CN104471398B - 免疫层析法、该方法中使用的检测装置 - Google Patents

免疫层析法、该方法中使用的检测装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种免疫层析法，其是利用检测装置一并对荧光和吸光分别进行检验测定的多项目检测用免疫层析法，其中，对于荧光颗粒和吸光颗粒，将荧光颗粒的荧光的激发波长与吸光颗粒的吸收波长设为相同的波长区域，对测试区域的反射光强度、测试区域的反射光强度、以及测试区域和测试区域以外的非测试区域的反射光强度一并进行检验测定。

Description

免疫层析法、该方法中使用的检测装置
【技术领域】
本发明涉及免疫层析法、该方法中使用的检测装置和试剂。
【背景技术】
免疫层析法是使用纳米颗粒的诊断方法。该方法操作简便，至判定为止所需的时间较短，为5～30分钟程度，不需要昂贵的装置，因此作为优异的简易诊断方法多用于临床现场。例如，在流感病毒的感染的判定中，可以将采自患者的咽喉擦拭液或鼻腔擦拭液作为被测物，当场在短时间内进行判定，作为感染的简易判定方法的有力工具得到了普及。
免疫层析法中，一般使用金胶体、着色乳液颗粒等着色颗粒作为标记颗粒。根据检体的状态、量、或者测定的内容的不同，使用这些着色颗粒的免疫层析法中可能会有灵敏度不充分的情况。某些情况下，可能被判断为伪阴性·伪阳性，从而成为误诊等的原因。为了解决这些课题，面对免疫层析法的高灵敏度化进行了尝试。
迄今为止，作为免疫层析法的高灵敏度化的方法，本申请人提出了使用荧光颗粒的荧光免疫层析法、或者将其与吸光颗粒组合的方法(参照后述的专利文献1～3)。根据在此提出的技术，通过目视就能够对于由测试区域发出的荧光进行检测，但考虑到更高的精度及定量测定的方便性等因素也可以利用受光装置进行检测。作为可适于该测定的高灵敏度的检测装置，本申请人之前提出了下述专利文献4的利用特有的透镜体系的技术。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：国际公开第2008/018566号小册子
专利文献2：国际公开第2007/097377号小册子
专利文献3：日本特开2010-14631号公报
专利文献4：日本特开2010-197248号公报
【发明内容】
【发明所要解决的课题】
此外，本申请人还推进了多项目检测用免疫层析法的技术开发，其是利用将荧光颗粒和吸光颗粒组合而成的试剂，分别捕捉不同的目标物质从而进行检测的方法(所述专利文献3公开了使用荧光颗粒和吸光颗粒却捕捉相同目标物质的单项目检测技术)。由此能够在例如诊疗现场一并对2个以上的疾病或感染项目等进行诊断，能够利用免疫层析法大幅改善检査的效率。至今还没有在将荧光和吸光组合起来的设想之下的技术开发，关于其检测方法和装置的研究，也还处于未着手的状态。
鉴于以上情况，本发明的目的在于提供一种检测方法和检测装置，在将分别捕捉不同的目标物质的荧光颗粒和吸光颗粒组合利用的免疫层析法中，能够对荧光和吸光一并进行检验测定。
【解决课题的手段】
本发明的上述的课题通过下述的手段得到了解决。
〔1〕一种免疫层析法，其是多项目检测用免疫层析法，该方法中，在具有荧光颗粒和吸光颗粒作为标记颗粒的测试片上施加可能含有目标物质A和B的被测物液体，使所述荧光颗粒和吸光颗粒流动，从而利用检测装置一并对由在所述测试片的测试区域捕捉到的荧光颗粒和吸光颗粒所发出的荧光和吸光分别进行检验测定，
其特征在于，
所述检测装置具有检测荧光和吸光的检测部和对其进行控制的控制部，另一方面，
对于所述荧光颗粒和吸光颗粒，将该荧光颗粒的荧光的激发波长(λ1)与吸光颗粒的吸收波长(λ2)设为相同的波长区域，并且，将所述荧光颗粒捕捉并检测的目标物质A与所述吸光颗粒捕捉并检测的目标物质B设为不同的物质，
所述测试片中，将捕捉所述荧光颗粒的测试区域nt1与捕捉所述吸光颗粒的测试区域nt2设为不同的位置，
所述检测装置的控制单元由此发出指令，藉由所述检测部对所述测试片进行扫描时，对所述测试区域nt1的反射光强度、测试区域nt2的反射光强度、以及测试区域nt1和测试区域nt2以外的非测试区域的反射光强度一并进行检验测定。
〔2〕如〔1〕所述的免疫层析法，其中，所述检测装置具有读取解析单元，该读取解析单元根据捕捉所述荧光颗粒的测试区域nt1的反射光强度大于非测试区域的反射光强度、以及捕捉所述吸光颗粒的测试区域nt2的反射光强度小于所述非测试区域的反射光强度来进行目标物质的检测。
〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的免疫层析法，其中，所述吸光颗粒为金胶体颗粒、着色二氧化硅颗粒或着色乳液颗粒。
〔4〕如〔1〕～〔3〕的任一项所述的免疫层析法，其中，所述荧光激发波长(λ 1)和吸光吸收波长(λ2)处于波长为300～800nm的范围。
〔5〕如〔1〕～〔4〕的任一项所述的免疫层析法，其中，所述测试区域nt1与所述测试区域nt2的间隔为1～10mm的范围。
〔6〕如〔1〕～〔5〕的任一项所述的免疫层析法，其中，由属于所述荧光激发波长的峰和/或属于吸光吸收波长的峰的面积来对目标物质的量进行定量。
〔7〕如〔1〕～〔6〕的任一项所述的免疫层析法，其中，通过设于所述检测部的1个受光器，对捕捉所述荧光颗粒的测试区域nt1的反射光强度、捕捉所述吸光颗粒的测试区域nt2的反射光强度、和所述非测试区域的反射光强度同时进行检测。
〔8〕如〔1〕～〔7〕的任一项所述的免疫层析法，其中，对于可能含有目标物质A和目标物质B的被测物，由所述测试区域nt1的反射光强度大于所述非测试区域的反射光强度来判定目标物质A的存在，由所述测试区域nt2的反射光强度小于所述非测试区域的反射光强度来判定目标物质B的存在，由所述测试区域nt1的反射光强度、所述测试区域nt2的反射光强度、非测试区域的反射光强度为同程度的值来判定两者的不存在，由所述测试区域nt1的反射光强度大于所述非测试区域的反射光强度、且所述测试区域nt2的反射光强度小于所述非测试区域的反射光强度来判定两者的存在。
〔9〕一种检测装置，其是进行多项目检测用免疫层析法的检测装置，该免疫层析法中，使用具有荧光颗粒和吸光颗粒作为标记颗粒的测试片，施加可能含有目标物质A和B的被测物液体，使所述荧光颗粒和吸光颗粒流动，在所述测试片中，对捕捉荧光颗粒的测试区域nt1的反射光强度、捕捉吸光颗粒的测试区域nt2的反射光强度、测试区域nt1和测试区域nt2以外的非测试区域的反射光强度一并进行检验测定，
其中，
所述检测装置具有检测荧光和吸光的检测部和对其进行控制的控制部，
所述检测装置的控制单元由此发出指令，藉由所述检测部对所述测试片进行扫描时，在满足下述(i)～(iii)的条件下一并对所述测试区域nt1的反射光强度、所述测试区域nt2的反射光强度和所述非测试区域的反射光强度进行检验测定。
(i)所述荧光颗粒的荧光的激发波长与所述吸光颗粒的吸收波长为相同的波长区域。
(ii)所述目标物质A与所述目标物质B不同。
(iii)所述测试区域nt1与所述测试区域nt2处于不同的位置。
〔10〕如〔9〕所述的检测装置，其中，该检测装置还具有读取解析单元，该读取解析单元由所述测试区域nt1的反射光强度大于所述非测试区域的反射光强度来判定目标物质A的存在，由所述测试区域nt2的反射光强度小于所述非测试区域的反射光强度来判定目标物质B的存在，由所述测试区域nt1的反射光强度、所述测试区域nt2的反射光强度、非测试区域的反射光强度为同程度的值来判定两者的不存在，由所述测试区域nt1的反射光强度大于所述非测试区域的反射光强度、且所述测试区域nt2的反射光强度小于所述非测试区域的反射光强度来判定两者的存在。
〔11〕如〔9〕或〔10〕所述的检测装置，其中，对于在所述检测装置的检测部安装的受光器的受光灵敏度，在对所述吸光和荧光进行检测的波长区域具有受光区域。
〔12〕一种免疫层析法用试剂，其是用于〔1〕～〔8〕的任一项所述的免疫层析法的试剂，其中，该试剂含有荧光颗粒和吸光颗粒，所述荧光颗粒中导入有捕捉目标物质A的结合性物质，所述吸光颗粒中导入有捕捉目标物质B的结合性物质，所述目标物质与所述目标物质A不同。
