KR101523487B1 - 면역크로마토그래피, 이것에 이용되는 검출 장치 및 시약 - Google Patents

면역크로마토그래피, 이것에 이용되는 검출 장치 및 시약 Download PDF

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Abstract

형광 및 흡광을 각각 검출 장치로 일괄하여 검출 측정하는 다항목 검출용 면역크로마토그래피로서, 형광 입자 및 흡광 입자는, 형광 입자의 형광의 여기 파장과 흡광 입자의 흡수 파장이 동일한 파장 영역이 되고, 시험 영역의 반사광 강도와 시험 영역의 반사광 강도와 시험 영역 및 시험 영역 이외의 비시험 영역의 반사광 강도를 일괄하여 검출 측정하는 면역크로마토그래피.

Description

면역크로마토그래피, 이것에 이용되는 검출 장치 및 시약{IMMUNOCHROMATOGRAPHY, AND DETECTOR AND REAGENT FOR USE THEREIN}
본 발명은, 면역크로마토그래피, 이것에 이용되는 검출 장치 및 시약에 관한 것이다.
면역크로마토그래피는, 나노 입자를 이용한 진단 수법이다. 이 수법은 조작이 간편하고, 판정까지 필요로 하는 시간이 5 ~ 30분 정도로 비교적 단시간이며, 고가의 장치를 필요로 하지 않는 것으로부터 우수한 간이 진단 수법으로서 임상의 현장에서 많이 사용되고 있다. 예를 들면, 인플루엔자 바이러스의 감염 판정에서는, 환자로부터 채취한 인두 스왑(throat swab)이나 비강 스왑(nasal swab)을 검체로 하여, 그 자리에서, 단시간에 판정이 가능하고, 감염의 간이 판정 수법으로서 유력한 툴로서 보급되어 있다.
면역크로마토그래피에서는 일반적으로 금 콜로이드나 착색 라텍스 입자 등의 착색 입자가 표지 입자로서 이용되고 있다. 검체 상태나 양, 혹은 측정하는 내용에 따라서는, 이러한 착색 입자를 이용한 면역크로마토그래피에서는, 그 감도가 충분하지 않은 것이 있다. 경우에 따라서는, 거짓 음성ㆍ거짓 양성으로 판정되어 버리고, 그러면 오진 등의 원인이 될 수도 있다. 이들 과제를 해결하기 위해서, 면역크로마토그래피의 고감도화를 향한 시도가 행해지고 있다.
본 출원인은, 지금까지, 면역크로마토그래피의 고감도화 수법으로서, 형광 입자를 이용한 형광 면역크로마토그래피, 혹은 이것을 흡광 입자와 조합한 것을 제안해 왔다(하기 특허 문헌 1 ~ 3 참조). 여기서 제안되고 있는 기술에 의하면, 시험 영역으로부터 발하여진 형광을 눈으로 보아서도 검출할 수 있는데, 보다 높은 정밀도나 정량 측정의 편의 등을 고려하여 수광 장치를 이용하여 검출할 수도 있다. 이 측정에 적용할 수 있는 고감도의 검출 장치로서, 본 출원인은 먼저 하기 특허 문헌 4의 특유의 렌즈계를 이용하는 기술을 제안했다.
국제공개 제2008/018566호 팜플렛 국제공개 제2007/097377호 팜플렛 일본 공개 특허 공보 2010-14631호 일본 공개 특허 공보 2010-197248호
그런데, 본 출원인은 나아가 형광 입자와 흡광 입자를 조합한 시약을 이용하여, 각각 다른 표적 물질을 포착하여 검출하는 다항목 검출용 면역크로마토그래피의 기술 개발을 진행시켰다(상기 특허 문헌 3은 형광 입자와 흡광 입자를 이용하지만, 동일한 표적 물질을 포착하는 단항목 검출 기술을 개시한다). 이것에 의해, 예를 들면, 진료 현장에 있어서 복수의 질환이나 감염 항목 등을 한 번에 진단할 수 있고, 면역크로마토그래피에 의한 검사의 효율을 큰 폭으로 개선할 수 있다. 지금까지, 형광과 흡광을 조합한 이러한 발상에서의 기술 개발은 이루어지지 않았고, 그 검출 방법이나 장치의 검토에 관해서도 미착수의 상황이었다.
이상의 상황에 비추어서, 본 발명은, 각각 다른 표적 물질을 포착하는 형광 입자와 흡광 입자를 조합하여 이용하는 면역크로마토그래피에 있어서, 그 형광과 흡광을 일괄하여 검출 측정할 수 있는 검출 방법 및 검출 장치의 제공을 목적으로 한다.
본 발명의 상기의 과제는 하기의 수단에 의해 해결되었다.
[1] 표지 입자로서 형광 입자와 흡광 입자를 가지는 시험편에, 표적 물질(A) 및 표적 물질(B)가 포함될 수 있는 검체액을 부여하여 상기 형광 입자와 흡광 입자를 유동시키고, 상기 시험편의 시험 영역에 포착된 형광 입자 및 흡광 입자로부터 발하여진 형광 및 흡광을 각각 검출 장치로 일괄하여 검출 측정하는 다항목 검출용 면역크로마토그래피로서,
상기 검출 장치는 형광 및 흡광을 검출하는 검출부와 그 제어를 행하는 제어부를 가지고, 한편,
상기 형광 입자 및 흡광 입자는, 해당 형광 입자의 형광의 여기 파장(λ1)과 흡광 입자의 흡수 파장(λ2)이 동일한 파장 영역이 되고, 또한, 상기 형광 입자가 포착하여 검출하는 표적 물질(A)와 상기 흡광 입자가 포착하여 검출하는 표적 물질(B)가 다른 것으로 되어 있고,
상기 시험편에 있어서, 상기 형광 입자가 포착되는 시험 영역(nt1)과 상기 흡광 입자가 포착되는 시험 영역(nt2)이 다른 위치가 되고,
상기 검출 장치의 제어 수단은, 그곳으로부터 지령을 발하고, 상기 검출부를 통하여 상기 시험편을 주사(走査)하는 것에 있어서, 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도와 시험 영역(nt2)의 반사광 강도와 시험 영역(nt1) 및 시험 영역(nt2) 이외의 비시험 영역의 반사광 강도를 일괄하여 검출 측정하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피.
[2] 상기 검출 장치가 읽기 해석 수단을 가지고, 해당 읽기 해석 수단이, 상기 형광 입자가 포착되는 시험 영역(nt1)의 반사광 강도가 비시험 영역의 반사광 강도보다 큰 것, 다른 한편, 상기 흡광 입자가 포착되는 시험 영역(nt2)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 작은 것으로부터 표적 물질의 검출을 행하는 [1]에 기재된 면역크로마토그래피.
[3] 상기 흡광 입자가 금 콜로이드 입자, 착색 실리카 입자, 또는 착색 라텍스 입자인 [1] 또는 [2]에 기재된 면역크로마토그래피.
[4] 상기 형광 여기 파장(λ1) 및 흡광 흡수 파장(λ2)이 파장 300 ~ 800 ㎚의 범위에 있는 [1] ~ [3]의 어느 한 항에 기재된 면역크로마토그래피.
[5] 상기 시험 영역(nt1)과, 상기 시험 영역(nt2)과의 간격이 1 ~ 10 ㎜의 범위인 [1] ~ [4]의 어느 한 항에 기재된 면역크로마토그래피.
[6] 상기 형광 여기 파장에 속하는 피크 및/또는 흡광 흡수 파장에 속하는 피크의 면적으로부터 표적 물질의 양을 정량하는 [1] ~ [5]의 어느 한 항에 기재된 면역크로마토그래피.
[7] 상기 검출부에 마련한 1개의 수광기에 의해, 상기 형광 입자가 포착되는 시험 영역(nt1)의 반사광 강도와, 상기 흡광 입자가 포착되는 시험 영역(nt2)의 반사광 강도와, 상기 비시험 영역의 반사광 강도를 함께 검출하는 [1] ~ [6]의 어느 한 항에 기재된 면역크로마토그래피.
[8] 표적 물질(A) 및 표적 물질(B)가 함유될 수 있는 검체에 대해서, 표적 물질(A)의 존재를 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 큰 것으로부터 판정하고, 표적 물질(B)의 존재를 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 작은 것으로부터 판정하며, 양자의 부존재를 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도, 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도, 비시험 영역의 반사광 강도가 동일한 정도의 값인 것으로부터 판정하고, 양자의 존재를 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 크고, 또한 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 작은 것으로부터 판정하는 [1] ~ [7]의 어느 한 항에 기재된 면역크로마토그래피.
[9] 표지 입자로서 형광 입자와 흡광 입자를 가지는 시험편을 이용하여, 표적 물질(A) 및 표적 물질(B)가 포함될 수 있는 검체액의 부여에 의해 상기 형광 입자와 흡광 입자를 유동시키고, 상기 시험편에 있어서 형광 입자가 포착되는 시험 영역(nt1)의 반사광 강도, 흡광 입자가 포착되는 시험 영역(nt2)의 반사광 강도, 시험 영역(nt1) 및 시험 영역(nt2) 이외의 비시험 영역의 반사광 강도를 일괄하여 검출 측정하는 다항목 검출용 면역크로마토그래피를 행하는 검출 장치로서,
상기 검출 장치는, 형광 및 흡광을 검출하는 검출부와 그 제어를 행하는 제어부를 가지고,
상기 검출 장치의 제어 수단은, 그곳으로부터 지령을 발하고, 상기 검출부를 통하여 상기 시험편을 주사(走査)하는 것에 있어서, 하기 (i) ~ (iii)을 만족하는 조건하에서, 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도와, 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도와, 상기 비시험 영역의 반사광 강도를 일괄하여 검출 측정하는 검출 장치.
(i) 상기 형광 입자의 형광의 여기 파장과 상기 흡광 입자의 흡수 파장이 동일한 파장 영역이다.
(ii) 상기 표적 물질(A)과 상기 표적 물질(B)가 다르다.
(iii) 상기 시험 영역(nt1)과 상기 시험 영역(nt2)이 다른 위치에 있다.
[10] 읽기 해석 수단을 더 가지고, 해당 읽기 해석 수단이, 표적 물질(A)의 존재를 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 큰 것으로부터 판정하고, 표적 물질(B)의 존재를 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 작은 것으로부터 판정하며, 양자의 부존재를 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도, 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도, 비시험 영역의 반사광 강도가 동일한 정도의 값인 것으로부터 판정하고, 양자의 존재를 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 크고, 또한 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 작은 것으로부터 판정하는 [9]에 기재된 검출 장치.
[11] 상기 검출 장치의 검출부에 조립된 수광기의 수광 감도가, 상기 흡광 및 형광을 검출하는 파장 영역에 수광 영역을 가지는 [9] 또는 [10]에 기재된 검출 장치.
[12] [1] ~ [8]의 어느 한 항에 기재된 면역크로마토그래피에 이용되는 시약으로서, 형광 입자와 흡광 입자를 포함하여 이루어지고, 상기 형광 입자에는 표적 물질(A)를 포착하는 결합성 물질이 도입되어 있고, 상기 흡광 입자에는 표적 물질(A)와는 다른 표적 물질(B)를 포착하는 결합성 물질이 도입되어 있는 면역크로마토그래피용 시약.
본 명세서에 있어서 「일괄하여」 검출 측정한다는 것은, 다른 장치로 전환하는 일없이, 단일의 장치로 복수의 항목을 검출 내지 측정을 행하는 것을 말한다. 동시가 아니어도 좋지만, 동일 시기(바람직하게는 30초 이내, 보다 바람직하게는 10초 이내)에 검출 측정이 행해지는 것이 바람직하다. 전형적으로는, 검출부에 의한 1회의 주사(走査)로 검출 및 측정을 행하는 것이 가능한 것을 의미한다.
