TWI539149B - An immunochromatographic method, a detection device and a reagent for use in the method - Google Patents

An immunochromatographic method, a detection device and a reagent for use in the method Download PDF

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Michio Ohkubo
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Description

免疫層析法、使用於該方法之檢測裝置及試劑
本發明係關於一種免疫層析法、使用於該方法之檢測裝置及試劑。
免疫層析法係使用奈米粒子之診斷方法。該方法因操作簡便，至判定為止所需之時間為5~30分鐘左右之相對較短時間，且無需昂貴之裝置，故而作為優異之簡易診斷方法多用於臨床現場。例如於流行性感冒病毒之感染判定中，可將自患者採取之咽喉擦拭液或鼻腔擦拭液作為檢體，當場在短時間內進行判定，其作為感染之簡易判定方法之有力工具而得以普及。
於免疫層析法中通常使用金膠體或著色乳膠粒子等著色粒子作為標記粒子。根據檢體之狀態或量、或所測定之內容，使用此種著色粒子之免疫層析法中存在其感度不足之情形。視情形可能會判定為偽陰性、偽陽性，若發生此種情況則亦很有可能會成為誤診等之原因。為了解決該等課題，業界正進行針對免疫層析法之高感度化之嘗試。
作為免疫層析法之高感度化之方法，本申請人目前為止已提出使用螢光粒子之螢光免疫層析法、或將其與吸光粒子組合而成者(參照下述專利文獻1~3)。根據此處所提出之技術，以目視則可檢測出自試驗區域發出之螢光，但考慮到更高之精度或定量測定之方便等，亦可使用受光 裝置進行檢測。作為可應用於該測定之高感度之檢測裝置，本申請人之前提出下述專利文獻4的利用特有之透鏡系統之技術。
[專利文獻1]國際公開第2008/018566號說明書
[專利文獻2]國際公開第2007/097377號說明書
[專利文獻3]日本特開2010-14631號公報
[專利文獻4]日本特開2010-197248號公報
此外，本申請人進而推進利用組合螢光粒子與吸光粒子之試劑，分別捕捉不同之標的物質並進行檢測的多項目檢測用免疫層析法之技術開發(上述專利文獻3係揭示使用螢光粒子與吸光粒子，但為捕捉相同之標的物質之單項目檢測技術)。藉此，例如可於診療現場一次診斷複數種疾病或感染項目等，可大幅改善利用免疫層析法之檢查效率。目前為止，尚未完成將螢光與吸光加以組合之此種設想下的技術開發，關於其檢測方法或裝置之研究亦為未著手之狀況。
鑒於以上之狀況，本發明之目的在於提供一種可於組合利用分別捕捉不同之標的物質之螢光粒子與吸光粒子之免疫層析法中，一次檢測測定該螢光與吸光的檢測方法及檢測裝置。
本發明之上述課題可藉由下述手段而解決。
[1]一種免疫層析法，係於具有螢光粒子及吸光粒子作為標記粒子之試片，賦予有時含有標的物質A及B之檢體液而使上述螢光粒子與吸光粒子流動，並利用檢測裝置一次分別檢測測定由於上述試片之試驗區域所捕捉 之螢光粒子及吸光粒子所發出之螢光及吸光的多項目檢測用免疫層析法，其特徵在於：上述檢測裝置具有檢測螢光及吸光之檢測部及進行其控制之控制部，另一方面，對於上述螢光粒子及吸光粒子，將該螢光粒子之螢光之激發波長(λ1)與吸光粒子之吸收波長(λ2)設為同一波長區域，且將上述螢光粒子所捕捉並檢測之標的物質A與上述吸光粒子所捕捉並檢測之標的物質B設為不同者，於上述試片，將捕捉上述螢光粒子之試驗區域nt1與捕捉上述吸光粒子之試驗區域nt2設為不同之位置，上述檢測裝置之控制手段自此處發出指令，於經由上述檢測部而掃描上述試片時，一次檢測測定上述試驗區域nt1之反射光強度、試驗區域nt2之反射光強度、及試驗區域nt1及試驗區域nt2以外之非試驗區域之反射光強度。
[2]如[1]之免疫層析法，其中上述檢測裝置具有讀取解析手段，該讀取解析手段係根據以下情況進行標的物質之檢測：捕捉上述螢光粒子之試驗區域nt1之反射光強度大於非試驗區域之反射光強度，另一方面，捕捉上述吸光粒子之試驗區域nt2之反射光強度小於上述非試驗區域之反射光強度。
[3]如[1]或[2]之免疫層析法，其中上述吸光粒子為金膠體粒子、著色二氧化矽粒子、或著色乳膠粒子。
[4]如[1]至[3]中任一項之免疫層析法，其中上述螢光激發波長(λ1)及吸光吸收波長(λ2)在波長300~800nm之範圍。
[5]如[1]至[4]中任一項之免疫層析法，其中上述試驗區域nt1與上述試驗區域nt2之間隔為1~10mm之範圍。
[6]如[1]至[5]中任一項之免疫層析法，其中根據屬於上述螢光激發波長之峰及/或屬於吸光吸收波長之峰之面積而將標的物質之量加以定量。
[7]如[1]至[6]中任一項之免疫層析法，其中藉由設置於上述檢測部之1個受光器，一併檢測捕捉上述螢光粒子之試驗區域nt1之反射光強度、捕捉上述吸光粒子之試驗區域nt2之反射光強度、及上述非試驗區域之反射光強度。
[8]如[1]至[7]中任一項之免疫層析法，其中對於有時含有標的物質A及標的物質B之檢體，根據上述試驗區域nt1之反射光強度大於上述非試驗區域之反射光強度而判定標的物質A之存在，根據上述試驗區域nt2之反射光強度小於上述非試驗區域之反射光強度而判定標的物質B之存在，根據上述試驗區域nt1之反射光強度、上述試驗區域nt2之反射光強度、非試驗區域之反射光強度為相同程度之值而判定兩者不存在，根據上述試驗區域nt1之反射光強度大於上述非試驗區域之反射光強度且上述試驗區域nt2之反射光強度小於上述非試驗區域之反射光強度而判定兩者之存在。
[9]一種檢測裝置，其係進行多項目檢測用免疫層析法之檢測裝置，該多項目檢測用免疫層析法係使用具有螢光粒子及吸光粒子作為標記粒子之試片，藉由賦予有時含有標的物質A及B之檢體液而使上述螢光粒子與吸光粒子流動，並於上述試片一次檢測測定捕捉螢光粒子之試驗區域nt1之反射光強度、捕捉吸光粒子之試驗區域nt2之反射光強度、及試驗區域nt1及試驗區域nt2以外之非試驗區域之反射光強度，上述檢測裝置具有檢測螢光及吸光之檢測部及進行其控制之控制部，上述檢測裝置之控制手段自此處發出指令，於經由上述檢測部而掃描上述試片時，於滿足下述(i)~(iii)之條件下，一次檢測測定上述試驗區域nt1之反射光強度、上述試驗區域nt2之反射光強度、及上述非試驗區域之反射光強度。
(i)上述螢光粒子之螢光激發波長與上述吸光粒子之吸收波長為同一波長區域。
(ii)上述標的物質A與上述標的物質B不同。
(iii)上述試驗區域nt1與上述試驗區域nt2位於不同之位置。
[10]如[9]之檢測裝置，其進而具有讀取解析手段，該讀取解析手段根據上述試驗區域nt1之反射光強度大於上述非試驗區域之反射光強度而判定標的物質A之存在，根據上述試驗區域nt2之反射光強度小於上述非試驗區域之反射光強度而判定標的物質B之存在，根據上述試驗區域nt1之反射光強度、上述試驗區域nt2之反射光強度、非試驗區域之反射光強度為相同程度之值而判定兩者之不存在，根據上述試驗區域nt1之反射光強度大於上述非試驗區域之反射光強度且上述試驗區域nt2之反射光強度小於上述非試驗區域之反射光強度而判定兩者之存在。
[11]如[9]或[10]之檢測裝置，其中編入上述檢測裝置之檢測部中之受光器的受光感度於檢測上述吸光及螢光之波長區域中具有受光區域。
[12]一種免疫層析法用試劑，其係用於[1]至[8]中任一項之免疫層析法之試劑，且包含螢光粒子與吸光粒子而成，於上述螢光粒子中導入有捕捉標的物質A之結合性物質，於上述吸光粒子中導入有捕捉與標的物質A不同之標的物質B之結合性物質。
於本說明書中，所謂「一次」檢測測定，係指無需切換為其他裝置，利用單一之裝置則可檢測或測定複數個項目。雖然可不同時，但較佳為於同時間(較佳為30秒以內，更佳為10秒以內)進行檢測測定。典型意指可藉由利用檢測部之一次掃描而進行檢測及測定。