本说明书中，“一并”进行检验测定是指，利用单一的装置对2个以上的项目进行检测或测定无需转换其他装置。也可以不是同时进行，但优选同时期(优选为30秒以内、更优选为10秒以内)进行检验测定。典型的含义是能够利用检测部通过一次扫描来进行检测和测定。
【发明的效果】
根据本发明的免疫层析法及其检测装置，在将分别捕捉不同的目标物质的荧光颗粒和吸光颗粒组合利用的免疫层析法中，能够对荧光和吸光一并进行检验测定。并且， 通过该一次性的荧光和吸光的检验测定，能够有效地进行2个以上的目标物质的检测等，能够大幅改善用于诊断和治疗等的免疫层析法测试的效率。此外，本发明的检测装置能够利用1个检测部对荧光和吸光一并进行检测，因此有利于免疫层析法中的省空间化和器件成本的降低。
此外，本发明的免疫层析法中，作为试剂颗粒(特别是荧光颗粒)可以举出二氧化硅颗粒和乳液颗粒，与乳液颗粒相比，二氧化硅是光透过性更高的材质，因此光源能够有效地浸入和透过内部，作为荧光颗粒的情况下，二氧化硅颗粒所含有的色素能够有效地得到激发，作为吸光颗粒的情况下，二氧化硅颗粒所含有的色素能够有效地吸收光源，发挥出更优异的效果。
本发明的上述和其他的特征和优点会通过下述的记载和附图得到进一步明确。
【附图说明】
图1是示意性表示适于本发明使用的长条测试体的分解立体图。
图2是适于本发明使用的免疫层析测试片的说明图，图2的(a)为俯视图，图2的(b)为展开截面图。
图3是表示本发明的优选实施方式的试剂颗粒的捕捉形态的说明图。
图4是示意性表示本发明的优选实施方式的杂化检测装置的实例的立体图。
图5是示意性表示本发明的免疫层析法中检测到的荧光峰和吸光峰与测试片的测试区域的关系的说明图。
图6是表示A型流感核蛋白质的浓度与I1-Ic的关系的曲线图。
图7是表示B型流感核蛋白质的浓度与Ic-I2的关系的曲线图。
【具体实施方式】
本发明的免疫层析法的特征在于利用特定的检测装置(以下有时称为“杂化检测装置”)一并对荧光和吸光进行检测。以下针对这一点，以优选的实施方式为中心进行详细说明。
[测试片]
首先，从本发明的优选实施方式的测试片的基本构成来进行说明。本实施方式的免疫层析法用测试片(试纸条)以下述部件相互产生毛细现象的方式串联联结。
·试样添加用部件(样品垫)8a
·渗入有荧光二氧化硅颗粒(荧光标记体)2和金胶体颗粒(吸光标记体)3并干燥所获得的部件(结合垫)8b
·具有测试区域和参照区域的膜(抗体固定化膜)8c
·吸收垫8d
本实施方式中，对构成测试片的部件没有特别限制，只要具有膜，也可以省略上述列举的部分部件，或者也可以组合使用上述以外的部件。例如，上述部件以外，也可以应用覆盖表面的透明膜，或者在各部件之间赋予功能性的片材。反过来，在将被测物液体与标记试剂纳米颗粒的混合液混合而滴加于样品垫的方法中，也可以省略结合垫。
本实施方式中，如图1和图2所示，上述的平面测试片10夹持内包于壳体上部6a与壳体下部6b之间，形成了长条测试体100。壳体上部6a设有检测开口部61和被测物导入开口部62。通过该检测开口部61，能够将照射光送至内部的膜10，从而对由此处发出的反射光强度进行检测·观测。另一方面，能够藉由被测物导入开口部62将被测物液体S供给至膜10进行测定测试。需要说明的是，本说明书中，将由荧光颗粒所发出的荧光、吸光颗粒所吸收的吸光以及测试区域以外的部分(非测试区域)中针对所述照射光的反射光总称为“反射光”。因此，将来自捕捉荧光颗粒的测试区域nt1的荧光的强度称为“测试区域nt1的反射光强度(I1)”，将来自捕捉吸光颗粒的测试区域nt2的吸光的强度称为“测试区域nt2的反射光强度(I2)”，将所述非测试区域的反射光强度称为“非测试区域的反射光强度(Ic)”。
本实施方式中，在所述测试片10的中央，在膜8c设有2个测试区域(第1测试区域nt1和第2测试区域nt2)。该第1测试区域nt1中配置并固定有捕捉目标物质(被测物质)1A的生物体分子4。即，第1测试区域中捕捉含有荧光颗粒的标记体2。另一方面，第2测试区域配置有捕捉目标物质(被测物质)1B的生物体分子5，在此捕捉吸光标记体3。由此能够对2个目标物质、即目标物质A(1A)和目标物质B(1B)进行区别检测。即，施加被测物液体s后，其中所含有的目标物质1(目标物质A(1A)和目标物质B(1B))随荧光标记体2和吸光标记体3一起朝着流动方向L在膜内流动。然后，捕捉到目标物质A(1A)的荧光标记体2被第1测试区域nt1捕捉，成为能够在此判断其存在的状态。进而，朝着流动方向L流动的目标物质B(1B)被吸光标记体3捕捉， 其在第2测试区域nt2被捕捉，由此处于能够对其存在进行检测的状态。
对上述的捕捉形态进行总结，本实施方式中，针对含有目标物质A和目标物质B的被测物试样，通过捕捉荧光颗粒的测试区域nt1的反射光强度(I1)大于测试区域nt1和测试区域nt2以外的非测试区域nc(参照图2)的反射光强度(Ic)(I1>Ic)来进行判定。并且，通过捕捉吸光颗粒的测试区域nt2的反射光强度(I2)小于非测试区域nc的反射光强度(Ic)(I2<Ic)来判定目标物质B的存在。通过捕捉荧光颗粒的测试区域nt1的反射光强度(I1)、捕捉吸光颗粒的测试区域nt2的反射光强度(I2)、非测试区域的反射光强度(Ic)为同程度的值来判定两者的不存在。可以通过捕捉荧光颗粒的测试区域nt1的反射光强度(I1)大于非测试区域的反射光强度(I2)、且捕捉吸光颗粒的测试区域nt2的反射光强度(I2)小于非测试区域的反射光强度(Ic)来判定两者的存在。由此能够通过一次扫描对可能含有2种目标物质的试样进行检验测定。需要说明的是，所述反射光的强度为同程度是指，根据需要以非测试区域的反射光强度(Ic)(a.u.)为基础，将Ic的±10％以内的情况称为“同程度”，更严格地说，是指Ic的±5％以内的情况。需要说明的是，反射光强度原本会根据测定装置和条件而变化，如上所述，可以通过利用相对值(比例)进行评价来归纳。严密地定义测定条件时，只要不特别声明，则设为后述实施例中测定的条件。
参照图2(a)和(b)对本实施方式的免疫层析法用试纸条进行说明，但本发明不限于这些说明。需要说明的是，图2中显示出了衬板8e而未做省略。图2(a)表示本发明的免疫层析法用试纸条(测试片)10的优选实施方式的俯视图，图2(b)是显示图2(a)中示出的免疫层析法用试纸条的展开纵截面图的图。如上所述，本实施方式的免疫层析法用试纸条10具备样品垫8a、结合垫8b、膜8c、吸收垫8d。此外，上述各构成部件利用带有粘合剂的衬板8e进行了打底。
图1和2中给出了按照叙述顺序配置有第1测试区域nt1、第2测试区域nt2、参照区域nr的例子。并且，本实施方式中，非测试区域nc被定义为膜8c的表面上第1测试区域nt1、第2测试区域nt2以及参照区域nr以外的部分。但是，本发明并不限于如此，例如测试区域的顺序可以相反，或者可以将参照区域的配置位置设于其他部分。并且，也可以是不设置参照区域nr的构成。
对第1测试区域nt1与第2测试区域nt2的间隔d(图2)没有特别限定，从避免由荧光与吸光的重复导致的光强度的相抵的方面考虑，优选为2mm～8mm，更优选为 3mm～5mm。
[目标物质]
本发明中，作为检测、定量的对象的目标物质1可以举出抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖链、配位体、受体、肽、化学物质等。本发明中，对含有目标物质1的试样没有特别限制，可以举出尿、血液等液体试样。在此示出本发明的重要特征之一，该目标物质经荧光检测到的物质(目标物质1A)和经吸光检测到的物质(目标物质1B)不同。从该方面考虑，本发明与针对同一目标物质利用荧光和吸光两者进行检测的所述专利文献3的技术在发明的基本构想上是不同的。
本发明的免疫层析法中，能够对目标物质A与目标物质B不同的2种以上的目标物质进行检测。其中，也可以出于确认不存在目标物质A和B(阴性)的目的进行检査。因此，被测物液体中可以含有目标物质A和B，也可以仅含有目标物质A或B，还可以不含有目标物质A和B中的任一种。
[样品垫]
