JP2015117980A - 染色方法 - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光免疫染色と形態観察染色とを共に行う場合であっても、蛍光免疫染色による抗原の定量性を向上させる。【解決手段】蛍光色素を樹脂中に内包した蛍光粒子１２であって平均粒径の異なる２種以上の蛍光粒子１２を、標識剤として用いる病理切片の染色方法が開示されている。かかる染色方法では、前記病理切片を、平均粒径の大きい第１の蛍光粒子を用いて免疫染色する工程と、前記病理切片を、平均粒径が前記第１の蛍光粒子より小さい第２の蛍光粒子を用いて免疫染色する工程と、を有する。【選択図】図３

Description

本発明は病理切片の染色方法に関し、特に免疫染色と形態観察染色とを共に実現しうる技術に関する。

病理診断では、臓器摘出や針生検によって得た組織検体を厚さ数ミクロン程度に薄切して組織標本を作成し、様々な所見を得るために光学顕微鏡を用いて拡大観察することが広く行われている。多くの場合、標本は、採取した組織を固定するため脱水し、パラフィンブロック化した後、数μｍの厚さに薄切りし、パラフィンを取り除いて作製される。ここで、標本は光を殆ど吸収および散乱せず無色透明に近いため、観察に先立って色素による染色を施すのが一般的である。

染色手法としては種々のものが提案されている。
特に組織標本に関しては、標本の形態を観察するための形態観察染色として、ヘマトキシリンおよびエオジンの２つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色）が標準的に用いられ（非特許文献１、特許文献１〜２参照）、ヘマトキシリン染色（Ｈ染色）により細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色され、エオジン染色（Ｅ染色）により細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色される。病理医は、染色された組織標本の顕微鏡画像の中で、細胞の核の大きさや形の変化、組織としてのパターンの変化などの形態学的な情報、染色情報、をもとに診断を行っている。

他方、病理診断では、免疫染色と呼ばれる、組織標本の分子情報の発現を確認するための分子標的染色を施し、遺伝子やタンパクの発現異常といった機能異常を診断する免疫観察も行なわれている。
免疫染色では、たとえば蛍光染色法（蛍光標識法）が用いられる。蛍光染色法は、蛍光色素などの蛍光粒子で修飾した抗体を用いて、対象となる抗原を染色し観察することで抗原量を測る手法である。

近年では、同一の病理切片に対し、形態観察染色と蛍光染色法による免疫染色（蛍光免疫染色）とを共に行うことが試みられており、たとえば、HER2などの膜に発現するタンパクを検出する場合には、HE染色と蛍光免疫染色とを共に行っている。
かかる場合、細胞の形態観察と蛍光粒子の観察との両方を行いたいため、ある程度エオジンが発光する励起波長で蛍光粒子を励起させている。その際に、輝度の低い蛍光粒子（たとえばQ-dotなど）では、Ｅ染色により蛍光が埋もれてしまい輝点の観測が不可能となるため、Ｅ染色に埋もれない輝度を有する蛍光粒子を選択することが必要となってくる。現在用いられている蛍光粒子では、輝度がその粒子の体積に比例することから、HE染色時においてある程度大きな粒径を有する粒子が必要となっており、実際には粒径が150nm程度の粒子が用いられている。