根據本發明之免疫層析法及其檢測裝置，可於組合利用分別捕捉不同之標的物質之螢光粒子與吸光粒子之免疫層析法中，一次檢測測定該螢光與吸光。又，藉由上述經一次之螢光與吸光的檢測測定，可有效率地進行複數種標的物質之檢測等，可大幅改善用於診斷及治療等之免疫 層析試驗之效率。進而，由於本發明之檢測裝置可利用1個檢測部一次進行螢光及吸光之檢測，故而有助於免疫層析法之省空間化及裝置成本之降低。
又，於本發明之免疫層析法中，作為成為其試劑之粒子(尤其是螢光粒子)，可列舉二氧化矽粒子或乳膠粒子，與乳膠粒子相比，二氧化矽為透光性高之材質，因此光源可有效率地浸入及透過至內部，於螢光粒子之情形時，可有效率地激發二氧化矽粒子中所包含之色素，於吸光粒子之情形時，二氧化矽粒子中所包含之色素可有效率地吸收光源，而發揮更加優異之效果。
本發明之上述及其他特徵及優勢可由下述記載及隨附之圖式而更明確。
1‧‧‧標的物質(被檢物質)
1A‧‧‧第1標的物質
1B‧‧‧第2標的物質
2‧‧‧螢光標記物
2a‧‧‧螢光微粒子
2b‧‧‧結合性物質
3‧‧‧吸光標記物
3a‧‧‧吸光微粒子
3b‧‧‧結合性物質
4、5‧‧‧試驗用捕捉性物質
6‧‧‧殼體
61‧‧‧檢測開口部
62‧‧‧檢體導入開口部
6a‧‧‧殼體上部
6b‧‧‧殼體下部
8a‧‧‧樣品墊
8b‧‧‧結合墊
8c‧‧‧膜片
8d‧‧‧吸收墊
8e‧‧‧墊片
7‧‧‧參照用捕捉性物質
10‧‧‧試片(試驗帶)
100‧‧‧長條試驗體
nt1‧‧‧第1試驗區域(測試線)
nt2‧‧‧第2試驗區域(測試線)
nr‧‧‧參照區域(參考線)
L‧‧‧側向流動方向
S‧‧‧檢體液
20‧‧‧檢測部
21‧‧‧檢測單元本體
21a‧‧‧樣品導入部
21b‧‧‧樣品導板
23‧‧‧配線
25‧‧‧個人電腦(控制部)
27‧‧‧受光器
28‧‧‧受光透鏡
29‧‧‧光照射器
圖1係示意性地表示本發明中較佳地使用之長條試驗體的分解立體圖。
圖2係本發明中較佳地使用之免疫層析試片之說明圖，(a)為俯視圖，(b)為展開剖面圖。
圖3係表示本發明之較佳之實施形態中之試劑粒子之捕捉形態的說明圖。
圖4係示意性地表示本發明之較佳實施形態之混合檢測裝置之例的立體圖。
圖5係示意性地表示利用本發明之免疫層析法檢測出之螢光峰及吸光峰與試片試驗區域之關係的說明圖。
圖6係表示A型流行性感冒核蛋白之濃度與I1-Ic之關聯的圖表。
圖7係表示B型流行性感冒核蛋白之濃度與Ic-I2之關聯的圖表。
本發明之免疫層析法之特徵在於使用特定之檢測裝置(以下有時將其稱為「混合檢測裝置」)一次檢測螢光與吸光。以下，對於該方面以較佳之實施形態為中心進行詳細說明。
[試片]
首先，根據本發明之較佳之實施形態之試片之基本構成進行說明。本實施形態之免疫層析法用試片(試驗帶)係下述構件以相互發生毛細管現象之方式串列連接。
‧試樣添加用構件(樣品墊)8a
‧含浸螢光二氧化矽粒子(螢光標記物)2及金膠體粒子(吸光標記物)3並進行乾燥而獲得之構件(結合(conjugate)墊)8b
‧具有試驗區域及參照區域之膜片(抗體固定化膜片)8c
‧吸收墊8d
於本實施形態中，構成試片之構件並無特別限制，只要具有膜片，則其他可省略上述例示之構件之一部分，或者組合使用除此以外之構件。例如除上述構件以外，亦可應用覆蓋表面之透明膜，或於各構件之間賦予功能性片材。反之，於將檢體液與標記試劑奈米粒子之混合液加以混合而滴加至樣品墊之方法中，可省略結合墊。
於本實施形態中，如圖1及圖2所示，上述平面試片10係由殼體上部6a與殼體下部6b所夾持內包，以構成長條試驗體100。於殼體上部6a設置有檢測開口部61與檢體導入開口部62。可經由該檢測開口部61，將照射光送至內部之膜片10，而檢測並觀測此處所發出之反射光強度。另一方面，可經由檢體導入開口部62將檢體液S供給至膜片10而進行測定試驗。再者，於本說明書中，將自螢光粒子發出之螢光、被吸光粒子吸 收之吸光、及試驗區域以外之部分(非試驗區域)中之針對上述照射光之反射光總稱為「反射光」。因此，將來自捕捉螢光粒子之試驗區域nt1之螢光強度稱為「試驗區域nt1之反射光強度(I1)」，將捕捉吸光粒子之試驗區域nt2中之吸光強度稱為「試驗區域nt2之反射光強度(I2)」，將上述非試驗區域中之反射光強度稱為「非試驗區域之反射光強度(Ic)」。
於本實施形態中，在上述試片10之中央於膜片8c上設置有2個試驗區域(第1試驗區域nt1及第2試驗區域nt2)。於該第1試驗區域nt1中，配置捕捉標的物質(被檢物質)1A之生物分子4並將其固定化。即，於第1試驗區域中捕捉含螢光粒子之標記物2。另一方面，於第2試驗區域中配置捕捉標的物質(被檢物質)1B之生物分子5，於此處捕捉吸光標記物3。藉此，可區別檢測2種標的物質，即標的物質A(1A)與標的物質B(1B)。即，於賦予檢體液s時，其中所含有之標的物質1(標的物質A(1A)與標的物質B(1B))會與螢光標記物2及吸光標記物3一同向流動方向L而流動於膜片內。並且，捕捉標的物質A(1A)之螢光標記物2於第1試驗區域nt1中被捕捉，成為可於此處判別其存在之狀態。進而，向流動方向L流動之標的物質B(1B)被吸光標記物3捕捉，成為藉由在第2試驗區域nt2捕捉其而被檢測其存在之狀態。
總結上述捕捉形態，於本實施形態中，對於含有標的物質A及標的物質B之檢體試樣，根據捕捉螢光粒子之試驗區域nt1之反射光強度(I1)大於試驗區域nt1及試驗區域nt2以外之非試驗區域nc(參照圖2)之反射光強度(Ic)(I1>Ic)而進行判定。又，根據捕捉吸光粒子之試驗區域nt2之反射光強度(I2)小於非試驗區域nc之反射光強度(Ic)(I2<Ic)而判定標的物質B之存在。兩者之不存在係根據捕捉螢光粒子之試驗區域nt1之反射光強度(I1)、捕捉吸光粒子之試驗區域nt2之反射光強度(I2)、非試驗區域之反射光強度(Ic)為相同程度之值而判定。兩者之存在可根據捕捉螢光粒 子之試驗區域nt1之反射光強度(I1)大於非試驗區域之反射光強度(Ic)且捕捉吸光粒子之試驗區域nt2之反射光強度(I2)小於非試驗區域之反射光強度(Ic)而判定。藉此，可利用一次掃描進行有時含有2種標的物質之試樣之檢測測定。再者，所謂上述反射光強度為相同程度，係視需要將非試驗區域之反射光強度(Ic)(a.u.)作為基礎，將Ic之±10%以內者稱為「相同程度」，更嚴格而言係指±5%以內者。再者，反射光強度本來會因測定裝置或條件而改變，但藉由如上所述般利用相對值(比率)進行評價來加以歸納。於嚴格地定義測定條件時，只要未特別說明，則設為利用下述實施例中進行測定之條件者。
參照圖2(a)及(b)，對本實施形態之免疫層析法用試驗帶進一步進行說明，但本發明並不受該等說明限制。再者，於圖2中，未省略墊片8e地進行表示。圖2(a)表示本發明之免疫層析法用試驗帶(試片)10之較佳實施形態之俯視圖，圖2(b)係表示圖2(a)所示之免疫層析法用試驗帶之展開縱截面圖之圖。如上所述，本實施形態之免疫層析法用試驗帶10係具備樣品墊8a、結合墊8b、膜片8c、吸收墊8d而成。進而，上述各構成構件係利用附有黏著劑之墊片8e來進行打底。
於圖1及圖2中，表示依序配置有第1試驗區域nt1、第2試驗區域nt2、參照區域nr之例。又，於本實施形態中，非試驗區域nc定義為於膜片8c之表面除第1試驗區域nt1、第2試驗區域nt2、及參照區域nr以外之部分。然而，本發明並不限定於此，例如可將試驗區域之順序顛倒，或者亦可將參照區域之配置部位設為其他部分。又，亦可設為不設置參照區域nr之構成。
第1試驗區域nt1與第2試驗區域nt2之間隔d(圖2)並無特別限定，就避免由螢光與吸光之重複所導致之光強度相抵之觀點來看較佳為2mm~8mm，更佳為3mm~5mm。
[標的物質]
於本發明中，作為檢測、定量之對象之標的物質1，可列舉抗原、抗體、DNA、RNA、糖、糖鏈、配位子、受體、肽、化學物質等。於本發明中，作為含有標的物質1之試樣並無特別限制，可列舉尿、血液等液體試樣。此處，若表示本發明之重要之特徵之一，則為該標的物質由於螢光檢測出者(標的物質1A)及吸光檢測出者(標的物質1B)不同。就該方面而言，本發明之基本構想與利用螢光與吸光兩者檢測相同之標的物質之上述專利文獻3之技術不同。
於本發明之免疫層析法中，可進行標的物質A與標的物質B不同之2種以上之標的物質之檢測。其中，亦可為了確認標的物質A或B之不存在(陰性)而進行檢查。因此，於檢體液中，可含有標的物質A及B，可僅含有標的物質A或B，亦可不含有標的物質A及B中之任一者。
[樣品墊]