본 발명의 면역크로마토그래피 및 그 검출 장치에 의하면, 각각 다른 표적 물질을 포착하는 형광 입자와 흡광 입자를 조합하여 이용하는 면역크로마토그래피에 있어서, 그 형광과 흡광을 일괄하여 검출 측정할 수 있다. 또한, 상기 일괄한 형광과 흡광의 검출 측정에 의해, 복수의 표적 물질의 검출 등을 효율적으로 행할 수 있고, 진단 및 치료 등을 위한 면역크로마토그래피 시험의 효율을 큰 폭으로 개선할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출 장치는, 형광 및 흡광의 검출을 1개의 검출부에서 일괄하여 행할 수 있기 때문에, 면역크로마토그래피에 있어서의 공간 절약화 및 디바이스 비용의 저감에 이바지한다.
또한, 본 발명의 면역크로마토그래피에 있어서, 그 시약이 되는 입자(특히 형광 입자)로서는 실리카 입자나 라텍스 입자를 들 수 있는데, 실리카는 라텍스 입자에 비해 광의 투과성이 높은 재질이기 때문에, 광원이 내부까지 효율적으로 침입 및 투과하고, 형광 입자의 경우는, 실리카 입자에 포함되는 색소를 효율적으로 여기할 수 있고, 흡광 입자의 경우는 실리카 입자에 포함되는 색소가 효율적으로 광원을 흡수할 수 있어서, 한층 우수한 효과를 발휘한다.
본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점은, 하기의 기재 및 첨부의 도면으로부터 보다 명백해질 것이다.
도 1은 본 발명에 적합하게 이용되는 긴 시험체를 모식적으로 나타내는 분해 사시도이다.
도 2는 본 발명에 적합하게 이용되는 면역크로마토 시험편의 설명도이며, (a)가 평면도이며, (b)가 전개 단면도이다.
도 3은 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서의 시약 입자의 포착 형태를 나타낸 설명도이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 실시형태에 대한 하이브리드 검출 장치의 예를 모식적으로 나타낸 사시도이다.
도 5는 본 발명의 면역크로마토그래피로 검출된 형광 피크 및 흡광 피크와 시험편의 시험 영역과의 관계를 모식적으로 나타내는 설명도이다.
도 6은 A형 인플루엔자 핵단백질의 농도와 I1 - Ic의 상관을 나타내는 그래프이다.
도 7은 B형 인플루엔자 핵단백질의 농도와 Ic - I2의 상관을 나타내는 그래프이다.
본 발명의 면역크로마토그래피는, 특정의 검출 장치(이하, 이것을 「하이브리드 검출 장치」라고 하는 경우가 있다)를 이용하여 형광과 흡광을 일괄하여 검출하는 것을 특징으로 한다. 이하, 이 점에 대해서, 바람직한 실시형태를 중심으로 상세하게 설명한다.
[시험편]
우선, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대한 시험편의 기본적인 구성부터 설명한다. 본 실시 형태의 면역크로마토그래피용 시험편(테스트 스트립)은, 하기의 부재가 서로 모세관 현상이 생기도록 직렬 연결되어 있다.
ㆍ시료 첨가용 부재(샘플 패드)(8a)
ㆍ형광 실리카 입자(형광 표지체)(2) 및 금 콜로이드 입자(흡광 표지체)(3)를 함침하고 건조하여 얻어지는 부재(콘주게이트(conjugate) 패드)(8b)
ㆍ시험 영역 및 참조 영역을 가지는 멤브레인(항체 고정화 멤브레인)(8c)
ㆍ흡수 패드(8d)
본 실시 형태에 있어서 시험편을 구성하는 부재에 특별히 제한은 없고, 멤브레인을 가지고 있으면, 그 외의, 상기에서 예시한 부재의 일부를 생략하거나, 혹은 그 외의 부재를 조합하여 사용해도 좋다. 예를 들어, 상술한 부재 외에도, 표면을 덮는 투명 필름을 적용하거나, 각 부재의 사이에 기능성 시트를 부여하거나 해도 좋다. 반대로, 검체액과 표지 시약 나노 입자의 혼합액을 혼합하여 샘플 패드에 적하하는 방법에서는, 콘주게이트 패드는 생략할 수 있다.
본 실시 형태에 있어서는, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 상술한 평면 시험편(10)이 케이스 상부(6a)와 케이스 하부(6b)로 협지 내포(內包)되어 긴 시험체(100)를 이루고 있다. 케이스 상부(6a)에는, 검출 개구부(61)와 검체 도입 개구부(62)가 마련되어 있다. 이 검출 개구부(61)를 개재하여, 조사광을 내부의 멤브레인(10)에 보내고, 그곳에서 발하여진 반사광 강도를 검출ㆍ관측할 수 있다. 한편, 검체 도입 개구부(62)를 개재하여 검체액(S)을 멤브레인(10)에 공급하고 측정 시험을 행할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서는, 형광 입자로부터 발하여진 형광, 흡광 입자에 의해 흡수되는 흡광, 및 시험 영역 이외의 부분(비시험 영역)에 있어서의 상기 조사광에 대한 반사광을 총칭하여 「반사광」으로 칭한다. 따라서, 형광 입자가 포착되는 시험 영역(nt1)으로부터의 형광의 강도를 「시험 영역(nt1)의 반사광 강도(I1)」로 칭하고, 흡광 입자가 포착되는 시험 영역(nt2)으로의 흡광의 강도를 「시험 영역(nt2)의 반사광 강도(I2)」로 칭하고, 상기 비시험 영역에서의 반사광 강도를 「비시험 영역의 반사광 강도(Ic)」로 칭한다.
본 실시 형태에 있어서는, 상기 시험편(10)의 중앙에 있어서 멤브레인(8c)에, 2개의 시험 영역(제1 시험 영역(nt1) 및 제2 시험 영역(nt2))이 마련되어 있다. 이 제1 시험 영역(nt1)에는, 표적 물질(피검 물질)(1A)를 포착하는 생체 분자(4)가 배치되어 고정화되어 있다. 즉, 제1 시험 영역에서는, 형광 입자를 포함하는 표지체(2)를 포착하도록 되어 있다. 한편, 제2 시험 영역에는 표적 물질(피검 물질)(1B)를 포착하는 생체 분자(5)가 배치되고, 여기서 흡광 표지체(3)를 포착하도록 되어 있다. 이것에 의해, 2개의 표적 물질, 즉 표적 물질 A(1A)와 표적 물질 B(1B)와의 구별 검출이 가능해진다. 즉, 검체액(S)을 부여했을 때에, 그것에 포함되는 표적 물질(1)(표적 물질 A(1A)와 표적 물질 B(1B))이 형광 표지체(2) 및 흡광 표지체(3)와 함께 플로우 방향(L)을 향하여 멤브레인 내를 유동한다. 그리고, 표적 물질 A(1A)를 포착한 형광 표지체(2)는 제1 시험 영역(nt1)에서 포착되고, 그 존재가 거기서 판별 가능한 상태가 된다. 또한, 플로우 방향(L)을 향하여 유동한 표적 물질 B(1B)는 흡광 표지체(3)에 포착되어 있고, 이것이 제2 시험 영역(nt2)에서 포착되는 것으로 그 존재가 검출되는 상태가 된다.
상기의 포착 형태를 정리하면, 본 실시 형태에 있어서는, 표적 물질(A) 및 표적 물질(B)가 함유된 검체 시료에 대해서, 형광 입자가 포착되는 시험 영역(nt1)의 반사광 강도(I1)가 시험 영역(nt1) 및 시험 영역(nt2) 이외의 비시험 영역(nc)(도 2 참조)의 반사광 강도(Ic)보다 큰(I1>Ic) 것에 의해 판정한다. 또한, 표적 물질(B)의 존재를 흡광 입자가 포착되는 시험 영역(nt2)의 반사광 강도(I2)가 비시험 영역(nc)의 반사광 강도(Ic)보다 작은(I2<Ic) 것에 의해 판정한다. 양자(兩者)의 부존재는, 형광 입자가 포착되는 시험 영역(nt1)의 반사광 강도(I1), 흡광 입자가 포착되는 시험 영역(nt2)의 반사광 강도(I2), 비시험 영역의 반사광 강도(Ic)가 동일한 정도의 값인 것에 의해 판정한다. 양자의 존재는, 형광 입자가 포착되는 시험 영역(nt1)의 반사광 강도(I1)가 비시험 영역의 반사광 강도(I2)보다 크고, 또한 흡광 입자가 포착되는 시험 영역(nt2)의 반사광 강도(I2)가 비시험 영역의 반사광 강도(Ic)보다 작은 것에 의해 판정할 수 있다. 이것에 의해, 2개의 표적 물질이 포함될 수 있는 시료의 검출 측정을 1회의 주사(走査)로 행할 수 있다. 또한, 상기 반사광의 강도가 동일한 정도라는 것은, 필요에 따라 비시험 영역의 반사광 강도(Ic)(a. u.)를 기초로 하여, Ic의 ±10% 이내의 것을 「동일한 정도」로 말하고, 보다 엄밀하게는 ±5% 이내의 것을 말한다. 또한, 반사광 강도는 본래 측정 장치나 조건에 의해서 변경되지만, 상기와 같이 상대값(비율)으로 평가하는 것에 의해 일반화할 수 있다. 엄밀하게 측정 조건을 정의할 때에는, 특별히 한정하지 않는 이상, 하기 실시예에서 측정한 조건에 의하는 것으로 한다.
도 2(a) 및 (b)을 참조하여, 본 실시 형태의 면역크로마토그래피용 테스트 스트립에 대해서 더 설명하는데, 본 발명은 이들 설명에 의해서 제한되는 것은 아니다. 또한, 도 2에서는, 백킹(backing) 시트(8e)를 생략하지 않고 나타내고 있다. 도 2(a)는, 본 발명의 면역크로마토그래피용 테스트 스트립(시험편)(10)의 바람직한 실시형태의 평면도를 나타내고, 도 2(b)는, 도 2(a)에서 나타낸 면역크로마토그래피용 테스트 스트립의 전개 종단면도를 나타내는 도이다. 본 실시 형태의 면역크로마토그래피용 테스트 스트립(10)은, 상술한 바와 같이, 샘플 패드(8a), 콘주게이트 패드(8b), 멤브레인(8c), 흡수 패드(8d)를 구비하여 이루어진다. 또한, 상기 각 구성 부재는, 점착제 부가 백킹 시트(8e)에 의해 덧댐되어 있다.
도 1 및 2에 있어서는, 제1 시험 영역(nt1), 제2 시험 영역(nt2), 참조 영역(nr)을 이 순서로 배치한 예를 나타내고 있다. 또한, 본 실시 형태에 있어서 비시험 영역(nc)은, 멤브레인(8c)의 표면에서 제1 시험 영역(nt1), 제2 시험 영역(nt2), 및 참조 영역(nr) 이외의 부분으로서 정의된다. 그러나, 본 발명은 이것으로 한정되는 것이 아니고, 예를 들면 시험 영역의 순서를 반대로 해도 좋고, 혹은 참조 영역의 배치 개소를 다른 부분으로 해도 좋다. 또한, 참조 영역(nr)을 마련하지 않는 구성으로 해도 좋다.
제1 시험 영역(nt1)과 제2 시험 영역(nt2)과의 간격(d)(도 2)은 특별히 한정되지 않지만, 형광과 흡광과의 중복에 의한 광강도의 상쇄를 피하는 관점으로부터, 2 ㎜ ~ 8 ㎜인 것이 바람직하고, 3 ㎜ ~ 5 ㎜인 것이 보다 바람직하다.
[표적 물질]
본 발명에 있어서, 검출, 정량의 대상으로 한 표적 물질(1)은, 항원, 항체, DNA, RNA, 당, 당쇄, 리간드, 수용체, 펩티드, 화학 물질 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 표적 물질(1)을 함유하는 시료로서는 특별히 제한은 없지만, 소변(尿), 혈액 등의 액체 시료를 들 수 있다. 여기서 본 발명의 중요한 특징의 하나를 나타내면, 이 표적 물질이 형광 검출되는 것(표적 물질(1A))과 흡광 검출되는 것(표적 물질(1B))이 서로 다른 것이다. 이 점에서, 동일한 표적 물질을 형광과 흡광의 양쪽 모두에서 검출하는 상기 특허 문헌 3의 기술은, 그 발명의 기본적인 착상이 서로 다르다.