特表２００１−５２５５８０号公報 特開２００９−１１５５９９号公報

診断に役立つ免疫組織化学、文光堂

ところで、抗原の発現数の少ない病理切片においてはそれほど大きな問題とはならないが、抗原の発現数の多い病理切片では、抗原間の距離が150nm以下になることが考えられ問題が発生する。
たとえば、図５に示すとおり、蛍光粒子１２とビオチン１４とを直接結合した標識体１０を作製し、標識体１０を用いて、抗原２０に１次抗体３０とアビジン４２で修飾した２次抗体４０とを結合したものを免疫染色する方法では、蛍光粒子１２が150nm程度の粒径を有しているため、蛍光粒子１２同士の立体障害によって抗原２０と結合できない蛍光粒子１２が存在し、すべての抗原２０を認識できなくなってしまう。
このような問題に対し、粒径の小さい蛍光粒子１２のみを用いれば、抗原２０間の距離が狭くても蛍光粒子１２が認識可能となり、Ｈ染色のみの観察条件では輝点数が増加する。しかしながら、粒径の小さい蛍光粒子１２では輝度自体が低いため、蛍光免疫染色とHE染色とを共に行うと、エオジンの蛍光より蛍光粒子１２の蛍光のほうが弱く、輝点が確認できず、蛍光免疫染色による定量性が低下する。

したがって、本発明の主な目的は、蛍光免疫染色と形態観察染色とを共に行う場合であっても、蛍光免疫染色による抗原の定量性を向上させることができる染色方法を提供することにある。

上記課題を解決するため本発明によれば、
蛍光色素を樹脂中に内包した蛍光粒子であって平均粒径の異なる２種以上の前記蛍光粒子を、標識剤として用いる病理切片の染色方法において、
前記病理切片を、平均粒径の大きい第１の蛍光粒子を用いて免疫染色する工程と、
前記病理切片を、平均粒径が前記第１の蛍光粒子より小さい第２の蛍光粒子を用いて免疫染色する工程と、
を有することを特徴とする染色方法が提供される。

本発明によれば、蛍光免疫染色と形態観察染色とを共に行う場合であっても、蛍光免疫染色による抗原の定量性を向上させることができる。

蛍光粒子の樹脂量と平均粒径との関係を概略的に示す図である。 エオジンの励起スペクトルと蛍光スペクトルとを概略的に示すスペクトル図である。 大径蛍光粒子と小径蛍光粒子とを用いた免疫染色時の粒子の挙動を概略的に示す模式図である。 本発明の実施例にかかる総タンパク量（抗原量）と輝点数との関係を示す図である。 従来技術の問題点を説明するための図である。

以下、図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態について説明する。

本発明の好ましい実施形態にかかる染色方法は、基本的には（１）病理切片を平均粒径の大きい蛍光粒子を用いて免疫染色する工程と、（２）病理切片を平均粒径の小さい蛍光粒子を用いて免疫染色する工程と、（３）形態観察のための染色試薬を用いて病理切片を形態観察染色する工程とを、有している。
特に（１）、（２）の病理切片を免疫染色する工程では、互いに平均粒径の異なる蛍光粒子を標識剤として使用するようになっている。そして蛍光染色後の病理切片に対しては、励起光を照射してこれら蛍光粒子を蛍光発光させ、その病理切片から生体物質（抗原）を検出するようになっている。

（１）の免疫染色する工程と（２）の免疫染色する工程とでは、（１）の免疫染色する工程の処理を先に実行し、その後に（２）の免疫染色する工程の処理を実行する。なお、蛍光粒子の輝点の観察については、HE染色条件で、平均粒径の大きい蛍光粒子の輝点数をカウントし、その後に励起波長を切り替えることで平均粒径の小さい蛍光粒子の輝点数をカウントする。
他方、（１）、（２）の免疫染色する工程と（３）の形態観察染色する工程とでは、好ましくは（１）、（２）の免疫染色する工程の処理を先に実行し、その後に（３）の形態観察染色する工程の処理を実行するのがよいが、その順序（先後）は入れ替わってもよい。