樣品墊8a係滴加含有標的物質之樣品之構成構件。其材料或尺寸等並無特別限定，可利用應用於此種製品之通常者。
[結合墊]
結合墊8b係含浸有螢光二氧化矽粒子等螢光標記物2及金膠體粒子等吸光標記物3之構成構件。並且，藉由毛細管現象自樣品墊8a來移動之試樣中所含有之標的物質由於抗原抗體反應等特異性分子識別反應而被上述螢光二氧化矽粒子(標記物)捕捉並加以標記的部分。結合墊8b之每單位面積(cm2)之螢光標記物之含量並無特別限制，較佳為1μg~100μg。吸光標記物亦同樣，較佳為1μg~100μg。作為含浸方法，可列舉塗佈、滴加或噴霧標記物之分散液後進行乾燥之方法等。
[膜片]
於將抗體固定化之膜片8c上之抗體固定化部，設置用以判定標的物質 之有無，即判定陽性陰性之測試線(第1試驗區域nt1及第2試驗區域nt2)。於該測試線nt1、nt2上，分別將標的物質捕捉用抗體(試驗用捕捉性物質)4及5固定化。進而，於膜片8c中包含將用以捕捉螢光二氧化矽粒子之抗體(參照用捕捉性物質)7固定化之控制線(參照區域)nr。於該試驗區域nt1、nt2例如藉由如上述之組合，而進行由固定化抗體(試驗用捕捉性物質)-標的物質-標記物所構成之夾層型免疫複合體形成反應(參照圖3)。作為上述膜片上之判定部(試驗區域、參照區域)之形狀，只要可局部地將固定化抗體加以固定化，則無特別限制，可列舉線狀、圓狀、帶狀等，較佳為線狀，更佳為寬度為0.5~1.5mm之線狀。
可通過上述夾層型免疫複合體形成反應，捕捉經標記之標的物質，並根據標記之程度而判定標的物質之有無(陽性陰性)。此時，可於上述試驗區域將螢光二氧化矽粒子等螢光標記物及金膠體粒子等吸光標記物濃縮，使其附近進行螢光發光或吸光著色，並使用檢測器進行檢測及判定。
此處，將本發明之免疫層析法中之標的物質、捕捉性物質、粒子之種類等之組合之代表例預先列舉於表1。本發明並不受該例限定而解釋。表中之( )內之編號與圖式中之符號對應(尤其參照圖3)。
於本發明中，如此設為可利用同一波長區域之螢光及吸光來檢測複數種標的物質之試劑成分之組合，因此利用單一之檢測部(受光器)則能以較高感度檢測出標的物質之有無或量。結果其優勢在於可使裝置之構造或測定操作等簡單化。
抗體固定化膜片上之判定部較佳為預先設置在如下位置：自與上述結合墊之連接端及與上述吸收墊之連接端分隔某種程度之位置(例如上述膜片之中間等)。藉此，可充分地完成上述夾層型免疫複合體形成反應。或者，由於可避免由液體試樣中之著色或螢光物質等之標記產生之對測定的影響或由未與標的物質結合之標記物產生之對測定的影響，故而較佳。
上述抗體固定化部(試驗區域)nt1、nt2中之抗體固定化量並無特別限制，於形狀為線狀之情形時，較佳為每單位長度(cm)0.5μg~5μg。作為固定化方法，可列舉塗佈、滴加或噴霧抗體溶液後進行乾燥，藉由物理吸附而將其固定化之方法等。於上述抗體固定化後，為了防止由非特異性吸附產生之對測定之影響，較佳為對上述抗體固定化膜片整體實施所謂阻斷處理。例如可列舉於含有白蛋白、酪蛋白、聚乙烯醇等阻斷劑之緩衝液中浸漬適當之時間後進行乾燥之方法等。作為市售之上述阻斷劑，例如可列舉脫脂乳(DIFCO公司製造)、4%Block Ace(明治乳業公司製造)等。
如上所述，於膜片8c上進而設置有參照區域nr。於此處會捕捉在試驗區域未被捕捉之標記物。藉此，與試驗區域中之螢光相對比，可鑑定標的物質之有無或量。為了發揮該功能，對於參照用捕捉性物質7，選擇與試驗用結合性物質2b或3b具有結合性者。又，參照區域亦可設置2個，於此情形時，一參照用捕捉性物質係選擇與試驗用結合性物質2b具有結合性者，另一參照用捕捉性物質係選擇與試驗用結合性物質3b具有結合 性者。
[吸收墊]
吸收墊8d係用以吸引藉由毛細管現象沿膜片來移動之標的物質1A、1B及標記物2、3之混合物，而使系統內產生一定流動之構成構件。
作為該等各構成構件之材料並無特別限制，可使用用於免疫層析法用試驗帶之構件。作為樣品墊及結合墊，較佳為Glass Fiber Conjugate Pad(商品名，MILLIPORE公司製造)等玻璃纖維墊。作為膜片，較佳為Hi-Flow Plus120 Membrane(商品名，MILLIPORE公司製造)等硝化纖維素膜片。作為吸收墊，較佳為Cellulose Fiber Sample Pad(商品名，MILLIPORE公司製造)等纖維素膜片。作為上述附有黏著劑之墊片，可列舉AR9020(商品名，Adhesives Research公司製造)等。
[技術用語之含義]
若確認本說明書中所使用之技術用語之含義，則標的物質1(1A、1B)(將圖1中之符號合併表示，但並不受此限定而解釋)係成為利用側向流動法(lateral flow method)之檢測對象之物質，與檢體中之被檢物質同義。結合性物質2b、3b係分別具有對上述標的物質及捕捉性物質之結合能力的物質，較佳為生物分子。將導入有結合性物質2b、3b之標記粒子2a、3a稱為標記物2、3。但是，於廣義上，有時將標記粒子之用語以包含標記物之含義使用。另一方面，試驗區域內被固定於膜片且經由標的物質1(1A、1B)而捕捉標記物2、3者為試驗用捕捉性物質4、5。另一方面，參照區域內被固定於膜片者為參照用捕捉性物質7，於此處不經由標的物質1(1A、1B)而捕捉標記物2、3。
[螢光標記物]
作為螢光標記物2，可一併使用螢光二氧化矽粒子或螢光乳膠粒子、半導體奈米粒子等。於本發明中，尤佳為使用螢光二氧化矽粒子。
二氧化矽之折射率如下所述為1.40~1.46左右，另一方面，乳膠粒子之折射率為1.6左右。因此，與乳膠相比，二氧化矽為透光性較高之材質，光源可有效率地浸入及透過到內部，於螢光粒子之情形時，可有效率地激發二氧化矽粒子中所包含之色素，於吸光粒子之情形時，二氧化矽粒子中所包含之色素可有效率地吸收光源，而發揮更加優異之效果。
螢光二氧化矽粒子之製備方法並無特別限制，可為藉由任意製備方法而獲得之二氧化矽粒子。例如可列舉Journal of Colloid and Interface Science,159,150-157(1993)中記載之溶膠-凝膠法。
於本發明中，尤佳為使用依據國際公開2007/074722A1公報中所記載之含有螢光色素化合物之膠體二氧化矽粒子的製備方法而獲得的含有功能性化合物之二氧化矽粒子。作為上述功能性化合物之具體例，可列舉螢光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標記化合物、pH感受性色素化合物等。
具體而言，含有上述功能性化合物之二氧化矽粒子可藉由如下方式製備：使上述功能性化合物與矽烷偶合劑進行反應，使其共價鍵結、離子鍵結及其他化學鍵結或吸附而獲得生成物，使1種或2種以上之矽烷化合物與該生成物縮聚合而形成矽氧烷鍵。藉此，可獲得有機矽氧烷成分與矽氧烷成分進行矽氧烷鍵結而成之二氧化矽粒子。
作為含有上述功能性化合物之二氧化矽粒子之較佳製備方法的態樣，可藉由如下方式製備：使具有或加成有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯基、順丁烯二醯亞胺基、異氰酸酯基、異硫氰酸酯基、醛基、對硝基苯基、二乙氧基甲基、環氧基、氰基等活性基的上述功能性化合物與具有與其等活性基對應而進行反應之取代基(例如胺基、羥基、硫醇基)的矽烷偶合劑進行反應，使其共價鍵結而獲得生成物，使1種或2種以上之矽烷化合物與該生成物縮聚合而形成矽氧烷鍵。
將使用γ-胺基丙基三乙氧基矽烷(APS)作為上述矽烷偶合劑，使用四乙氧基矽烷(TEOS)作為矽烷化合物之情形例示於以下。
作為具有或加成有上述活性基之上述功能性化合物之具體例，可列舉5-(及-6)-羧基四甲基羅丹明(5-(and-6)-carboxytetramethylrhodamine)-NHS酯(商品名，emp Biotech GmbH公司製造)、分別以下述式表示之DY550-NHS酯或DY630-NHS酯(任一者均為商品名，Dyomics GmbH公司製造)等具有NHS酯基之螢光色素化合物。
作為具有上述取代基之矽烷偶合劑之具體例，可列舉γ-胺基丙基三乙氧基矽烷(APS)、3-[2-(2-胺基乙基胺基)乙基胺基]丙基-三乙氧基矽烷、N-2(胺基乙基)3-胺基丙基甲基二甲氧基矽烷、3-胺基丙基三甲氧基矽烷等具有胺基之矽烷偶合劑。其中，較佳為APS。