样品垫8a是滴加含有目标物质的样品的构成部件。对其材料和尺寸等没有特别限定，可以利用应用于这种产品的通常的材料。
[结合垫]
结合垫8b是渗入有荧光二氧化硅颗粒等荧光标记体2和金胶体颗粒等吸光标记体3的构成部件。并且，由样品垫8a通过毛细现象移动来的试样所含有的目标物质是由于抗原抗体反应等特异性分子识别反应而被所述荧光二氧化硅颗粒(标记体)捕捉、标记的部分。对结合垫8b的每单位面积(cm2)的荧光标记体的含量没有特别限制，优选为1μg～100μg。吸光标记体也同样优选为1μg～100μg。作为渗入方法，可以举出涂布、滴加标记体的分散液或将标记体的分散液喷雾后进行干燥的方法等。
[膜]
在对抗体进行固定化的膜8c的抗体固定化部设有用于判断目标物质的有无、即判断阳性阴性的测试线(第1测试区域nt1和第2测试区域nt2)。该测试线nt1、nt2中，目标物质捕捉用抗体(测试用捕捉性物质)4和5分别得到固定化。此外，膜8c中含有用于捕捉荧光二氧化硅颗粒的抗体(参照用捕捉性物质)7得到了固定化的控制线(参照区域)nr。该测试区域nt1、nt2中，通过例如上述那样的组合，进行由固定化抗体(测试用捕捉性物质)-目标物质-标记体构成的夹层型免疫复合物形成反应(参照图3)。对 所述膜的判定部(测试区域、参照区域)的形状没有特别限制，只要固定化抗体被局部地固定化即可，可以举出线状、圆状、带状等，优选为线状，更优选为宽0.5～1.5mm的线状。
可以通过上述夹层型免疫复合物形成反应，捕捉经标记的目标物质，根据标记的程度来判断目标物质的有无(阳性阴性)。此时，在所述测试区域，荧光二氧化硅颗粒等荧光标记体和金胶体颗粒等吸光标记体得到浓缩，其附近发生荧光发光或吸光着色，可以利用检测器对其进行检测以及判定。
在此，将本发明的免疫层析法中的目标物质、捕捉性物质、颗粒的种类等的组合代表例列于表1。本发明不被限定解释为这些例子。表中()内的编号与附图中的符号对应(特别参照图3)。
本发明中，如此地设为能够将2个以上的目标物质利用同一波长区域的荧光和吸光进行检测的试剂成分的组合，因此能够利用单一的检测部(受光器)以高灵敏度对目标物质的有无和量进行检测。结果其优点在于能够使装置的结构和测定操作等简单化。
抗体固定化膜中的判定部优选设于离开与所述结合垫的联结端和与所述吸收垫的联结端一定程度的位置(例如所述膜的中间位置等)。由此能够充分完成所述夹层型免疫复合物形成反应。或者，由于能够避免由于液体试样中的着色或荧光物质等的标记所导致的对测定的影响和由未与目标物质结合的标记体所导致的对测定的影响，因此是优选的。
对所述抗体固定化部(测试区域)nt1、nt2中的抗体固定化量不特别限制，形状为线状的情况下，优选每单位长度(cm)为0.5μg～5μg。作为固定化方法，可以举出将抗体溶液涂布、滴加或喷雾后进行干燥，通过物理吸附固定化的方法等。上述的抗体固定化之后，为了防止由于非特异性吸附导致的对测定的影响，优选对所述抗体固定化膜整体实施所谓的阻断处理。例如可以举出在含有白蛋白、酪蛋白、聚乙烯醇等阻断剂的缓冲液中浸渍适当时间后干燥的方法等。作为市售的所述阻断剂，可以举出例如脱脂乳(DIFCO社制造)、4％Block Ace(明治乳业社制造)等。
如上所述，膜8c还设置有参照区域nr。在此捕捉未在测试区域捕捉到的标记体。由此，与测试区域的荧光进行对比，能够对目标物质的有无和量进行鉴定。为了实现该功能，作为参照用捕捉性物质7，选择与测试用结合性物质2b或3b具有结合性的物质。并且，参照区域也可以设置2处，这种情况下，一种参照用捕捉性物质选择与测试用结合性物质2b具有结合性的物质，另一种参照用捕捉性物质选择与测试用结合性物质3b具有结合性的物质。
[吸收垫]
吸收垫8d是用于通过毛细现象对在膜中移动而来的目标物质1A,1B和标记体2,3的混合物进行吸引从而在体系内产生一定流动的的构成部件。
对这些各构成部件的材料没有特别限制，可以使用用于免疫层析法用试纸条的部件。作为样品垫和结合垫优选GlassFiber Conjugate Pad(商品名、MILLIPORE社制造)等玻璃纤维垫。作为膜优选Hi-Flow Plus120膜(商品名、MILLIPORE社制造)等硝酸纤维素膜。作为吸收垫优选Cellulose Fiber Sample Pad(商品名、MILLIPORE社制造) 等纤维素膜。作为所述带有粘合剂的衬板，可以举出AR9020(商品名、Adhesives Research社制造)等。
[技术术语的含义]
对本说明书中的技术术语的含义进行确认，目标物质1(1A,1B)(将图1中的符号合并表示，但不被限定解释于此)是成为利用侧向流动法(lateral flow method)的检测对象的物质，与被测物中的被测物质含义相同。结合性物质2b,3b是分别具有对所述目标物质和捕捉性物质具有结合能的物质，优选为生物体分子。导入有结合性物质2b,3b的标记颗粒2a,3a称作标记体2。但是，广义来看，有时会以包含标记体的含义来使用标记颗粒这一术语。另一方面，在测试区域固定于膜、经由目标物质1(1A,1B)捕捉标记体2,3的物质是测试用捕捉性物质4,5。另一方面，在参照区域固定于膜的物质是参照用捕捉性物质7，此处标记体2,3不经由目标物质1(1A,1B)而被捕捉。
[荧光标记体]
作为荧光标记体2，可以合用荧光二氧化硅颗粒、荧光乳液颗粒、半导体纳米颗粒等。本发明中，特别优选使用荧光二氧化硅颗粒。
如后所述，二氧化硅的折射率为1.40～1.46左右，另一方面，乳液颗粒的折射率为1.6左右。因此，二氧化硅是光透过性高于乳液的材质，光源有效地浸入和透过内部，在荧光颗粒的情况下能够有效地激发二氧化硅颗粒所含有的色素，在吸光颗粒的情况下，二氧化硅颗粒所含有的色素能够有效地吸收光源，发挥出更优异的效果。
对荧光二氧化硅颗粒的制备方法没有特别限制，可以是根据任意的制备方法得到的二氧化硅颗粒。例如可以举出Journal of Colloid and Interface Science,159,150-157(1993)中记载的溶胶-凝胶法。
本发明中，特别优选使用根据国际公开2007/074722A1公报所记载的含有荧光色素化合物的胶体二氧化硅颗粒的制备方法所得到的含有功能性化合物的二氧化硅颗粒。作为所述功能性化合物的具体例，可以举出荧光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射线标记化合物、pH敏感性色素化合物等。
具体地说，含有所述功能性化合物的二氧化硅颗粒可以如下制备：使所述功能性化合物与硅烷偶联剂反应，使其通过共价键合、离子键合、其他化学键合或者吸附而得到生成物，使1种或2种以上的硅烷化合物与该生成物缩聚，从而形成硅氧烷键，从而制备出功能性化合物的二氧化硅颗粒。由此获得有机硅氧烷成分与硅氧烷成分进 行硅氧烷结合而成的二氧化硅颗粒。
作为含有所述功能性化合物的二氧化硅颗粒的优选制备方法的方式，可以如下进行制备：使具有或加成有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基、马来酰亚胺基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、醛基、对硝基苯基、二乙氧基甲基、环氧基、氰基等活性基的所述功能性化合物与具有与其活性基对应地反应的取代基(例如氨基、羟基、硫羟基)的硅烷偶联剂反应，使其共价键合而得到生成物，使1或2种以上的硅烷化合物与该生成物缩聚，从而形成硅氧烷键，由此进行制备。
以下列出作为所述硅烷偶联剂使用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)、作为硅烷化合物使用四乙氧基硅烷(TEOS)的情况。
【化1】
作为具有或加成有所述活性基的所述功能性化合物的具体例，可以举出5-(和-6)-羧基四甲基若丹明-NHS酯(商品名、emp Biotech GmbH社制造)、下式各自表示的DY550-NHS酯或DY630-NHS酯(均为商品名、Dyomics GmbH社制造)等具有NHS酯基的荧光色素化合物。
【化2】