免疫染色やそこで使用する蛍光粒子の特性や種類、形態観察染色などの詳細は下記のとおりである。

［免疫染色］
（ｉ）染色方法
免疫染色では蛍光染色法が好適に用いられる。
蛍光染色法は抗原を蛍光粒子で染色する方法である。
染色の際には、蛍光粒子と１次抗体を直接結合した標識体を作製し、抗原を染色する方法（１次抗体法）、蛍光粒子と２次抗体を直接結合した標識体を作製し、抗原に１次抗体を結合したものを染色する方法（２次抗体法）、蛍光粒子とビオチンとを直接結合した標識体を作製し、抗原に１次抗体とアビジンで修飾した２次抗体とを結合したものを染色する方法（ビオチン−アビジン法、図５参照）などを用いることができる。
１次抗体は特に限定されず、免疫染色を行おうとする対象（抗原）によって変わる。たとえばHER2抗原の免疫染色を行う場合には、抗HER2抗体を用いる。
「抗原」は膜タンパク質や細胞質内のタンパク質などが好適な対象である。
２次抗体も特に限定されず、１次抗体によって変わる。たとえば抗マウス・ラビット・牛・ヤギ・羊・犬・チキンが挙げられる。
蛍光粒子と抗体やビオチンの結合は既存の如何なる方法を用いても構わない。たとえば、アミンとカルボン酸の反応によるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、エポキシとアミンの反応によるアミノ化などを用いることができる。

（ｉｉ）標識剤
免疫染色では、まず、標識剤として蛍光粒子を使用する。
本実施形態にかかる「蛍光粒子」とは、蛍光色素を樹脂中に内包した蛍光色素内包樹脂粒子である。

（ｉｉ−Ａ）構成材料
蛍光色素としては、たとえば、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、ローダミン系色素分子、オキサジン系色素分子、芳香環系色素分子、カルボピロニン系色素分子などを挙げることができる。
具体的には、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ，ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、１，３−Ｂｉｓ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］−２，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ， ｂｉｓ、１，３−Ｂｉｓ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］−２，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ， ｂｉｓ、２−（４−（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−（４−（ｄｉｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ−２，５−ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ−１−ｅｎｏｌａｔｅ、２−（４−（Ｄｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−（４−（ｄｉｂｕｔｙｌｉｍｉｎｉｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ−２，５−ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ−１−ｅｎｏｌａｔｅ、２−（８−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１，１，７，７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１，２，３，５，６，７−ｈｅｘａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｏ［３，２，１−ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ−９−ｙｌ）−４−（８−ｈｙｄｒｏｘｙ−１，１，７，７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２，３，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−１Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ［３，２，１−ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ−９（５Ｈ）−ｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ−１−ｅｎｏｌａｔｅ、１−Ｂｕｔｙｌ−２−［５−（１−ｂｕｔｙｌ−１，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２Ｈ−ｉｎｄｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ）−ｐｅｎｔａ−１，３−ｄｉｅｎｙｌ］−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３ｅｉｔｉ−ｉｎｄｏｌｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１−Ｂｕｔｙｌ−２−［５−（１−ｂｕｔｙｌ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｉｎｄｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｃｈｌｏｒｏ−ｐｅｎｔａ−１，３−ｄｉｅｎｙｌ］−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ−ｉｎｄｏｌｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３−Ｅｔｈｙｌ−２−［５−（３−ｅｔｈｙｌ−３Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ）−ｐｅｎｔａ−１，３−ｄｉｅｎｙｌ］−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−３−ｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ、N, N-Di-(2, 6-diisopropylphenyl)-1, 6, 7, 12-(4-tert.butyl-phenoxy)-perylen-3, 4, 9, 10-tetracarbonacid diimide、N,N-Bis(2,6-diisopropylphenyl)-1,6,7,12-tetraphenoxyperylene-3,4:9,10-tetracarboxdiimide、N,N'-Bis(2,6-diisopropylphenyl)perylene-3,4:9,10-bis(dicarbimide)、Benzenesulfonic acid, 4,4',4'',4'''-[[2,9-bis[2,6-bis(1-methylethyl)phenyl]-1,2,3,8,9,10-hexahydro-1,3,8,10-tetraoxoanthra[2,1,9-def:6,5,10-d'e'f']diisoquinoline-5,6,12,13-tetrayl]tetrakis(oxy)]tetrakis-、Benzeneethanaminium, 4,4',4'',4'''-[[2,9-bis[2,6-bis(1-
methylethyl)phenyl]-1,2,3,8,9,10-hexahydro-1,3,8,10-tetraoxoanthra[2,1,9-def:6,5,10-d'e'f']diisoquinoline-5,6,12,13-tetrayl]tetrakis(oxy)]tetrakis[N,N,N-trimethyl-、ROX (X-Rhodamine,Rhodamine Red X)、DY-590、5-ROX、Spectrum Red、PYRROMETHENE650、Texas Red、BODIPY TR、DyLight 594、AlexaFluor 594、HiLyte594、HiLyteFluor TR、Cresyl violet、ATTO590、MFP590、DY-610、ATTO610、DY-615、Oxazine170、ATTO620、C-Phycocyanin、AlexaFluor 633、Phycocyanin、ATTO633、DY-630、DY-632、DY-633、MFP631、DyLight633、NorthernLights637、DY-631、DY-634、Nile Blue、APC(Allophycocyanin)、APC-XL、EVOblue30、SRfluor 680-CarboxylateLD700 PERCHLORATE、ATTO 655などを挙げることができる。
これら蛍光色素は、単独で用いられてもよいし、複数種が混合され用いられてもよい。