作為進行上述縮聚合之上述矽烷化合物並無特別限制，可列舉TEOS、γ-巰基丙基三甲氧基矽烷(MPS)、γ-巰基丙基三乙氧基矽烷、γ-胺基丙基三乙氧基矽烷(APS)、3-硫氰基丙基三乙氧基矽烷、3-縮水甘油氧基丙基三乙氧基矽烷、3-異氰酸酯基丙基三乙氧基矽烷、及3-[2-(2-胺基乙基胺基)乙基胺基]丙基-三乙氧基矽烷。其中，就形成上述二氧化矽粒子內部之矽氧烷成分之觀點而言，較佳為TEOS，就形成上述二氧化矽粒子內部之有機矽氧烷成分之觀點而言，較佳為MPS或APS。
若以上述方式製備，則可製造球狀或接近球狀之二氧化矽粒子。所謂接近球狀之二氧化矽粒子，具體而言係長軸與短軸之比為2以下之形狀。
為了獲得所需之平均粒徑之二氧化矽粒子，可藉由如下方式實現：使用YM-10、YM-100(任一者均為商品名，Millipore公司製造)等超過濾膜進行超過濾，而去除粒徑過大或過小之粒子，或者以適當之重力加速度進 行離心分離，並僅將上清液或沈澱回收。
作為吸附或結合於上述二氧化矽粒子之表面之生物分子，可列舉抗原、抗體、DNA、RNA、糖、糖鏈、配位子、受體、蛋白質或肽。此處，所謂配位子係指與蛋白質特異性地結合之物質，例如係指與酵素結合之基質、輔酵素、調節因子、或激素、神經傳導物質等，不僅包含低分子量之分子或離子，亦包含高分子量之物質。
螢光二氧化矽粒子之平均粒徑較佳為1nm~1μm，更佳為20nm~500nm，尤佳為200nm~400nm。
於本發明中，上述平均粒徑係如下者：根據由穿透式電子顯微鏡(TEM)、掃描型電子顯微鏡(SEM)等之圖像隨機選擇之100個標記試劑二氧化矽粒子之合計投影面積，利用圖像處理裝置求出標記試劑二氧化矽粒子之佔有面積，將該合計之佔有面積除以所選擇之標記試劑二氧化矽粒子之個數(100個)，求出相當於所得之值的圓之直徑平均值(平均等效圓直徑)。
再者，上述平均粒徑與包含一次粒子凝集而成之二次粒子之概念的下述「利用動態光散射法所得之粒度」不同，係僅由一次粒子構成之粒子的平均粒徑。
乳膠粒子之密度為1g/cm3，由於密度較小，因此有若使粒徑減小則無法利用離心分離進行分離，而無法用作標記粒子之情形。對此，二氧化矽相對而言密度較大(例如約為2g/cm3)，因此即便減小粒徑亦容易利用離心分離進行分離，可較佳地用作標記粒子。因此，於本發明之檢測中，若使用二氧化矽粒子則可使用粒徑小於乳膠粒子之粒子，因此可廣泛地選擇所使用之粒子的粒徑選擇範圍，可選擇使膜片內之移動特性最佳化之更小徑粒子。就此種方面而言，於本發明中較佳為使用二氧化矽粒子。
又，如下所述般為低折射率亦不會引起由周圍水之影響所導致之光散 射，而成為使用二氧化矽粒子之優勢。尤其是於本案發明中，如下述實施例中所示，亦可確保10ng/ml之極微量檢體之檢測的精度提高，就該觀點而言，亦較佳為設為使用二氧化矽粒子之標記試劑。
<折射率> 589nm 23℃
聚苯乙烯珠 1.59
二氧化矽粒子 1.40-1.46
水 1.33
(理科年表 國立天文台編)
反射光強度 R=(n0-ni)2
n0 水之折射率
ni 粒子之折射率
R(聚苯乙烯珠)=7.93×10-3
R(二氧化矽粒子)=6.57×10-4~2.17×10-3
於本說明書中，所謂上述「利用動態光散射法所得之粒度」係指藉由動態光散射法測定，其與上述平均粒徑不同，不僅為一次粒子，亦包含一次粒子凝集而成之二次粒子的概念，成為評價上述複合粒子之分散穩定性之指標。
作為利用動態光散射法之粒度之測定裝置，可列舉Zetasizer Nano(商品名，Malvern公司製造)。該方法係測定微粒子等光散射體之光散射強度之時間變動，根據其自相關函數(autocorrelation function)計算光散射體之布朗運動(Brownian motion)速度，並根據其結果導出光散射體之粒度分佈。
較佳為本發明之粒子作為粒狀物質為單分散，粒度分佈之變動係數即為所謂之CV值，其並無特別限制，較佳為10%以下，更佳為8%以下。
[吸光標記物]
吸光標記物3較佳為與螢光標記物2同樣地利用對於標的物質、參照用捕捉性物質具有良好之結合性之生物分子等(結合性物質)3b來對吸光微粒子3a進行表面改質。吸光微粒子之表面改質之實施形態與上述螢光微粒子同樣。
吸光微粒子之種類或形狀並無特別限定。吸光微粒子之平均粒徑、構成材料等之較佳者與上述螢光微粒子同樣。作為標記物質，只要微粒子之構成材料為吸光性者，則可無需特別使用。於應用標記物質(吸光物質)之情形時，可使用多環顏料或偶氮顏料等有機顏料、碳黑或群青等無機顏料。例如亦可使上述二氧化矽粒子或乳膠粒子中內包上述吸光物質。又，對於吸光微粒子，亦較佳為使用下述半導體微粒子等。
‧半導體粒子等
上述半導體粒子之材質並無特別限制，可較佳地例示ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdO、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、InP、InAs、GaN、GaP、GaAs、TiO2、WO3、PbS、或PbSe。例如可使用日本專利第3897285號公報等中所記載之半導體奈米粒子。上述半導體奈米粒子可藉由使硫醇化合物之-SH基與半導體奈米粒子之表面之S、O、Se、Te、P、As、N等原子取代而進行表面改質。作為金粒子、上述金屬奈米粒子，可使用日本特開2003-26638說明書等中所記載之金膠體粒子及金屬膠體粒子。作為上述金屬膠體粒子之具體例，可列舉鉑、銅、氧化鐵等金屬膠體粒子。作為上述無機結晶，可列舉氧化鐵(III)(Fe2O3)、氧化銀(I)(Ag2O)、氧化錫(IV)(SnO2)、氧化鈦(IV)(TiO2)、銦錫氧化物(ITO)等。例如可使用日本特開2005-76064公報中所記載之無機結晶。
金膠體通常表面電漿子效應較大，又，有效率地吸收可見光之波長，因此視認性良好。又，由於吸收峰之波長與綠雷射之波長大致一致，故而藉由與可利用綠雷射進行激發之螢光粒子(例如含有羅丹明6G之二氧化矽 粒子)組合，可構築螢光之檢測感度較高且吸光之檢測感度亦較高之螢光-吸光一次檢測測定裝置。
‧吸光係數
吸光微粒子較佳為可吸收可見光進行著色而視認者。較佳為其莫耳吸光係數ε為5×106M-1cm-1以上之粒子，莫耳吸光係數ε更佳為5×107M-1cm-1~1×1010M-1cm-1。
此處，莫耳吸光係數ε可根據下述朗泊-比爾定律(Lambert-Beer law)之式子而算出。
A=Log10(I0/I)=ε bp=asbp'
[A：吸光度，I：透過光之強度，I0：入射光之強度，ε：莫耳吸光係數(M-1cm-1)，b：光程長度(cm)，p：標記粒子(包含著色粒子及螢光微粒子之混合分散液)之濃度(M(mol/l))，as：比吸光度，p'：標記粒子(包含著色粒子及螢光微粒子之混合分散液)之濃度(g/l)]
上述濃度p'(g/l)係決定自一定量(例如1ml)之標記粒子分散液只回收標記粒子並使其乾燥而獲得之質量所得之值。另一方面，上述濃度p(mol/l)係根據TEM照片求出標記粒子之大小而決定一個粒子之體積，根據粒子之密度(例如於二氧化矽粒子之情形時為2.3g/cm3)而決定一個粒子之質量，根據自一定量(例如1ml)之標記粒子分散液只回收標記粒子並使其乾燥而獲得之標記粒子之質量而決定莫耳數所得之值。於本發明中，所謂「標記粒子之莫耳吸光係數ε」，係指藉由對標記粒子分散液測定吸光度，並應用於上述朗泊-比爾定律之式子而獲得的上述分散液中之標記粒子之莫耳吸光係數ε。標記粒子之吸光度、吸光光譜及ε可使用任意吸光光度計或讀板儀(plate reader)，製成水分散液、乙醇分散液、N,N-二甲基甲醯胺分散液等分散液而測定。
[螢光及吸光之波長]