作为具有所述取代基的硅烷偶联剂的具体例，可以举出γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三乙氧基硅烷、N-2(氨基乙基)3-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷等具有氨基的硅烷偶联剂。其中优选APS。
对进行所述缩聚的所述硅烷化合物没有特别限制，可以举出TEOS、γ-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS)、γ-巯基丙基三乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)、3-硫代氰合丙基三乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷、3-异氰酸根合丙基三乙氧基硅烷以及3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三乙氧基硅烷。其中，从形成所述二氧化硅颗粒内部的硅氧烷成分的方面考虑优选TEOS，从形成所述二氧化硅颗粒内部的有机硅氧烷成分的方面考虑优选MPS或APS。
以上述方式制备时，能够制造出球状或接近于球状的二氧化硅颗粒。所谓接近于球状的二氧化硅颗粒，具体是指长轴与短轴之比为2以下的形状。
为了得到所期望的平均粒径的二氧化硅颗粒，可以使用YM-10、YM-100(均为商品名、Millipore社制造)等超滤膜进行超滤，将粒径过大或过小的颗粒除去，或者利用适当的重力加速度进行离心分离，仅回收上清或沉淀，由此得到所期望的平均粒径的二氧化硅颗粒。
作为吸附或结合于所述二氧化硅颗粒的表面的生物体分子，可以举出抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖链、配位体、受体、蛋白质或肽。此处，配位体是指与蛋白质特异性结合的物质，是指例如与酶结合的基质、辅酶、调节因子、或者荷尔蒙、神经 传递物质等，不仅包括低分子量的分子和离子，也包括高分子量的物质。
荧光二氧化硅颗粒的平均粒径优选为1nm～1μm、更优选为20nm～500nm、特别优选为200nm～400nm。
本发明中，所述平均粒径是如下求出的值：根据由透过型电子显微镜(TEM)、扫描型电子显微镜(SEM)等的图像随机选择的100个标记试剂二氧化硅颗粒的合计投影面积，利用图像处理装置求出标记试剂二氧化硅颗粒的占有面积，将该合计的占有面积除以选择出的标记试剂二氧化硅颗粒的个数(100个)，求出相当于除得的值的圆的直径的平均值(平均圆相当直径)。
需要说明的是，所述平均粒径与包含一次颗粒凝集而成的二次颗粒的概念的后述的“基于动态光散射法的粒度”不同，其是仅由一次颗粒构成的颗粒的平均粒径。
乳液颗粒的密度为1g/cm3，由于密度小，因此减小粒径时可能无法通过离心分离来进行分离，无法作为标记颗粒使用。与此相对，二氧化硅的密度相对较大(例如约2g/cm3)，因此即使减小粒径，也易于通过离心分离来进行分离，能够适宜地作为标记颗粒使用。因此，本发明的检测中，使用二氧化硅颗粒时，能够使用粒径小于乳液颗粒的颗粒，因此能够广泛地选择所使用的颗粒的粒径，能够选择使膜内的移动特性最佳化的粒径更小的颗粒。从这样的方面考虑，本发明中优选使用二氧化硅颗粒。
并且，如下所示为低折射率，其不会由于周围的水的影响而引起光的散射，是使用二氧化硅颗粒的优势。特别地，本发明中，如后述实施例所示，在10ng/ml这样极其微量的检体的检测中也能确保精度的提高，从这方面出发也优选使用二氧化硅颗粒的标记试剂。
<折射率>589nm 23℃
聚苯乙烯珠 1.59
二氧化硅颗粒 1.40-1.46
水 1.33
(理科年表 国立天文台编)
反射光强度 R＝(n0-ni)2
n0 水的折射率
ni 颗粒的折射率
R(聚苯乙烯珠)＝7.93×10-3
R(二氧化硅颗粒)＝6.57×10-4～2.17×10-3
本说明书中，所述“基于动态光散射法的粒度”是利用动态光散射法测定的，其不同于所述的平均粒径，其是不仅为一次颗粒也包括一次颗粒凝集而成的二次颗粒的概念，是评价所述复合颗粒的分散稳定性的指标。
作为基于动态光散射法的粒度的测定装置，可以举出Zetasizer Nano(商品名；Malven社制造)。该方法中，测定微粒等光散射体的光散射强度的时间变动，根据其自相关函数计算光散射体的布朗运动速度，由其结果导出光散射体的粒度分布。
本发明的颗粒作为粒状物质优选为单分散，对粒度分布的变异系数所谓CV值没有特别限制，优选为10％以下，更优选为8％以下。
[吸光标记体]
吸光标记体3优选与荧光标记体2的情况同样地利用对于目标物质、参照用捕捉性物质具有良好的结合性的生物体分子等(结合性物质)3a对吸光微粒3a进行表面修饰。吸光微粒的表面修饰的实施方式与所述荧光微粒相同。
对吸光微粒的种类和形状没有特别限定。吸光微粒的平均粒径、构成材料等的优选例与所述荧光微粒相同。作为标记物质，只要微粒的构成材料为吸光性的也不必特别使用。应用标记物质(吸光物质)的情况下，可以使用多环颜料、偶氮颜料等有机颜料；炭黑、佛青等无机颜料。例如，在所述二氧化硅颗粒和乳液颗粒中可以包含所述吸光物质。并且，吸光微粒中也优选使用下述的半导体微粒等。
·半导体颗粒等
对所述半导体颗粒的材质没有特别限制，优选举出ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdO、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、InP、InAs、GaN、GaP、GaAs、TiO2、WO3、PbS、或者PbSe。例如可以使用日本专利第3897285号公报等中记载的半导体纳米颗粒。所述半导体纳米颗粒可以通过使硫醇化合物的-SH基与半导体纳米颗粒的表面的S、O、Se、Te、P、As、N等原子进行取代来进行表面修饰。作为金颗粒、所述金属纳米颗粒，可以使用日本特开2003-26638说明书等中记载的金胶体颗粒和金属胶体颗粒。作为所述金属胶体颗粒的具体例，可以举出铂、铜、氧化铁等金属胶体颗粒。作为所述无机结晶，可以举出氧化铁(III)(Fe2O3)、氧化银(I)(Ag2O)、氧化锡(IV)(SnO2)、二氧化钛(IV)(TiO2)、铟锡氧化物(ITO)等。例如可以使用日本特开2005-76064公报所记载的无机结晶。
通常，金胶体的表面等离子体效应大，而且有效地吸收可见光的波长，因此可见性良好。此外，由于吸收峰的波长与绿激光器的波长大致一致，因此通过与能够由绿激光器激发的荧光颗粒(例如含有若丹明6G的二氧化硅颗粒)组合，能够构建荧光的检测灵敏度高、且吸光的检测灵敏度也高的荧光·吸光一并检验测定装置。
·吸光系数
吸光微粒优选为吸收可见光进行着色从而能够看得到的微粒。优选其摩尔吸光系数ε为5×106M-1cm-1以上的颗粒，更优选摩尔吸光系数ε为5×107M-1cm-1～1×1010M-1cm-1。
此处，摩尔吸光系数ε可以根据下述朗伯比尔公式计算。
A＝Log10(I0/I)＝εbp＝asbp’
[A：吸光度、I：透过光的强度、I0：入射光的强度、ε：摩尔吸光系数(M-1cm-1)、b：光程长(cm)、p：标记颗粒(包含着色颗粒和荧光微粒的混合分散液)的浓度(M(mol/l))、as：比吸光度、p’：标记颗粒(包含着色颗粒和荧光微粒的混合分散液)的浓度(g/l)]
上述浓度p’(g/l)是由一定量(例如1ml)的标记颗粒分散液中只将标记颗粒回收、干燥并对所得的质量进行确定而得到的值。另一方面，上述浓度p(mol/l)是由TEM照片求出标记颗粒的尺寸并确定一个颗粒的体积，由颗粒的密度(例如二氧化硅颗粒的情况下为2.3g/cm3)确定一个颗粒的质量，由一定量(例如1ml)的标记颗粒分散液中只将标记颗粒回收、干燥并由所得的标记颗粒的质量确定摩尔数而得到的值。本发明中，所谓“标记颗粒的摩尔吸光系数ε”是指，通过针对标记颗粒分散液测定吸光度并将其应用于所述朗伯比尔公式所得到的所述分散液中的标记颗粒的摩尔吸光系数ε。标记颗粒的吸光度、吸光光谱和ε可以使用任意的吸光光度计或板读取器以水分散液、乙醇分散液、N,N-二甲基甲酰胺分散液等分散液的形式进行测定。