内包用の樹脂としては、たとえば、ポリスチレン、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、ポリグリシジルメタクリレート、ポリメラミン、ポリウレア、ポリベンゾグアナミン、ポリフラン、ポリキシレン、フェノール樹脂などがあり、安定に蛍光色素を内包できるものが使用される。
蛍光色素の内包には、原料であるモノマーに蛍光色素の分子を結合させて粒子を合成する方法、樹脂に蛍光色素を吸着させて導入する方法など、樹脂中への蛍光色素の導入はいかなる方法を用いても構わない。

（ｉｉ−Ｂ）平均粒径などの特性
次に、免疫染色では、互いに平均粒径の異なる２種以上の蛍光粒子を用いる。「平均粒径」とは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数（本実施形態では１０００個）の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径の算術平均である。
これら蛍光粒子間では、いずれも蛍光色素内包樹脂粒子が使用され、蛍光色素は異なっていてもよいし同じでもよく、内包用の樹脂も異なっていてもよいし同じでもよい。

平均粒径の大きい蛍光粒子（大径蛍光粒子）としては、好ましくはペリレンジイミド（PI）をポリメラミン中に内包したPI色素内包ポリメラミン粒子や、PIをポリスチレン中に内包したPI色素内包ポリスチレン粒子が使用され、より好ましくはPI色素内包ポリメラミン粒子が使用される。HE染色時に必要な輝度の観点から、大径蛍光粒子の平均粒径は、好ましくは120-180nm（120nm以上で180nm以下）である。
平均粒径の小さい蛍光粒子（小径蛍光粒子）としては、好ましくはCy5をポリメラミン中に内包したCy5色素内包ポリメラミン粒子や、Cy5をポリスチレン中に内包したCy5色素内包ポリスチレン粒子が使用され、より好ましくはCy5色素内包ポリメラミン粒子が使用される。大径蛍光粒子の平均粒径との関係から、小径蛍光粒子の平均粒径（上限値）は、好ましくは80nm以下である。汎用顕微鏡において、HE染色時に輝点としてカウントできる必要があるという観点から、小径蛍光粒子の平均粒径（下限値）は、好ましくは20nm以上である。

平均粒径の異なる蛍光粒子の作製（粒径制御）にあたっては、合成時の内包用の樹脂量と蛍光色素量とを一定として、樹脂量を増減することにより、平均粒径の異なる蛍光粒子が合成可能である。たとえば、内包用の樹脂量と蛍光色素量との比を０．０４とした場合の蛍光粒子の平均粒径の分布例を、図１に示す。

