JP6703215B1 - 光学測定装置及び光学測定方法 - Google Patents

Abstract

光学測定装置は、励起光が照射された免疫クロマト試験片から生じる蛍光、及び、励起光に起因する光であって励起光と等しい位相を持つ散乱光を含む検出光を検出する光検出素子と、検出光に応じた検出信号を処理するキャンセル回路と、を備え、キャンセル回路は、蛍光と散乱光における位相の違いに基づき、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去する。

Description

本発明の一態様は、試料の光学特性を測定するための光学測定装置及び光学測定方法に関する。

特許文献１には、基板上に置かれた蛍光サンプルに対して励起光を照射し、蛍光を測定した際に含まれる蛍光ノイズ成分（基板からの蛍光成分）を除去すべく、減衰信号を生成して差し引く技術が開示されている。具体的には、特許文献１では、基板の蛍光と等しい位相の減衰信号を生成し、測定した蛍光信号から該減衰信号を差し引くことにより、蛍光ノイズ成分を除去している。

特表２０１０−５１８３９４号公報

上述したように、特許文献１では、励起光を試料に照射することにより生じる蛍光から、試料の測定対象部以外から生じる蛍光ノイズ成分が除去されている。ここで、試料に光を照射し、試料からの光を検出した際に含まれるノイズ成分には、試料（照射されたもの）から生じる光（例えば蛍光）に起因するものだけでなく、照射光（例えば励起光）自体に起因する光（例えば散乱光）がノイズ成分となることも考えられる。特許文献１の技術では、照射光自体がノイズ成分となった場合を考慮しておらず、当該ノイズ成分を除去することができない。

本発明の一態様は上記実情に鑑みてなされたものであり、照射光自体に起因するノイズ成分を除去可能な光学測定装置及び光学測定方法を提供することを目的とする。

本発明の一態様に係る光学測定装置は、第１光が照射された試料から生じる第２光、及び、第１光に起因する光であって第１光と等しい位相を持つ第３光を含む検出光を検出する光検出部と、検出光に応じた検出信号を処理する信号処理部と、を備え、信号処理部は、第２光と第３光における位相の違いに基づき、検出信号から第３光に応じた信号成分を除去する。

本発明の一態様に係る光学測定装置では、第１光が照射された試料から生じる第２光と、第１光に起因する、第１光と等しい位相を持つ第３光との位相の違いに基づいて、検出信号から、第３光に応じた信号成分が除去される。つまり、検出光に含まれる光成分のうち、ノイズ成分に相当する第３光は、第１光に起因する光であって第１光と等しい位相を持つことに着目し、検出信号に対して第１光と等しい位相を持つ信号成分を除去することで、第１光自体に起因するノイズ成分である第３光に応じた信号成分を除去することができる。具体的には、検出光には、試料から生じる光（第２光）だけでなく、照射光（第１光）に起因する光（第３光）がノイズ成分として含まれることがあるところ、第２光が第３光に対して僅かに遅れて検出される（第２光が第３光に対して位相差を有している）ため、当該位相の違いを利用することによって、検出信号から第３光に応じた信号成分だけを適切に除去することができる。以上のように、本発明の一態様に係る光学測定装置によれば、照射光（第１光）自体に起因するノイズ成分を適切に除去することができる。

上述した信号処理部は、検出信号について、第３光の位相に応じた所定の時間単位で分離し、分離した検出信号の各成分をそれぞれ増幅し、増幅した各成分を合成することにより、検出信号から第３光に応じた信号成分を除去してもよい。このように、第３光の位相を考慮して、第３光に応じた信号成分のみが除去されるように検出信号の分離（所定の時間単位での分離）、分離した各成分の増幅、増幅した各成分の合成を行うことによって、第３光に応じた信号成分を適切に除去することができる。そして、第２光は第３光に対して位相の違いを有しているため、第３光に応じた信号成分のみが除去されるような信号処理を行っても、第２光に応じた信号成分は除去されず、検出信号から第２光に応じた信号成分のみを適切に取り出すことができる。

上述した第１光は、試料を励起する励起光であり、第２光は、励起光に応じて試料が放出する蛍光であり、第３光は、励起光又は励起光の散乱光の少なくとも一方を含んでいてもよい。これにより、蛍光及び励起光又は励起光の散乱光の少なくとも一方に応じた信号成分を含む検出信号から、励起光又は励起光の散乱光の少なくとも一方に応じた信号成分を適切に除去し、蛍光に応じた信号成分のみを適切に取り出すことができる。

光検出部は、第２光を含まず第３光を含むキャリブレーション処理用光を検出し、信号処理部は、キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づき、検出信号から第３光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を実施し、該キャリブレーション処理の実施結果を考慮して、検出信号から第３光に応じた信号成分を除去してもよい。検出信号から第３光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を、第３光を含むキャリブレーション処理用光に基づき予め行うことによって、検出信号から第３光に応じた信号成分を適切に除去することができる。

上述した光学測定装置は、第１光を出力する光源の変調周波数を設定する光源駆動回路を更に備え、信号処理部は、キャリブレーション処理において、光源駆動回路によって設定される光源の変調周波数に合わせた信号処理部の動作周波数で周期を刻む周期信号に対して位相をずらしたロックイン用のスイッチ信号を生成し、キャリブレーション信号及びスイッチ信号を入力として、第３光に応じた信号成分を出力し、該第３光に応じた信号成分の電圧値が０に近似する所定範囲内となるように、スイッチ信号の位相を調整し、検出信号、及び、キャリブレーション処理において位相が調整されたスイッチ信号を入力として、検出信号から第３光に応じた信号成分を除去してもよい。このように、ロックイン回路を用いて、キャリブレーション処理において第３光に応じた信号成分の電圧値が０に近似する値となるようにスイッチ信号の位相が調整されることにより、位相調整後のスイッチ信号を入力として、検出信号から第３光に応じた信号成分を適切に除去することができる。

信号処理部は、キャリブレーション処理において、第３光に応じた信号成分の電圧値が所定範囲内ではなく該所定範囲の値よりも大きい場合には、スイッチ信号の位相を遅らせるように調整し、第３光に応じた信号成分の電圧値が所定範囲内ではなく該所定範囲の値よりも小さい場合には、スイッチ信号の位相を進めるように調整してもよい。これにより、キャリブレーション処理において第３光に応じた信号成分の電圧値を、適切に０に近い値に調整することができる。

光源駆動回路は、光源の変調周波数を、第２光の強度がピーク値から１／ｅに落ちるまでの時間である蛍光寿命に対応する値よりも低くしてもよい。変調周波数が蛍光寿命に対応する値程度に高くされた場合には、連続する信号が互いに重なってしまう場合があり蛍光強度を最大化することができない。この点、変調周波数が蛍光寿命に対応する値よりも低くされることにより、蛍光強度を適切に高めることができる。

光源駆動回路は、光源の変調周波数を、蛍光寿命に対応する値よりも低く、且つ、商用周波数よりも高くしてもよい。これにより、変調周波数が蛍光寿命に対応する値よりも高くなり蛍光強度が弱まることを回避しながら、ノイズの増加を回避することができる。

信号処理部は、ロックイン用のスイッチ信号として、第１信号と、該第１信号に対して位相が９０度ずれた第２信号と、第１信号を反転させた第３信号と、第２信号を反転させた第４信号とを、それぞれ独立した専用の回路を用いて生成してもよい。独立した専用の回路で反転信号が生成されることにより、例えばnot回路により反転信号を生成する場合に問題となる微小な遅延（not回路の通過に伴う微小な遅延）が発生することを防止できる。

信号処理部は、２種類の動作周波数が所定の割合で切り替えて設定されてもよい。これにより、動作周波数が１種類とされる場合よりも、信号処理部の動作周波数を光源の変調周波数に合わせやすくなり、これらの同期精度を向上させることができる。

本発明の一態様に係る光学測定方法は、試料に第１光を照射することと、第１光が照射された試料から生じる第２光、及び、第１光に起因する光であって第１光と等しい位相を持つ第３光を含む検出光を検出することと、第２光と第３光における位相の違いに基づき、検出光に応じた検出信号から第３光に応じた信号成分を除去することと、を含む。本発明の一態様に係る光学測定方法によれば、照射光（第１光）自体に起因するノイズ成分を適切に除去することができる。