본 발명의 면역크로마토그래피에 있어서는, 표적 물질(A)와 표적 물질(B)의 서로 다른 2개 이상의 표적 물질의 검출을 행할 수 있다. 다만, 표적 물질(A)나 표적 물질(B)의 부존재(음성)의 확인 목적으로 검사를 행할 수도 있다. 따라서, 검체액에는, 표적 물질(A) 및 표적 물질(B)가 포함되어 있어도 좋고, 표적 물질(A) 또는 표적 물질(B)만이 포함되어 있어도 좋고, 표적 물질(A) 및 표적 물질(B)의 어느 쪽도 포함되지 않아도 좋다.
[샘플 패드]
샘플 패드(8a)는 표적 물질을 포함하는 샘플을 적하하는 구성 부재이다. 그 재료나 치수 등은 특별히 한정되지 않고, 이러한 종류의 제품에 적용되는 일반적인 것을 이용할 수 있다.
[콘주게이트 패드]
콘주게이트 패드(8b)는 형광 실리카 입자 등의 형광 표지체(2) 및 금 콜로이드 입자 등의 흡광 표지체(3)가 함침된 구성 부재이다. 그리고, 샘플 패드(8a)로부터 모세관 현상에 의해 이동해 온 시료에 포함되는 표적 물질이 항원 항체 반응 등의 특이적 분자 인식 반응으로, 상기 형광 실리카 입자(표지체)에 의해서 포착되고, 표지되는 부분이다. 콘주게이트 패드(8b)에 있어서의 단위 면적(㎠) 당의 형광 표지체의 함유량은 특별히 제한은 없지만 1㎍ ~ 100㎍이 바람직하다. 흡광 표지체도 동일하며 1㎍ ~ 100㎍이 바람직하다. 함침 방법으로서는, 표지체의 분산액을 도포, 적하 내지는 분무 후, 건조하는 방법 등을 들 수 있다.
[멤브레인]
항체를 고정화하는 멤브레인(8c)에 있어서의 항체 고정화부에, 표적 물질의 유무를 판정, 즉 양성 음성을 판정하기 위한 테스트 라인(제1 시험 영역(nt1) 및 제2 시험 영역(nt2))을 마련한다. 이 테스트 라인(nt1, nt2)에서는, 표적 물질 포착용 항체(시험용 포착성 물질)(4 및 5)가 각각 고정화되어 있다. 또한, 멤브레인(8c)에는, 형광 실리카 입자를 포착하기 위한 항체(참조용 포착성 물질)(7)가 고정화된 컨트롤 라인(참조 영역)(nr)이 포함된다. 이 시험 영역(nt1, nt2)에서는, 예를 들면 상술한 바와 같은 조합에 의해, 고정화 항체(시험용 포착성 물질) - 표적 물질 - 표지체로 이루어지는 샌드위치형 면역 복합체 형성 반응이 행해진다(도 3 참조). 상기 멤브레인에 있어서의 판정부(시험 영역, 참조 영역)의 형상으로서는 국소적으로 고정화 항체가 고정화되어 있는 한 특별히 제한은 없고, 라인 형상, 원 형상, 줄 형상 등을 들 수 있지만, 라인 형상인 것이 바람직하고, 폭 0.5 ~ 1.5 ㎜의 라인 형상인 것이 보다 바람직하다.
상기 샌드위치형 면역 복합체 형성 반응을 통해서, 표지된 표적 물질이 포착되고, 표지의 정도에 의해 표적 물질의 유무(양성 음성)를 판정할 수 있다. 이때, 상기 시험 영역에 형광 실리카 입자 등의 형광 표지체 및 금 콜로이드 입자 등의 흡광 표지체가 농축되고, 그 근방이 형광 발광 내지 흡광 착색되고 검출기를 이용하여 검출, 및 판정을 할 수 있다.
여기서 본 발명의 면역크로마토그래피에 있어서의, 표적 물질, 포착성 물질, 입자의 종류 등의 조합의 대표예를 표 1에 예시한다. 본 발명이 이 예에 의해서 한정하여 해석되는 것은 아니다. 표 중의 () 내의 번호는 도면 중의 부호와 대응한다(특히 도 3을 참조).
Figure 112015005203943-pct00001
본 발명에 있어서는, 이와 같이 복수의 표적 물질을 동일 파장 영역의 형광 및 흡광으로 검지 가능한 시약 성분의 조합으로 했기 때문에, 단일의 검출부(수광기)에서도 높은 감도로 표적 물질의 유무나 양을 검출할 수 있다. 그 결과, 장치의 구조나 측정 조작 등을 간소화할 수 있는 것이 그 이점이다.
항체 고정화 멤브레인에 있어서의 판정부는, 상기 콘주게이트 패드와의 연결단 및 상기 흡수 패드와의 연결단으로부터 어느 정도 이격(離隔)된 위치(예를 들면, 상기 멤브레인의 중간 정도 등)에 마련해 두는 것이 바람직하다. 이것에 의해, 상기 샌드위치형 면역 복합체 형성 반응을 충분히 완료시킬 수 있다. 혹은, 액체 시료 중의 착색 또는 형광 물질 등의 표지에 의한 측정에의 영향이나, 표적 물질과 결합하지 않은 표지체에 의한 측정에의 영향을 회피하기 위하여 바람직하다.
상기 항체 고정화부(시험 영역)(nt1, nt2)에 있어서의 항체 고정화량은 특별히 제한되지 않지만, 형상이 라인 형상인 경우, 단위 길이(㎝) 당 0.5㎍ ~ 5㎍이 바람직하다. 고정화 방법으로서는, 항체 용액을 도포, 적하 내지는 분무 후, 건조하여 물리 흡착에 의해 고정화하는 방법 등을 들 수 있다. 상술의 항체 고정화 후에, 비특이적 흡착에 의한 측정에의 영향을 방지하기 위해서 상기 항체 고정화 멤브레인 전체를 이른바 블로킹 처리를 실시해 두는 것이 바람직하다. 예를 들면, 알부민, 카제인, 폴리비닐알코올 등의 블로킹제를 함유하는 완충액 중에 적당 시간 침지한 후 건조하는 방법 등을 들 수 있다. 시판의 상기 블로킹제로서는, 예를 들면, 스킴 밀크(DIFCO사제), 4% 블록 에이스(메이지뉴교샤(明治乳業社)제) 등을 들 수 있다.
멤브레인(8c)에는, 상술한 바와 같이, 참조 영역(nr)이 더 마련되어 있다. 그곳에는 시험 영역에 포착되지 않은 표지체가 포착된다. 이것에 의해, 시험 영역에서의 형광과 대비하여, 표적 물질의 유무나 양을 동정(同定, identification)할 수 있다. 이 기능을 하기 위해서, 참조용 포착성 물질(7)에는, 시험용 결합성 물질(2b 또는 3b)과 결합성을 가지는 것이 선정된다. 또한, 참조 영역은 2개 마련해도 좋고, 그 경우, 한 쪽의 참조용 포착성 물질에는, 시험용 결합성 물질(2b)과 결합성을 가지는 것이 선정되고, 다른 쪽의 참조용 포착성 물질에는, 다른 시험용 결합성 물질(3b)과 결합성을 가지는 것이 선정된다.
[흡수 패드]
흡수 패드(8d)는, 모세관 현상으로 멤브레인을 이동해 온 표적 물질(1A, 1B) 및 표지체(2, 3)의 혼합물을 흡인하고, 계 내에 일정한 흐름이 생기게 하기 위한 구성 부재이다.
이들 각 구성 부재의 재료로서는 특별히 제한은 없고, 면역크로마토그래피용 테스트 스트립에 이용되는 부재를 사용할 수 있다. 샘플 패드 및 콘주게이트 패드로서는 Glass Fiber Conjugate Pad(상품명, MILLIPORE사제) 등의 글래스 파이버의 패드가 바람직하다. 멤브레인으로서는 Hi-Flow Plus 120 멤브레인(상품명, MILLIPORE사제) 등의 니트로 셀룰로스 멤브레인이 바람직하다. 흡수 패드로서는 Cellulose Fiber Sample Pad(상품명, MILLIPORE사제) 등의 셀룰로스 멤브레인이 바람직하다. 상기 점착제 부가 백킹 시트로서는, AR9020(상품명, Adhesives Research사제) 등을 들 수 있다.
[기술 용어의 의미]
본 명세서에서 이용하는 기술 용어의 의미를 확인하자면, 표적 물질(1)(1A, 1B)(도 1 중의 부호를 함께 나타내지만, 이것에 의해 한정하여 해석되는 것은 아니다.)은 측면유동(lateral flow)법에 의한 검출 대상이 되는 물질이며, 검체 중의 피검 물질과 동일 의미이다. 결합성 물질(2b, 3b)은 각각 상기 표적 물질 및 포착성 물질에 대한 결합능을 가지는 물질이며, 바람직하게는 생체 분자이다. 결합성 물질(2b, 3b)이 도입된 표지 입자(2a, 3a)를 표지체(2)로 칭한다. 다만, 넓은 의미로는, 표지 입자라고 하는 용어를 표지체를 포함하는 의미로 이용하는 경우가 있다. 한편, 시험 영역에서 멤브레인에 고정되고, 표적 물질(1)(1A, 1B)을 통하여 표지체(2, 3)를 포착하는 것이 시험용 포착성 물질(4, 5)이다. 다른 한편, 참조 영역에서 멤브레인에 고정된 것이 참조용 포착성 물질(7)이며, 이것에 표지체(2, 3)가 표적 물질(1)(1A, 1B)을 통하지 않고 포착된다.
[형광 표지체]
형광 표지체(2)로서는, 형광 실리카 입자나 형광 라텍스 입자, 반도체 나노 입자 등을 함께 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 특히 형광 실리카 입자를 이용하는 것이 바람직하다.
실리카의 굴절률은, 하기와 같이 1.40 ~ 1.46 정도이고, 한편 라텍스 입자의 굴절률은 1.6 정도이다. 이 때문에, 실리카는 광의 투과성이 라텍스에 비해 높은 재질이며, 광원이 내부까지 효율적으로 침입 및 투과하고, 형광 입자의 경우는, 실리카 입자에 포함되는 색소를 효율적으로 여기할 수 있고, 흡광 입자의 경우는 실리카 입자에 포함되는 색소가 효율적으로 광원을 흡수할 수 있어서, 한층 우수한 효과를 발휘한다.
형광 실리카 입자의 조제 방법으로 특별히 제한은 없고, 임의의 어떠한 조제 방법에 의해서 얻어진 실리카 입자라도 좋다. 예를 들면, Journal of Colloid and Interface Science, 159, 150-157(1993)에 기재된 졸-겔법을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 국제 공개 2007/074722 A1 공보에 기재된 형광 색소 화합물 함유 콜로이드 실리카 입자의 조제 방법에 준하여 얻어진, 기능성 화합물을 함유하는 실리카 입자를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 상기 기능성 화합물의 구체적인 예로서는, 형광 색소 화합물, 흡광 화합물, 자성 화합물, 방사선 표지 화합물, pH 감수성 색소 화합물 등을 들 수 있다.
구체적으로는, 상기 기능성 화합물을 함유하는 실리카 입자는, 상기 기능성 화합물과 실란 커플링제를 반응시켜, 공유 결합, 이온 결합 그 외의 화학적으로 결합 혹은 흡착시켜 얻어진 생성물에 1종 또는 2종 이상의 실란 화합물을 축중합(縮重合)시키고 실록산 결합을 형성시키는 것에 의해 조제할 수 있다. 이것에 의해 올가노 실록산 성분과 실록산 성분이 실록산 결합하여 이루어지는 실리카 입자가 얻어진다.
상기 기능성 화합물을 함유하는 실리카 입자의 바람직한 조제 방법의 형태로서는, N-히드록시석신이미드(NHS) 에스테르기, 말레이미드기, 이소시아네이트기, 이소티오시아네이트기, 알데히드기, 파라니트로페닐기, 디에톡시메틸기, 에폭시기, 시아노기 등의 활성기를 가지는 또는 부가한 상기 기능성 화합물과, 이들 활성기와 대응하여 반응하는 치환기(예를 들면, 아미노기, 수산기, 티올기)를 가지는 실란 커플링제를 반응시키고, 공유 결합시켜서 얻어진 생성물에 1 또는 2종 이상의 실란 화합물을 축중합시키고 실록산 결합을 형성시키는 것에 의해 조제할 수 있다.