（ｉｉ−Ｃ）励起・発光波長
HE染色に用いられるエオジンは顕微鏡観察条件によっては蛍光を放つ。エオジン吸収波長は多くの蛍光標識体の励起波長と重複するため、HE染色に用いたエオジンの発光が蛍光標識体の観察を妨害しうるという課題がある。
エオジンの蛍光スペクトル（励起波長520nm）と励起スペクトル（蛍光波長540nm）を、図２に示す。励起スペクトルより、エオジンは350nm未満の波長域および450nmを超えかつ550nm未満の波長域で効率よく励起されることがわかる。
従って、本実施形態にかかる蛍光粒子は、この波長域を回避した350〜450nmの波長域かまたは550nm以上の長波長域の光で励起される必要がある。
好ましくは、大径蛍光粒子の蛍光色素については580nm付近の波長の光で励起する蛍光色素を使用し、小径蛍光粒子の蛍光色素については600nm以上の波長の光で励起する蛍光色素を使用する。

［形態観察染色］
形態観察染色のうち、特に組織標本に関しては、標本の形態を観察するための形態観察染色として、ヘマトキシリンおよびエオジンの２つの色素を用いるHE染色が標準的に用いられているが、これに限定されるものではない。他の形態観察染色としては、例えば細胞診に用いられるパパニコロウ染色（Ｐａｐ染色）等がある。
また、HE染色では、Ｈ染色により細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色され、Ｅ染色により細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色されるが、これに限定されるものではない。ヘマトキシリン類縁体やヘマトキシリンと同様の吸収波長を持つ色素により細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色され、エオジン類縁体やエオジンと類似の吸収波長を持つ色素により細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色されてもよい。

以上の本実施形態によれば、大径蛍光粒子を用いて免疫染色した後に、小径蛍光粒子を用いて免疫染色するため、大径蛍光粒子の立体障害で染色できなかった部位の染色を行うことができる（図３参照）。かかる場合において、小径蛍光粒子の励起波長と発光波長が600nm以上であるため、輝点の輝度が低くても、エオジンの蛍光による影響を受けず、輝点（抗原）を認識することができる。
したがって、HE染色における視認性を維持したまま、抗原数が多く蛍光粒子の立体障害が問題となってくるような病理切片においても、より多くの抗原を認識可能となり、結果として蛍光免疫染色と形態観察染色とを共に行う場合であっても、蛍光免疫染色による抗原の定量性を向上させることができる。

（１）蛍光粒子／標識体サンプルの作製
蛍光粒子としてPI色素内包ポリメラミン粒子を、標識体としてストレプトアビジンが結合したPI色素内包ポリメラミン粒子を、下記のとおり作製した。
Ｎ,Ｎ’−Ｂｉｓ（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１,６,７,１２−ｔｅｔｒａｐｈｅｎｏｘｙｐｅｒｙｌｅｎｅ−３,４：９，１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｄｉｉｍｉｄｅを濃硫酸で処理し、ペリレンジイミドスルホン酸誘導体を作製した。これを酸クロリドに変換してペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体とした。
ペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体１４．４ｍｇを水２２．５ｍＬに加えた後、ホットスターラ―上で７０℃２０分間加熱し、メラミン樹脂ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）０．６５ｇ（粒径１５０ｎｍ）を加え、さらに５分間加熱撹拌した。ギ酸１００μＬを加え、６０℃２０分間で加熱攪拌した後、室温放冷した。冷却後、反応混合物を遠心用チューブに入れて遠心分離機に１２，０００ｒｐｍで２０分間かけ、上澄み除去した。この洗浄をエタノールと水で行なった。
得られた粒子０．１ｍｇをＥｔＯＨ（エタノール）１．５ｍＬ中に分散し、アミンプロピルトリメトキシシランＬＳ−３１５０（信越化学工業社製）２μＬを加えて８時間反応させて表面アミノ化処理を行なった。
得られた色素内包ナノ粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基が付いた蛍光色素内包樹脂粒子（蛍光粒子）を得た。
一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光色素内包樹脂粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
上記の蛍光色素内包樹脂粒子とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合ＰＩ色素内包ポリメラミン粒子Ａ（標識体）を得た。
このような製造方法において、PI量とポリメラミン量とを一定としてポリメラミン量を増減させ、ストレプトアビジン結合PI色素内包ポリメラミン粒子のサンプルＢ〜Ｈを作製した（表１参照）。