上記光学測定方法において、第２光を含まず第３光を含むキャリブレーション処理用光を検出し、キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づき、検出信号から第３光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を実施し、該キャリブレーション処理の実施結果を考慮して、検出信号から第３光に応じた信号成分を除去してもよい。

キャリブレーション処理において、光源の変調周波数に合わせて周期を刻む周期信号に対して位相をずらしたロックイン用のスイッチ信号を生成し、キャリブレーション信号及びスイッチ信号を入力として、第３光に応じた信号成分を出力し、該第３光に応じた信号成分の電圧値が０に近似する所定範囲内となるように、スイッチ信号の位相を調整し、検出信号、及び、キャリブレーション処理において位相が調整されたスイッチ信号を入力として、検出信号から第３光に応じた信号成分を除去してもよい。

キャリブレーション処理において、第３光に応じた信号成分の電圧値が所定範囲内ではなく該所定範囲の値よりも大きい場合には、スイッチ信号の位相を遅らせるように調整し、第３光に応じた信号成分の電圧値が所定範囲内ではなく該所定範囲の値よりも小さい場合には、スイッチ信号の位相を進めるように調整してもよい。

試料は、検体が滴下される滴下部と、蛍光試薬で標識された検出抗体を保持する保持部と、捕捉抗体を固定した測定部とが上流から下流に向けて配置されており、キャリブレーション処理用光は、試料における、捕捉抗体よりも下流側のエリアに第１光が照射されることにより検出されてもよい。蛍光成分は捕捉抗体よりも上流側に滞留しやすいところ、補足抗体の下流側のエリアに第１光が照射されてキャリブレーション処理用光が検出されることにより、適切に、蛍光成分の影響を低減したキャリブレーション処理用光を検出することができる。

本発明の一態様によれば、照射光自体に起因するノイズ成分を除去することができる。

本発明の実施形態に係る光学測定装置の概略構成図である。 蛍光と散乱光との位相差を説明する図である。 散乱光のキャンセル手法について説明する図である。 蛍光測定手法について説明する図である。 光学測定装置による蛍光測定処理を示すフローチャートである。 変形例に係る光学測定装置の概略構成図である。 ノイズ成分の除去について説明する図である。 試料を模式的に示す図である。 Ｓ／Ｎの定義について説明する図である。 キャリブレーション処理で用いる信号について説明する図である。 キャリブレーション処理を説明する図である。 変調周波数毎の蛍光成分の割合を示す表である。 試料の各領域における蛍光強度の詳細を説明する図である。 信号のドリフト対策の効果を説明する図である。 キャリブレーション処理を示すフローチャートである。 キャリブレーション処理の効果を説明する図である。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。なお、各図においては同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明を省略する。

図１は、本実施形態に係る光学測定装置１の概略構成図である。光学測定装置１は、試料に照射された光に応じて試料から生じる光を検出する装置である。本実施形態では、光学測定装置１は、試料に照射された励起光に応じて試料から生じる蛍光を検出する蛍光測定装置であるとして説明する。励起光とは試料を励起する光であり、蛍光とは励起光に応じて試料が放出する光であり、励起光と波長が異なる光である。また、本実施形態では、光学測定装置１は、イムノクロマト法を用いた測定に係る蛍光を検出する装置であるとして説明する。イムノクロマト法とは、抗原抗体反応を利用した免疫測定法であり、例えば、インフルエンザウイルスの検出等に用いられる。

図１に示されるように、イムノクロマト法を用いた測定では、試料として免疫クロマト試験片１００が用意される。免疫クロマト試験片１００は、試薬ホルダ１０１内に、測定対象物となるイムノクロマトメンブレンを収容している。免疫クロマト試験片１００のイムノクロマトメンブレンの特定の位置（測定対象部）には、所定の抗原に対する捕捉抗体（例えばインフルエンザウイルス抗原に対する抗体）が固定されている。試薬ホルダ１０１には、イムノクロマトメンブレンに検体を滴下するための開口部である検体点着ウィンドウ、及び捕捉抗体が固定された測定対象部を測定するための開口部である測定ウィンドウが設けられている。試薬ホルダ１０１の検体点着ウィンドウに検体が滴下されると、検体中の抗原が、まず蛍光試薬で標識された検出抗体と結合し、次いで捕捉抗体との間で抗原抗体反応を起こしてトラップされる。光学測定装置１は、免疫クロマト試験片１００の測定ウィンドウから露出したイムノクロマトメンブレンに対して励起光を照射し、測定対象部における抗原‐抗体複合物（詳細には、抗体の蛍光試薬）から蛍光を検出することにより、蛍光強度を測定する。なお、蛍光試薬としては、例えばユウロピウム、Ｑ−ｄｏｔ（登録商標）、有機色素等を用いることができる。

ここで、光学測定装置１において後述する検出光学系２０に入射し、検出される検出光には、蛍光だけでなく、励起光自体に起因する光が含まれることが考えられる。このような光は、例えば、励起光の散乱光が挙げられる。このような散乱光は、例えば、励起光が免疫クロマト試験片１００に照射され、散乱することで発生する励起光の一部であり、励起光と等しい位相を持つ（位相差のない）光である。免疫クロマト試験片１００のイムノクロマトメンブレンや試薬ホルダ１０１は一般的に白色であるため、上述した散乱光が生じやすくなっている。また、測定する試料や検出光学系の配置によっては、励起光そのものが検出される場合もある。以下では、光学測定装置１において検出される検出光には、蛍光及び散乱光が含まれるとして説明する。

図１に示されるように、光学測定装置１は、照射光学系１０（光源部）と、検出光学系２０（光検出部）と、光源駆動回路３０と、ＩＶ変換アンプ４０と、波形生成回路５０と、キャンセル回路６０（信号処理部）と、タイミング生成器７０と、ＡＤ変換器８０と、ＣＰＵ９０と、を備える。

照射光学系１０は、免疫クロマト試験片１００に向けて励起光を照射する。照射光学系１０は、光源１１と、アパーチャー１２と、励起光フィルタ１３と、コリメートレンズ１４と、を有している。光源１１は、免疫クロマト試験片１００（試料）に励起光（第１光）を照射する。光源１１は、例えば半導体発光素子である。本実施形態では、光源１１は発光ダイオード（ＬＥＤ）であるとして説明するがこれに限定されず、例えば光量を確保すべくＬＤが用いられてもよい。アパーチャー１２は、光源１１から出射された光を、所望の光束断面を有する光に整形するための光束整形部材である。励起光フィルタ１３は、アパーチャー１２を介して到達した励起光について、励起に必要な波長をフィルタリングする波長選択フィルタである。励起光フィルタ１３は、例えば誘電体多層膜フィルタや色ガラスフィルタ等の光学フィルタであり、より詳細には特定の波長帯（蛍光試薬の励起波長）のみを透過させる誘電体多層膜フィルタからなるバンドパスフィルタである。コリメートレンズ１４は、励起光フィルタ１３によるフィルタリング後の励起光を、免疫クロマト試験片１００（詳細にはイムノクロマトメンブレンの測定対象部）上に結像させるレンズである。

検出光学系２０は、免疫クロマト試験片１００からの蛍光を検出する。しかしながら、現実的には、検出光学系２０には、免疫クロマト試験片１００からの蛍光（イムノクロマトメンブレンの測定対象部からの蛍光）に加え、上述した励起光自体に起因する散乱光も含んだ光である検出光が入射され、当該検出光を検出することになる。検出光学系２０は、光検出素子２１と、蛍光フィルタ２２と、集光レンズ２３とを有している。検出光は、集光レンズ２３によって集光され、蛍光フィルタ２２を介して光検出素子２１へと入射する。蛍光フィルタ２２は、免疫クロマト試験片１００からの検出光について、蛍光以外の光が光検出素子２１に到達することを抑制するために設けられる波長選択フィルタである。蛍光フィルタ２２は、例えば誘電体多層膜フィルタや色ガラスフィルタ等の光学フィルタであり、より詳細には特定の波長帯のみを透過させる誘電体多層膜フィルタと色ガラスフィルタを組み合わせたバンドパスフィルタである。しかしながら、例えば励起光波長及び蛍光波長が近い場合等においては、蛍光フィルタ２２によって蛍光波長を持つ蛍光を適切に透過させながら励起光波長を持つ散乱光のみを効率よく遮断することは困難である。また、一般的に、効率の良い波長選択フィルタとして汎用される誘電体多層膜フィルタは光の入射角度によって特性が変化してしまう。そのため本実施形態においては、蛍光フィルタ２２を、誘電体多層膜フィルタと色ガラスフィルタとの組み合わせによって構成することで、斜め方向からの散乱光を色ガラスフィルタによって効果的に遮断している。しかしながら、やはり波長選択のみでは十分な効果が得難く、様々な条件を持った散乱光の進入を効率よく防ぐことは困難である。以下では、蛍光フィルタ２２を設けることによっても、光検出素子２１に到達する検出光には散乱光が含まれてしまっているとして説明する。