於本發明之較佳之實施形態中，對於上述螢光粒子2a(螢光標記物2)及吸光粒子3a(吸光標記物3)，使其螢光激發波長(典型為峰頂)[λ1]與吸收波長(典型為吸光峰頂)[λ2]成為同一波長區域。此處，所謂同一波長區域，只要可實現本發明所需之效果，即藉由1個檢測部(受光器)檢測螢光與吸光，並以反向峰之形式讀取，則無特別限定。其中，較佳為於免疫層析法之製造步驟中能以目視確認標記粒子，即呈現顏色，因此螢光之激發波長及吸光之吸收波長(λ1、λ2)較佳為300nm~800nm。進而，若考慮螢光色素及著色色素之獲取性等，則上述螢光及吸光之檢測波長區域(λ1、λ2)較佳為350~700nm，更佳為400nm~650nm。若考慮通用之檢測器(光感測器)之受光感度特性，則尤佳為500nm~650nm。再者，此處所謂之峰係指峰頂至其附近全體，狹義上設為意指峰頂(頂點)者。再者，於目視下上述波長區域之螢光看上去大致為綠色，吸光(著色)看上去大致為紅色。上述螢光激發波長[λ1]與吸收波長[λ2]之差[△λ]並無特別限定，就較佳之一次檢測之觀點而言，其差[△λ=λ1-λ2]較佳為60nm以下，更佳為30nm以下，尤佳為10nm以下。下限雖無特別限定，但實際上為0.5nm以上。再者，於本發明中，光之波長只要未特別說明，則設為利用下述實施例中進行測定之條件(裝置、測定溫度等)者。例如於螢光色素、吸光色素均使用羅丹明6G之情形時，螢光激發波長[λ1]與吸收波長[λ2]之差為23nm，於使用ATTO532作為螢光色素，使用TAMRA作為吸光色素之情形時為7nm，滿足上述關係。
[檢測方法]
於本發明之免疫層析法中，使用上述試片，利用混合檢測裝置一次分別檢測測定自此處發出之螢光及吸光(著色)。圖4係示意性地表示上述檢測裝置之較佳之實施形態的立體圖。本檢測裝置200具有以配線23連接檢測單元本體21與個人電腦(控制部)25之形態。於上述檢測單元本體21 中內置有檢測部20(參照圖5)。該檢測部20係以如下方式進行：與長條試驗體100之樣品開口部61對應的位置移動，該長條試驗體100係自樣品導入部21a沿樣品導板21b而被導入，掃描自此處露出之試片10之表面。藉此，可檢測測定試片10之試驗區域(nt1、nt2)及參照區域nr中之螢光或吸光、亦或各區域之反射光強度(I1、I2、Ic)。
上述檢測器20係由受光器27、受光透鏡28、光照射器29所構成。圖5之上圖示意性地表示使該檢測部20沿試驗區域(nt1、nt2)自初期位置(i)至終期位置(f)進行掃描時的狀態。進而，圖5之下圖表示此時檢測出之螢光峰與吸光峰之例。如同圖所示，於第1試驗區域nt1中檢測出向上凸之螢光峰，於第2試驗區域nt2中檢測出向下凸之吸光峰。於本實施例中，於參照線nr檢測出螢光峰。兩峰由於試驗區域分隔而不重疊地檢測，而使光強度不會被相抵。如此，本發明之優勢在於可藉由1個檢測部(受光器)一次性測定螢光與吸光兩者。
於本實施形態中，上述混合檢測裝置之控制部25自此處發出指令，經由上述檢測部掃描上述試片，而一次檢測測定上述螢光峰與吸光峰。但是，並不限定於此種實施形態，控制部可設為任意構成，例如亦可編入至檢測單元本體21之內部。於本實施形態中，上述個人電腦(檢測部)25兼作讀取解析手段，該讀取解析手段可將上述螢光峰以向上或向下凸起之峰之形式進行識別，將上述吸光峰以與上述螢光峰上下相反地凸起之峰之形式進行識別，而進行各個標的物質1A、1B之檢測，並將其結果顯示於顯示部25a。其中，如上所述，對於該檢測、解析，並非僅利用光之峰之解析，可廣泛地根據反射光強度(I1、I2、Ic)而判定標的物質之存在、不存在，或進行其定量。
於本實施形態中，較佳為使用上述混合檢測裝置200作為根據上述螢光峰及/或吸光峰之面積而定量標的物質之量之定量測定裝置。於 進行此種定量時，較佳為預先求出峰面積之校準曲線，並與其進行對照，藉此鑑定被檢物質之量。欲知概略之量時，或者欲確定利用螢光峰所檢測出之被檢物質與利用吸光峰所檢測出之被檢物質之相對關係時等，可不使用校準曲線，利用由峰值求出之積分強度而進行定量測定。
根據本發明，可利用1個試片進行複數種被檢物質(標的物質)之測定，因此可較佳地防止試片間之偏差或試樣之製作上之誤差或誤操作(樣品之取代等)等，故而較佳。又，藉由設為簡易之構成之檢測裝置，亦可實現試驗場所之移動或分散配置。此種優勢對於要求對大量樣品進行試驗並測定之公共醫療中之利用尤其顯著。
如上所述，於利用本發明之免疫層析法之標的物質之檢測方法中，較佳為使用利用毛細管現象等進行移動之標記物，使上述粒子集聚於判定部，並進行判定的檢測，例如較佳為利用免疫層析法或微流路晶片等進行。此時，二氧化矽粒子可較佳地用作側向流動用標記物。進而，於本發明中，較佳為利用側向流動型之免疫層析法而檢測標的物質。
作為上述試驗帶之製作法，可藉由如下方式製作：按照樣品墊、結合墊、抗體固定化膜片、吸收墊之排列順序，為了使各構件間容易產生毛細管現象，與鄰接其等各構件兩端之構件重疊1~5mm左右(較佳為於墊片上)而貼附。
作為上述免疫層析法用螢光-吸光檢測系統，較佳為至少由(1)由樣品墊、結合墊、抗體固定化膜片及吸收墊構成之試驗帶，及(2)激發光源所構成。
於上述螢光檢測系統中，就較佳地檢測出上述二氧化矽粒子(標記物)所發出之螢光之觀點而言，較佳為上述激發光源(光照射器)發出波長500nm~550nm之激發光。作為上述激發光源，可列舉水銀燈、鹵素燈及氙氣燈。尤佳為使用自雷射二極體或發光二極體照射之激發光。
又，上述螢光檢測系統更佳為具備用以自上述激發光源中僅使特定之波長之光透過之濾光片，進而，就準確地檢測螢光之觀點而言，進而較佳為具備去除上述激發光而僅使螢光透過之濾光片。
上述受光器尤佳為接收上述螢光且檢測吸光(著色)之光電倍增管、CCD檢測器、CMOS檢測器，藉此亦可檢測出於目視下無法確認之強度或波長之螢光，進而可測定該螢光強度，因此亦可進行標的物質之定量，可實現高感度檢測及定量。作為受光器之受光感度之特性，就高感度之製品之獲取性之觀點而言，較佳為應用在波長400~700nm具有高感度之受光區域(受光峰)者，更佳為應用在波長500~600nm具有高感度之受光區域(受光峰)者。
[實施例]
以下，基於實施例進而詳細地說明本發明。本發明並不受該等實施例之任何限定。
製備例1(螢光二氧化矽奈米粒子之製備)
將5-(及-6)-羧基羅丹明6G-琥珀醯亞胺酯(商品名，emp Biotech GmbH公司製造)2.9mg溶解於1mL之二甲基甲醯胺(DMF)中。向其中添加1.3μL之APS，並於室溫(25℃)下反應1小時。
將所獲得之反應液600μL與乙醇140mL、TEOS 6.5mL、蒸餾水35mL及28質量%氨水15.5mL加以混合，並於室溫下反應24小時。
將反應液以15000×G之重力加速度進行離心分離30分鐘，並去除上清液。於沈澱之二氧化矽粒子中添加蒸餾水4mL，使粒子分散，再次以15000×G之重力加速度進行離心分離20分鐘。將本洗淨操作進而重複2次，去除二氧化矽奈米粒子分散液所含有之未反應之TEOS或氨等，而獲得平均粒徑為227nm之二氧化矽奈米粒子1.65g。產率約為94%。
製備例2(螢光二氧化矽粒子與抗體之複合粒子之製備)
於製備例1中所使用之濃度5mg/ml之含有羅丹明6G之螢光二氧化矽粒子(平均粒徑197nm)之分散液100μL(分散介質：蒸餾水)中，添加蒸餾水775μL、濃度10mg/mL之海藻酸鈉水溶液(重量平均分子量70000)100μL及28重量%之氨水溶液25μL，並於室溫(24℃)下緩慢混合1小時。將所獲得之膠體以12,000×G之重力加速度進行離心分離30分鐘，並去除上清液。向其中添加蒸餾水875μL，使粒子再分散。繼而，添加10mg/mL之海藻酸鈉水溶液100μL並利用攪拌器充分攪拌後，添加28重量%之氨水溶液25μL，緩慢混合1小時。將該膠體以12,000×G之重力加速度進行離心分離30分鐘並去除上清液後，添加蒸餾水1mL而使粒子分散。以同樣之方式進而將離心分離及分散於蒸餾水中之操作重複2次而將粒子洗淨，並分散於蒸餾水200μL中，而獲得含有羅丹明6G之二氧化矽粒子/海藻酸複合粒子之膠體(產量為2.5mg/mL×200μL)。
於上述含有羅丹明6G之螢光二氧化矽粒子/海藻酸複合粒子之膠體中，依序添加0.5M之2-嗎啉乙磺酸(morpholinoethanesulfonic acid)緩衝液(pH值6.0)100μL、蒸餾水395μL、50mg/mL之NHS(N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccininide))水溶液230μL、及19.2mg/mL之EDC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺)(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)水溶液75μL，並混合10分鐘。