상기 실란 커플링제로서 γ-아미노프로필트리에톡시실란(APS), 실란 화합물로서 테트라에톡시실란(TEOS)을 이용한 경우를 하기에 예시한다.
Figure 112015005203943-pct00002
상기 활성기를 가지는 또는 부가한 상기 기능성 화합물의 구체적인 예로서, 5-(및-6)-카르복시테트라메틸로다민-NHS 에스테르(상품명, emp Biotech GmbH사제), 하기 식에서 각각 나타내는 DY550-NHS 에스테르 또는 DY630-NHS 에스테르(모두 상품명, Dyomics GmbH 사제) 등의 NHS 에스테르기를 가지는 형광 색소 화합물을 들 수 있다.
Figure 112015005203943-pct00003
상기 치환기를 가지는 실란 커플링제의 구체적인 예로서 γ-아미노프로필트리에톡시실란(APS), 3-[2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필-트리에톡시실란, N-2(아미노에틸)3-아미노프로필메틸디메톡시실란, 3-아미노프로필트리메톡시실란 등의 아미노기를 가지는 실란 커플링제를 들 수 있다. 그 중에서도, APS가 바람직하다.
상기 축중합시키는 상기 실란 화합물로서는 특별히 제한은 없지만, TEOS, γ-메르캅토프로필트리메톡시실란(MPS), γ-메르캅토프로필트리에톡시실란, γ-아미노프로필트리에톡시실란(APS), 3-티오시아네이트프로필트리에톡시실란, 3-글리시딜옥시프로필트리에톡시실란, 3-이소시아네이트프로필트리에톡시실란, 및 3-[2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필-트리에톡시실란을 들 수 있다. 그 중에서도, 상기 실리카 입자 내부의 실록산 성분을 형성하는 관점에서는 TEOS가 바람직하고, 상기 실리카 입자 내부의 올가노 실록산 성분을 형성하는 관점에서는 MPS 또는 APS가 바람직하다.
상술한 바와 같이 조제하면, 구 형상, 혹은, 구 형상에 가까운 실리카 입자가 제조될 수 있다. 구 형상에 가까운 실리카 입자란, 구체적으로는 장축과 단축의 비가 2 이하의 형상이다.
소망한 평균 입경의 실리카 입자를 얻기 위해서는, YM-10, YM-100(모두 상품명, 미리포아샤(MILLIPORE社)제)등의 한외여과(ultrafiltration)막을 이용하여 한외여과를 행하고, 입경이 너무 크거나 너무 작은 입자를 제거하거나, 또는 적절한 중력 가속도로 원심 분리를 행하고, 상청(supernatant) 또는 침전만을 회수하는 것으로 가능하다.
상기 실리카 입자의 표면에 흡착 또는 결합시키는 생체 분자로서는, 항원, 항체, DNA, RNA, 당, 당쇄, 리간드, 수용체, 단백질 또는 펩티드를 들 수 있다. 여기서, 리간드는 단백질과 특이적으로 결합하는 물질을 말하고, 예를 들면, 효소에 결합하는 기질(基質), 보조효소(coenzyme), 조절 인자, 혹은 호르몬, 신경 전달 물질 등을 말하고, 저분자량의 분자나 이온 뿐만 아니라, 고분자량의 물질도 포함한다.
형광 실리카 입자의 평균 입경이 1 nm ~ 1μm인 것이 바람직하고, 20 nm ~ 500 nm인 것이 보다 바람직하고, 200 nm ~ 400 nm인 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 평균 입경은, 투과형 전자현미경(TEM), 주사형 전자현미경(SEM) 등의 화상으로부터 무작위로 선택한 100개의 표지 시약 실리카 입자 합계의 투영 면적으로부터 표지 시약 실리카 입자의 점유 면적을 화상 처리 장치에 의해서 구하고, 이 합계의 점유 면적을, 선택한 표지 시약 실리카 입자의 개수(100개)로 나눈 값에 상당하는 원의 직경의 평균값(평균 원 상당 직경)을 구한 것이다.
또한, 상기 평균 입경은, 1차 입자가 응집하여 이루어지는 2차 입자를 포함하는 개념인 후술하는 「동적 광산란법에 의한 입도」와는 다르고, 1차 입자만으로 이루어지는 입자의 평균 입경이다.
라텍스 입자는 밀도가 1 g/㎤이고, 밀도가 작은 것으로부터, 입경을 작게 하면 원심 분리로 분리가 불가능하게 되어, 표지 입자로서 사용할 수 없게 되는 경우가 있다. 이에 비하여, 실리카는 상대적으로 밀도가 크기 때문에(예를 들면 약 2 g/㎤), 입경을 작게 해도 원심 분리로 분리하기 쉽고, 적합하게 표지 입자로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 검출에 있어서, 실리카 입자를 이용하면 라텍스 입자보다 작은 입경의 입자를 사용할 수 있는 것으로부터, 사용하는 입자의 입경의 선택의 폭을 넓게 취할 수 있고, 멤브레인 내의 이동 특성을 최적으로 하는 것에 의해 작은 입경의 입자를 선택하는 것이 가능하게 된다. 이러한 점으로부터, 본 발명에 있어서는 실리카 입자를 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 하기와 같이 저굴절률인 것도, 주위의 물의 영향에 의한 광 산란을 일으키지 않아, 실리카 입자를 이용하는 이점이 된다. 특히, 본원 발명에 있어서는, 하기 실시예에서 나타내는 바와 같이, 10 ng/ml라고 하는 극히 미량의 검체의 검출에 대한 정밀도 향상도 확인되며, 그 관점에서도 실리카 입자를 이용한 표지 시약으로 하는 것이 바람직하다.
<굴절률> 589 nm 23℃
폴리스티렌 비즈 1.59
실리카 입자 1.40 ~ 1.46
물 1.33
(이과연표(理科年表) 국립천문대편)
반사광 강도 R = (n0-ni)2
n0 물의 굴절률
ni 입자의 굴절률
R(폴리스티렌 비즈) = 7.93×10-3
R(실리카 입자) = 6.57×10-4 ~ 2.17×10-3
본 명세서에 있어서, 상기 「동적 광산란법에 의한 입도」란, 동적 광산란법에 의해 측정되고, 상기의 평균 입경과는 달리, 1차 입자 뿐만 아니라, 1차 입자가 응집하여 이루어지는 2차 입자도 포함하는 개념이며, 상기 복합 입자의 분산 안정성을 평가하는 지표가 된다.
동적 광산란법에 의한 입도의 측정 장치로서는, 제타사이더나노(상품명; 멜번샤(MALVERN社)제)를 들 수 있다. 이 수법은, 미립자 등의 광산란체에 의한 광산란 강도의 시간 변동을 측정하고, 그 자기 상관 함수로부터 광산란체의 브라운 운동 속도를 계산하고, 그 결과로부터 광산란체의 입도 분포를 도출한다고 하는 것이다.
본 발명의 입자는 입상 물질로서 단분산인 것이 바람직하고, 입도 분포의 변동 계수 이른바 CV값은 특별히 제한은 없지만, 10% 이하가 바람직하고, 8% 이하가 보다 바람직하다.
[흡광 표지체]
흡광 표지체(3)는, 형광 표지체(2)의 경우와 동일하게, 표적 물질, 참조용 포착성 물질에 대해서 양호한 결합성을 가지는 생체 분자 등(결합성 물질)(3a)으로 흡광 미립자(3a)가 표면 수식되고 있는 것이 바람직하다. 흡광 미립자의 표면 수식의 실시형태는 상기 형광 미립자와 동일하다.
흡광 미립자의 종류나 형상은 특별히 한정되지 않는다. 흡광 미립자의 평균 입경, 구성 재료 등의 바람직한 것은 상기 형광 미립자와 동일하다. 표지 물질로서는, 미립자의 구성 재료가 흡광성의 것이면 특별히 이용하지 않아도 좋다. 표지 물질(흡광 물질)을 적용하는 경우에는, 다환(多環) 안료나 아조 안료 등의 유기 안료, 카본 블랙이나 울트라마린 블루 등의 무기 안료를 이용할 수 있다. 예를 들면, 상기 실리카 입자나 라텍스 입자에 상기 흡광 물질을 내포시켜도 좋다. 또한, 흡광 미립자에는 하기의 반도체 미립자 등을 이용하는 것도 바람직하다.
ㆍ반도체 입자 등
상기 반도체 입자의 재질은 특별히 제한되지 않지만, ZnO, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdO, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, InP, InAs, GaN, GaP, GaAs, TiO2, WO3, PbS, 또는 PbSe가 바람직하게 예시된다. 예를 들면, 일본특허 제3897285호 공보 등에 기재된 반도체 나노 입자를 이용할 수 있다. 상기 반도체 나노 입자는, 티올 화합물의 -SH기가 반도체 나노 입자의 표면의 S, O, Se, Te, P, As, N 등의 원자와 치환하는 것에 의해 표면 수식할 수 있다. 금 입자, 상기 금속 나노 입자로서는, 일본공개특허 공보 2003-26638 명세서 등에 기재된 금 콜로이드 입자 및 금속 콜로이드 입자를 이용할 수 있다. 상기 금속 콜로이드 입자의 구체적인 예로서는, 백금, 구리, 산화철 등의 금속 콜로이드 입자를 들 수 있다. 상기 무기 결정으로서는, 산화철(III)(Fe2O3), 산화은(I)(Ag2O), 산화주석(IV)(SnO2), 산화티탄(IV)(TiO2), 인듐주석 산화물(ITO) 등을 들 수 있다. 예를 들면, 일본공개특허 공보 2005-76064에 기재된 무기 결정을 이용할 수 있다.
금 콜로이드는, 일반적으로, 표면 플라즈몬 효과가 크고, 또한, 가시광선의 파장을 효율적으로 흡수하기 때문에, 시인성이 좋다. 또한, 흡수 피크의 파장이 녹색 레이저의 파장과 거의 일치하는 것으로부터, 녹색 레이저로 여기할 수 있는 형광 입자(예를 들어 로다민 6G를 함유하는 실리카 입자)와 조합하는 것으로, 형광의 검출 감도가 높고 또한 흡광에 의한 검출 감도도 높은, 형광·흡광 일괄 검출 측정 장치를 구축할 수 있다.
ㆍ흡광 계수
흡광 미립자는, 가시광을 흡수하고 착색하여 시인할 수 있는 것인 것이 바람직하다. 그 몰 흡광 계수 ε가 5×106M-1cm-1 이상인 입자인 것이 바람직하고, 몰 흡광 계수 ε가 5×107M-1cm-1 ~ 1×1010M-1cm-1인 것이 보다 바람직하다.
여기서, 몰 흡광 계수 ε는 하기 람벨토-베일의 식으로부터 산출할 수 있다.
A = Log10(I0/I) = εbp = asbp＇
[A: 흡광도, I: 투과광의 강도, I0: 입사광의 강도, ε: 몰 흡광 계수(M-1cm-1), b: 광로 길이(cm), p: 표지 입자(착색 입자 및 형광 미립자의 혼합 분산액을 포함한다)의 농도(M(mol/l)), as: 비흡광도, p＇: 표지 입자(착색 입자 및 형광 미립자의 혼합 분산액을 포함한다)의 농도(g/l)]
상기 농도 p＇(g/l)는, 일정량(예를 들면 1 ml)의 표지 입자 분산액으로부터 표지 입자만을 회수하고, 건조시켜서 얻어진 질량을 결정하여 얻어진 값이다. 한편, 상기 농도 p(mol/l)는, 표지 입자의 크기를 TEM 사진으로부터 구하고, 1 입자의 체적을 결정하고, 입자의 밀도(예를 들면 실리카 입자의 경우는 2.3g/㎤)로부터 1 입자의 질량을 결정하고, 일정량(예를 들면 1 ml)의 표지 입자 분산액으로부터 표지 입자만을 회수하고, 건조시켜서 얻어진 표지 입자의 질량으로부터 몰수를 결정하여 얻어진 값이다. 본 발명에 있어서, 「표지 입자의 몰 흡광 계수 ε」란, 표지 입자 분산액에 대해서 흡광도를 측정하고, 상기 람벨토-베일의 식에 적용하는 것에 의해 얻어진, 상기 분산액 중에 있어서의 표지 입자의 몰 흡광 계수 ε을 말한다. 표지 입자의 흡광도, 흡광 스펙트럼 및 ε은, 임의의 흡광 광도계 내지는 플레이트 리더를 이용하여, 물 분산액, 에탄올 분산액, N,N-디메틸포름아미드 분산액 등의 분산액으로서 측정할 수 있다.