光検出素子２１は、蛍光フィルタ２２によるフィルタリング後の検出光を検出する光センサである。光検出素子２１は、例えば半導体受光素子である。本実施形態では、光検出素子２１はフォトダイオード（ＰＤ）であるとして説明するがこれに限定されず、後述する光源１１からの励起光の変調周波数に対応して高速応答できるものであれば、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）又は光電子増倍管（ＰＭＴ）等であってもよい。光検出素子２１は、詳細には、励起光が照射された免疫クロマト試験片１００（詳細にはイムノクロマトメンブレンの測定対象部における抗原‐抗体複合物の蛍光試薬）から生じる蛍光（第２光）、及び、励起光に起因する光であって励起光と位相差がない上述した散乱光（第３光）が含まれる検出光を検出する。光検出素子２１は、検出光に応じた検出信号をＩＶ変換アンプ４０に出力する。

光源駆動回路３０は、ＬＥＤである光源１１に駆動電流を出力することにより光源１１を駆動させる回路である。光源駆動回路３０は、タイミング生成器７０から、基準となるサイン波状の周波数信号の入力を受ける。光源駆動回路３０は、入力された基準となる周波数信号に基づいて駆動電流の周波数を変調する。すなわち、光源駆動回路３０は、励起光を出力する光源１１の変調周波数を設定する。これに応じて、光源１１から出力される励起光の周波数が変調し、光源１１からの光量（励起光量）がサイン波状に変化する。なお、変調周波数は、用いられる蛍光試薬の蛍光寿命に基づいて決定されてもよい。例えば、蛍光試薬として蛍光寿命が数ミリ秒であるユウロピウムが用いられる場合には変調周波数が１ｋＨｚ程度とされ、蛍光寿命が数１０ナノ秒であるＱ−ｄｏｔが用いられる場合には変調周波数が１ＭＨｚ程度とされ、蛍光寿命が数ナノ〜数十ナノ秒である有機色素が用いられる場合には変調周波数が１０ＭＨｚ程度とされてもよい。

一般的に、蛍光寿命は、蛍光強度がピーク値から１／ｅ（約３７％）に落ちるまでの時間とされる。この蛍光寿命の定義から逆算すると、例えば蛍光寿命が数ミリ秒であるユウロピウムを用いる場合の最適な変調周波数は１ｋＨｚ、蛍光寿命が数ナノ〜数十ナノ秒である有機色素を用いる場合の最適な変調周波数は１００ＭＨｚ〜１ＧＨｚ程度が好ましいと考えられる。しかし、ユウロピウム試薬を用いて実際に変調周波数に対する蛍光由来の信号出力を測定したところ、蛍光寿命から定まる周波数よりも低周波で変調したほうが、蛍光強度が高くなり、励起光に対する蛍光信号の割合も大きくなることが判明した（図１２参照）。図１２に示されるように、蛍光寿命から定まる周波数である１ｋＨｚよりも低周波側において、蛍光強度が高くなっている。具体的には、蛍光寿命を１／ｅではなく、「蛍光強度のピーク値が１％に落ちるまでの時間」と定義し、その時間から変調周波数を求めることによって、蛍光強度を高くすることができた。この場合、ユウロピウムであれば蛍光寿命が約１０ｍｓとなり、ここから定まる光源１１の変調周波数は約１００Ｈｚとなる。

上述したように、光源駆動回路３０は、光源１１の変調周波数を、蛍光強度を考慮して決定してもよい。具体的には、光源駆動回路３０は、光源１１の変調周波数を、蛍光強度がピーク値から１／ｅに落ちるまでの時間である蛍光寿命に対応する値（詳細には、１／蛍光寿命）よりも低くする。光源駆動回路３０は、光源１１の変調周波数を、蛍光寿命に対応する値よりも低く、且つ、商用周波数（５０Ｈｚ，６０Ｈｚ）よりも高く設定し、例えば、１００Ｈｚ付近であって商用周波数の倍波を避けることによりノイズの影響を低減した１１０Ｈｚ程度に設定する。光源駆動回路３０は、光源１１の変調周波数を、１００Ｈｚ付近の他の値、例えば９０Ｈｚ、８０Ｈｚ，７０Ｈｚ，または１３０Ｈｚ等に設定してもよい。

ＩＶ変換アンプ４０は、光検出素子２１から出力された電流信号（検出信号）を電圧信号に変換する。ＩＶ変換アンプ４０は、電圧信号に変換した検出信号を波形生成回路５０に出力する。

波形生成回路５０は、ＩＶ変換アンプ４０から出力された検出信号に基づいて、検出信号の波形を生成する回路である。波形生成回路５０は、タイミング生成器７０から、基準となる周波数信号の入力を受ける。タイミング生成器７０は、光源駆動回路３０及び波形生成回路５０に対して同じタイミングで基準となる周波数信号を入力する。波形生成回路５０は、生成した波形（検出信号）の情報をキャンセル回路６０に出力する。

キャンセル回路６０は、波形生成回路５０によって生成された波形（検出信号）を処理する信号処理部である。キャンセル回路６０は、蛍光と散乱光における位相の違い（位相差）に基づき、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去する。なお、キャンセル回路６０は、光源駆動回路３０及び波形生成回路５０と同じタイミングで、タイミング生成器７０から基準の周波数信号の入力を受けることにより、励起光（すなわち散乱光）の位相の情報を取得する。これにより、キャンセル回路６０において、蛍光と散乱光における位相差に基づく、散乱光の信号成分の除去が可能になっている。キャンセル回路６０の処理の詳細について、図２〜図４を参照して説明する。

図２は、蛍光と散乱光との位相差を説明する概念図である。図２に示されるように、光源部Ｌからサイン波状の励起光が照射された試料Ｓからのサイン波状の検出光（光検出部Ｄにおいて検出される検出光）には、サイン波状の散乱光及び蛍光が含まれている。なお、光源部Ｌからの励起光は、サイン波状に限らず、矩形波等の周期的変調波形でもよく、その場合、検出光（散乱光及び蛍光）も励起光と同様の周期的変調波形を有する。そして、散乱光は励起光と位相差がない光であるのに対して、蛍光は、励起光に応じて試料Ｓから生じる光であり、散乱光に対して数１０ミリ秒からナノ秒程度、位相が遅れて検出されることとなる。本発明者らは、このような位相差に着目し、検出光から散乱光のみを除去し蛍光のみを取り出す手法を見出した。なお、図２においては、光源部Ｌの光軸上に試料Ｓ及び光検出部Ｄが配置されているため、励起光の光軸と交わる方向に放出された蛍光を検出する図１と異なり、励起光の光軸と同軸方向に放出された蛍光を検出している。このような場合、検出光に含まれるのは蛍光及び散乱光に加え、励起光そのものが含まれる可能性もある。また、光検出部Ｄに入射する、励起光に起因する光の光量も大きくなる可能性が高い。そのため、本手法による蛍光の取出しが有効になる。