將膠體以12,000×G之重力加速度進行離心分離10分鐘，並去除上清液。向其中添加50mM之KH2PO4(pH值7.0)400μL，使粒子分散，進而添加源自山羊之抗A型流行性感冒核蛋白抗體(Anti-Influenza A Virus Nucleoprotein，antibody，Goat-Poly，LifeSpan Biosciences公司製造)100μL(0.5mg/mL)，並於室溫下緩慢混合30分鐘，而使抗hCG抗體共價鍵結於上述二氧化矽奈米粒子。
繼而，將膠體以12,000×G之重力加速度進行離心分離10分 鐘，並去除上清液。向其中添加50mM之KH2PO4(pH值7.0)1mL，使粒子分散，並以12,000×G之重力加速度進行離心分離10分鐘後，去除上清液。向其中添加50mM之KH2PO4(pH值7.0)1mL，使粒子分散，並以12,000×G之重力加速度進行離心分離10分鐘後，去除上清液。向其中添加50mM之KH2PO4(pH值7.0)1mL，使粒子分散，而獲得0.5mg/ml之二氧化矽粒子與抗A型流行性感冒核蛋白抗體之複合粒子膠體1mL。
製備例3(金膠體與抗體之複合粒子之製備)
於金膠體(粒徑40nm)0.5mL添加50μg/mL之抗B型流行性感冒核蛋白抗體(Anti-Human Influenza B，Momoclonal(Clone 9D6)，Takara Bio公司製造)100μL，並於室溫下靜置10分鐘。繼而，添加含有1重量%之牛血清白蛋白之磷酸緩衝液(pH值7.5)100μL，進而於室溫下靜置10分鐘。其後，以8,000×G進行離心分離15分鐘，去除上清液，並添加含有1重量%之牛血清白蛋白之磷酸緩衝液(pH值7.5)100μL而使粒子分散。
製作例(檢測裝置)
製作如下檢測裝置：其具有由光源、光學濾光片、及光電倍增管(PMT)所構成之檢測單元，該檢測單元具備藉由馬達以一定速度進行直線移動之機構，且具備每隔50μs記錄一次PMT之受光強度之記錄機構。再者，關於檢測單元，光源為532nm之雷射二極體，其具有如下機構：將雷射二極體照射至樣品，並使反射光透過僅使波長550nm以上光透過之光學濾光片後，利用光電倍增管(PMT)(Hamamatsu Photonics公司製造，正對(head-on)型光電倍增管(商品名))接收光。再者，於本實施例中，反射光之檢測均於室溫(25℃)下進行。
實施例1(免疫層析法用試驗帶之製作)
將製備例1、2中獲得之螢光二氧化矽粒子與抗體之複合粒子之膠體240μL、製備例3中獲得之金膠體粒子與抗體之複合粒子100μL、及50mM 之KH2PO4(pH值7.0)460μL進行混合。將所獲得之混合液800μL均勻地塗佈於Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP，MILLIPORE公司製造)(8×150mm)上。在乾燥器內於室溫下減壓乾燥一夜，而製作含有製備例中獲得之複合粒子而成的結合墊。
其次，利用以下之方法製作抗體固定化膜片。
於自膜片(長度25mm，商品名：Hi-Flow Plus120 Membrane，MILLIPORE公司製造)之一端約9mm之位置，以0.75μL/cm之塗佈量塗佈含有源自鼠類之抗A型流行性感冒核蛋白抗體(Influenza A nucleoprotein，InA245，HyTest公司製造)1mg/mL之溶液((50mM之KH2PO4，pH值7.0)+5%蔗糖)而成為寬度約1mm之A型流行性感冒用測試線。
繼而，以0.75μL/cm之塗佈量塗佈含有源自鼠類之抗B型流行性感冒核蛋白抗體(Influenza B Virus Nucleoprotein antibody，Fitzgerald公司製造)1mg/mL之溶液((50mM之KH2PO4，pH值7.0)+5%蔗糖)而成為寬度約1mm之B型流行性感冒用測試線。再者，將A型流行性感冒用測試線與B型流行性感冒用測試線之間隔d設為3mm。
繼而，作為寬度約1mm之控制線(control line)，以0.75μL/cm之塗佈量塗佈含有源自山羊之抗鼠類IgG抗體(AKP Goat anti-mouse IgG Antibody，BioLegend公司製造)1mg/mL之溶液((50mM之KH2PO4，pH值7.0)無糖)，並於50℃下乾燥30分鐘。再者，將B型流行性感冒用測試線與控制線之間隔設為3mm。
依序組裝樣品墊(Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP)，MILLIPORE公司製造)、上述結合墊、上述抗體固定化膜片、及吸收墊(Cellulose Fiber Sample Pad(CFSP)，MILLIPORE公司製造)於墊片(商品名AR9020，Adhesives Research公司製造)上。再者，膜片係以A型流行性感冒用測試線成為結合墊側、控制線成為吸收墊側之方式構成。
流行性感冒核蛋白之迅速判定
以表2所示之組成製備A型流行性感冒核蛋白與B型流行性感冒核蛋白之混合液。繼而將該混合液100μL滴加至試驗帶之樣品墊部分。於15分鐘後，進行利用製作例之檢測器之測定、及A型流行性感冒用測試線之利用螢光讀取器之判定、B型流行性感冒用測試線之利用目視之判定。此處，所謂螢光讀取器係由波長532nm之雷射二極體及光學濾光片所構成之裝置，係藉由將上述雷射二極體照射至膜片之線區域，並經由光學膜對線進行觀察，而僅觀察螢光粒子所發出之螢光之裝置。
作為測定結果之一例，將對No16之膜片進行測定時之螢光分佈示於圖5。圖中位置9mm附近之向上凸之峰係由與A型流行性感冒用測試線結合之螢光二氧化矽粒子產生之峰。位置12mm附近之向下凸之峰係由與B型流行性感冒用測試線結合之金膠體產生之峰。位置15mm附近之向上凸之峰係由與控制線結合之螢光二氧化矽粒子產生之峰。
將測定及判定之結果示於表2。表中線nt1表示A型流行性感冒用測試線，線nt2表示B型流行性感冒用測試線。判定器之值之基線值係膜片之位置10.5mm之螢光強度之值。線nt1之值係A型流行性感冒用測試線之螢光強度之峰值(I1)。線nt2之值係B型流行性感冒用測試線之螢光強度之峰值(I2)。又，關於線之判定，線nt1係使用螢光讀取器進行判定，線nt2係以目視進行判定。「+」意味著可見線，「-」意味著未見線。再者，所謂螢光讀取器，係照射作為光源之532nm之雷射二極體，使反射光通過僅使波長540nm以上之光透過之光學濾光片並以目視進行觀察的裝置。
將A型流行性感冒核蛋白濃度與I1-Ic之關聯、及B型流行性感冒核蛋白濃度與Ic-I2之關聯分別示於圖6及圖7。
根據該結果，對於A型流行性感冒用測試線，於含有A型流行性感冒核蛋白10ng/mL以上之樣品中，線之峰值之螢光強度與基線(參 照圖5中之輔助線Ic)之螢光強度之差(I1-Ic)與未含有A型流行性感冒核蛋白之樣品之值相比，係明顯較大之值。具體而言，在含有A型流行性感冒核蛋白100ng/mL以上之樣品中，線之峰值之螢光強度與基線之螢光強度之差(I1-Ic)為基線之螢光強度Ic之30%以上之值，相對於此，於未含有A型流行性感冒核蛋白之樣品中，為5%以下之值。又，於利用螢光讀取器之判定中，可知檢測極限為20ng/mL，因此本檢測方法為高感度。
同樣，對於B型流行性感冒用測試線，於含有B型流行性感冒核蛋白200ng/mL以上之樣品中，基線之螢光強度與線之峰值之螢光強度之差(Ic-I2)與未含有B型流行性感冒核蛋白之樣品之值相比，係明顯較大之值。具體而言，在含有B型流行性感冒核蛋白200ng/mL以上之樣品中，基線之螢光強度與線之峰值之螢光強度之差(Ic-I2)為基線之螢光強度Ic之15%以上之值，相對於此，於未含有B型流行性感冒核蛋白之樣品中，為4%以下之值。又，於目視之判定中，檢測極限為500ng/mL，因此本檢測方法為高感度。
根據以上，本檢測方法可利用1次測定同時檢測2個項目，且根據螢光讀取器或目視之判定可稱為高感度。
(實施例2)標的物質之定量
根據實施例1之表2所示之結果，製作A型流行性感冒核蛋白與B型流行性感冒核蛋白之校準曲線。基於該校準曲線，採取2種被檢體A、B(體液)，並使用上述裝置進行其一次檢測。其結果，對於被檢體A，I1-Ic為0.216，關於Ic-I2為0.002。對於被檢體B，I1-Ic為0.005，關於Ic-I2為0.044。根據該結果，該試驗體A之A型流行性感冒核蛋白為27ng/ml，該試驗體B之B型流行性感冒核蛋白鑑定為246ng/ml。使用其他方法(ELISA法)鑑定上述被檢體之成分，結果與上述結果完全一致。由該結果可知，根據本發明，可實現高精度之定量檢測。