[형광 및 흡광의 파장]
본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서는, 상기 형광 입자(2a)(형광 표지체(2)) 및 흡광 입자(3a)(흡광 표지체(3))는, 그 형광 여기 파장(전형적으로는 피크 탑)[λ1]과 흡수 파장(전형적으로는 흡광 피크 탑)[λ2]이 동일한 파장 영역이 되도록 되어 있다. 여기서 동일한 파장 영역은 본 발명의 소망의 효과, 즉 1개의 검출부(수광기)에 의해 형광과 흡광을 검출하고, 역피크로서 읽어낼 수 있으면 특별히 한정은 되지 않는다. 다만, 면역크로마토그래피의 제조 공정에 있어서 표지 입자가 눈으로 보아 확인할 수 있는 것, 즉 색을 나타내는 것이 바람직한 것으로부터, 형광의 여기 파장 및 흡광의 흡수 파장(λ1, λ2)은, 300 nm ~ 800 nm인 것이 바람직하다. 또한, 형광 색소 및 착색 색소의 입수성 등을 고려하면, 상기 형광 및 흡광의 검출 파장 영역(λ1, λ2)은, 350 ~ 700 nm인 것이 바람직하고, 400 nm ~ 650 nm인 것이 보다 바람직하다. 범용의 검출기(광센서)의 수광 감도 특성을 고려하면 500 nm ~ 650 nm인 것이 특히 바람직하다. 또한 여기서 말하는 피크는 피크 탑 내지 그 근방 전반을 가리키고, 좁은 의미로는 피크 탑(정점)을 의미하는 것으로 한다. 또한, 상기 파장 영역의 형광은 눈으로 보아서는 대략 녹색으로 보이고, 흡광(착색)은 대략 적색으로 보인다. 상기 형광 여기 파장[λ1]과 흡수 파장[λ2]의 차[Δλ]는 특별히 한정되지 않지만, 그 차[Δλ = λ1-λ2]는, 적합한 일괄 검출의 관점으로부터, 60 nm 이하인 것이 바람직하고, 30 nm 이하인 것이 보다 바람직하고, 10 nm 이하인 것이 특히 바람직하다. 하한은 특별히 없지만, 0.5 nm 이상인 것이 실제적이다. 또한, 본 발명에 있어서 광의 파장은 특별히 한정하지 않는 이상, 하기 실시예에서 측정한 조건(장치, 측정 온도 등)에 의하는 것으로 한다. 예를 들어, 형광 색소, 흡광 색소 모두 로다민 6G를 이용한 경우에는, 형광 여기 파장[λ1]과 흡수 파장[λ2]의 차는 23 nm이며, 형광 색소로서 ATTO532를, 흡광 색소로서 TAMRA를 이용한 경우에는 7 nm가 되어서, 상기 관계를 만족한다.
[검출 방법]
본 발명의 면역크로마토그래피에 있어서는, 상기 시험편을 이용하여, 그곳으로부터 발하여진 형광 및 흡광(착색)을 각각 하이브리드 검출 장치로 일괄하여 검출 측정한다. 도 4는 상기 검출 장치의 바람직한 실시형태를 모식적으로 나타낸 사시도이다. 본 검출 장치(200)는, 검출 유닛 본체(21)와 퍼스널 컴퓨터(제어부)(25)가 배선(23)으로 접속된 형태를 가지고 있다. 상기 검출 유닛 본체(21)에는, 검출부(20)(도 5 참조)가 내장되어 있다. 이 검출부(20)는, 샘플 도입부(21a)로부터 샘플 가이드(21b)를 따라서 도입되는 긴 시험체(100)의 샘플 개구부(61)에 대응하는 위치에서 이동하고, 그곳으로부터 노출되는 시험편(10)의 표면을 주사(走査)하도록 되어 있다. 이것에 의해, 시험편(10)의 시험 영역(nt1, nt2) 및 참조 영역(nr)에 있어서의 형광 내지 흡광, 혹은 각 영역의 반사광 강도(I1, I2, Ic)를 검출 측정할 수 있다.
상기 검출기(20)는, 수광기(27), 수광 렌즈(28), 광조사기(29)로 구성되어 있다. 도 5의 상부도는, 이 검출부(20)를, 시험 영역(nt1, nt2)을 따라서, 초기 위치 (i)로부터 끝 위치 (f)에 도달할 때까지 주사했을 때의 상태를 모식적으로 나타내고 있다. 또한, 도 5의 하부도는, 그 때 검출되는 형광 피크와 흡광 피크의 예를 나타내고 있다. 상기 도에 나타낸 바와 같이, 제1 시험 영역(nt1)에서는 상방으로 돌출 형광 피크가 검출되고, 제2 시험 영역(nt2)에서는 하방으로 돌출 흡광 피크가 검출되고 있다. 본 실시예에 있어서는 참조 라인(nr)에서 형광 피크가 검출되고 있다. 양 피크는, 시험 영역이 이간하고 있는 것에 의해 중첩없이 검출되고, 광강도가 상쇄되지 않도록 되어 있다. 이와 같이, 1개의 검출부(수광기)에 의해, 형광과 흡광의 양자(兩者)를 한 번에 측정할 수 있는 것이 본 발명의 이점이다.
본 실시 형태에 있어서, 상기 하이브리드 검출 장치의 제어부(25)는, 그곳으로부터 지령을 발하고, 상기 검출부를 통하여 상기 시험편을 주사(走査)하고, 상기 형광 피크와 흡광 피크를 일괄하여 검출 측정한다. 다만, 이러한 실시형태에 한정하지 않고, 제어부는 임의의 구성으로서 좋고, 예를 들면, 검출 유닛 본체(21)의 내부에 조립해도 좋다. 본 실시 형태에 있어서는, 상기 퍼스널 컴퓨터(검출부)(25)가 읽기 해석 수단을 겸하고 있고, 해당 읽기 해석 수단이 상기 형광 피크를 상방 혹은 하방으로의 돌출 피크로서 인식하고, 상기 흡광 피크를 상기 형광 피크와는 상하 반대로의 돌출 피크로서 인식하며, 각각의 표적 물질(A1, B1)의 검출을 행하고, 그 결과를 표시부(25a)에 표시할 수 있도록 하고 있다. 다만, 상술한 바와 같이, 이 검출ㆍ해석에 있어서는, 광의 피크의 해석에만 의한 것이 아니라, 넓게, 반사광 강도(I1, I2, Ic)로부터, 표적 물질의 존재, 부존재, 또는 그 정량을 행할 수 있다.
본 실시 형태에 있어서는, 상기 하이브리드 검출 장치(200)를, 상기 형광 피크 및/또는 흡광 피크의 면적으로부터 표적 물질의 양을 정량하는 정량 측정 장치로서 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 정량을 행할 때는, 미리 피크 면적의 검량선(檢量線)을 구해 두고, 그것에 대조하는 것으로, 피검 물질의 양을 동정하는 것이 바람직하다. 개략적인 양을 알고 싶을 때, 혹은 형광 피크로 검출되는 피검 물질과 흡광 피크로 검출되는 피검 물질과의 상대 관계를 파악하고 싶을 때 등은, 검량선을 이용하지 않고 피크로부터 구해지는 적분 강도로 정량 측정을 행해도 좋다.
본 발명에 의하면, 1개의 시험편으로 복수의 피검 물질(표적 물질)의 측정을 할 수 있기 때문에, 시험편 간의 편차나 시료의 작성 상의 오차 내지 오조작(샘플의 바뀜 등) 등을 적합하게 방지할 수 있어서 바람직하다. 또한, 심플한 구성의 검출 장치로 하는 것으로, 시험 장소의 이동이나 분산 배치도 가능해진다. 이러한 이점은, 대량의 샘플을 시험하고 측정하는 것이 요구되는 공공 의료에서의 이용에 있어서 특히 현저해진다.
상기와 같이, 본 발명의 면역크로마토그래피에 의한 표적 물질의 검출 방법 에 있어서는, 모세관 현상 등을 이용하여 이동하는 표지체를 이용하여, 판정부에서 상기 입자를 집적시키고, 판정을 행하는 검출이 바람직하며, 예를 들면 면역크로마토그래피나 마이크로유로(流路) 칩 등을 이용하여 행하는 것이 바람직하다. 이때, 실리카 입자는 측면 유동용 표지체로서 적합하게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 측면 유동 타입의 면역크로마토그래피를 이용하여 표적 물질을 검출하는 것이 바람직하다.
상기 테스트 스트립의 제작법으로서는, 샘플 패드, 콘주게이트 패드, 항체 고정화 멤브레인, 흡수 패드의 나열 순서로, 각 부재 사이에서 모세관 현상을 일으키기 쉽게 하기 위해서, 이들 각 부재의 양단을 인접하는 부재와 1 ~ 5 mm 정도 중첩하여(바람직하게는 백킹 시트 상에) 붙이는 것으로 제작할 수 있다.
상기 면역크로마토그래피용 형광ㆍ흡광 검출 시스템으로서는, 적어도 (1) 샘플 패드, 콘주게이트 패드, 항체 고정화 멤브레인 및 흡수 패드로 이루어지는 테스트 스트립, 및 (2) 여기 광원으로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 형광 검출 시스템에 있어서, 상기 실리카 입자(표지체)가 발하는 형광을 적합하게 검출하는 관점으로부터, 상기 여기 광원(광조사기)이, 파장 500 nm ~ 550 nm의 여기광을 발하는 것이 바람직하다. 상기 여기 광원으로서는, 수은 램프, 할로겐 램프 및 크세논 램프를 들 수 있다. 특히 레이저 다이오드 또는 발광 다이오드로부터 조사한 여기광을 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 형광 검출 시스템은, 상기 여기 광원으로부터 특정의 파장의 광만을 투과시키기 위한 필터를 구비하고 있는 것이 보다 바람직하고, 또한 형광을 정확하게 검출하는 관점으로부터, 상기 여기광을 제거하고 형광만을 투과시키는 필터를 구비하고 있는 것이 더 바람직하다.
상기 수광기는, 상기 형광을 수광하고 흡광(착색)을 검지하는 광전자 배증관, CCD 검출기, CMOS 검출기인 것이 특히 바람직하고, 이것에 의해 눈으로 보아서는 확인할 수 없는 강도 내지는 파장의 형광도 검출할 수 있고, 또한 그 형광 강도를 측정할 수 있는 것으로부터 표적 물질의 정량도 할 수 있고, 고감도 검출 및 정량이 가능해진다. 수광기의 수광 감도에 있어서의 특성으로서는, 고감도 제품의 입수성의 관점으로부터, 파장 400 ~ 700 nm에 고감도의 수광 영역(수광 피크)이 있는 것을 적용하는 것이 바람직하고, 파장 500 ~ 600 nm에 고감도의 수광 영역(수광 피크)이 있는 것을 적용하는 것이 보다 바람직하다.
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예에 근거하여 더 상세하게 설명한다. 본 발명은 이들 실시예에 의해 어떠한 한정이 되는 것은 아니다.
조제예 1(형광 실리카 나노 입자의 조제)
5-(및-6)-카르복시로다민 6Gㆍ숙신이미딜에스테르(succinimidylester)(상품명, emp Biotech GmbH사제) 2.9 mg를 1 mL의 디메틸포름아미드(DMF)에 용해했다. 여기에 1.3μL의 APS를 더하고, 실온(25℃)에서 1시간 반응을 행했다.