図３は、散乱光の除去（キャンセル）手法について説明する図である。図３は、検出光のうち散乱光の波形のみを示している。なお、この波形は励起光の波形と等しい。図３において横軸は時間、縦軸は振幅を示している。図３に示される、散乱光の位相に応じた波形について、例えば１周期の１／４の時間単位で分離（時間領域を分離）し、各時間領域１〜４についてそれぞれ積分すると、各時間領域１〜４における散乱光の出力を得ることができる。ここで、各時間領域１〜４の積分値それぞれに、ある乗数を掛けて全て足し合わせると、出力の合計を０とすることができる。すなわち、各時間領域１〜４の出力の絶対値は同じであり、時間領域１及び２の振幅の範囲は正、時間領域３及び４の振幅の範囲は負であるところ、図３に示されるように、時間領域１について乗数「−１」が掛けられて増幅されると時間領域１の出力は「正×負」で負の値となり、時間領域２について乗数「＋１」が掛けられて増幅されると時間領域２の出力は「正×正」で正の値となり、時間領域３について乗数「＋１」が掛けられて増幅されると時間領域３の出力は「負×正」で負の値となり、時間領域４について乗数「−１」が掛けられて増幅されると時間領域４の出力は「負×負」で正の値となる。このため、所定の乗数が掛けて増幅された各時間領域１〜４の積分値を全て足し合わされると、各値が相殺されて、出力の合計が０となる。このように、散乱光に応じた信号成分については、散乱光の位相に応じた所定の時間単位で分離し、分離した各成分をそれぞれ増幅し、増幅した各成分を合成することによって、除去する（出力を０とする）ことができる。

図４は、蛍光測定手法について説明する図である。図４は、検出信号に含まれる散乱光及び蛍光の波形を示している。図４において横軸は時間、縦軸は振幅を示している。上述したように、散乱光に応じた信号成分については、散乱光の位相に応じた所定の時間単位で分離し、分離した各成分をそれぞれ増幅し、増幅した各成分を合成することによって、除去する（出力を０とする）ことができた。ここで、図４に示されるように、蛍光については散乱光に対して位相差を有しているため、散乱光の位相に応じた所定の時間単位で分離すると、各時間領域１〜４の積分値が同じ値とならないため、散乱光と同様の乗数を掛けてそれぞれ増幅し足し合わされた値は０ではない値が出力される。このように、散乱光及び蛍光について、同じ時間領域に分離して増幅し合成することによって、散乱光の信号成分を除去しながら蛍光の出力強度を検波出力することができる。

このように、キャンセル回路６０は、検出信号について、散乱光の位相に応じた所定の時間単位で分離し、分離した検出信号の各成分をそれぞれ増幅し、増幅した各成分を合成することにより、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去し、蛍光の信号成分を得ることができる。キャンセル回路６０は、散乱光に応じた信号成分を除去した信号（すなわち蛍光の信号成分のみとなった信号）である蛍光信号をＡＤ変換器８０に出力する。なお、所定の時間単位として１周期の１／４の時間を例示したがこれに限定されず、合成後において散乱光に応じた信号成分を除去可能な時間単位であればどのような時間単位であってもよい。また、増幅における乗数として「＋１」及び「−１」を例示したがこれに限定されず、合成後において散乱光に応じた信号成分を除去可能な乗数であればどのような乗数であってもよい。

ＡＤ変換器８０は、キャンセル回路６０から出力された蛍光信号について、ＡＤ変換を行いデジタル値に変換し、ＣＰＵ９０に出力する。ＣＰＵ９０は、ＡＤ変換器８０から出力されたデジタル信号（蛍光信号）について、所定の制御・信号処理を行う。ＣＰＵ９０は、信号処理結果を例えばシリアル通信で外部のコンピュータに転送してもよい。また、ＣＰＵ９０は、タイミング生成器７０から出力される信号、すなわち光学測定装置１における各種動作タイミングを決定する信号を生成してタイミング生成器７０に出力してもよい。なお、ＣＰＵ９０に替えてＦＰＧＡが用いられてもよい。以上の処理によって、光学測定装置１は、検出光から散乱光の影響を除去し、蛍光試薬の蛍光に関する信号のみを得ることができる。

次に、光学測定装置１が行う蛍光測定処理（光学測定方法）について、図５を参照して説明する。

図５は、光学測定装置１による蛍光測定処理を示すフローチャートである。図５に示されるように、蛍光測定処理では、最初に、照射光学系１０（光源部）の光源１１が、免疫クロマト試験片１００（試料）に向けて励起光を照射する（ステップＳ１）。免疫クロマト試験片１００（詳細には、イムノクロマトメンブレンの測定対象部における抗原‐抗体複合物）に対して励起光が照射されることにより、抗原‐抗体複合物の蛍光試薬から蛍光が放出される。一方、励起光が免疫クロマト試験片１００で散乱され、散乱光が生じる。

つづいて、検出光学系２０（光検出部）の光検出素子２１が、上述した蛍光及び散乱光を含む検出光を検出する（ステップＳ２）。光検出素子２１は、検出光をＩＶ変換アンプ４０に出力する。そして、ＩＶ変換アンプ４０において光検出素子２１から出力された電流信号（検出信号）が電圧信号に変換され、波形生成回路５０において検出信号の波形が生成された後に、キャンセル回路６０（信号処理部）が、蛍光と散乱光における位相差に基づき、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去する（ステップＳ３）。具体的には、キャンセル回路６０は、検出信号について、散乱光の位相に応じた所定の時間単位で分離し、分離した検出信号の各成分をそれぞれ増幅し、増幅した各成分を合成することにより、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去し、蛍光の信号成分を得る。その後、ＡＤ変換器８０において蛍光信号がデジタル値に変換され、ＣＰＵ９０において所定の制御・信号処理が行われることにより、蛍光に関する信号を得ることができる。

次に、上述した光学測定装置１の作用効果について説明する。

光学測定装置１は、照射光学系１０からの励起光が照射された免疫クロマト試験片１００から生じる蛍光、及び、励起光に起因する光であって励起光と等しい位相を持つ散乱光を含む検出光を検出する検出光学系２０と、検出光に応じた検出信号を処理するキャンセル回路６０と、を備え、キャンセル回路６０は、蛍光と散乱光における位相の違いに基づき、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去する。

このような光学測定装置１では、励起光が照射された免疫クロマト試験片１００（詳細には、イムノクロマトメンブレンの測定対象部における抗原‐抗体複合物の蛍光試薬）から生じる蛍光と、励起光と等しい位相を持つ散乱光における位相の違いに基づいて、検出信号から、散乱光に応じた信号成分が除去される。つまり、検出光に含まれる光成分のうち、ノイズ成分に相当する散乱光は、励起光に起因する光であって励起光と等しい位相を持つことに着目し、検出信号に対して励起光と等しい位相を持つ信号成分を除去することで、励起光自体に起因するノイズ成分である散乱光に応じた信号成分を除去することができる。具体的には、検出光には、免疫クロマト試験片１００（詳細には、抗原‐抗体複合物の蛍光試薬）から生じる光（蛍光）だけでなく、励起光に起因する光（散乱光）がノイズ成分として含まれることがあるところ、蛍光が散乱光に対して僅かに遅れて検出される（蛍光が散乱光に対して位相差を有している）ため、当該位相の違いを利用することによって、検出信号から散乱光に応じた信号成分だけを適切に除去することができる。以上のように、光学測定装置１によれば、励起光自体に起因するノイズ成分である散乱光を適切に除去することができる。

なお、検出光から散乱光を除去する手法としては、波長選択によるもの、具体的には、検出光に対して波長選択フィルタを用いることで蛍光の波長帯のみを抜き出して散乱光の波長帯を除去することが考えられる。本実施形態においても、蛍光フィルタ２２を設けることによってある程度の散乱光を除去している。しかしながら、励起光波長及び蛍光波長が近い場合においては、蛍光フィルタ２２によって蛍光波長を持つ蛍光を適切に透過させながら励起光波長を持つ散乱光を完全に遮断することは困難である。また、一般的に、波長選択フィルタは光の入射角度によって特性が変化してしまうため、蛍光フィルタ２２によって、つまり波長選択によって、様々な角度から入射する散乱光の進入を完全に防ぐことは困難である。この点、本実施形態の光学測定装置１では、蛍光フィルタ２２を用いた光学的な波長選択に加え、蛍光と散乱光（すなわち励起光）との位相差を利用して、散乱光のみを除去する信号処理を行っているため、蛍光フィルタ２２によって完全に遮断することができない散乱光についても、適切に除去することができる。また、波長選択フィルタのみによって散乱光を除去すべく、例えば波長選択フィルタに対する散乱光の入射角度を一定にするための光学系を設けることが考えられるが、この場合には光検出に係る構成が大型化してしまうことが問題となる。この点、本実施形態の光学測定装置１では、散乱光の入射角度を一定にするための光学系が不要となり、装置の小型化を実現することができる。

