focal, los nulos en la MTF (véase la figura 3b) conducen a una pérdida de contraste irrevocable y los consiguientes defectos de deconvolución. Las láminas de luz de haz de Bessel extienden de manera efectiva el campo de visión a 20 pm o 40 pm, aproximadamente inversamente dependiente de la anchura anular si se usa la apertura para crear el haz. La abrupta pérdida de resolución fuera de esta región puede entenderse considerando los perfiles de intensidad de haz representados en la fila superior de la figura 4. Aproximadamente a 20 pm y 40 pm puede verse cómo la intensidad en el eje disminuye rápidamente. En este punto, debido a la diferencia en la longitud de trayectoria óptica entre el borde interior y exterior de la apertura anular, la interferencia destructiva conduce a una degradación del haz. Una reducción de la anchura anular conduce a un campo de visión aumentado. Sin embargo, también puede observarse que esto tiene un efecto adverso en la resolución. Esto puede verse de manera más cuantitativamente comparando las curvas MTF del haz de Bessel mostradas en la figura 3.
En contraste con los haces de Bessel, la misma muestra fotografiada con la lámina de luz de Airy tiene un campo de visión que cubre la región completa de interés, manteniendo al mismo tiempo una alta resolución axial en todo el campo de visión. Además, el seguimiento 4D de un solo fluoróforo es posible con menor potencia pico ya que, debido a los lóbulos laterales de la lámina de luz de Airy, la señal útil puede recopilarse en diversos fotogramas. La saturación de fluorescencia, el blanqueamiento y el daño fotográfico son por lo tanto menos probables en comparación con la formación de imágenes de láminas de luz de haz de Bessel o convencionales. Por lo tanto, el uso de una lámina de luz de Airy puede prolongar sí la vida útil de los fluoróforos.
La aplicabilidad de la técnica se ha demostrado además en muestras biológicas mediante la formación de imágenes
de células renales embrionarias humanas suspendidas en gel de agarosa. Para permitir una comparación de resolución, las células se transfectaron para expresar la proteína fluorescente DsRed en las mitocondrias. La corrección del frente de onda in situ se logró usando microesferas fluorescentes premezcladas en el gel de agarosa como sondas fluorescentes cerca de las células de interés. La figura 5 muestra un grupo de células dispersas sobre un volumen inaccesible por la microscopía de lámina de luz convencional. Ambas vistas de los ejes x e y se muestran para todos los haces. Si bien puede verse que ambas láminas de luz de haz de Bessel resuelven más células que la lámina de luz gaussiana con aperturas, solo la microscopía de lámina de luz de haz de Airy puede resolver todas las células y hacerlo con alta resolución.
La figura 6 muestra ejemplos de láminas de luz asimétricas diferentes que pueden usarse para la formación de imágenes de láminas de luz de volumen extendido. Columna izquierda: ecuación de la modulación de fase, especificado en radianes, en función de la coordenada pupilar normalizada, u. Tanto los haces parabólicos como los hacer de Airy tienen un perfil de fase cúbica como se ha descrito en la ecuación de la primera fila. Las filas segunda y tercera muestran una fracción y un exponente de quinto orden, respectivamente. Las filas cuarta y quinta muestran una función goniométrica y exponencial con un número infinito de componentes en su expansión de Taylor. Como ejemplo final, la sexta fila muestra una modulación de fase polinomial de segundo orden combinada con una modulación de amplitud gaussiana.