[荧光和吸光的波长]
本发明的优选实施方式中，对于所述荧光颗粒2a(荧光标记体2)和吸光颗粒3a(吸光标记体3)，使其荧光激发波长(典型性地为峰顶)〔λ1〕与吸收波长(典型性地为吸光峰顶)〔λ2〕为相同的波长区域。此处，对于所谓相同的波长区域，只要能够实现本发明所期望的效果，即通过1个检测部(受光器)检测荧光和吸光并以反向峰的形式读取，则没有特别限定。其中，由于优选能够在免疫层析法的制造工序中目视确认标记 颗粒、即进行呈色，因此优选荧光的激发波长和吸光的吸收波长(λ1、λ2)为300nm～800nm。进而，考虑荧光色素和着色色素的获得性等时，优选上述荧光和吸光的检测波长区域(λ1、λ2)为350～700nm，更优选为400nm～650nm。考虑通用的检测器(光传感器)的受光灵敏度特性时，特别优选为500nm～650nm。需要说明的是，此处所说的峰是指峰顶至其附近全体，狭义上是指峰顶(顶点)。需要说明的是，上述波长区域的荧光以目视大致看上去为绿色，吸光(着色)大致看上去为红色。对上述荧光激发波长〔λ1〕与吸收波长〔λ2〕的差〔Δλ〕没有特别限定，从适宜的一并检测的方面出发，其差〔Δλ＝λ1-λ2〕优选为60nm以下，更优选为30nm以下，特别优选为10nm以下。没有特别的下限，但实际中为0.5nm以上。需要说明的是，本发明中，对于光的波长，只要不特别声明，则设为后述实施例中测定的条件(装置、测定温度等)下的波长。例如，荧光色素、吸光色素均使用若丹明6G的情况下，荧光激发波长〔λ1〕与吸收波长〔λ2〕之差为23nm，荧光色素使用ATTO532、吸光色素使用TAMRA的情况下为7nm，满足上述关系。
[检测方法]
本发明的免疫层析法中，使用所述测试片，利用杂化检测装置对由此发出的荧光和吸光(着色)一并进行检验测定。图4是适宜性地显示所述检测装置的优选实施方式的立体图。本检测装置200具有以配线23将检测单元本体21与个人计算机(控制部)25连接起来的形态。所述检测单元本体21中内置有检测部20(参照图5)。该检测部20如下设计：在与由样品导入部21a沿着样品导板21b导入的长条测试体100的样品开口部61对应的位置上移动，对由此处露出的测试片10的表面进行扫描。由此能够对测试片10的测试区域(nt1、nt2)和参照区域nr的荧光或吸光、或者各区域的反射光强度(I1、I2、Ic)进行检验测定。
所述检测器20由受光器27、受光透镜28、光照射器29构成。图5的上图示意性地表示出使该检测部20沿着测试区域(nt1、nt2)从初期位置(i)起扫描至终期位置(f)时的状态。进而，图5的下图表示出此时检测到的荧光峰和吸光峰的实例。如该图所示，第1测试区域nt1中检测到向上凸的荧光峰，第2测试区域nt2中检测到向下凸的吸光峰。本实施例中，在参照线nr检测到荧光峰。两峰由于测试区域分开而不会被重叠地检测，光强度不会被相抵。如此地，能够利用1个检测部(受光器)对荧光和吸光这两者一并进行测定是本发明的优点。
本实施方式中，所述杂化检测装置的控制部25由此处发出指令，经由所述检测部对所述测试片进行扫描，一并对所述荧光峰和吸光峰进行检验测定。但是，并不限于这样的实施方式，控制部可以为任意的构成，例如可以安装于检测单元本体21的内部。本实施方式中，所述个人计算机(检测部)25兼作读取解析单元，该读取解析单元能够将所述荧光峰识别为向上凸或向下凸的峰，将所述吸光峰识别为与所述荧光峰上下相反地凸起的峰，对各个目标物质A1,B1进行检测，将其结果表示于表示部25a。其中，如上所述，该检测·解析中，不仅利用光的峰的解析，还能够广泛地由反射光强度(I1、I2、Ic)来判断目标物质的存在、不存在或进行其定量。
本实施方式中，优选使用所述杂化检测装置200作为由所述荧光峰和/或吸光峰的面积对目标物质的量进行定量的定量测定装置。进行这样的定量时，优选预先求出峰面积的校正曲线，对其进行对照，从而对被测物质的量进行鉴定。想要了解大致的量时、或者想要掌握通过荧光峰检测的被测物质与通过吸光峰检测的被测物质的相对关系等情况下，也可以不使用校正曲线而利用由峰求出的积分强度来进行定量测定。
根据本发明，能够利用1个测试片对2个以上的被测物质(目标物质)进行测定，因此能够适宜地防止测试片间的偏差和试样制作上的误差或误操作(样品的调换等)等，所以是优选的。并且，通过制成简易构成的检测装置，能够实现测试场所的移动和分散配置。在要求对大量的样品进行测试测定的公共医疗中的利用中，这样的优点特别显著。
如上所述，利用本发明的免疫层析法的目标物质的检测方法中，优选利用通过毛细现象等进行移动的标记体在判定部聚集所述颗粒并进行判定的检测，优选例如利用免疫层析法或微流路芯片等来进行。此时，二氧化硅颗粒可适宜地用作侧向流动用标记体。此外，本发明中，优选利用侧向流动型免疫层析法对目标物质进行检测。
作为所述试纸条的制作方法可以如下进行：按照样品垫、结合垫、抗体固定化膜、吸收垫的排列顺序，为了使各部件间容易产生毛管现象，将这些各部件的两端与相邻的部件重合1～5mm左右(优选在衬板上)进行贴附。
作为所述免疫层析法用荧光·吸光检测系统，优选为至少由(1)由样品垫、结合垫、抗体固定化膜和吸收垫构成的试纸条、以及(2)激发光源构成。
所述荧光检测系统中，从适宜地对所述二氧化硅颗粒(标记体)发出的荧光进行检测的方面考虑，优选所述激发光源(光照射器)发出波长为500nm～550nm的激发光。 作为所述激发光源，可以举出水银灯、卤素灯和氙灯。特别优选使用由激光器二极管或发光二极管照射出来的激发光。
此外，所述荧光检测系统更优选具备用于由所述激发光源中仅透过特定波长的光的过滤器，进而，从准确地检测荧光的方面考虑，更优选具备去除所述激发光而仅使荧光透过的过滤器。
所述受光器特别优选为接受所述荧光且对吸光(着色)进行检测的光电倍增管、CCD检测器、CMOS检测器，由此能够对无法通过目视确认的强度或波长的荧光进行检测，进而能够测定该荧光强度，因此能够进行目标物质的定量，能够进行高灵敏度的检测和定量。作为受光器的受光灵敏度的特性，从获得高灵敏度的制品的方面出发，优选在波长400～700nm具有高灵敏度的受光区域(受光峰)，更优选中波长500～600nm具有高灵敏度的受光区域(受光峰)。
【实施例】
以下基于实施例对本发明详细地进行说明。本发明并不受这些实施例的任何限定。
制备例1(荧光二氧化硅纳米颗粒的制备)
将5-(和-6)-羧基若丹明6G·琥珀酰亚胺基酯(商品名、emp Biotech GmbH社制造)2.9mg溶解于1mL的二甲基甲酰胺(DMF)。在其中添加1.3μL的APS，于室温(25℃)进行1小时反应。
将所得到的反应液600μL与乙醇140mL、TEOS6.5mL、蒸馏水35mL和28质量％氨水15.5mL混合，于室温进行24小时反应。
对反应液以15000×G的重力加速度进行30分钟离心分离，除去上清。在沉淀出的二氧化硅颗粒中添加蒸馏水4mL，使颗粒分散，再次以15000×G的重力加速度进行20分钟离心分离。进一步重复本清洗操作2次，将二氧化硅纳米颗粒分散液所含有的未反应的TEOS和氨等除去，得到平均粒径为227nm的二氧化硅纳米颗粒1.65g。收率约为94％。
制备例2(荧光二氧化硅颗粒与抗体的复合颗粒的制备)
在制备例1中使用过的含有浓度为5mg/ml的若丹明6G的荧光二氧化硅颗粒(平均粒径197nm)的分散液100μL(分散介质：蒸馏水)中添加蒸馏水775μL、浓度10mg/mL的藻酸钠水溶液(重均分子量70000)100μL和28重量％的氨水溶液25μL，于室温(24℃) 用1小时缓慢地混合。对所得到的胶体以12,000×G的重力加速度进行30分钟离心分离，除去上清。在其中添加蒸馏水875μL，使颗粒再分散。接着，添加10mg/mL的藻酸钠水溶液100μL，利用搅拌子充分搅拌后，添加28重量％的氨水溶液25μL，用1小时缓慢地混合。对该胶体以12,000×G的重力加速度进行30分钟离心分离，除去上清后，添加蒸馏水1mL使颗粒分散。进一步同样地进行2次离心分离和分散于蒸馏水的操作，对颗粒进行清洗，分散于蒸馏水200μL中，得到含有若丹明6G的二氧化硅颗粒/藻酸的复合颗粒的胶体(产率2.5mg/mL×200μL)。