また、他にも、励起光及び信号光を全て光検出器に入力し、時間‐出力信号波形から寿命が長い蛍光試薬（例えば、ユウロピウム）の蛍光成分のみをデジタル処理及びゲート回路によって取り出すような、蛍光寿命を利用した時間分解法による蛍光測定が知られている。しかしながら、当該方法では、計測システムが複雑となるのに加え、蛍光寿命の短い（蛍光寿命がナノ秒程度である）蛍光を捕らえるためには超高速な時間分解能が必要となるため、コストが高くなる。この点、本実施系形態の光学測定装置１では、励起光（散乱光）と蛍光との位相差に着目し、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去して蛍光に応じた信号成分のみを取り出す。このような技術は、タイミング制御回路及び分離・合成回路によって容易に実現することができるため、コストを低減することができる。また、光学測定装置１によれば、１０ＭＨｚ程度の位相変調を行うことによって数ナノ秒の蛍光寿命を有する有機色素の蛍光も検出することができる。

そして、キャンセル回路６０は、検出信号について、散乱光の位相（励起光の位相）に応じた所定の時間単位で分離し、分離した検出信号の各成分をそれぞれ増幅し、増幅した各成分を合成することにより、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去している。このように、散乱光の位相を考慮して、散乱光に応じた信号成分のみが除去されるように検出信号の分離（所定の時間単位での分離）、分離した各成分の増幅、増幅した各成分の合成を行うことによって、散乱光に応じた信号成分を適切に除去することができる。そして、蛍光は散乱光に対して位相の違いを有しているため、散乱光に応じた信号成分のみが除去されるような信号処理を行っても、蛍光に応じた信号成分は除去されず、検出信号から蛍光に応じた信号成分のみを適切に取り出すことができる。

また、上述したように、第１光は、試料を励起する励起光であり、第２光は、励起光に応じて試料が放出する蛍光であり、第３光は、励起光又は励起光の散乱光の少なくとも一方を含む。これにより、蛍光及び励起光または励起光の散乱光の少なくとも一方に応じた信号成分を含む検出信号から、励起光または励起光の散乱光の少なくとも一方に応じた信号成分を適切に除去し、蛍光に応じた信号成分のみを適切に取り出すことができる。

以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されない。例えば、光学測定装置１では、キャンセル回路６０において検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去するとして説明したが、これに限定されない。すなわち、図６に示される光学測定装置１Ａのように、キャンセル回路６０を設けずに、ＡＤ変換器８０におけるＡ／Ｄ変換後に、ＣＰＵ９０Ａ（信号処理部）において検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去する処理を行ってもよい。この場合には、キャンセル回路６０を設ける必要がないため、装置の小型化に寄与することができる。

また、光学測定装置１は、試料に第１光を照射し、試料から生じる第２光、及び、第１光に起因する光であって第１光と等しい位相を持つ第３光を含む検出光を検出するものであればよく、第１光が励起光以外の光であり、第２光が蛍光以外の光であり、第３光が散乱光以外の光であってもよい。

なお、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去して蛍光等を高感度に検出する本技術は、様々な技術分野に応用することが考えられる。例えば、マイクロプレートリーダ―においては、蛍光色素として蛍光寿命数が数ｎｓｅｃから数十ｎｓｅｃであり検出困難な有機色素（例えばフルオレセイン）が用いられるところ、本技術を適用することにより蛍光を高感度に検出することが期待できる。同様に、液体クロマトグラフの分野においても本技術を適用することが考えられる。また、例えばＤＮＡシーケンサの分野では、増幅したＤＮＡをキャピラリー電気泳動により分離し、Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃにそれぞれ標識した蛍光色素の蛍光を読み取るところ、本技術を適用することにより、励起光由来のノイズを効果的に除去し、高Ｓ／Ｎな信号が得られることが期待できる。同様に、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）の分野においても本技術を適用することが考えられる。

次に、上述した実施形態において説明した特定の信号成分（ノイズ）の除去に関して、図７〜図１６を参照してより具体的に説明する。

図７は、ノイズ成分の除去について説明する図である。図７（ａ）は励起光に起因する散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去を行わなかった場合の検出光の強度、図７（ｂ）は励起光に起因する散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去を行った場合の検出光の強度を示している。図７（ａ）及び図７（ｂ）において縦軸は検出光の強度を示しており、横軸は試料５００の測定エリアである測定部５０１における位置を示すチャンネルである。１チャンネルは例えば０．０２ｍｍである。図７（ｃ）は、図７（ａ）及び図７（ｂ）のチャンネルの位置に対応する試料５００の領域を示す図である。図７（ｃ）に示した試料５００を拡大した模式図が図８である。図８に示されるように、試料５００は、検体が滴下される滴下部５０２と、蛍光試薬で標識された検出抗体を保持する保持部５０３と、捕捉抗体を測定対象部５０４に固定した測定部５０１とが上流から下流に向けて配置されている。蛍光試薬は、例えばDTBTA-Eu^3＋である。測定部５０１は、例えば白色のイムノクロマトメンブレンの一部であるため、励起光を散乱し易い。

このような試料５００に対して、滴下部５０２に検体を滴下すると、検体は毛細管現象により下流側へ移動する。検体中に被検出物質がある場合、保持部５０３の検出抗体と被検出物質とが反応して複合体を形成し、この複合体が測定部５０１を下流側に移動していく。そして、複合体が測定部５０１上の測定対象部５０４に達したときに、複合体が測定対象部５０４の捕捉抗体に捕捉され、被検出物質、検出抗体、及び捕捉抗体の３つによる複合体が形成される。この状態で測定エリアである測定部５０１に対して集光位置（チャンネル）を変化させながら励起光が照射されることにより、図７（ａ）及び図７（ｂ）に示されるようなチャンネル毎の検出光強度を導出することができる。図７（ａ）及び図７（ｂ）において検出光強度が他と比べて大きくなっているチャンネルは、複合体が捕捉されている測定対象部５０４の位置に対応するチャンネルである。

図７（ａ）に示されるように、散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去が行われていない場合には、検出光には蛍光だけでなく散乱光が含まれるため、検出光強度が大きくなっている。そして、このようなノイズは励起光量を大きくすることに伴って大きくなるため、図７（ａ）に示されるように、励起光量を２倍にするとノイズも同様に２倍程度になっている。一般的にＳ／Ｎを向上させる方法として、励起光量を増加させることにより蛍光シグナル量を増加させる方法が考えられるが、上述したように、図７（ａ）のように励起光量に応じてノイズも増加する態様においては、Ｓ／Ｎを向上させることが難しい。さらに、励起光量を増加させることによってダイナミックレンジが狭まるという問題もある。

一方で、図７（ｂ）に示されるように、散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去を行った場合には、検出光には概ね蛍光のみが含まれており、検出したい信号（蛍光に基づく信号）のみを検出することができている。この場合には、ノイズがほぼ０であるため、図７（ｂ）に示されるように、励起光量を増加させても（例えば２倍にしても）、光検出器が飽和しない限り、励起光（散乱光）の影響をほぼ０にキャンセルすることができ、ノイズが極端に大きくなることがない。以上のように、図７（ｂ）に示されるようなノイズの除去を行う構成においては、励起光を増加させた場合にノイズ成分をほぼ０にキャンセルした状態でシグナル成分のみを増加させることができるため、Ｓ／Ｎの向上につながる。当該構成は、ノイズ成分に非常に強いため、励起光量を増加させることやＩＶ変換アンプの増倍率を上げることが可能となる。

図９は、Ｓ／Ｎの定義について説明する図である。図９は、チャンネル毎の検出光の強度（測定エリアの各位置における検出光の強度）の一例を示している。図９に示されるように、検出光の強度１０ｃｏｕｎｔ付近に±４程度のゆらぎ成分が存在している。このようなベース光量のゆらぎ（標準偏差）は、蛍光物質等が何も塗布されていない測定部５０１（或いは、計測状態と同様にぬれた状態とされた測定部５０１）に励起光をスキャンして取得される値である。以下では、当該ベース光量のゆらぎをノイズＮと定義する。また、シグナルＳは、「測定対象部５０４のピーク蛍光強度から全チャネルにおける測定対象部５０４の位置を除いたノイズ成分の平均値を差し引いた値」と定義する。Ｓ／Ｎは、上記で定義したシグナルをノイズで割った値と定義する。