La columna 2 de la figura 6 muestra la fase (línea azul gruesa sólida, [unidades de longitud de onda]) y la amplitud de transmisión (línea negra discontinua, unidades arbitrarias). La amplitud de los haces no se modula excepto en el último tipo que, para el fin de la demostración, se modula con una apodización gaussiana. La columna 3 de la figura 6 muestra el perfil de intensidad del haz (y por lo tanto la lámina de luz) debido a la modulación correspondiente. La columna 4 muestra la MTF en la cintura para la lámina de luz respectiva (línea azul sólida y gruesa), y la MTF de la lámina de luz gaussiana de apertura tradicional para su comparación (línea roja discontinua). La columna 5 muestra la MTF desenfocada correspondiente a un desenfoque que introduce una diferencia de trayectoria óptica de dos longitudes de onda (W20= 2A). A diferencia de la MTF gaussiana de apertura tradicional, no se ven nulos en la MTF de las láminas de luz moduladas, y el contraste es considerablemente mayor en el plano desenfocado para la mayoría de las frecuencias espaciales. Incluso si esta lista no es exhaustiva, está claro que la lámina de luz usada para extender el volumen de formación de imágenes de alta resolución no necesita estar restringida a la lámina de luz de haz de Airy. Las aplicaciones o implementaciones específicas pueden beneficiarse de una lámina de luz asimétrica alternativa.
Un experto en la materia apreciará que son posibles variaciones de las disposiciones descritas sin alejarse del alcance de la invención. Aunque un sistema óptico de lámina de luz se describe específicamente haciendo referencia a la microscopía de iluminación plana selectiva, el sistema óptico de lámina de luz podría aplicarse igualmente a cualquier disposición que use una lámina de luz, por ejemplo, para formación de imágenes, espectroscopia, tal como la espectroscopia de fluorescencia o de Raman, o la excitación o ejercer fuerzas ópticas, tales como atrapar o guiar. Igualmente, podrían usarse tipos de radiación distintos a la radiación óptica descrita en el presente documento, por ejemplo, onda milimétrica, terahercios, rayos X, radar o acústica. Por consiguiente, la descripción anterior de la realización específica se realiza a modo de ejemplo únicamente y no con fines de limitación. Para un experto en la materia será evidente que pueden hacerse modificaciones menores sin cambios significativos en la operación descrita.
Claims (13)
1. Un sistema óptico de lámina de luz que comprende un elemento de generación de lámina de luz (LSG) y un elemento de modulación (MK1), en donde el elemento de generación de lámina de luz (LSG) y el elemento de modulación (MK1) están configurados para crear una lámina de luz invariante no difractiva o cuasi no difractiva y/o de propagación con un perfil de intensidad asimétrica en una dirección que es transversal tanto a una dirección de propagación de la lámina de luz como a una dirección en la que se expande un haz para formar la lámina de luz, y en donde el elemento de modulación (MK1) está situado en una trayectoria de iluminación del sistema óptico de lámina de luz antes o después del elemento de generación de lámina de luz (LSG), o en donde el elemento de modulación (MK1) está integrado con el elemento de generación de lámina de luz (LSG).
2. Un sistema óptico de lámina de luz de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el elemento de modulación (MK1) está configurado para crear un haz invariante no difractivo o cuasi no difractivo y/o de propagación que tiene un perfil de haz de intensidad asimétrica transversal a una dirección de propagación del haz, y en donde el elemento de generación de lámina de luz (LSG) está configurado para formar la lámina de luz invariante no difractiva o cuasi no difractiva y/o de propagación usando el haz invariante no difractivo o cuasi no difractivo y/o de propagación.
3. Un sistema óptico de lámina de luz de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el haz asimétrico invariante no difractivo o cuasi no difractivo y/o de propagación tiene una transformada de Fourier que incluye un término de fase que tiene un polinomio de segundo o mayor orden, por ejemplo, un exponente fraccionario de 2,5 o un exponente cúbico.
4. Un sistema óptico de lámina de luz de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el haz asimétrico invariante no difractivo o cuasi no difractivo y/o de propagación tiene una transformada de Fourier que contiene un componente de tercer o mayor orden, por ejemplo, un componente de fase cúbica, en la expansión de Taylor de la modulación de fase.
5. Un sistema óptico de lámina de luz de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde el haz asimétrico invariante no difractivo o cuasi no difractivo y/o de propagación comprende un haz de Airy.