在所述含有若丹明6G的荧光二氧化硅颗粒/藻酸的复合颗粒的胶体中依次添加0.5M的2-吗啉乙磺酸缓冲液(pH6.0)100μL、蒸馏水395μL、50mg/mL的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)水溶液230μL以及19.2mg/mL的EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)水溶液75μL，混合10分钟。
对胶体以12,000×G的重力加速度进行10分钟离心分离，除去上清。在其中添加50mM KH2PO4(pH7.0)400μL，使颗粒分散，进而添加源自山羊的抗A型流感核蛋白质抗体(Anti-Influenza A Virus Nucleoprotein,antibody,Goat-Poly,LifeSpan Biosciences社制造)100μL(0.5mg/mL)，于室温用30分钟缓慢地混合，使抗hCG抗体与所述二氧化硅纳米颗粒共价键合。
接着，对胶体以12,000×G的重力加速度进行10分钟离心分离，除去上清。在其中添加50mM KH2PO4(pH7.0)1mL，使颗粒分散、以12,000×G的重力加速度进行10分钟离心分离后，除去上清。在其中添加50mM KH2PO4(pH7.0)1mL，使颗粒分散，以12,000×G的重力加速度进行10分钟离心分离后，除去上清。在其中添加50mM KH2PO4(pH7.0)1mL，使颗粒分散，得到0.5mg/ml的二氧化硅颗粒与抗A型流感各蛋白质抗体的复合颗粒胶体1mL。
制备例3(金胶体与抗体的复合颗粒的制备)
在金胶体(粒径40nm)0.5mL中添加50μg/mL的抗B型流感核蛋白质抗体(Anti-Human Influenza B,Momoclonal(Clone 9D6)，宝生物社制造)100μL，于室温静置10分钟。接着，添加含有1重量％的牛血清白蛋白的磷酸缓冲液(pH7.5)100μL，进一步于室温静置10分钟。其后，以8,000×G进行15分钟离心分离，除去上清，添加含有1重量％的牛血清白蛋白的磷酸缓冲液(pH7.5)100μL，使颗粒分散。
制作例(检测装置)
制作检测装置，该检测装置具有由光源、滤光器和光电倍增管(PMT)构成的检测单元，该检测单元具备通过马达以一定速度直线移动的机构，具备每隔50μ秒对PMT的受光强度进行记录的记录机构。需要说明的是，检测单元是光源为532nm的激光器二极管，其具备以下机构：将激光器二极管照射至样品，使反射光透过仅使550nm以上的波长的光透过的滤光器后，利用光电倍增管(PMT)(Hamamatsu Photonics社制造，端窗型光电倍增管(商品名))进行受光。需要说明的是，本实施例中，反射光的检测均于室温(25℃)进行。
实施例1(免疫层析法用试纸条的制作)
将制备例1、2中得到的荧光二氧化硅颗粒与抗体的复合颗粒的胶体240μL和制备例3中得到的金胶体颗粒与抗体的复合颗粒100μL与50mM KH2PO4(pH7.0)460μL混合。将所得到的混合液800μL均匀地涂布于Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP、MILLIPORE社制造)(8×150mm)。在干燥器内于室温下进行一夜减压干燥，制作出含有制备例中得到的复合颗粒的结合垫。
接着，按以下的方法制作抗体固定化膜。
在从膜(长25mm、商品名：Hi-Flow Plus120膜、MILLIPORE社制造)的一端起约9mm的位置上，以0.75μL/cm的涂布量涂布含有源自小鼠的抗A型流感核蛋白质抗体(Influenza A nucleoprotein，InA245，HyTest社制造)1mg/mL的溶液((50mMKH2PO4，pH7.0)+5％蔗糖)，成为宽约1mm的A型流感用测试线。
接着，以0.75μL/cm的涂布量涂布含有源自小鼠的抗B型流感核蛋白质抗体(Influenza B Virus Nucleoprotein antibody、Fitzgerald社制造)1mg/mL的溶液((50mMKH2PO4,pH7.0)+5％蔗糖)，成为宽约1mm的B型流感用测试线。需要说明的是，A型流感用测试线与B型流感用测试线的间隔d为3mm。
接着，以0.75μL/cm的涂布量涂布含有源自山羊的抗小鼠IgG抗体(AKP Goat anti-mouse IgG Antibody、BioLegend社制造)1mg/mL的溶液((50mMKH2PO4，pH7.0)无糖)，成为宽约1mm的控制线，于50℃干燥30分钟。需要说明的是，B型流感用测试线与控制线的间隔为3mm。
在衬板(商品名AR9020,Adhesives Research社制造)上按叙述顺序组装样品垫(Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP)、MILLIPORE社制造)、所述结合垫、所述抗体固定化膜以及吸收垫(Cellulose Fiber Sample Pad(CFSP)、MILLIPORE社制造)。需要说明 的是，膜以A型流感用测试线为结合垫侧、控制线为吸收垫侧的朝向构成。
流感核蛋白质的迅速判定
以表2所示的组成制备A型流感核蛋白质与B型流感核蛋白质的混合液。接着将该混合液在试纸条的样品垫部分滴加100μL。15分钟后，利用检测器进行制作例的测定，利用荧光读取器进行A型流感用测试线的判定，利用目视进行B型流感用测试线的判定。此处荧光读取器是由波长532nm的激光器二极管和滤光器构成的装置，是通过在膜的线区域照射所述激光器二极管，藉由光学膜对线进行观察从而仅对由荧光颗粒发出的荧光进行观察的装置。
作为测定结果的一例，图5示出测定No16的膜时的荧光廓线。图中在位置9mm附近向上凸的峰是与A型流感用测试线结合的荧光二氧化硅颗粒带来的峰。位置12mm附近向下凸的峰是与B型流感用测试线结合的金胶体带来的峰。位置15mm附近向上凸的峰是与控制线结合的荧光二氧化硅颗粒带来的峰。
测定和判定的结果列于表2。表中线nt1表示A型流感用测试线，线nt2表示B型流感用测试线。判定器的值的基线值是膜的位置10.5mm处的荧光强度的值。线nt1的值是A型流感用测试线的荧光强度的峰值(I1)。线nt2的值是B型流感用测试线的荧光强度的峰值(I2)。并且，线的判定中，线nt1是使用荧光读取器进行的判定，线nt2是目视的判定。“+”表示线可见，“-”表示线不可见。需要说明的是，荧光读取器是以目视观察的装置，其照射532nm的激光器二极管作为光源，使反射光通过仅使540nm以上的波长的光透过的滤光器，从而以目视观察。
图6和图7分别表示出A型流感核蛋白质的浓度与I1-Ic的关系和B型流感核蛋白质浓度与Ic-I2的关系。
根据该结果，对于A型流感用测试线，在含有A型流感核蛋白质10ng/mL以上的样品中，线的峰的荧光强度与基线(参照图5中的辅助线Ic)的荧光强度之差(I1-Ic)是与不含有A型流感核蛋白质的样品的值相比明显更大的值。具体地说，在含有A型流感核蛋白质100ng/mL以上的样品中，线的峰的荧光强度与基线的荧光强度之差(I1-Ic)是基线的荧光强度Ic的30％以上的值，与此相对，不含有A型流感核蛋白质的样品中为5％以下的值。并且，利用荧光读取器的判定中，检测极限为20ng/mL，因此可知本检测方法为高灵敏度。
同样地，对于B型流感用测试线，在含有B型流感核蛋白质200ng/mL以上的样 品中，基线的荧光强度与线的峰的荧光强度之差(Ic-I2)是与不含有B型流感核蛋白质的样品的值相比明显更大的值。具体地说，含有B型流感核蛋白质200ng/mL以上的样品中，基线的荧光强度与线的峰的荧光强度之差(Ic-I2)是基线的荧光强度Ic的15％以上的值，与此相对，不含有B型流感核蛋白质的样品中是4％以下的值。并且，利用目视的判定中，检测极限为500ng/mL，因此本检测方法为高灵敏度。