（２）染色方法
病理切片として、あらかじめELISAで総タンパク量を測定している培養細胞を使用した。抗原はHER2を用いた。
その後、上記病理切片を、サンプルＡ〜Ｈを用いて免疫染色し、その後形態観察染色（Ｈ染色およびHE染色）を実施した。免疫染色と形態観察染色は下記のとおりに実施した。
培養細胞を脱パラフィン処理した後、水に置換する洗浄を行った。洗浄した培養細胞スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１２１℃、５分間オートクレーブ処理することで、抗原の不活性化処理を行った。
不活性化処理後の培養細胞スライドを、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄した後、湿潤箱中で１時間１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液を用いてブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）（ベンタナ社製）を組織切片と２時間反応させた。これをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で２μｇ／ｍＬに希釈した４Ｂ５に結合するビオチン標識抗ウサギモノクロナール抗体と３０分反応させた。この反応後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．２ｎＭに希釈した前述の蛍光色素内包樹脂粒子を組織切片と、中性のｐＨ環境（ｐＨ６．９〜７．４）、室温の条件下で３時間反応させた。小径粒子を反応させる際には、上記反応後、培養細胞スライドをＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．２ｎＭに希釈した小径粒子を用いて湿潤箱中で反応される。その後、培養細胞スライドを、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。
免疫染色後、形態観察染色（Ｈ染色およびHE染色）を行った。免疫染色した培養細胞スライドをマイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行った（Ｈ染色）。その後、該切片を４５℃の流水で３分間洗浄した。次に、１％エオジン液で５分間染色してエオジン染色を行った（HE染色）。
Ｈ染色後またはHE染色後、純エタノールに５分間漬ける操作４回行い、洗浄・脱水を行った。続いてキシレンに５分間漬ける操作を４回行い、透徹を行った。最後に、封入剤（「エンテランニュー」、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて組織切片を封入して観察用のサンプルスライドとした。

（３）輝点数のカウント
Ｈ染色後の輝点数とHE染色後の輝点数とを下記のとおりにカウントした。
免疫染色および形態観察染色した組織切片に対して所定の励起光を照射して蛍光を発光させた。その状態の組織切片を蛍光顕微鏡（ＢＸ−５３，オリンパス社製）により観察および撮像を行った。また、輝点計測は、ＩｍａｇｅＪ ＦｉｎｄＭａｘｉｍａ法により計測した（露光時間４００ｍ秒でＮｏｉｓｅＴｏｌｅｒａｎｃｅは６０）。上記励起光は、光学フィルターに通すことで、PI色素内包ポリメラミン粒子に対して５７５〜６００ｎｍに設定した。また、観察する蛍光の波長（ｎｍ）の範囲についても、光学フィルターに通すことで、６１２〜６８２ｎｍに設定した。顕微鏡観察、画像取得時の励起波長条件は視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ^２となるようにした。画像取得時の露光時間は画像の輝度が飽和しないように任意に設定（例えば４００ｍ秒に設定）して撮像した。
Ｈ染色後の輝点数とHE染色後の輝点数とをカウントした結果を表１に示す。

（４）まとめ
表１に示すとおり、Ｈ染色時の輝点数に着目して、サンプルＡからサンプルＨにかけて順に確認すると、サンプルＦからサンプルＧにかけて当該輝点数が著しく減少している。この結果から、小径蛍光粒子を用いた抗原の定量化にあたり、蛍光粒子の平均粒径（下限値）は好ましくは20nm以上であると判断される。
他方、Ｈ染色時の輝点数とHE染色時の輝点数とに着目して、サンプルＡからサンプルＨにかけてサンプルごとにこれら輝点数の差を確認すると、サンプルＤにおいて輝点数の差が著しく大きくなっている。この結果から、小径蛍光粒子を用いた抗原の定量化にあたり、蛍光粒子の平均粒径（上限値）は好ましくは80nm以下であると判断される。