6. Un sistema óptico de lámina de luz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde el haz invariante no difractivo o cuasi no difractivo y/o de propagación no da como resultado ceros en la función de transferencia de modulación del sistema.
7. Un sistema óptico de lámina de luz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el elemento de modulación (MK1) comprende un modulador de luz espacial u otro elemento óptico difractivo estático o dinámico para formar el haz asimétrico invariante no difractivo o cuasi no difractivo y/o de propagación.
8. Un sistema óptico de lámina de luz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, que comprende medios para mover o colocar el haz asimétrico invariante no difractivo o cuasi no difractivo y/o de propagación para capturar imágenes en diferentes posiciones a lo largo de un volumen de muestra.
9. Un sistema óptico de lámina de luz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, que comprende una modulación de fase en la trayectoria de detección para detectar luz de múltiples superficies de luz formadas por el haz asimétrico invariante no difractivo o cuasi no difractivo y/o de propagación, y medios de formación de imágenes para formar una imagen de volumen usando la luz detectada.
10. Un sistema óptico de lámina de luz de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el elemento de generación de lámina de luz (LSG) está configurado para formar una lámina de luz simétrica y el elemento de modulación (MK1) está configurado para convertir la lámina de luz simétrica en la lámina de luz invariante no difractiva o cuasi no difractiva y/o de propagación con el perfil de intensidad asimétrica.
11. Un sistema óptico de lámina de luz de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el elemento de modulación (MK1) comprende un elemento de modulación de fase que está en la trayectoria de iluminación en la que se propaga la lámina de luz simétrica, por ejemplo, en donde el elemento de modulación de fase está configurado para proporcionar una modulación de fase cúbica.
12. Un sistema óptico de lámina de luz de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde el elemento de modulación (Mk1) comprende una máscara en la trayectoria de iluminación sobre la que se propaga la lámina de luz simétrica.
13. Un sistema óptico de lámina de luz de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sistema es uno o más de un sistema de formación de imágenes de lámina de luz; un sistema de espectroscopia, por ejemplo, un sistema de espectroscopía de Raman; un sistema de microscopía; un sistema para ejercer una fuerza óptica sobre una partícula, tal como cualquier partícula inerte o biológica, tal como una célula, por ejemplo, un sistema de captura óptica o un sistema de guiado óptico.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB1205974.7A GB201205974D0 (en) | 2012-04-03 | 2012-04-03 | High resolution imaging of extended volumes |
| GBGB1215169.2A GB201215169D0 (en) | 2012-08-24 | 2012-08-24 | High resolution imaging of extended volumes |
| PCT/GB2013/050788 WO2013150273A1 (en) | 2012-04-03 | 2013-03-26 | High resolution imaging of extended volumes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2898616T3 true ES2898616T3 (es) | 2022-03-08 |
Family
ID=48095913
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES13716348T Active ES2898616T3 (es) | 2012-04-03 | 2013-03-26 | Imágenes de alta resolución de volúmenes extendidos |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10444520B2 (es) |