なお、図９に示される例では、ノイズの値が１０ｃｏｕｎｔほどオフセットしている。後述するキャリブレーション処理を行うことによって、原理的にはノイズの値はほぼ０にキャンセルされる。しかし、ノイズの値に応じたバックグラウンドはばらつきがあるところ、ソフトでの解析の観点からは信号が常にプラスの値となることが好ましいため、バックグラウンドのオフセット処理を行っている。なお、オフセット量は、信号がダイナミックレンジ内（０〜４０９６ｃｏｕｎｔ内）に収まるように設定される。オフセット量は、ダイナミックレンジの観点から極力少なくしつつ、測定部５０１に励起光をスキャンすることにより得られるバックグラウンドの信号が常に（ほぼ確実に）プラスの値となるように設定されている。具体的には、オフセット量は、例えば、蛍光物質等が何も塗布されていない測定部５０１（或いは、計測状態と同様にぬれた状態とされた測定部５０１）に励起光をスキャンして取得される検出光の強度平均値＋該強度平均値の６σの値とされてもよい。なお、回路系に突発的なノイズが飛び込んでくる場合に備えて、上記で計算されるオフセット量に適当なマージンを加えて最終的なオフセット量とされてもよい。オフセット量は、ダイナミックレンジを犠牲にせず且つ信号がマイナスに出力されないように選択され、例えば＋２０ｃｏｕｎｔ程度であってもよい。

次に、散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去手法について、具体的に説明する。光学測定装置１では、ロックイン回路であるキャンセル回路６０においてキャリブレーション処理が行われ、該キャリブレーション処理の実施結果が考慮されて、検出信号から散乱光に応じた信号成分（ノイズ）が除去される。

具体的には、光学測定装置１を用いた光学測定方法では、最初に、試料５００の測定対象部５０４以外の箇所に励起光が照射されるように、照射光学系１０の光学ヘッドが配置される。つづいて、照射光学系１０からの励起光が測定部５０１等に照射されることによる散乱光（測定部５０１等に散乱した励起光成分）が検出光学系２０において検出される。ここで検出光学系２０に検出される光は、基本的には、少なくとも測定対象部５０４における蛍光を含まない散乱光のみの光であり、キャリブレーション処理に用いられるキャリブレーション処理用光である。

キャリブレーション処理用光の取得について、より詳細に説明する。キャリブレーション処理用光は、試料５００における、測定対象部５０４に固定された捕捉抗体よりも下流側のエリアに励起光が照射されることにより検出されてもよい。図１３は、試料５００の各領域における蛍光強度を説明する図である。図１３において、「ＬｉｎｅＡ」と示された箇所は測定対象部５０４の箇所を示している。図７（ａ）及び図７（ｂ）等の説明においては、説明の便宜上、測定対象部５０４以外の蛍光強度を小さく示したが、実際には、図１３に示されるように、検体が滴下される上流側においては、捕捉抗体が存在しなくても蛍光強度が大きくなりやすい。このため、散乱光のみとしたいキャリブレーション処理用光は、試料５００における、測定対象部５０４上に固定された捕捉抗体よりも下流側のエリアに励起光が照射されることにより検出されることが好ましい。なお、キャリブレーション処理用光の取得は、試料５００における測定部５０１以外にも、イムノクロマトメンブレンを収容するケースや、別途用意したキャブレーション処理用の部材を用いて行ってもよい。

つづいて、キャリブレーション処理が実施される。具体的には、光学測定装置１のキャンセル回路６０が、上述したキャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づき、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を実施する。キャリブレーション処理の詳細については後述する。そして、キャリブレーション処理の完了後、試料５００の測定エリア（測定部５０１）上を照射光学系１０の光学ヘッドでスキャンすることにより、測定部５０１の蛍光情報が取得される。具体的には、キャンセル回路６０が、上述したキャリブレーション処理の実施結果を考慮して、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去することにより、蛍光情報を取得する。

次に、キャリブレーション処理の詳細について説明する。光学測定装置１のキャンセル回路６０は、例えばＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）を利用したロックイン回路である。キャリブレーション処理において、キャンセル回路６０は、光源駆動回路３０によって設定される光源１１の変調周波数（例えばＤＤＳ（Direct Digital Synthesizer）の周波数）に合わせた、キャンセル回路６０の動作周波数で周期を刻む周期信号に対して位相をずらしたロックイン用のスイッチ信号を生成する。そして、ロックイン回路として機能するキャンセル回路６０は、測定信号であるキャリブレーショ信号、及び、参照信号であるスイッチ信号を入力として、散乱光に応じた信号成分を出力し、該散乱光に応じた信号成分の電圧値が０に近似する所定範囲内（スラッシュレベル）となるように、スイッチ信号の位相を調整する。

図１０は、キャンセル回路６０のＦＰＧＡ内部でキャリブレーション処理に用いる信号を示している。図１０に示される周期信号は、上述したようにＤＤＳの周波数に合わせて周期を刻むクロック信号である。基準信号は、周期信号から任意の位相にある（周期信号に対して位相をずらした）、周期信号と同じ周波数の信号であり、後述するＸＹ信号用のトリガである。ＸＹ信号は、上述したロックイン用のスイッチ信号であり、基準信号をトリガにして作られる信号である。Ｘ信号（第１信号）は、基準信号と位相差がない信号である。Ｙ信号（第２信号）は、基準信号に対して９０度位相がずれた信号である。キャンセル回路６０は、実際にはＸ信号及びＹ信号に加えて、更に、Ｘ信号を反転させたＸ´信号（第３信号）と、Ｙ信号を反転させたＹ´信号（第４信号）とを生成する。Ｘ信号、Ｙ信号、Ｘ´信号、及びＹ´信号は、それぞれ独立した専用の回路によって生成される。散乱光に応じた信号成分の電圧値がスラッシュレベルとなるようにスイッチ信号の位相を調整するとは、すなわち、キャンセル回路６０からの出力が０Ｖ（またはそれに近似する値）になるまで、周期信号に対して基準信号の位相をずらし続けることである。

図１１は、周期信号に対して基準信号の位相をずらして出力が０Ｖになるように調整する処理を説明する図である。いま、周期信号、基準信号、及びスイッチ信号の初期状態の位相関係が図１１（ａ）に示される状態であったとする。そして、スイッチ信号に基づいて図１１中の網掛けの区間で積分処理がなされ、出力（散乱光に応じた信号成分の電圧値）がスラッシュレベルではなく且つ正の値であったとする。この場合、図１１（ｂ）に示されるように、スイッチ信号の位相を遅らせるように基準信号の位相が調整される。すなわち、キャンセル回路６０は、キャリブレーション処理において、散乱光に応じた信号成分の電圧値がスラッシュレベルではなく正の値である場合には、スイッチ信号の位相を遅らせるように調整する。

いま、スイッチ信号の位相調整がなされた図１１（ｂ）の状態においても、網掛けの区間の積分処理の結果、出力（散乱光に応じた信号成分の電圧値）がスラッシュレベルではなく且つ正の値であったとする。この場合、図１１（ｃ）に示されるように、更にスイッチ信号の位相を遅らせるように基準信号の位相が調整される。

いま、スイッチ信号の位相調整がなされた図１１（ｃ）の状態においても、網掛けの区間の積分処理の結果、出力（散乱光に応じた信号成分の電圧値）がスラッシュレベルではなく且つ正の値であったとする。この場合、図１１（ｄ）に示されるように、更にスイッチ信号の位相を遅らせるように基準信号の位相が調整される。

いま、スイッチ信号の位相調整がなされた図１１（ｄ）の状態において、網掛けの区間の積分処理の結果、出力（散乱光に応じた信号成分の電圧値）がスラッシュレベルではなく且つ負の値であったとする。この場合、図１１（ｅ）に示されるように、スイッチ信号の位相を進めるように基準信号の位相が調整される。すなわち、キャンセル回路６０は、キャリブレーション処理において、散乱光に応じた信号成分の電圧値がスラッシュレベルではなく負の値である場合には、スイッチ信号の位相を進めるように調整する。

そして、スイッチ信号の位相を進めるように調整された結果、図１１（ｅ）に示されるように、網掛けの区間の積分処理の結果、出力（散乱光に応じた信号成分の電圧値）がスラッシュレベル（０に近似する所定範囲内の値）になると、キャリブレーション処理が完了する。