얻어진 반응액 600μL와, 에탄올 140 mL, TEOS 6.5 mL, 증류수 35 mL 및 28 질량% 암모니아수 15.5 mL를 혼합하고, 실온에서 24시간 반응을 행했다.
반응액을 15000×G의 중력 가속도로 30분간 원심 분리를 행하고, 상청을 제거했다. 침전된 실리카 입자에 증류수를 4 mL 더하고, 입자를 분산시키고, 다시 15000×G의 중력 가속도로 20분간 원심 분리를 행했다. 본 세정 조작을 2회 더 반복하고, 실리카 나노 입자 분산액에 포함되는 미반응의 TEOS나 암모니아 등을 제거하여, 평균 입경 227 nm의 실리카 나노 입자 1.65 g를 얻었다. 수율 약 94%.
조제예 2(형광 실리카 입자와 항체의 복합 입자의 조제)
조제예 1에서 이용한, 농도 5 mg/ml의 로다민 6G 함유 형광 실리카 입자(평균 입경 197 nm)의 분산액 100μL(분산매: 증류수)에, 증류수 775μL, 농도 10 mg/mL의 알긴산나트륨 수용액(중량 평균 분자량 70000) 100μL 및 28 중량%의 암모니아 수용액을 25μL 더하고, 실온(24℃)에서 1시간 천천히 혼합했다. 얻어진 콜로이드를 12,000×G의 중력 가속도로 30분 원심 분리하고, 상청을 제거했다. 여기에 증류수를 875μL 더하고, 입자를 재분산시켰다. 계속하여, 10 mg/mL의 알긴산나트륨 수용액을 100μL 더하고 교반자로 잘 교반한 후, 28 중량%의 암모니아 수용액을 25μL 더하고, 1시간 천천히 혼합했다. 이 콜로이드를 12,000×G의 중력 가속도로 30분 원심 분리하고, 상청을 제거 후, 증류수를 1 mL 더하고 입자를 분산시켰다. 이와 같이 하여 2회 원심 분리와 증류수에의 분산을 반복하여 입자를 더 세정하고, 증류수 200μL에 분산시키고, 로다민 6G 함유 실리카 입자/알긴산의 복합 입자의 콜로이드를 얻었다(수량 2.5mg/mL×200μL).
상기 로다민 6G 함유 형광 실리카 입자/알긴산의 복합 입자의 콜로이드에, 0.5 M의 2-Morpholinoethanesulfonic acid 버퍼(pH6.0)를 100μL, 증류수 395μL, 50 mg/mL의 NHS(N-Hydroxy succinimide) 수용액 230μL, 및 19.2mg/mL의 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 수용액 75μL를 순서대로 더하여 10분간 혼합했다.
콜로이드를 12,000×G의 중력 가속도로 10분 원심 분리하고, 상청을 제거했다. 여기에 50 mMKH2PO4(pH7.0)을 400μL 더하고, 입자를 분산시키고, 염소(goat)로부터 유래된 항A형 인플루엔자 핵단백질 항체(Anti-Influenza A Virus Nucleo protein, antibody, Goat-Poly, Life Span Biosciences사제) 100μL(0.5mg/mL)를 더 더하고, 실온에서 30분간 천천히 혼합하고, 항 hCG 항체를 상기 실리카 나노 입자에 공유 결합시켰다.
계속하여, 콜로이드를 12,000×G의 중력 가속도로 10분 원심 분리하고, 상청을 제거했다. 여기에 50 mMKH2PO4(pH7.0)을 1 mL 더하고, 입자를 분산시키고, 12,000×G의 중력 가속도로 10분 원심 분리 후, 상청을 제거했다. 여기에 50 mMKH2PO4(pH7.0)을 1 mL 더하고, 입자를 분산시키고, 12,000×G의 중력 가속도로 10분 원심 분리 후, 상청을 제거했다. 여기에 50 mMKH2PO4(pH7.0)을 1 mL 더하고, 입자를 분산시키고, 실리카 입자와 항A형 인플루엔자 각 단백질 항체의 복합 입자 콜로이드 0.5mg/ml를 1 mL 얻었다.
조제예 3(금 콜로이드와 항체의 복합 입자의 조제)
금 콜로이드(입경 40 nm) 0.5 mL에, 50μg/mL의 항B형 인플루엔자 핵단백질 항체(Anti-Human Influenza B, Momoclonal(Clone9D6), 다카라바이오샤(TAKARA-BIO社)제)를 100μL 더하고, 10분간 실온에서 정치(靜置)했다. 계속하여, 1 중량%의 소혈청 알부민을 포함하는 인산 완충액(pH7.5) 100μL 더하고, 10분간 실온에서 더 정치했다. 그 후, 8,000×G로 15분간 원심 분리를 행하고, 상청을 제거하고, 1 중량%의 소혈청 알부민을 포함하는 인산 완충액(pH7.5) 100μL를 더하고 입자를 분산시켰다.
제작예(검출 장치)
광원과 광학 필터와 광전자 배증관(PMT)으로 이루어지는 검출 유닛을 가지고, 해당 검출 유닛이, 모터에 의해서 일정 속도로 직선 이동하는 기구를 구비하고, PMT의 수광 강도를 50μ초마다 기록하는 기록 기구를 구비한 검출 장치를 제작했다. 또한, 검출 유닛은, 광원이 532 nm의 레이저 다이오드이며, 레이저 다이오드를 샘플에 조사하고, 반사광을 550 nm 이상의 파장의 광만을 투과하는 광학 필터를 투과시킨 후에 광전자 증배관(PMT)(하마마츠포토닉스샤(HAMAMATSU PHOTONICS社)제, 헤드온형 광전자 배증관(상품명))에서 수광하는 기구를 가진다. 또한, 본 실시예에 있어서 반사광의 검출은 모두 실온(25℃)에서 행했다.
실시예 1(면역크로마토그래피용 테스트 스트립의 제작)
조제예 1, 2에서 얻어진 형광 실리카 입자와 항체의 복합 입자의 콜로이드 240μL와 조제예 3에서 얻어진 금 콜로이드 입자와 항체의 복합 입자 100μL와 50 mMKH2PO4(pH7.0) 460μL를 혼합했다. 얻어진 혼합액 800μL를 Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP, MILLIPORE사제)(8×150 mm)에 균등하게 도포했다. 데시케이터(desiccator)내에서 실온하, 하룻밤 감압 건조하고, 조제예에서 얻어진 복합 입자를 함유하여 이루어지는 콘주게이트 패드를 제작했다.
다음으로, 항체 고정화 멤브레인을 이하의 방법으로 제작했다.
멤브레인(길이 25 mm, 상품명: Hi-Flow Plus120 멤브레인, MILLIPORE사제)의 단(端)으로부터 약 9 mm의 위치에, 폭 약 1 mm의 A형 인플루엔자용 테스트 라인으로서, 마우스로부터 유래된 항A형 인플루엔자 핵단백질 항체(Influenza A nucleoprotein, InA245, HyTest사제)를 1 mg/mL 함유하는 용액((50 mMKH2PO4, pH7.0)+5% 수크로스(sucrose))을 0.75μL/cm의 도포량으로 도포했다.
계속하여, 폭 약 1 mm의 B형 인플루엔자용 테스트 라인으로서, 마우스로부터 유래된 항B형 인플루엔자 핵단백질 항체(Influenza B Virus Nucleoprotein antibody, Fitzgerald사제)를 1 mg/mL 함유하는 용액((50 mMKH2PO4, pH7.0)+5% 수크로스)을 0.75μL/cm의 도포량으로 도포했다. 또한, A형 인플루엔자용 테스트 라인과 B형 인플루엔자용 테스트 라인과의 간격(d)은 3 mm로 했다.
계속하여, 폭 약 1 mm의 컨트롤 라인으로서, 염소로부터 유래된 항마우스 IgG 항체(AKP Goat anti-mouse IgG Antibody, BioLegend사제)를 1 mg/mL 함유하는 용액((50 mMKH2PO4, pH7.0) 슈거ㆍ프리)을 0.75μL/cm의 도포량으로 도포하고, 50℃에서 30분 건조시켰다. 또한, B형 인플루엔자용 테스트 라인과 컨트롤 라인과의 간격은 3 mm로 했다.
샘플 패드(Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP), MILLIPORE사제), 상기 콘주게이트 패드, 상기 항체 고정화 멤브레인, 및 흡수 패드(Cellulose Fiber Sample Pad(CFSP), MILLIPORE사제)를 백킹 시트(상품명 AR9020, Adhesives Research사제) 상에서 이 순서대로 조립했다. 또한, 멤브레인은 A형 인플루엔자용 테스트 라인이 콘주게이트 패드측, 컨트롤 라인이 흡수 패드 측이 되는 방향으로 구성했다.
인플루엔자 핵단백질의 신속 판정
표 2에 나타내는 조성으로, A형 인플루엔자 핵단백질과 B형 인플루엔자 핵단백질의 혼합액을 조제했다. 계속하여 상기 혼합액을 테스트 스트립의 샘플 패드 부분에 100μL 적하했다. 15 분 후, 제작예의 검출기에 의한 측정, 및 A형 인플루엔자용 테스트 라인의 형광 리더에 의한 판정, B형 인플루엔자용 테스트 라인의 눈으로 보는 것에 의한 판정을 행했다. 여기서 형광 리더란, 파장 532 nm의 레이저 다이오드와 광학 필터로 이루어지는 장치이며, 멤브레인의 라인 영역에 상기 레이저 다이오드를 조사하고, 광학 필름을 개재하여 라인을 관찰하는 것에 의해서, 형광 입자가 발하는 형광만을 관찰하는 장치이다.
측정 결과의 일례로서 No 16의 멤브레인을 측정했을 때의 형광 프로파일을 도 5에 나타낸다. 도면 중 위치 9 mm 부근 상방으로의 돌출 피크는, A형 인플루엔자용 테스트 라인에 결합한 형광 실리카 입자에 의한 피크이다. 위치 12 mm 부근 하방으로의 돌출 피크는, B형 인플루엔자용 테스트 라인에 결합한 금 콜로이드에 의한 피크이다. 위치 15 mm 부근 상방으로의 돌출 피크는, 컨트롤 라인에 결합한 형광 실리카 입자에 의한 피크이다.
측정 및 판정의 결과를 표 2에 나타낸다. 표 중 라인(nt1)은, A형 인플루엔자용 테스트 라인, 라인(nt2)은, B형 인플루엔자용 테스트 라인을 나타낸다. 판정기의 값의 베이스 라인값은, 멤브레인의 위치 10.5 mm의 형광 강도의 값이다. 라인(nt1)의 값은, A형 인플루엔자용 테스트 라인의 형광 강도의 피크치(I1)이다. 라인(nt2)의 값은, B형 인플루엔자용 테스트 라인의 형광 강도의 피크치(I2)이다. 또한, 라인의 판정은, 라인(nt1)은 형광 리더를 이용한 판정이며, 라인(nt2)은 눈으로 본 판정이다. 「+」은 라인이 보인 것을 의미하고, 「-」은 라인이 보이지 않은 것을 의미한다. 또한 형광 리더는 광원으로서 532 nm의 레이저 다이오드를 조사하고, 반사광을, 540 nm 이상의 파장의 광만을 투과시키는 광학 필터를 통하여 눈으로 보아서 관찰하는 장치이다.
A형 인플루엔자 핵단백질의 농도와 I1 - Ic의 상관, 및 B형 인플루엔자 핵단백질 농도와 Ic - I2의 상관을 도 6 및 도 7에 각각 나타낸다.
이 결과로부터, A형 인플루엔자용 테스트 라인에 대해서, A형 인플루엔자 핵단백질을 10 ng/mL 이상 포함하는 샘플에서는, 라인 피크의 형광 강도와 베이스 라인(도 5 중의 보조선 Ic 참조)의 형광 강도의 차(I1 - Ic)는, A형 인플루엔자 핵단백질을 포함하지 않는 샘플의 값에 비해 우세하게 큰 값이다. 구체적으로는 A형 인플루엔자 핵단백질을 100 ng/mL 이상 포함하는 샘플에서는, 라인 피크의 형광 강도와 베이스 라인의 형광 강도의 차(I1 - Ic)는, 베이스 라인의 형광 강도 Ic의 30% 이상의 값인데 비해, A형 인플루엔자 핵단백질을 포함하지 않는 샘플에서는, 5% 이하의 값이다. 또한, 형광 리더에서의 판정에서는, 검출 한계가 20 ng/mL인 것으로부터, 본 검출 수법은 고감도인 것을 알 수 있다.