| EP (1) | EP2834695B1 (es) |
| JP (1) | JP6166776B2 (es) |
| CN (1) | CN104204898B (es) |
| CA (1) | CA2869359C (es) |
| ES (1) | ES2898616T3 (es) |
| IN (1) | IN2014DN09127A (es) |
| WO (1) | WO2013150273A1 (es) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7838302B2 (en) | 2006-08-07 | 2010-11-23 | President And Fellows Of Harvard College | Sub-diffraction limit image resolution and other imaging techniques |
| US8564792B2 (en) | 2007-12-21 | 2013-10-22 | President And Fellows Of Harvard College | Sub-diffraction limit image resolution in three dimensions |
| US9404869B2 (en) | 2012-10-09 | 2016-08-02 | Howard Hughes Medical Institute | Multiview light-sheet microscopy |
| DE102013208926A1 (de) * | 2013-05-14 | 2014-11-20 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Verfahren zur 3D-hochauflösenden Lokalisierungsmikroskopie |
| US10539772B2 (en) | 2013-10-09 | 2020-01-21 | Howard Hughes Medical Institute | Multiview light-sheet microscopy |
| DE102013112595A1 (de) * | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Anordnung zur Lichtblattmikroskopie |
| DE102013021222B4 (de) * | 2013-12-17 | 2023-05-04 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Mikroskop und Mikroskopieverfahren |
| US20170038574A1 (en) * | 2014-02-03 | 2017-02-09 | President And Fellows Of Harvard College | Three-dimensional super-resolution fluorescence imaging using airy beams and other techniques |
| DE102014102215A1 (de) * | 2014-02-20 | 2015-08-20 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Verfahren und Anordnung zur Lichtblattmikroskopie |
| GB201413500D0 (en) | 2014-07-30 | 2014-09-10 | Univ St Andrews | Airy beam light sheet |
| DE102014113827A1 (de) * | 2014-09-24 | 2016-03-24 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Vorrichtung zur Abbildung einer Probe |
| CN104459971B (zh) * | 2014-12-24 | 2016-01-13 | 中国科学院半导体研究所 | 一种基于集成光子芯片的结构光照明显微成像系统 |
| GB201508376D0 (en) | 2015-05-15 | 2015-07-01 | Univ St Andrews | Light sheet imaging |
| CN107003509B (zh) * | 2015-05-22 | 2021-08-06 | 香港科技大学 | 产生用于多色荧光显微镜的无衍射光片的方法和系统 |
| DE102015209758A1 (de) * | 2015-05-28 | 2016-12-01 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Anordnung und Verfahren zur Strahlformung und zur Lichtblattmikroskopie |
| EP3341710B1 (en) * | 2015-08-26 | 2022-02-16 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health & Human Services | Systems and methods for multi-view nonlinear optical imaging for improved signal-to-noise ratio and resolution in point scanning multi-photon microscopy |
| DE102016203671A1 (de) * | 2016-03-07 | 2017-09-07 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Verfahren zum Bestimmen einer Höheninformationen einer Probe und Scanningmikroskop |
| DE102016108384B3 (de) * | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur lichtblattartigen Beleuchtung einer Probe |
| CN105866013A (zh) * | 2016-05-26 | 2016-08-17 | 天津大学 | 基于两幅激光干涉成像离焦干涉图的球形粒子判别方法 |
| EP3475753A4 (en) * | 2016-06-24 | 2020-04-15 | Howard Hughes Medical Institute | AUTOMATIC ADJUSTMENT OF LIGHT BODY GEOMETRY IN A MICROSCOPE |
| CN106053346B (zh) * | 2016-06-29 | 2018-06-08 | 华中科技大学 | 一种光片显微成像转换装置 |
| CN106153307B (zh) * | 2016-06-30 | 2018-09-28 | 河南科技大学 | 一种利用光强比测量Airy光束衰减因子的装置和方法 |
| EP3497502B1 (de) * | 2016-08-15 | 2022-10-26 | Leica Microsystems CMS GmbH | Lichtblattmikroskop |
| CN111142251B (zh) | 2016-10-26 | 2022-03-25 | 合肥百会拓知科技有限公司 | 一种具有三维成像能力的显微镜和成像方法 |