進而，將峰強度差換為峰面積而製作上述校準曲線，並進行定量測定。 由其結果可知，定量檢測之精度進一步提高。
製備例4(吸光二氧化矽奈米粒子之製備)
將5-(及-6)-羧基羅丹明6G-琥珀醯亞胺酯(商品名，emp Biotech GmbH公司製造)2.9mg溶解於1mL之二甲基甲醯胺(DMF)中。向其中添加1.3μL之APS，並於室溫(25℃)下反應1小時。
繼而，於4ml庚烷中添加AOT(Aerosol OT)280mg。向其中添加蒸餾水40μl、28%氨水40μl並充分攪拌，而製備反膠束(reverse micelle)。
於上述反膠束液中添加5-(及-6)-羧基羅丹明6G/矽烷偶合劑複合體溶液200μl、TEOS(原矽酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate))100μl，於室溫下充分混合，並反應24小時。
於反應液中添加丙酮4ml並充分混合後，以22000×g之重力加速度進行離心分離30分鐘，並去除上清液。於沈澱之二氧化矽粒子中添加乙醇1ml而使其分散，再次以22000×g之重力加速度進行離心分離30分鐘。將本洗淨操作進而重複2次。繼而，於沈澱之二氧化矽粒子中添加蒸餾水1ml而使其分散，並以22000×g之重力加速度進行離心分離30分鐘。將本洗淨操作進而重複2次，而去除吸光二氧化矽粒子分散液中所含有之未反應之TEOS或氨等。
藉此，獲得含有5-(及-6)-羧基羅丹明6G之吸光二氧化矽粒子(平均粒徑238nm)20.2mg。產率為74%。
(含有5-(及-6)-羧基羅丹明6G之吸光二氧化矽粒子之吸光光譜及吸光最大波長下之莫耳吸光係數ε之測定)
使用吸光光度計(Molecular Devices公司製造)及光程長度1cm之孔，對含有5-(及-6)-羧基羅丹明6G之吸光二氧化矽粒子之水分散液的吸光光譜及吸光最大波長(546nm)下之莫耳吸光係數ε進行測定。532nm下之ε為1.1×1010M-1cm-1。
製備例5(二氧化矽粒子與抗體之複合粒子之製備)
利用與製備例2同樣之方法獲得製備例5之0.5mg/ml之含有5-(及-6)-羧基羅丹明6G之吸光二氧化矽粒子與抗B型流行性感冒核蛋白抗體之複合粒子膠體1mL。
(實施例3)
利用與實施例1同樣之方法實施流行性感冒核蛋白之迅速判定試驗。將測定及判定之結果示於表3。
根據該結果，對於A型流行性感冒用測試線，於含有A型流行性感冒核蛋白10ng/mL以上之樣品中，線之峰值之螢光強度與基線之螢光強度之差(I1-Ic)與未含有A型流行性感冒核蛋白之樣品之值相比，係明顯較大之值。又，於利用螢光讀取器之判定中，可知檢測極限為20ng/mL，因此本檢測方法為高感度。
同樣，對於B型流行性感冒用測試線，於含有B型流行性感冒核蛋白200ng/mL以上之樣品中，基線之螢光強度與線之峰值之螢光強度之差(Ic-I2)與未含有B型流行性感冒核蛋白之樣品之值相比，係明顯較大之值。又，於目視之判定中，檢測極限為500ng/mL，因此本檢測方法為高感度。
根據以上，本檢測方法可利用1次測定同時檢測2個項目，且根據螢光讀取器或目視之判定可謂高感度。
製備例6(螢光二氧化矽奈米粒子之製備)
將ATTO532-NHS酯(商品名，ATTO-TEC GmbH公司製造)3.5mg溶解於1mL之二甲基甲醯胺(DMF)中。向其中添加1.3μL之APS，並於室溫(25℃)下反應1小時。
將所獲得之反應液600μL與乙醇140mL、TEOS 6.5mL、蒸餾水35mL及28質量%氨水15.5mL加以混合，並於室溫下反應24小時。
將反應液以15000×G之重力加速度進行離心分離30分鐘，並去除上清液。於沈澱之二氧化矽粒子中添加蒸餾水4mL，使粒子分散，再次以15000×G之重力加速度進行離心分離20分鐘。將本洗淨操作進而重複2次，去除二氧化矽奈米粒子分散液中所含有之未反應之TEOS或氨等，而獲得平均粒徑為238nm之二氧化矽奈米粒子1.47g。產率約為83%。
製備例7(二氧化矽粒子與抗體之複合粒子之製備)
利用與製備例2同樣之方法獲得0.5mg/ml之含有ATTO532之螢光二氧化矽粒子與抗諾羅病毒GI單株抗體(本公司製造)之複合粒子膠體1mL。
製備例8(吸光二氧化矽奈米粒子之製備)
將5-(及-6)-羧基四甲基羅丹明琥珀醯亞胺酯(Molecular Probes公司製造)3.3mg溶解於1ml之二甲基甲醯胺(DMF)中。向其中添加1.4μl之APS(3-胺基丙基三乙氧基矽烷)，並於室溫(23℃)下反應1小時，而獲 得TAMRA/矽烷偶合劑複合體溶液。
繼而，於4ml庚烷中添加AOT(Aerosol OT)280mg。向其中添加蒸餾水40μl、28%氨水40μl並充分攪拌，而製備反膠束。
於上述反膠束液中添加TAMRA/矽烷偶合劑複合體溶液200μl、TEOS(原矽酸四乙酯)100μl，於室溫下充分混合，並反應24小時。
於反應液中添加丙酮4ml並充分混合後，以22000×g之重力加速度進行離心分離30分鐘，並去除上清液。於沈澱之二氧化矽粒子中添加乙醇1ml而使其分散，再次以22000×g之重力加速度進行離心分離30分鐘。將本洗淨操作進而重複2次。繼而，於沈澱之二氧化矽粒子中添加蒸餾水1ml而使其分散，並以22000×g之重力加速度進行離心分離30分鐘。將本洗淨操作進而重複2次，而去除吸光二氧化矽粒子分散液中所含有之未反應之TEOS或氨等。
藉此，獲得含有TAMRA之吸光二氧化矽粒子(平均粒徑211nm)18.0mg。產率為66%。
(含有TAMRA之膠體二氧化矽粒子之吸光光譜及吸光最大波長下之莫耳吸光係數ε之測定)
使用吸光光度計(Molecular Devices公司製造)及光程長度1cm之孔，對含有TAMRA之膠體二氧化矽粒子之水分散液之吸光光譜及吸光最大波長(546nm)下之莫耳吸光係數ε進行測定。660nm下之ε為1.6×1010M-1cm-1。
製備例9(二氧化矽粒子與抗體之複合粒子之製備)
利用與製備例2同樣之方法獲得0.5mg/ml之含有TAMRA之吸光二氧化矽粒子與抗諾羅病毒GII單株抗體(本公司製造)之複合粒子膠體1mL。
(實施例4)
將製備例7中獲得之螢光二氧化矽粒子與抗體之複合粒子之膠體240 μL、製備例9中獲得之吸光二氧化矽粒子與抗體之複合粒子100μL、及50mM之KH2PO4(pH值7.0)460μL進行混合。將所獲得之混合液800μL均勻地塗佈於Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP，MILLIPORE公司製造)(8×150mm)上。在乾燥器內於室溫下減壓乾燥一夜，而製作含有製備例中獲得之複合粒子而成之結合墊。
其次，利用以下之方法製作抗體固定化膜片。
於自膜片(長度25mm，商品名：Hi-Flow Plus180 Membrane，MILLIPORE公司製造)之一端約9mm之位置，以0.75μL/cm之塗佈量塗佈含有源自類鼠之抗諾羅病毒GI抗體(本公司製造)1mg/mL之溶液((50mM之KH2PO4，pH值7.0)+5%蔗糖)而成為寬度約1mm之諾羅病毒GI用測試線。
繼而，以0.75μL/cm之塗佈量塗佈含有源自鼠類之抗諾羅病毒GII抗體(本公司製造)1mg/mL之溶液((50mM之KH2PO4，pH值7.0)+5%蔗糖)而成為寬度約1mm之諾羅病毒GII用測試線。再者，將諾羅病毒GI用測試線與諾羅病毒GII用測試線之間隔d設為3mm。
繼而，作為寬度約1mm之控制線，以0.75μL/cm之塗佈量塗佈含有源自山羊之抗鼠類IgG抗體(AKP Goat anti-mouse IgG Antibody，BioLegend公司製造)1mg/mL之溶液((50mM之KH2PO4，pH值7.0)無糖)，並於50℃下乾燥30分鐘。再者，將諾羅病毒GII用測試線與控制線之間隔設為3mm。
依序組裝樣品墊(Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP)，MILLIPORE公司製造)、上述結合墊、上述抗體固定化膜片、及吸收墊(Cellulose Fiber Sample Pad(CFSP)，MILLIPORE公司製造)於墊片(商品名AR9020，Adhesives Research公司製造)上。再者，膜片係以諾羅病毒GI用測試線成為結合墊側、控制線成為吸收墊側之方式構成。