通过以上结果，可以说本检测方法能够通过1次测定同时进行2项检测，并且灵敏度高于荧光读取器和目视的判定。
【表2】
A型：A型流感核蛋白质
B型：B型流感核蛋白质
线的判定：线nt1利用荧光读取器判定。线nt2利用目视判定。
(实施例2)目标物质的定量
基于实施例1的表2所示结果，制作A型流感核蛋白质与B型流感核蛋白质的校正曲线。基于此，采集两种被测体A,B(体液)，利用上述的装置对两种被测体A,B一并进行检测。其结果，被测体A中，I1-Ic为0.216、Ic-I2为0.002。被测体B中，I1-Ic为0.005、Ic-I2为0.044。根据该结果鉴定出，该测试体A的A型流感核蛋白质为27ng/ml，该测试体B的B型流感核蛋白质为246ng/ml。使用其他方法(ELISA法)对上述被测物的成分进行鉴定，结果与上述的结果完全一致。由该结果可知，根据本发明能够进行高精度的定量检测。
此外，将峰强度差变更为峰面积，制作上述的校正曲线，进行定量测定。结果可 知定量检测的精度进一步得到了提高。
制备例4(吸光二氧化硅纳米颗粒的制备)
将5-(和-6)-羧基若丹明6G·琥珀酰亚胺基酯(商品名、emp Biotech GmbH社制造)2.9mg溶解于1mL的二甲基甲酰胺(DMF)。在其中添加1.3μL的APS，于室温(25℃)进行1小时反应。
接着，在庚烷4ml中添加AOT(气溶胶OT)280mg。在其中添加蒸馏水40μl、28％氨水40μl，充分搅拌，制备出反胶束。
在上述的反胶束液中添加5-(和-6)-羧基若丹明6G/硅烷偶联剂复合物溶液200μl、TEOS(正硅酸四乙酯)100μl，室温下充分混合，进行24小时反应。
在反应液中添加丙酮4ml充分混合后，以22000×g的重力加速度进行30分钟离心分离，除去上清。在沉淀出的二氧化硅颗粒中添加乙醇1ml使其分散，再次以22000×g的重力加速度进行30分钟离心分离。进一步重复本清洗操作2次。接着，在沉淀出的二氧化硅颗粒中添加蒸馏水1ml使其分散，以22000×g的重力加速度进行30分钟离心分离。进一步重复进行本清洗操作2次，将吸光二氧化硅颗粒分散液所含有的未反应的TEOS和氨等除去。
由此得到含有5-(和-6)-羧基若丹明6G的吸光二氧化硅颗粒(平均粒径238nm)20.2mg。收率为74％。
(含有5-(和-6)-羧基若丹明6G的吸光二氧化硅颗粒的吸光光谱以及吸光最大波长下的摩尔吸光系数ε的测定)
使用吸光光度计(Molecular Devices社制造)和光程长1cm的比色杯，对含有5-(和-6)-羧基若丹明6G的吸光二氧化硅颗粒的水分散液的吸光光谱和吸光最大波长(546nm)下的摩尔吸光系数ε进行测定。532nm下的ε为1.1×1010M-1cm-1。
制备例5(二氧化硅颗粒与抗体的复合颗粒的制备)
采用与制备例2相同的方法得到0.5mg/ml的制备例6的含有5-(和-6)-羧基若丹明6G的吸光二氧化硅颗粒与抗B型流感各蛋白质抗体的复合颗粒胶体1mL。
(实施例3)
采用与实施例1相同的方法实施流感核蛋白质的迅速判定测试。测定和判定的结果列于表3。
【表3】
根据该结果，对于A型流感用测试线，在含有A型流感核蛋白质10ng/mL以上的样品中，线的峰的荧光强度与基线的荧光强度之差(I1-Ic)是与不含有A型流感核蛋白质的样品的值相比明显大的值。并且，利用荧光读取器的判定中，检测极限为20ng/mL，因此可知本检测方法为高灵敏度。
同样地，对于B型流感用测试线，在含有B型流感核蛋白质200ng/mL以上的样品中，基线的荧光强度与线的峰的荧光强度之差(Ic-I2)是与不含有B型流感核蛋白质的样品的值相比明显更大的值。并且，利用目视的判定中，检测极限为500ng/mL，因此本检测方法为高灵敏度。
通过以上结果，可以说本检测方法能够通过1次测定同时进行2项检测，并且灵敏度高于荧光读取器和目视的判定。
制备例6(荧光二氧化硅纳米颗粒的制备)
将ATTO532-NHS酯(商品名、ATTO-TEC GmbH社制造)3.5mg溶解于1mL的二 甲基甲酰胺(DMF)。在其中添加1.3μL的APS，于室温(25℃)进行1小时反应。
将所得到的反应液600μL与乙醇140mL、TEOS6.5mL、蒸馏水35mL和28质量％氨水15.5mL混合，于室温进行24小时反应。
对反应液以15000×G的重力加速度进行30分钟离心分离，除去上清。在沉淀出的二氧化硅颗粒中添加蒸馏水4mL，使颗粒分散，再次以15000×G的重力加速度进行20分钟离心分离。进一步重复进行本清洗操作2次，将二氧化硅纳米颗粒分散液所含有的未反应的TEOS和氨等除去，得到平均粒径为238nm的二氧化硅纳米颗粒1.47g。收率约为83％。
制备例7(二氧化硅颗粒与抗体的复合颗粒的制备)
采用与制备例2相同的方法得到0.5mg/ml的含有ATTO532的荧光二氧化硅颗粒与抗诺如病毒GI单克隆的抗体(本公司制造)的复合颗粒胶体1mL。
制备例8(吸光二氧化硅纳米颗粒的制备)
将5-(和-6)-羧基若丹明琥珀酰亚胺酯(Molecular Probes社制造)3.3mg溶解于1ml的二甲基甲酰胺(DMF)。在其中添加1.4μl的APS(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)，于室温(23℃)进行1小时反应，得到TAMRA/硅烷偶联剂复合物溶液。
接着，在庚烷4ml中添加AOT(气溶胶OT)280mg。在其中添加蒸馏水40μl、28％氨水40μl，充分搅拌，制备出反胶束。
在上述的反胶束液中添加TAMRA/硅烷偶联剂复合物溶液200μl、TEOS(正硅酸四乙酯)100μl，室温下充分混合，进行24小时反应。
在反应液中添加丙酮4ml充分混合后，以22000×g的重力加速度进行30分钟离心分离，除去上清。在沉淀出的二氧化硅颗粒中添加乙醇1ml使其分散，再次以22000×g的重力加速度进行30分钟离心分离。进一步重复本清洗操作2次。接着，在沉淀出的二氧化硅颗粒中添加蒸馏水1ml使其分散，以22000×g的重力加速度进行30分钟离心分离。进一步重复本清洗操作2次，将吸光二氧化硅颗粒分散液所含有的未反应的TEOS和氨等除去。
由此得到含有TAMRA的吸光二氧化硅颗粒(平均粒径211nm)18.0mg。收率为66％。
(含有TAMRA的胶体二氧化硅颗粒的吸光光谱以及吸光最大波长下的摩尔吸光系数ε的测定)
使用吸光光度计(Molecular Devices社制造)和光程长1cm的比色杯，对含有TAMRA的胶体二氧化硅颗粒的水分散液的吸光光谱和吸光最大波长(546nm)下的摩尔吸光系数ε进行测定。660nm下的ε为1.6×1010M-1cm-1。
制备例9(二氧化硅颗粒与抗体的复合颗粒的制备)
采用与制备例2相同的方法得到0.5mg/ml的含有TAMRA的吸光二氧化硅颗粒与抗诺如病毒GII单克隆的抗体(本公司制造)的复合颗粒胶体1mL。
(实施例4)
将制备例7中得到的荧光二氧化硅颗粒与抗体的复合颗粒的胶体240μL、制备例9中得到的吸光二氧化硅颗粒与抗体的复合颗粒100μL和50mM KH2PO4(pH7.0)460μL混合。将所得到的混合液800μL均匀地涂布于玻璃纤维结合垫(Glass Fiber Conjugate Pad，GFCP，MILLIPORE社制造)(8×150mm)。在干燥器内于室温下进行一夜减压干燥，制作出含有制备例中得到的复合颗粒的结合垫。
接着，按以下的方法制作抗体固定化膜。
在从膜(长25mm、商品名：Hi-Flow Plus180膜、MILLIPORE社制造)的一端起约9mm的位置上，以0.75μL/cm的涂布量涂布含有源自小鼠的抗诺如病毒GI抗体(本公司制造)1mg/mL的溶液((50mM KH2PO4,pH7.0)+5％蔗糖)，成为宽约1mm的诺如病毒GI用测试线。
接着，以0.75μL/cm的涂布量涂布含有源自小鼠的抗诺如病毒GII抗体(本公司制造)1mg/mL的溶液((50mM KH2PO4,pH7.0)+5％蔗糖)，成为宽约1mm的诺如病毒GII用测试线。需要说明的是，诺如病毒GI用测试线与诺如病毒GII用测试线的间隔d为3mm。