| EP3538941A4 (en) | 2016-11-10 | 2020-06-17 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | METHODS FOR FAST IMAGING OF HIGH RESOLUTION LARGE SAMPLES |
| US20180139366A1 (en) * | 2016-11-11 | 2018-05-17 | Cold Spring Harbor Laboratory | System and method for light sheet microscope and clearing for tracing |
| RU2019138507A (ru) * | 2017-05-02 | 2021-06-02 | Мерк Шарп И Доум Корп. | Составы антител против lag3 и совместные составы антител против lag3 и антител против pd-1 |
| CN107238590A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-10-10 | 清华大学 | 基于光片显微与单像素成像的显微层析成像装置 |
| CN107144951B (zh) * | 2017-06-30 | 2023-03-21 | 中国计量大学 | 一种基于半球微结构的超分辨显微装置 |
| CN108303402A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-07-20 | 华中科技大学 | 一种大视场无衍射贝塞尔光片显微扫描成像方法及系统 |
| WO2019135069A1 (en) * | 2018-01-02 | 2019-07-11 | King's College London | Method and system for localisation microscopy |
| CN108398774B (zh) * | 2018-01-18 | 2021-03-02 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种光片显微镜 |
| CN108469429B (zh) | 2018-02-06 | 2020-11-24 | 西安电子科技大学 | 一种双模态拉曼-光学投影断层成像系统 |
| WO2019153530A1 (zh) * | 2018-02-06 | 2019-08-15 | 西安电子科技大学 | 一种双模态拉曼-光学投影断层成像系统 |
| US10247910B1 (en) | 2018-03-14 | 2019-04-02 | Nanotronics Imaging, Inc. | Systems, devices and methods for automatic microscopic focus |
| US10146041B1 (en) | 2018-05-01 | 2018-12-04 | Nanotronics Imaging, Inc. | Systems, devices and methods for automatic microscope focus |
| CN108732124B (zh) * | 2018-05-21 | 2023-05-26 | 深圳市重投华讯太赫兹科技有限公司 | 一种三维层析成像系统及方法 |
| CN108956562B (zh) * | 2018-06-11 | 2020-05-22 | 浙江大学 | 一种基于重定位的光切片荧光显微成像方法和装置 |
| CN108645831B (zh) * | 2018-06-14 | 2020-11-20 | 厦门大学 | 多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪及其检测方法 |
| DE102018115001A1 (de) * | 2018-06-21 | 2019-12-24 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Verfahren zum Kalibrieren einer Phasenmaske und Mikroskop |
| EP3620841A1 (en) * | 2018-09-07 | 2020-03-11 | ETH Zurich | Automated system for wide-field multiphoton microscope |
| CN109297949B (zh) * | 2018-09-19 | 2024-04-05 | 上海镭立激光科技有限公司 | 显微影像结合透射拉曼光谱的肿瘤细胞检测方法及装置 |
| CN109656028A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-04-19 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种产生无衍射光的系统及方法 |
| US11187659B2 (en) * | 2019-03-28 | 2021-11-30 | The Regents Of The University Of California | Systems for fluorescence light sheet microscopy of large samples in high refractive index solutions |
| US20220196557A1 (en) * | 2019-04-05 | 2022-06-23 | Cytoveris Inc. | Angular depth resolved raman spectroscopy apparatus and method |
| CN110441983B (zh) * | 2019-07-24 | 2022-09-09 | 成都仲伯科技有限公司 | 基于光学传递函数的x光高分辨率成像方法 |
| WO2021178950A1 (en) * | 2020-03-06 | 2021-09-10 | Georgia Tech Research Corporation | Tomographic imaging systems and methods |
| CN112821946A (zh) * | 2021-01-06 | 2021-05-18 | 广东工业大学 | 一种基于自加速光束的短距自由空间光互连系统 |
| CN113075174B (zh) * | 2021-03-12 | 2022-07-05 | 华中科技大学 | 一种斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统 |
| SE546014C2 (en) * | 2022-09-30 | 2024-04-16 | Spec Imaging Ab | An assembly for measurements of one or more optical parameters of a medium and a method of using the assembly |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1667494A (zh) * | 2004-03-08 | 2005-09-14 | 明基电通股份有限公司 | 图像显示装置 |
| WO2006058187A2 (en) * | 2004-11-23 | 2006-06-01 | Robert Eric Betzig | Optical lattice microscopy |
| DE102007063274B8 (de) * | 2007-12-20 | 2022-12-15 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Mikroskop |