キャリブレーション処理が完了すると、キャンセル回路６０は、蛍光成分及び散乱光成分（励起光成分）を含んだ検出光に応じた検出信号と、キャリブレーション処理において位相が調整されたスイッチ信号とを入力として、検出信号から散乱光成分に応じた信号成分を除去する。

図１５は、キャリブレーション処理を示すフローチャートである。図１５に示されるように、キャリブレーション処理では、最初に、ＡＤ変換器への入力が所定のオフセット電圧に切り替えられて０レベルが記憶される（ステップＳ１）。そして、スイッチの切り替えによりキャンセル回路６０（ロックイン回路）の信号がＡＤ変換器に入力される（ステップＳ２）。この状態で、一度強制的に基準信号の位相がずらされる（ステップＳ３）。キャンセル回路６０（ロックイン回路）の出力は周期信号に対する基準信号の位相が０度と１８０度のときに０Ｖとなるが、初期状態で偶然１８０度に位相が合っていた場合、誤ってキャリブレーション処理を完了してしまい、出力される信号の正負が反転してしまうため、後段の回路の構成によっては出力される信号を検出できなくなる場合がある。この点、スタート時に強制的に基準信号の位相をずらすことにより、誤ってキャリブレーション処理が完了してしまうことを防止できる。また、このようにして開始時の位相を合わせることにより、出力される信号の正負が固定される。その結果、出力される信号をデジタル値に変換した際の符号ビットが必要なくなり、ＡＤ変換器のダイナミックレンジを有効に使用することができる。また、負の出力で計測したいときは、キャリブレーション完了の位相を０度ではなく１８０度にしてもよい。

ステップＳ３が完了すると、現在のＡＤ変換器の入力値が記録され（ステップＳ４）、キャリブレーションのループ処理が実行される。まず、現在のＡＤ変換器の入力値と０レベルとが比較されて、ＡＤ変換器の入力値が０レベルよりも小さいか（負の値であるか）否かが判定される（ステップＳ５）。ステップＳ５においてＡＤ変換器の入力値が負の値であると判定されると、ＤＤＳの周波数に応じた周期信号に対するキャンセル回路６０のスイッチ信号（すなわち基準信号）の位相が進めされる（ステップＳ６）。一方で、ステップＳ５においてＡＤ変換器の入力値が正の値であると判定されると、周期信号に対するキャンセル回路６０のスイッチ信号（すなわち基準信号）の位相が遅らされる（ステップＳ７）。

そして、ＡＤ変換器の入力値について、符号が変化せずにスラッシュレベルとなったか否かが判定される（ステップＳ８）。ステップＳ８において符号が変化せずにスラッシュレベルになったと判定されると、キャリブレーション処理が終了する。一方で、ステップＳ８において条件を満たしていないと判定されると、位相をずらしたことによりＡＤ変換器の入力の符号が変わったか否かが判定される（ステップＳ９）。ステップＳ９において変わっていないと判定された場合には再度ステップＳ４の処理が行われ、変わっていると判定された場合には制御による位相の変化幅が現状の半分に変更されて（ステップＳ１０）、再度ステップＳ４の処理が行われる。以上が、キャリブレーション処理である。

次に、光源駆動回路３０によって設定される光源１１の変調周波数（例えばＤＤＳ（Direct Digital Synthesizer）の周波数）と、ＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）を利用したロックイン回路であるキャンセル回路６０の動作周波数との同期処理について説明する。ロックイン回路を用いた位相差蛍光計測を行う上で、光源１１の変調周波数とロックイン回路の動作周波数とは極めて厳密に同期させる必要がある。光源１１の変調周波数とロックイン回路の動作周波数とがずれていると、上述したキャリブレーション処理によってロックイン回路の出力を０にしても、図１４に示されるように時間経過とともに周波数のずれ、すなわち位相差が蓄積して出力がドリフトしてしまう（図１４において「元データ」と記したグラフを参照）。このように、適切に同期処理が行われていない場合には、散乱光の影響によって蛍光計測を正確に行うことができない。すなわち、ロックイン回路の動作周波数で周期を刻む周期信号が、光源１１の変調周波数と同期していないことによって、周期信号に基づいて生成される基準信号及びスイッチ信号が適切な信号とならず、蛍光計測を正確に行うことができない。

ここで、ＦＰＧＡを利用したロックイン回路と、光源１１の変調を行うＤＤＳとは互いに異なるタイミングで動作しているため、光源１１を所望の周波数で変調させつつ、双方の動作周波数を完全に同一にすることは不可能である。そこで、本態様では、ＦＰＧＡの動作周波数を２種類設定し、２種類の動作周波数を所定の割合で切り替えながら動作させることで、ロックイン回路及びＤＤＳの周波数ずれを実用上問題とならない程度に小さくしている。すなわち、例えばロックイン回路が１０回駆動するトータルの時間で考えた場合に、全て同じ動作周波数とするのではなく、例えば１０回中８回はＤＤＳの動作周波数よりも高いものにすると共に、１０回中２回はＤＤＳの動作周波数よりも低いものにする、等によって、ロックイン回路が１０回駆動するトータルの時間でのＤＤＳとの周波数ずれを小さくすることができる。このように周波数ずれを小さくすることによって、図１４に示されるように、出力のドリフトを低減することができる（図１４において「改良後」と記したグラフを参照）。なお、ＦＰＧＡの動作周波数ではなくＤＤＳの動作周波数を２種類設定して切り替えても同様の効果を得ることができる。

最後に、上述した態様の作用効果について説明する。本態様では、蛍光を含まず散乱光を含むキャリブレーション処理用光を検出し、キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づき、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を実施し、該キャリブレーション処理の実施結果を考慮して、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去する。検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を、散乱光を含むキャリブレーション処理用光に基づき予め行うことによって、検出信号から散乱光に応じた信号成分を適切に除去することができる。

このようにして散乱光（ノイズ）を適切に除去することの効果について、図１６を参照して説明する。図１６（ａ）は散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去を行わなかった場合の検出光の強度、図１６（ｂ）は散乱光に応じた信号成分（ノイズ）の除去を行った場合の検出光の強度を示している。図１６は、蛍光試薬としてDTBTA-Eu^3＋を塗布したメンブレンを計測した場合の結果を示している。図１６（ａ）に示されるように、ノイズの除去が行われていない場合においては、励起光（散乱光）のバックグラウンド（ＢＫＧ）のために約３３０ｃｏｕｎｔｓのオフセットが必要になっている。そして、ノイズ（標準偏差）は２．１６、シグナル強度は４０４ｃｏｕｎｔｓであった。これに対して、図１６（ｂ）に示されるように、ノイズの除去が行われている場合においては、励起光がメンブレンに散乱することを考慮したオフセットが必要とならず、ソフト上の処理（信号の値を全てプラスにする処理）のための最低限のオフセットのみが行われている。そして、ノイズ（標準偏差）は０．６９、シグナル強度は１４７５ｃｏｕｎｔｓとすることができた。このように、ノイズの除去が行われている場合においてはオフセット量が小さいため、光源からの励起光量及びＩＶ変換アンプの増幅率を上げることができ、シグナル強度を好適に上げることができる。この結果、ノイズの除去が行われない場合のＳ／Ｎが１８７であるのにたいして、ノイズの除去が行われる場合のＳ／Ｎを２１４０とすることができ、Ｓ／Ｎを１０倍以上向上させることができる。

キャリブレーション処理において、光源１１の変調周波数に合わせたキャンセル回路６０の動作周波数で周期を刻む周期信号に対して位相をずらしたロックイン用のスイッチ信号を生成し、キャリブレーション信号及びスイッチ信号を入力として、散乱光に応じた信号成分を出力し、該散乱光に応じた信号成分の電圧値が０に近似する所定範囲内となるように、スイッチ信号の位相を調整し、検出信号、及び、キャリブレーション処理において位相が調整されたスイッチ信号を入力として、検出信号から散乱光に応じた信号成分を除去してもよい。このように、ロックイン回路を用いて、キャリブレーション処理において散乱光に応じた信号成分の電圧値が０に近似する値となるようにスイッチ信号の位相が調整されることにより、位相調整後のスイッチ信号を入力として、検出信号から散乱光に応じた信号成分を適切に除去することができる。