（１）蛍光粒子／標識体サンプルの作製
表２〜表５に示すとおり、大径蛍光粒子または小径蛍光粒子を含むストレプトアビジン結合蛍光色素内包樹脂粒子のサンプルを作製した。
サンプル１−１、２−１、３−１、４−１では、標識体として市販（インヴィトロジェン社製）のストレプトアビジン結合Ｑｄｏｔ６５５を用いた。
サンプル１−２〜１−１１、２−２〜２−１１、３−２〜３−１１、４−２〜４−１１では、［実施例１］と同様にして標識体を作製した。なお、免疫染色において１番目に使用する標識体として［実施例１］と同様にPIを使用しサンプル作製し、２番目に使用する標識体としてPIを単にCy5に変更しサンプル作製した（平均粒径はCy5量とポリメラミン量とを一定としてポリメラミン量を増減させ制御した。）。

サンプル１−１２〜１−１４、２−１２〜２−１４、３−１２〜３−１４、４−１２〜４−１４では、下記のとおり、蛍光粒子としてPI色素内包ポリスチレン粒子を、標識体としてストレプトアビジンが結合したPI色素内包ポリスチレン粒子を、それぞれ作製した。
ＰＩ色素内包ポリスチレン粒子はソープフリー乳化重合法により作製した。［実施例１］のＰＩ蛍光色素を４−アミノスチレン（東京化成工業社製）と室温条件で１時間混合し、色素結合スチレンを作製した。アルゴンバブリングした純水中５ｍＬにグリシジルメタクリレート(東京化成工業社製)０．１８ｇとスチレン（和光純薬社製）０．０５ｇ、ジビニルベンゼン０．０５ｇ、上記色素結合スチレン０．００５ｇを加えた。撹拌しながら７０℃に昇温し、水溶性アゾ重合開始剤であるＶ−５０（和光純薬社性）を０．０１２ｇ加え、１２時間反応した。反応液を１００００Ｇで２０分遠心分離し、粒子を回収した。回収した粒子を純水に分散し再度遠心分離で回収する事で精製を行なった。得られた粒子を過剰のアンモニア水に加え、粒子末端のエポキシ基をアミノ基へと変換し、末端にアミノ基を持つ色素内包ポリスチレンナノ粒子を得た。
得られた色素内包ナノ粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基が付いた蛍光色素内包樹脂粒子（蛍光粒子）を得た。
一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光色素内包樹脂粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
上記の蛍光色素内包樹脂粒子とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合ＰＩ色素内包ポリスチレン粒子（標識体）を得た。
なお、サンプル１−１２〜１−１４、２−１２〜２−１４、３−１２〜３−１４、４−１２〜４−１４でも、免疫染色において２番目に使用する標識体としてPIを単にCy5に変更しサンプル作製した（平均粒径はCy5量とポリスチレン量とを一定としてポリスチレン量を増減させ制御した。）。

（２）染色方法と輝点数のカウント
［実施例１］と同様にして、免疫染色と形態観察染色とを実施し、Ｈ染色後の輝点数とHE染色後の輝点数とをカウントした。
なお、免疫染色にあたっては、大径蛍光粒子（PI色素内包樹脂粒子）を反応させた後に、PBSで３回洗浄し、小径蛍光粒子（Cy5色素内包樹脂粒子）を反応させた。輝点数のカウントにあたっては、励起光は、光学フィルターに通すことで、ＰＩ、Ｃｙ５色素内包樹脂粒子それぞれに対して５７５〜６００ｎｍ、６３５〜６５０ｎｍに設定し、観察する蛍光の波長（ｎｍ）の範囲についても、光学フィルターに通すことで、それぞれ６１２〜６８２ｎｍ、６５０〜７００ｎｍに設定した。
Ｈ染色後の輝点数とHE染色後の輝点数とをカウントした結果を表２〜表５に示す。