동일하게 B형 인플루엔자용 테스트 라인에 대해서, B형 인플루엔자 핵단백질을 200 ng/mL 이상 포함하는 샘플에서는, 베이스 라인의 형광 강도와 라인 피크의 형광 강도의 차(Ic - I2)는, B형 인플루엔자 핵단백질을 포함하지 않는 샘플의 값에 비해 우세하게 큰 값이다. 구체적으로는 B형 인플루엔자 핵단백질을 200 ng/mL 이상 포함하는 샘플에서는, 베이스 라인의 형광 강도와 라인의 피크의 형광 강도의 차(Ic - I2)는, 베이스 라인의 형광 강도 Ic의 15% 이상의 값인데 비해, B형 인플루엔자 핵단백질을 포함하지 않는 샘플에서는, 4% 이하의 값이다. 또한, 눈으로 보는 판정에서는, 검출 한계가 500 ng/mL인 것으로부터, 본 검출 수법이 고감도이다.
이상으로부터, 본 검출 수법은, 1회의 측정으로 동시에 2항목의 검출이 가능하고, 또한 형광 리더나 눈으로 보는 판정보다 고감도라고 말할 수 있다.
Figure 112015005203943-pct00004
A형: A형 인플루엔자 핵단백질
B형: B형 인플루엔자 핵단백질
라인의 판정: 라인(nt1)은 형광 리더에 의한 판정. 라인(nt2)은 눈으로 보는 것에 의한 판정.
(실시예 2) 표적 물질의 정량
실시예 1의 표 2에 나타낸 결과를 기초로, A형 인플루엔자 핵단백질과 B형 인플루엔자 핵단백질과의 검량선을 작성했다. 이것에 근거하여, 2 종류의 피험체 A, B(체액)를 채취하고, 그것의 일괄 검출을 상기의 장치를 이용해서 행했다. 그 결과는, 피험체 A에서는, I1 - Ic가 0.216, Ic - I2에 대해서는 0.002였다. 피험체 B에서는, I1 - Ic가 0.005, Ic - I2에 대해서는 0.044였다. 이 결과로부터, 상기 시험체 A의 A형 인플루엔자 핵단백질은 27 ng/ml이며, 상기 시험체 B의 B형 인플루엔자 핵단백질은 246 ng/ml로 동정(同定)되었다. 다른 방법(ELISA법)을 이용하여 상기 피검체의 성분을 동정한 바, 상기의 결과와 잘 일치했다. 이 결과로부터, 본 발명에 의하면, 높은 정밀도의 정량 검출이 가능하다는 것을 알 수 있다.
또한, 상기의 검량선을 피크 강도차가 아니라 피크 면적으로 바꾸어서 작성하고, 정량 측정을 행했다. 그 결과, 정량 검출의 정밀도가 더 높아지는 것을 알 수 있었다.
조제예 4(흡광 실리카 나노 입자의 조제)
5-(및-6)-카르복시로다민 6Gㆍ숙신이미딜에스테르(상품명, emp Biotech GmbH사제) 2.9 mg를 1 mL의 디메틸포름아미드(DMF)에 용해했다. 여기에 1.3μL의 APS를 더하고, 실온(25℃)에서 1시간 반응을 행했다.
계속하여, 헵탄 4 ml에 AOT(에어로졸 OT) 280 mg를 더했다. 여기에, 증류수 40μl, 28% 암모니아수 40μl를 더하고, 잘 교반하고, 역미셀(reversed micelle)을 조제했다.
상기의 역미셀액에, 5-(및-6)-카르복시로다민 6G/실란 커플링제 복합체 용액 200μl, TEOS(오르토규산테트라에틸) 100μl를 더하고, 실온에서 잘 혼합하고, 24시간 반응을 행했다.
반응액에 아세톤을 4 ml를 더하고, 잘 혼합한 후, 22000×g의 중력 가속도로 30분간 원심 분리를 행하고, 상청을 제거했다. 침전한 실리카 입자에 에탄올을 1 ml 더하여 분산시키고, 다시 22000×g의 중력 가속도로 30분간 원심 분리를 행했다. 본 세정 조작을 2회 더 반복했다. 계속하여, 침전한 실리카 입자에 증류수를 1 ml 더하여 분산시키고, 22000×g의 중력 가속도로 30분간 원심 분리를 행했다. 본 세정 조작을 2회 더 반복하고, 흡광 실리카 입자 분산액에 포함되는 미반응의 TEOS나 암모니아 등을 제거했다.
이것에 의해서, 5-(및-6)-카르복시로다민 6G 함유 흡광 실리카 입자(평균 입경 238 nm)를 20.2 mg 얻었다. 수율 74%.
(5-(및-6)-카르복시로다민 6G 함유 흡광 실리카 입자의 흡광 스펙트럼 및 흡광 최대 파장에 있어서의 몰 흡광 계수 ε의 측정)
흡광 광도계(Molecular Devices사제) 및 광로 길이 1 cm의 셀을 이용하여, 5-(및-6)-카르복시로다민 6G 함유 흡광 실리카 입자의 수분산액의 흡광 스펙트럼과 흡광 최대 파장(546 nm)에 있어서의 몰 흡광 계수 ε을 측정했다. 532 nm에 있어서의 ε는 1.1×1010M-1cm-1이었다.
조제예 5(실리카 입자와 항체의 복합 입자의 조제)
조제예 2와 동일한 방법으로 조제예 6의 5-(및-6)-카르복시로다민 6G 함유 흡광 실리카 입자와 항B형 인플루엔자 각 단백질 항체의 복합 입자 콜로이드 0.5mg/ml를 1 mL 얻었다.
(실시예 3)
실시예 1와 동일한 방법으로, 인플루엔자 핵단백질의 신속 판정 시험을 실시 했다. 측정 및 판정의 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure 112015005203943-pct00005
이 결과로부터, A형 인플루엔자용 테스트 라인에 대해서, A형 인플루엔자 핵단백질을 10 ng/mL 이상 포함하는 샘플에서는, 라인 피크의 형광 강도와 베이스 라인의 형광 강도의 차(I1 - Ic)는, A형 인플루엔자 핵단백질을 포함하지 않는 샘플의 값에 비해 우세하게 큰 값이다. 또한, 형광 리더에서의 판정에서는, 검출 한계가 20 ng/mL인 것으로부터, 본 검출 수법은 고감도인 것을 알 수 있다.
동일하게, B형 인플루엔자용 테스트 라인에 대해서, B형 인플루엔자 핵단백질을 200 ng/mL 이상 포함하는 샘플에서는, 베이스 라인의 형광 강도와 라인의 피크의 형광 강도의 차(Ic - I2)는, B형 인플루엔자 핵단백질을 포함하지 않는 샘플의 값에 비해 우세하게 큰 값이다. 또한, 눈으로 보는 판정에서는, 검출 한계가 500 ng/mL인 것으로부터, 본 검출 수법이 고감도이다.
이상으로부터, 본 검출 수법은, 1회의 측정으로 동시에 2항목의 검출이 가능하고, 또한 형광 리더나 눈으로 보는 판정보다 고감도라고 말할 수 있다.
조제예 6(형광 실리카 나노 입자의 조제)
ATTO532-NHS 에스테르(상품명, ATTO-TEC GmbH사제) 3.5 mg를 1 mL의 디메틸포름아미드(DMF)에 용해했다. 여기에 1.3μL의 APS를 더하고, 실온(25℃)에서 1시간 반응을 행했다.
얻어진 반응액 600μL와, 에탄올 140 mL, TEOS 6.5 mL, 증류수 35 mL 및 28 질량% 암모니아수 15.5 mL를 혼합하고, 실온에서 24시간 반응을 행했다.
반응액을 15000×G의 중력 가속도로 30분간 원심 분리를 행하고, 상청을 제거했다. 침전한 실리카 입자에 증류수를 4 mL 더하고, 입자를 분산시키고, 다시 15000×G의 중력 가속도로 20분간 원심 분리를 행했다. 본 세정 조작을 2회 더 반복하고, 실리카 나노 입자 분산액에 포함되는 미반응의 TEOS나 암모니아 등을 제거하고, 평균 입경 238 nm의 실리카 나노 입자 1.47 g를 얻었다. 수율 약 83%.
조제예 7(실리카 입자와 항체의 복합 입자의 조제)
조제예 2와 동일한 방법으로 ATTO532 함유 형광 실리카 입자와 항 노로바이러스 GI 모노클로날 항체(자사제(自社製))의 복합 입자 콜로이드 0.5mg/ml를 1 mL 얻었다.
조제예 8(흡광 실리카 나노 입자의 조제)
5-(and-6)-Carboxytetramethylrhodamine, SuccinimidylEster(Molecular Probes사제) 3.3 mg를 1 ml의 디메틸포름아미드(DMF)에 용해했다. 여기에 1.4μl의 APS(3-아미노프로필 트리에톡시실란)를 더하고, 실온(23℃)에서 1시간 반응을 행하고, TAMRA/실란 커플링제 복합체 용액을 얻었다.
계속하여, 헵탄 4 ml에 AOT(에어로졸 OT) 280 mg를 더했다. 여기에, 증류수 40μl, 28% 암모니아수 40μl를 더하고, 잘 교반하고, 역미셀을 조제했다.
상기의 역미셀액에, TAMRA/실란 커플링제 복합체 용액 200μl, TEOS(오르토규산테트라에틸) 100μl를 더하고, 실온에서 잘 혼합하고, 24시간 반응을 행했다.
반응액에 아세톤을 4 ml 더하고 잘 혼합한 후, 22000×g의 중력 가속도로 30분간 원심 분리를 행하고, 상청을 제거했다. 침전한 실리카 입자에 에탄올을 1 ml 더하여 분산시키고, 다시 22000×g의 중력 가속도로 30분간 원심 분리를 행했다. 본 세정 조작을 2회 더 반복했다. 계속하여, 침전한 실리카 입자에 증류수를 1 ml 더하여 분산시키고, 22000×g의 중력 가속도로 30분간 원심 분리를 행했다. 본 세정 조작을 2회 더 반복하고, 흡광 실리카 입자 분산액에 포함되는 미반응의 TEOS나 암모니아 등을 제거했다.
이것에 의해서, TAMRA 함유 흡광 실리카 입자(평균 입경 211 nm)를 18.0 mg 얻었다. 수율 66%.
(TAMRA 함유 콜로이드 실리카 입자의 흡광 스펙트럼 및 흡광 최대 파장에 있어서의 몰 흡광 계수 ε의 측정)
흡광 광도계(Molecular Devices사제) 및 광로 길이 1 cm의 셀을 이용하여, TAMRA 함유 콜로이드 실리카 입자의 물 분산액의 흡광 스펙트럼과 흡광 최대 파장(546 nm)에 있어서의 몰 흡광 계수 ε을 측정했다. 660 nm에 있어서의 ε는 1.6×1010M-1cm-1이었다.
조제예 9(실리카 입자와 항체의 복합 입자의 조제)
조제예 2와 동일한 방법으로 TAMRA 함유 흡광 실리카 입자와 항 노로바이러스 GII 모노클로날 항체(자사제)의 복합 입자 콜로이드 0.5mg/ml를 1 mL 얻었다.
(실시예 4)
조제예 7에서 얻어진 형광 실리카 입자와 항체의 복합 입자의 콜로이드 240μL와 조제예 9에서 얻어진 흡광 실리카 입자와 항체의 복합 입자 100μL와 50 mMKH2PO4(pH7.0) 460μL를 혼합했다. 얻어진 혼합액 800μL를 Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP, MILLIPORE사제)(8×150 mm)에 균등하게 도포했다. 데시케이터 내에서 실온하, 하룻밤 감압 건조하고, 조제예에서 얻어진 복합 입자를 함유하여 이루어지는 콘주게이트 패드를 제작했다.