諾羅病毒抗原之迅速判定
以表4所示之組成製備諾羅病毒GI抗原(VLP GI/1)與諾羅病毒GII抗原(VLP GII/4)之混合液。繼而將該混合液100μL滴加至試驗帶之樣品墊部分。於15分鐘後，進行利用製作例之檢測器之測定、及諾羅病毒GI用測試線之利用螢光讀取器之判定、諾羅病毒GII用測試線之利用目視之判定。
根據該結果，對於諾羅病毒GI用測試線，於含有VLP GI/1 0.1ng/mL以上之樣品中，線之峰值之螢光強度與基線之螢光強度之差(I1-Ic)與未含有VLP GI/1之樣品之值相比，係明顯較大之值。又，於利用螢光讀取器之判定中，可知檢測極限為0.2ng/mL，因此本檢測方法為高感度。
同樣，對於諾羅病毒GII用測試線，於含有VLP GII/4 1ng/mL以上之樣品中，基線之螢光強度與線之峰值之螢光強度之差(Ic-I2)與未含有VLP GII/4之樣品之值相比，係明顯較大之值。又，於目視之判定中，檢測極限為2.5ng/mL，因此本檢測方法為高感度。
根據以上，本檢測方法可利用1次測定同時檢測2個項目，且根據螢光讀取器或目視之判定可謂高感度。
雖然將本發明與其實施態樣一併進行了說明，但只要發明人未特別指定，其並非在所說明之任何細節部分亦限定本發明，應考慮在不背離隨附之申請專利範圍所示之發明之精神與範圍之情況下進行廣泛地解釋。
本申請案係基於2012年11月28日在日本提出專利申請之日本特願2012-260227而主張優先權者，該等於本文中作為參照，其內容作為本說明書之記載之一部分而併入本文中。
1‧‧‧標的物質(被檢物質)
1A‧‧‧第1標的物質
1B‧‧‧第2標的物質
2‧‧‧螢光標記物
2a‧‧‧螢光微粒子
2b‧‧‧結合性物質
3‧‧‧吸光標記物
3a‧‧‧吸光微粒子
3b‧‧‧結合性物質
4、5‧‧‧試驗用捕捉性物質
6‧‧‧殼體
61‧‧‧檢測開口部
62‧‧‧檢體導入開口部
6a‧‧‧殼體上部
6b‧‧‧殼體下部
7‧‧‧參照用捕捉性物質
8a‧‧‧樣品墊
8b‧‧‧結合墊
8c‧‧‧膜片
8d‧‧‧吸收墊
10‧‧‧試片(試驗帶)
100‧‧‧長條試驗體
nt1‧‧‧第1試驗區域(測試線)
nt2‧‧‧第2試驗區域(測試線)
nr‧‧‧參照區域(參考線)
L‧‧‧側向流動方向
S‧‧‧檢體液

Claims (14)

  1. 一種免疫層析法，係於具有螢光粒子及吸光粒子作為標記粒子之試片，賦予有時含有標的物質A及B之檢體液而使上述螢光粒子與吸光粒子流動，並利用檢測裝置一次分別檢測測定由於上述試片之試驗區域所捕捉之螢光粒子及吸光粒子所發出之螢光及吸光的多項目檢測用免疫層析法，且上述檢測裝置具有檢測螢光及吸光之檢測部，另一方面，對於上述螢光粒子及吸光粒子，將該螢光粒子之螢光之激發波長(λ1)與吸光粒子之吸收波長(λ2)設為同一波長區域，且將上述螢光粒子所捕捉並檢測之標的物質A與上述吸光粒子所捕捉並檢測之標的物質B設為不同者，於上述試片，將捕捉上述螢光粒子之試驗區域nt1與捕捉上述吸光粒子之試驗區域nt2設為不同之位置，一次檢測測定上述試驗區域nt1之反射光強度、試驗區域nt2之反射光強度、以及試驗區域nt1及試驗區域nt2以外之非試驗區域之反射光強度。
  2. 如申請專利範圍第1項之免疫層析法，其中上述檢測裝置具有進行其控制之控制部；上述檢測裝置之控制部自此處發出指令，於經由上述檢測部而掃描上述試片時，一次檢測測定上述試驗區域nt1之反射光強度、試驗區域nt2之反射光強度、以及試驗區域nt1及試驗區域nt2以外之非試驗區域之反射光強度。
  3. 如申請專利範圍第1項之免疫層析法，其中上述檢測裝置具有讀取解析手段，該讀取解析手段係根據以下情況進行標的物質之檢測：捕捉上述螢光粒子之試驗區域nt1之反射光強度大於非試驗區域之反射光強度，另一方面，捕捉上述吸光粒子之試驗區域nt2之反射光強度小於上述非試驗區域之反射光強度。
  4. 如申請專利範圍第1項之免疫層析法，其中上述螢光粒子為螢光二氧化矽粒子，上述吸光粒子為金膠體粒子、著色二氧化矽粒子、或著色乳膠粒子。
  5. 如申請專利範圍第1項之免疫層析法，其中上述螢光激發波長(λ1)及吸光吸收波長(λ2)在波長300~800nm之範圍。
  6. 如申請專利範圍第1項之免疫層析法，其中上述試驗區域nt1與上述試驗區域nt2之間隔為1~10mm之範圍。
  7. 如申請專利範圍第1項之免疫層析法，其中根據屬於上述螢光激發波長之峰及/或屬於吸光吸收波長之峰之面積而將標的物質之量加以定量。
  8. 如申請專利範圍第1項之免疫層析法，其中藉由設置於上述檢測部之1個受光器，一併檢測捕捉上述螢光粒子之試驗區域nt1之反射光強度、捕捉上述吸光粒子之試驗區域nt2之反射光強度、及上述非試驗區域之反射光強度。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之免疫層析法，其中對於有時含有標的物質A及標的物質B之檢體，根據上述試驗區域nt1之反射光強度大於上述非試驗區域之反射光強度而判定標的物質A之存在，根據上述試驗區域nt2之反射光強度小於上述非試驗區域之反射光強度而判定標的物質B之存在，根據上述試驗區域nt1之反射光強度、上述試驗區域nt2之反射光強度、非試驗區域之反射光強度為相同程度之值而判定兩者之不存在，根據上述試驗區域nt1之反射光強度大於上述非試驗區域之反射光強度且上述試驗區域nt2之反射光強度小於上述非試驗區域之反射光強度而判定兩者之存在。
  10. 一種檢測裝置，係進行多項目檢測用免疫層析法之檢測裝置，該多項目檢測用免疫層析法係使用具有螢光粒子及吸光粒子作為標記粒子之試片，藉由賦予有時含有標的物質A及B之檢體液而使上述螢光粒子及吸光 粒子流動，並於上述試片一次檢測測定捕捉螢光粒子之試驗區域nt1之反射光強度、捕捉吸光粒子之試驗區域nt2之反射光強度、以及試驗區域nt1及試驗區域nt2以外之非試驗區域之反射光強度，上述檢測裝置具有檢測螢光及吸光之檢測部，於滿足下述(i)~(iii)之條件下，一次檢測測定上述試驗區域nt1之反射光強度、上述試驗區域nt2之反射光強度、及上述非試驗區域之反射光強度，(i)上述螢光粒子之螢光激發波長與上述吸光粒子之吸收波長為同一波長區域；(ii)上述標的物質A與上述標的物質B不同；(iii)上述試驗區域nt1與上述試驗區域nt2位於不同之位置。
  11. 如申請專利範圍第10項之檢測裝置，其具有進行其控制之控制部；上述檢測裝置之控制部自此處發出指令，於經由上述檢測部而掃描上述試片時，於滿足下述(i)~(iii)之條件下，一次檢測測定上述試驗區域nt1之反射光強度、上述試驗區域nt2之反射光強度、及上述非試驗區域之反射光強度，(i)上述螢光粒子之螢光激發波長與上述吸光粒子之吸收波長為同一波長區域；(ii)上述標的物質A與上述標的物質B不同；(iii)上述試驗區域nt1與上述試驗區域nt2位於不同之位置。
  12. 如申請專利範圍第10項之檢測裝置，其進而具有讀取解析手段，該讀取解析手段根據上述試驗區域nt1之反射光強度大於上述非試驗區域之反射光強度而判定標的物質A之存在，根據上述試驗區域nt2之反射光強度小於上述非試驗區域之反射光強度而判定標的物質B之存在，根據上述試驗區域nt1之反射光強度、上述試驗區域nt2之反射光強度、非試驗區域之反射 光強度為相同程度之值而判定兩者之不存在，根據上述試驗區域nt1之反射光強度大於上述非試驗區域之反射光強度且上述試驗區域nt2之反射光強度小於上述非試驗區域之反射光強度而判定兩者之存在。
  13. 如申請專利範圍第10項之檢測裝置，其中編入上述檢測裝置之檢測部中之受光器之受光感度於檢測上述吸光及螢光之波長區域中具有受光區域。
  14. 一種免疫層析法用試劑，其係用於申請專利範圍第1至9項中任一項之免疫層析法之試劑，且包含螢光粒子與吸光粒子而成，於上述螢光粒子中導入有捕捉標的物質A之結合性物質，於上述吸光粒子中導入有捕捉與標的物質A不同之標的物質B之結合性物質。
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