表２はELISA測定による総HER2タンパク量が36.1μg/mlの結果を、表３はELISA測定による総HER2タンパク量が78.0μg/mlの結果を、表４はELISA測定による総HER2タンパク量が150.8μg/mlの結果を、表５はELISA測定による総HER2タンパク量が701.8μg/mlの結果を、それぞれ示す。

表２〜表５、図４に示すとおり、サンプル１−１、２−１、３−１、４−１では、小径の標識剤（Qdot655）のみで免疫染色しており、Ｈ染色時の輝点数は抗原の定量化にあたりより正確な値であると考えられるが、輝点そのものの輝度が低いため、HE染色時においてはエオジンの蛍光の影響を受け輝点数が激減している。
なお、表２〜表５では、サンプル１−１、２−１、３−１、４−１におけるＨ染色時の輝点数が、抗原の定量化にあたりより正確な値であって理想的な値をとり、合計輝点数がこの値に近いほど、抗原の定量化が向上していると判断することができる。
サンプル１−２、２−２、３−２、４−２では、先に小径蛍光粒子で免疫染色しその後に大径蛍光粒子で免疫染色しており、HE染色時において小径蛍光粒子による輝点数が少なく、抗原の定量化が向上しているとはいえない。

これに対し、サンプル１−３〜１−１１、２−３〜２−１１、３−３〜３−１１、４−３〜４−１１では、先に大径蛍光粒子で免疫染色しその後に小径蛍光粒子で免疫染色しており、HE染色時において小径蛍光粒子による輝点数が多く、抗原の定量化が向上しているといえる。
このような結果から、蛍光染色と形態観察染色とを共に行う場合、蛍光染色による抗原の定量性を向上させるには、先に大径蛍光粒子で免疫染色しその後に小径蛍光粒子で免疫染色することが有用であることがわかる。
さらに、サンプル１−６〜１−８、２−６〜２−８、３−６〜３−８、４−６〜４−８と、サンプル１−１２〜１−１４、２−１２〜２−１４、３−１２〜３−１４、４−１２〜４−１４との比較から、前者のサンプル群のほうがHE染色時における小径蛍光粒子による輝点数が多く、蛍光粒子の内包用の樹脂としては、ポリスチレンよりもポリメラミンのほうが好適であることがわかる。

１０ 標識体
１２ 蛍光粒子
１４ ビオチン
２０ 抗原
３０ １次抗体
４０ ２次抗体
４２ アビジン

Claims (5)

1. 蛍光色素を樹脂中に内包した蛍光粒子であって平均粒径の異なる２種以上の前記蛍光粒子を、標識剤として用いる病理切片の染色方法において、
   前記病理切片を、平均粒径の大きい第１の蛍光粒子を用いて免疫染色する工程と、
   前記病理切片を、平均粒径が前記第１の蛍光粒子より小さい第２の蛍光粒子を用いて免疫染色する工程と、
   を有することを特徴とする染色方法。
2. 請求項１に記載の染色方法において、
   前記第１の蛍光粒子と前記第２の蛍光粒子とで平均粒径の差が４０ｎｍ以上であることを特徴とする染色方法。
3. 請求項１または２に記載の染色方法において、
   前記第１の蛍光粒子の平均粒径が１２０〜２００ｎｍであることを特徴とする染色方法。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の染色方法において、
   前記第１の蛍光粒子の平均粒径が１２０〜２００ｎｍであり、
   前記第２の蛍光粒子の平均粒径が２０〜８０ｎｍであることを特徴とする染色方法。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の染色方法において、
   前記病理切片を、ヘマトキシリン・エオジン染色する工程をさらに有し、
   前記第１の蛍光粒子として５８０ｎｍ付近の波長の光で励起する蛍光粒子を使用し、前記第２の蛍光粒子として６００ｎｍ以上の波長の光で励起する蛍光粒子を使用することを特徴とする染色方法。

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