다음에, 항체 고정화 멤브레인을 이하의 방법으로 제작했다.
멤브레인(길이 25 mm, 상품명: Hi-Flow Plus 180 멤브레인, MILLIPORE사제)의 단으로부터 약 9 mm의 위치에, 폭 약 1 mm의 노로바이러스 GI용 테스트 라인으로서, 쥐로부터 유래된 항 노로바이러스 GI 항체(자사제)를 1 mg/mL 함유하는 용액((50 mMKH2PO4, pH7.0)+5% 수크로스)을 0.75μL/cm의 도포량으로 도포했다.
계속하여, 폭 약 1 mm의 노로바이러스 GII용 테스트 라인으로서, 마우스로부터 유래된 항 노로바이러스 GII 항체(자사제)를 1 mg/mL 함유하는 용액((50 mMKH2PO4, pH7.0)+5% 수크로스)을 0.75μL/cm의 도포량으로 도포했다. 또한, 노로바이러스 GI용 테스트 라인과 노로바이러스 GII용 테스트 라인과의 간격(d)은 3 mm로 했다.
계속하여, 폭 약 1 mm의 컨트롤 라인으로서, 염소로부터 유래된 항마우스 IgG 항체(AKP Goat anti-mouse IgG Antibody, BioLegend사제)를 1 mg/mL 함유하는 용액((50 mMKH2PO4, pH7.0) 슈거ㆍ프리)을 0.75μL/cm의 도포량으로 도포하고, 50℃에서 30분 건조시켰다. 또한, 노로바이러스 GII용 테스트 라인과 컨트롤 라인과의 간격은 3 mm로 했다.
샘플 패드(Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP), MILLIPORE사제), 상기 콘주게이트 패드, 상기 항체 고정화 멤브레인, 및 흡수 패드(Cellulose Fiber Sample Pad(CFSP), MILLIPORE사제)를 백킹 시트(상품명 AR9020, Adhesives Research사제) 상에서 이 순서대로 조립했다. 또한, 멤브레인은 노로바이러스 GI용 테스트 라인이 콘주게이트 패드측, 컨트롤 라인이 흡수 패드 측이 되는 방향으로 구성했다.
노로바이러스 항원의 신속 판정
표 4에 나타내는 조성에서, 노로바이러스 GI 항원(VLP GI/1)과 노로바이러스 GI 항원(VLP GII/4)의 혼합액을 조제했다. 계속하여 상기 혼합액을 테스트 스트립의 샘플 패드 부분에 100μL 적하했다. 15 분 후, 제작예의 검출기에 의한 측정, 및 노로바이러스 GI용 테스트 라인의 형광 리더에 의한 판정, 노로바이러스 GII용 테스트 라인의 눈으로 보는 것에 의한 판정을 행했다.
Figure 112015005203943-pct00006
이 결과로부터, 노로바이러스 GI용 테스트 라인에 대해서, VLP GI/1을 0.1ng/mL 이상 포함하는 샘플에서는, 라인 피크의 형광 강도와 베이스 라인의 형광 강도의 차(I1 - Ic)는, VLP GI/1을 포함하지 않는 샘플의 값에 비해 우세하게 큰 값이다. 또한, 형광 리더에서의 판정에서는, 검출 한계가 0.2ng/mL인 것으로부터, 본 검출 수법은 고감도인 것을 알 수 있다.
동일하게, 노로바이러스 GII용 테스트 라인에 대해서, VLP GII/4를 1 ng/mL 이상 포함하는 샘플에서는, 베이스 라인의 형광 강도와 라인 피크의 형광 강도의 차(Ic - I2)는, VLP GII/4를 포함하지 않는 샘플의 값에 비해 우세하게 큰 값이다. 또한, 눈으로 보는 판정에서는, 검출 한계가 2.5ng/mL인 것으로부터, 본 검출 수법이 고감도이다.
이상으로부터, 본 검출 수법은, 1회의 측정으로 동시에 2항목의 검출이 가능하고, 또한 형광 리더나 눈으로 보는 판정보다 고감도라고 말할 수 있다.
본 발명을 그 실시 형태와 함께 설명했지만, 우리는 특별히 지정하지 않는 한 우리의 발명을 설명의 어느 세부에 있어서도 한정하려고 하는 것이 아니고, 첨부의 청구의 범위에 나타낸 발명의 정신과 범위에 반하는 일 없이 폭넓게 해석되어야 할 것으로 생각한다.
본원은, 2012년 11월 28일에 일본에서 특허 출원된 일본 특허 출원 2012-260227에 근거하는 우선권을 주장하는 것이며, 이것들은 여기에 참조하여 그 내용을 본 명세서의 기재의 일부로서 넣는다.
1: 표적 물질(피검 물질)
1A: 제1 표적 물질
1B: 제2 표적 물질
2: 형광 표지체
2a: 형광 미립자
2b: 결합성 물질
3: 흡광 표지체
3a: 흡광 미립자
3b: 결합성 물질
4, 5: 시험용 포착성 물질
6: 케이스
61: 검출 개구부
62: 검체 도입 개구부
6a: 케이스 상부
6b: 케이스 하부
8a: 샘플 패드
8b: 콘주게이트 패드
8c: 멤브레인
8d: 흡수 패드
8e: 백킹 시트
7: 참조용 포착성 물질
10: 시험편(테스트 스트립)
100: 긴 시험체
nt1: 제1 시험 영역(테스트 라인)
nt2: 제2 시험 영역(테스트 라인)
nr: 참조 영역(레퍼런스 라인)
L: 측면 유동 방향
S: 검체액
20: 검출부
21: 검출 유닛 본체
21a: 샘플 도입부
21b: 샘플 가이드
23: 배선
25: 퍼스널 컴퓨터(제어부)
27: 수광기
28: 수광 렌즈
29: 광조사기(光照射器)

Claims (12)

  1. 표지 입자로서 형광 입자와 흡광 입자를 가지는 시험편에, 표적 물질(A) 및 표적 물질(B)가 포함될 수 있는 검체액을 부여하여 상기 형광 입자와 흡광 입자를 유동시키고, 상기 시험편의 시험 영역에 포착된 형광 입자 및 흡광 입자로부터 발하여진 형광 및 흡광을 각각 검출 장치로 일괄하여 검출 측정하는 다항목 검출용 면역크로마토그래피로서,
    상기 검출 장치는 형광 및 흡광을 검출하는 검출부와 그 제어를 행하는 제어부를 가지고, 한편,
    상기 형광 입자 및 흡광 입자는, 상기 형광 입자의 형광의 여기 파장(λ1)과 흡광 입자의 흡수 파장(λ2)이 동일한 파장 영역이 되고, 또한, 상기 형광 입자가 포착하여 검출하는 표적 물질(A)과 상기 흡광 입자가 포착하여 검출하는 표적 물질(B)이 다른 것으로 되어 있고,
    상기 시험편에 있어서, 상기 형광 입자가 포착되는 시험 영역(nt1)과 상기 흡광 입자가 포착되는 시험 영역(nt2)이 다른 위치가 되고,
    상기 검출 장치의 제어부는, 그곳으로부터 지령을 발하고, 상기 검출부를 통하여 상기 시험편을 주사(走査)하는 것에 있어서, 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도와 시험 영역(nt2)의 반사광 강도와 시험 영역(nt1) 및 시험 영역(nt2) 이외의 비시험 영역의 반사광 강도를 일괄하여 검출 측정하는 면역크로마토그래피.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 검출 장치가 읽기 해석 수단을 가지고, 상기 읽기 해석 수단이, 상기 형광 입자가 포착되는 시험 영역(nt1)의 반사광 강도가 비시험 영역의 반사광 강도보다 큰 것, 다른 한편, 상기 흡광 입자가 포착되는 시험 영역(nt2)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 작은 것으로부터 표적 물질의 검출을 행하는 면역크로마토그래피.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 형광 입자가 형광 실리카 입자이며, 상기 흡광 입자가 금 콜로이드 입자, 착색 실리카 입자, 또는 착색 라텍스 입자인 면역크로마토그래피.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 형광 여기 파장(λ1) 및 흡광 흡수 파장(λ2)이 파장 300 ~ 800 nm의 범위에 있는 면역크로마토그래피.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 시험 영역(nt1)과, 상기 시험 영역(nt2)와의 간격이 1 ~ 10 mm의 범위인 면역크로마토그래피.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 형광 여기 파장에 속하는 피크 및/또는 흡광 흡수 파장에 속하는 피크의 면적으로부터 표적 물질의 양을 정량(定量)하는 면역크로마토그래피.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 검출부에 마련한 1개의 수광기에 의해, 상기 형광 입자가 포착되는 시험 영역(nt1)의 반사광 강도와, 상기 흡광 입자가 포착되는 시험 영역(nt2)의 반사광 강도와, 상기 비시험 영역의 반사광 강도를 함께 검출하는 면역크로마토그래피.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    표적 물질(A) 및 표적 물질(B)가 함유될 수 있는 검체에 대해서, 표적 물질(A)의 존재를 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 큰 것으로부터 판정하고, 표적 물질(B)의 존재를 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 작은 것으로부터 판정하고, 양자(兩者)의 부존재를 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도, 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도, 비시험 영역의 반사광 강도가 동일한 정도의 값인 것으로부터 판정하고, 양자의 존재를 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 크고, 또한 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 작은 것으로부터 판정하는 면역크로마토그래피.
  9. 표지 입자로서 형광 입자와 흡광 입자를 가지는 시험편을 이용하여, 표적 물질(A) 및 표적 물질(B)가 포함될 수 있는 검체액의 부여에 의해 상기 형광 입자와 흡광 입자를 유동시키고, 상기 시험편에 있어서 형광 입자가 포착되는 시험 영역(nt1)의 반사광 강도, 흡광 입자가 포착되는 시험 영역(nt2)의 반사광 강도, 시험 영역(nt1) 및 시험 영역(nt2) 이외의 비시험 영역의 반사광 강도를 일괄하여 검출 측정하는 다항목 검출용 면역크로마토그래피를 행하는 검출 장치로서,
    상기 검출 장치는, 형광 및 흡광을 검출하는 검출부와 그 제어를 행하는 제어부를 가지고,
    상기 검출 장치의 제어부는, 그곳으로부터 지령을 발하고, 상기 검출부를 통하여 상기 시험편을 주사하는 것에 있어서, 하기 (i) ~ (iii)을 만족하는 조건하에서, 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도와, 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도와, 상기 비시험 영역의 반사광 강도를 일괄하여 검출 측정하는 검출 장치.
    (i) 상기 형광 입자의 형광의 여기 파장과 상기 흡광 입자의 흡수 파장이 동일한 파장 영역이다.
    (ii) 상기 표적 물질(A)와 상기 표적 물질(B)가 다르다.
    (iii) 상기 시험 영역(nt1)과 상기 시험 영역(nt2)이 다른 위치에 있다.
  10. 제 9 항에 있어서,
    읽기 해석 수단을 더 가지고, 상기 읽기 해석 수단이, 표적 물질(A)의 존재를 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 큰 것으로부터 판정하고, 표적 물질(B)의 존재를 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 작은 것으로부터 판정하고, 양자의 부존재를 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도, 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도, 비시험 영역의 반사광 강도가 동일한 정도의 값인 것으로부터 판정하고, 양자의 존재를 상기 시험 영역(nt1)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 크고, 또한 상기 시험 영역(nt2)의 반사광 강도가 상기 비시험 영역의 반사광 강도보다 작은 것으로부터 판정하는 검출 장치.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 검출 장치의 검출부에 조립된 수광기의 수광 감도가, 상기 흡광 및 형광을 검출하는 파장 영역에 수광 영역을 가지는 검출 장치.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 면역크로마토그래피에 이용되는 시약으로서, 형광 입자와 흡광 입자를 포함하여 이루어지고, 상기 형광 입자에는 표적 물질(A)을 포착하는 결합성 물질이 도입되어 있고, 상기 흡광 입자에는 표적 물질(A)와는 다른 표적 물질(B)을 포착하는 결합성 물질이 도입되어 있는 면역크로마토그래피용 시약.
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