キャリブレーション処理において、散乱光に応じた信号成分の電圧値が所定範囲内ではなく該所定範囲の値よりも大きい場合には、スイッチ信号の位相を遅らせるように調整し、散乱光に応じた信号成分の電圧値が所定範囲内ではなく該所定範囲の値よりも小さい場合には、スイッチ信号の位相を進めるように調整してもよい。これにより、キャリブレーション処理において散乱光に応じた信号成分の電圧値を、適切に０に近い値に調整することができる。

光源１１の変調周波数を、蛍光の強度がピーク値から１／ｅに落ちるまでの時間である蛍光寿命に対応する値よりも低くしてもよい。変調周波数が蛍光寿命に対応する値程度に高くされた場合には、連続する信号が互いに重なってしまう場合があり蛍光強度を最大化することができない。この点、変調周波数が蛍光寿命に対応する値よりも低くされることにより、蛍光強度を適切に高めることができる。

光源１１の変調周波数を、蛍光寿命に対応する値よりも低く、且つ、商用周波数よりも高くしてもよい。これにより、変調周波数が蛍光寿命に対応する値よりも高くなり蛍光強度が弱まることを回避しながら、ノイズの増加を回避することができる。

ックイン用のスイッチ信号として、Ｘ信号と、該Ｘ信号に対して位相が９０度ずれたＹ信号と、Ｘ信号を反転させたＸ´信号と、Ｙ信号を反転させたＹ´信号とを、それぞれ独立した専用の回路を用いて生成してもよい。独立した専用の回路で反転信号が生成されることにより、例えばnot回路により反転信号を生成する場合に問題となる微小な遅延（not回路の通過に伴う微小な遅延）が発生することを防止できる。

キャンセル回路６０（ロックイン回路）は、２種類の動作周波数が所定の割合で切り替えて設定されてもよい。これにより、動作周波数が１種類とされる場合よりも、ロックイン回路の動作周波数を光源１１の変調周波数に合わせやすくなり、これらの同期制度を向上させることができる。

キャリブレーション処理用光は、試料５００における、測定対象部５０４に固定された捕捉抗体よりも下流側のエリアに励起光が照射されることにより検出されてもよい。蛍光成分は捕捉抗体よりも上流側に滞留しやすいところ、補足抗体の下流側のエリアに励起光が照射されてキャリブレーション処理用光が検出されることにより、適切に、蛍光成分の影響を低減したキャリブレーション処理用光を検出することができる。

１，１Ａ…光学測定装置、１０…照射光学系（光源部）、２０…検出光学系（光検出部）、３０…光源駆動回路、６０…キャンセル回路（信号処理部）、１００…免疫クロマト試験片（試料）。

Claims (12)

1. 第１光が照射された試料から生じる第２光、及び、前記第１光に起因する光であって前記第１光と等しい位相を持つ第３光を含む検出光を検出する光検出部と、
   前記検出光に応じた検出信号を処理する信号処理部と、を備え、
   前記信号処理部は、前記第２光と前記第３光における位相の違いに基づき、前記検出信号から前記第３光に応じた信号成分を除去し、
   前記第１光は、前記試料を励起する励起光であり、
   前記第２光は、前記励起光に応じて前記試料が放出する蛍光であり、
   前記第３光は、前記励起光又は前記励起光の散乱光の少なくとも一方を含み、
   前記光検出部は、前記第２光を含まず前記第３光を含むキャリブレーション処理用光を検出し、
   前記信号処理部は、前記キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づき、前記検出信号から前記第３光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を実施し、該キャリブレーション処理の実施結果を考慮して、前記検出信号から前記第３光に応じた信号成分を除去する、光学測定装置。
2. 前記信号処理部は、前記検出信号について、前記第３光の位相に応じた所定の時間単位で分離し、分離した前記検出信号の各成分をそれぞれ増幅し、増幅した各成分を合成することにより、前記検出信号から前記第３光に応じた信号成分を除去する、請求項１記載の光学測定装置。
3. 前記第１光を出力する光源の変調周波数を設定する光源駆動回路を更に備え、
   前記信号処理部は、
   前記キャリブレーション処理において、前記光源駆動回路によって設定される前記光源の変調周波数に合わせた前記信号処理部の動作周波数で周期を刻む周期信号に対して位相をずらしたロックイン用のスイッチ信号を生成し、前記キャリブレーション信号及び前記スイッチ信号を入力として、前記第３光に応じた信号成分を出力し、該第３光に応じた信号成分の電圧値が０に近似する所定範囲内となるように、前記スイッチ信号の位相を調整し、
   前記検出信号、及び、前記キャリブレーション処理において位相が調整された前記スイッチ信号を入力として、前記検出信号から前記第３光に応じた信号成分を除去する、請求項１又は２記載の光学測定装置。
4. 前記信号処理部は、前記キャリブレーション処理において、前記第３光に応じた信号成分の電圧値が前記所定範囲内ではなく該所定範囲の値よりも大きい場合には、前記スイッチ信号の位相を遅らせるように調整し、前記第３光に応じた信号成分の電圧値が前記所定範囲内ではなく該所定範囲の値よりも小さい場合には、前記スイッチ信号の位相を進めるように調整する、請求項３記載の光学測定装置。
5. 前記光源駆動回路は、前記光源の変調周波数を、前記第２光の強度がピーク値から１／ｅに落ちるまでの時間である蛍光寿命に対応する値よりも低くする、請求項３又は４記載の光学測定装置。
6. 前記光源駆動回路は、前記光源の変調周波数を、前記蛍光寿命に対応する値よりも低く、且つ、商用周波数よりも高くする、請求項５記載の光学測定装置。
7. 前記信号処理部は、前記ロックイン用のスイッチ信号として、第１信号と、該第１信号に対して位相が９０度ずれた第２信号と、前記第１信号を反転させた第３信号と、前記第２信号を反転させた第４信号とを、それぞれ独立した専用の回路を用いて生成する、請求項３〜６のいずれか一項記載の光学測定装置。
8. 前記信号処理部は、２種類の前記動作周波数が所定の割合で切り替えて設定される、請求項３〜７のいずれか一項記載の光学測定装置。
9. 試料に第１光を照射することと、
   前記第１光が照射された前記試料から生じる第２光、及び、前記第１光に起因する光であって前記第１光と等しい位相を持つ第３光を含む検出光を検出することと、
   前記第２光と前記第３光における位相の違いに基づき、前記検出光に応じた検出信号から前記第３光に応じた信号成分を除去することと、を含み、
   前記第２光を含まず前記第３光を含むキャリブレーション処理用光を検出し、
   前記キャリブレーション処理用光に応じたキャリブレーション信号に基づき、前記検出信号から前記第３光に応じた信号成分を除去するためのキャリブレーション処理を実施し、該キャリブレーション処理の実施結果を考慮して、前記検出信号から前記第３光に応じた信号成分を除去する、光学測定方法。
10. 前記キャリブレーション処理において、光源の変調周波数に合わせて周期を刻む周期信号に対して位相をずらしたロックイン用のスイッチ信号を生成し、前記キャリブレーション信号及び前記スイッチ信号を入力として、前記第３光に応じた信号成分を出力し、該第３光に応じた信号成分の電圧値が０に近似する所定範囲内となるように、前記スイッチ信号の位相を調整し、
    前記検出信号、及び、前記キャリブレーション処理において位相が調整された前記スイッチ信号を入力として、前記検出信号から前記第３光に応じた信号成分を除去する、請求項９記載の光学測定方法。
11. 前記キャリブレーション処理において、前記第３光に応じた信号成分の電圧値が前記所定範囲内ではなく該所定範囲の値よりも大きい場合には、前記スイッチ信号の位相を遅らせるように調整し、前記第３光に応じた信号成分の電圧値が前記所定範囲内ではなく該所定範囲の値よりも小さい場合には、前記スイッチ信号の位相を進めるように調整する、請求項１０記載の光学測定方法。
12. 前記試料は、検体が滴下される滴下部と、蛍光試薬で標識された検出抗体を保持する保持部と、捕捉抗体を固定した測定部とが上流から下流に向けて配置されており、
    前記キャリブレーション処理用光は、前記試料における、前記捕捉抗体よりも下流側のエリアに前記第１光が照射されることにより検出される、請求項９〜１１のいずれか一項記載の光学測定方法。