接着，以0.75μL/cm的涂布量涂布含有源自山羊的抗小鼠IgG抗体(AKP Goat anti-mouse IgG Antibody、BioLegend社制造)1mg/mL的溶液((50mM KH2PO4,pH7.0)无糖)，成为宽约1mm的控制线，于50℃干燥30分钟。需要说明的是，诺如病毒GII用测试线与控制线的间隔为3mm。
在衬板(商品名AR9020,Adhesives Research社制造)上按叙述顺序组装样品垫(Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP)、MILLIPORE社制造)、所述结合垫、所述抗体固定化膜以及吸收垫(Cellulose Fiber Sample Pad(CFSP)、MILLIPORE社制造)。需要说明的是，膜以诺如病毒GI用测试线为结合垫侧、控制线为吸收垫侧的朝向构成。
诺如病毒抗原的迅速判定
以表4所示的组成制备诺如病毒GI抗原(VLP GI/1)与诺如病毒GI抗原(VLP GII/4)的混合液。接着将该混合液在试纸条的样品垫部分滴加100μL。15分钟后，利用检测器进行制作例的测定，利用荧光读取器进行诺如病毒GI用测试线的判定，利用目视进行诺如病毒GII用测试线的判定。
【表4】
根据该结果，对于诺如病毒GI用测试线，在含有VLP GI/10.1ng/mL以上的样品中，线的峰的荧光强度与基线的荧光强度之差(I1-Ic)是与不含有VLP GI/1的样品的值相比明显更大的值。并且，利用荧光读取器的判定中，检测极限为0.2ng/mL，因此可知本检测方法为高灵敏度。
同样地，对于诺如病毒GII用测试线，在含有VLP GII/4 1ng/mL以上的样品中，基线的荧光强度与线的峰的荧光强度之差(Ic-I2)是与不含有VLP GII/4的样品的值相比明显更大的值。并且，利用目视的判定中，检测极限为2.5ng/mL，因此本检测方法为高灵敏度。
通过以上结果，可以说本检测方法能够通过1次测定同时进行2项检测，并且灵敏度高于荧光读取器和目视的判定。
将本发明与其实施方式一并进行了说明，但只要发明人未特别指定，则说明中的任何细节均不会对本发明构成限定，应当在不违反所附权利要求书中所示的发明的精 神和范围的情况下宽泛地解释本发明。
本申请要求享有基于2012年11月28日向日本国提交的日本特愿2012-260227的优先权，在此参照该优先权的内容并将其内容作为本说明书的记载的一部分引入。
【符号的说明】
1 目标物质(被测物质)
1A 第1目标物质
1B 第2目标物质
2 荧光标记体
2a 荧光微粒
2b 结合性物质
3 吸光标记体
3a 吸光微粒
3b 结合性物质
4、5 测试用捕捉性物质
6 壳体
61 检测开口部
62 被测物导入开口部
6a 壳体上部
6b 壳体下部
8a 样品垫
8b 结合垫
8c 膜
8d 吸收垫
8e 衬板
7 参照用捕捉性物质
10 测试片(试纸条)
100 长条测试体
nt1 第1测试区域(测试线)
nt2 第2测试区域(测试线)
nr 参照区域(参照线)
L 侧向流动方向
S 被测物液体
20 检测部
21 检测单元本体
21a 样品导入部
21b 样品导板
23 配线
25 个人计算机(控制部)
27 受光器
28 受光透镜
29 光照射器

Claims (11)

1.一种免疫层析法，其是多项目检测用免疫层析法，该方法中，在具有荧光颗粒和吸光颗粒作为标记颗粒的测试片上施加可能含有目标物质A和B的被测物液体，使所述荧光颗粒和吸光颗粒流动，从而利用检测装置一并对由在所述测试片的测试区域捕捉到的荧光颗粒和吸光颗粒所发出的荧光和吸光分别进行检验测定，
其中，
所述检测装置具有检测荧光和吸光的检测部和对其进行控制的控制部，另一方面，
对于所述荧光颗粒和吸光颗粒，将该荧光颗粒的荧光的激发波长(λ1)与吸光颗粒的吸收波长(λ2)设为相同的波长区域，并且，将所述荧光颗粒捕捉并检测的目标物质A与所述吸光颗粒捕捉并检测的目标物质B设为不同的物质，
所述测试片中，将捕捉所述荧光颗粒的测试区域nt1与捕捉所述吸光颗粒的测试区域nt2设为不同的位置，
所述检测装置的控制部由此发出指令，藉由所述检测部对所述测试片进行扫描时，对所述测试区域nt1的反射光强度、测试区域nt2的反射光强度、以及测试区域nt1和测试区域nt2以外的非测试区域的反射光强度一并进行检验测定。
2.如权利要求1所述的免疫层析法，其中，
所述检测装置具有读取解析单元，该读取解析单元根据捕捉所述荧光颗粒的测试区域nt1的反射光强度大于非测试区域的反射光强度、以及捕捉所述吸光颗粒的测试区域nt2的反射光强度小于所述非测试区域的反射光强度来进行目标物质的检测。
3.如权利要求1或2所述的免疫层析法，其中，
所述荧光颗粒为荧光二氧化硅颗粒，所述吸光颗粒为金胶体颗粒、着色二氧化硅颗粒或着色乳液颗粒。
4.如权利要求1或2所述的免疫层析法，其中，
所述荧光激发波长(λ1)和吸光吸收波长(λ2)处于波长为300nm～800nm的范围。
5.如权利要求1或2所述的免疫层析法，其中，
所述测试区域nt1与所述测试区域nt2的间隔为1～10mm的范围。
6.如权利要求1或2所述的免疫层析法，其中，
由在所述荧光的激发波长下激发产生的荧光峰的面积和/或在所述吸光吸收波长下照射产生的吸光峰的面积来对目标物质的量进行定量。
7.如权利要求1或2所述的免疫层析法，其中，
通过设于所述检测部的1个受光器，对捕捉所述荧光颗粒的测试区域nt1的反射光强度、捕捉所述吸光颗粒的测试区域nt2的反射光强度、和所述非测试区域的反射光强度同时进行检测。
8.如权利要求1或2所述的免疫层析法，其中，
对于可能含有目标物质A和目标物质B的被测物，由所述测试区域nt1的反射光强度大于所述非测试区域的反射光强度来判定目标物质A的存在，由所述测试区域nt2的反射光强度小于所述非测试区域的反射光强度来判定目标物质B的存在，由所述测试区域nt1的反射光强度、所述测试区域nt2的反射光强度、非测试区域的反射光强度为同程度的值来判定两者的不存在，由所述测试区域nt1的反射光强度大于所述非测试区域的反射光强度、且所述测试区域nt2的反射光强度小于所述非测试区域的反射光强度来判定两者的存在。
9.一种检测装置，其是进行多项目检测用免疫层析法的检测装置，该免疫层析法中，使用具有荧光颗粒和吸光颗粒作为标记颗粒的测试片，施加可能含有目标物质A和B的被测物液体，使所述荧光颗粒和吸光颗粒流动，在所述测试片中，对捕捉荧光颗粒的测试区域nt1的反射光强度、捕捉吸光颗粒的测试区域nt2的反射光强度、测试区域nt1和测试区域nt2以外的非测试区域的反射光强度一并进行检验测定，
其中，
所述检测装置具有检测荧光和吸光的检测部和对其进行控制的控制部，
所述检测装置的控制部由此发出指令，藉由所述检测部对所述测试片进行扫描时，在满足下述(i)～(iii)的条件下一并对所述测试区域nt1的反射光强度、所述测试区域nt2的反射光强度和所述非测试区域的反射光强度进行检验测定：
(i)所述荧光颗粒的荧光的激发波长与所述吸光颗粒的吸收波长为相同的波长区域；
(ii)所述目标物质A与所述目标物质B不同；
(iii)所述测试区域nt1与所述测试区域nt2处于不同的位置。
10.如权利要求9所述的检测装置，其中，
该检测装置还具有读取解析单元，该读取解析单元由所述测试区域nt1的反射光强度大于所述非测试区域的反射光强度来判定目标物质A的存在，由所述测试区域nt2的反射光强度小于所述非测试区域的反射光强度来判定目标物质B的存在，由所述测试区域nt1的反射光强度、所述测试区域nt2的反射光强度、非测试区域的反射光强度为同程度的值来判定两者的不存在，由所述测试区域nt1的反射光强度大于所述非测试区域的反射光强度、且所述测试区域nt2的反射光强度小于所述非测试区域的反射光强度来判定两者的存在。
11.如权利要求9或10所述的检测装置，其中，
对于在所述检测装置的检测部安装的受光器的受光灵敏度，在对所述吸光和荧光进行检测的波长区域具有受光区域。
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