| WO2012003259A1 (en) * | 2010-06-30 | 2012-01-05 | The Government Of The U.S.A., Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | System and method of producing nondiffracting light sheets by a multiplicity of spatially overlapping, minimally interfering nondiffracting optical beams |
-
2013
- 2013-03-26 WO PCT/GB2013/050788 patent/WO2013150273A1/en active Application Filing
- 2013-03-26 CN CN201380018625.4A patent/CN104204898B/zh active Active
- 2013-03-26 US US14/384,800 patent/US10444520B2/en active Active
- 2013-03-26 IN IN9127DEN2014 patent/IN2014DN09127A/en unknown
- 2013-03-26 ES ES13716348T patent/ES2898616T3/es active Active
- 2013-03-26 EP EP13716348.1A patent/EP2834695B1/en active Active
- 2013-03-26 CA CA2869359A patent/CA2869359C/en active Active
- 2013-03-26 JP JP2015503931A patent/JP6166776B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2015514235A (ja) | 2015-05-18 |
| WO2013150273A1 (en) | 2013-10-10 |
| CN104204898A (zh) | 2014-12-10 |
| EP2834695A1 (en) | 2015-02-11 |
| IN2014DN09127A (es) | 2015-05-22 |
| CA2869359A1 (en) | 2013-10-10 |
| US10444520B2 (en) | 2019-10-15 |
| JP6166776B2 (ja) | 2017-07-19 |
| CN104204898B (zh) | 2017-12-15 |
| EP2834695B1 (en) | 2021-08-25 |
| US20150029325A1 (en) | 2015-01-29 |
| CA2869359C (en) | 2021-03-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2898616T3 (es) | Imágenes de alta resolución de volúmenes extendidos | |
| US9500846B2 (en) | Rapid adaptive optical microscopy over large multicellular volumes | |
| ES2900148T3 (es) | Dispositivo de obtención de imágenes basado en láminas de luz con profundidad de campo aumentada | |
| Gao et al. | 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy | |
| JP6086366B2 (ja) | 顕微鏡、焦準器具、流体保持器具、及び光学ユニット | |
| JP6996048B2 (ja) | 広視野高分解能顕微鏡 | |
| US20200150446A1 (en) | Method and System for Improving Lateral Resolution in Optical Scanning Microscopy | |
| US20150323787A1 (en) | System, method and computer-accessible medium for depth of field imaging for three-dimensional sensing utilizing a spatial light modulator microscope arrangement | |
| Jiang et al. | Resolution-enhanced parallel coded ptychography for high-throughput optical imaging | |
| CN110082900A (zh) | 可变照明傅立叶重叠关联成像设备、系统以及方法 | |
| WO2012027542A2 (en) | Simultaneous orthogonal light sheet microscopy and computed optical tomography | |
| Dean et al. | Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy | |
| JP6512667B2 (ja) | 側方照明顕微鏡システム及び顕微方法 | |
| WO2016020684A1 (en) | Multiplexed optical tomography | |
| US20160041099A1 (en) | Light sheet fluorescence and differential interference contrast microscope | |
| CN112005100A (zh) | 用于荧光显微镜的光盘显微术 | |
| WO2013176549A1 (en) | Optical apparatus for multiple points of view three-dimensional microscopy and method | |
| Friedrich et al. | Axial resolution beyond the diffraction limit of a sheet illumination microscope with stimulated emission depletion | |
| JP2004317741A (ja) | 顕微鏡およびその光学調整方法 | |
| JP6300739B2 (ja) | 画像取得装置および画像取得方法 | |
| Kozawa et al. | Light needle microscopy with spatially transposed detection for axially resolved volumetric imaging | |
| Wang et al. | Adaptive optics in super-resolution microscopy | |
| Lin | Super-Resolution Structured Illumination Microscopy with Adaptive Optics | |
| Castello et al. | Image scanning microscopy with single-photon detector array | |
| Wilding et al. | Two-Photon light-sheet microscope with adaptive optics in the illumination and detection path |