BRPI0719077A2 - Dispositivo para separar pelo menos um analito em uma amostra líquida, método para determinar a presença e/ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra, e, uso de um dispositivo - Google Patents

Description

“DISPOSITIVO PARA SEPARAR PELO MENOS UM ANALITO EM UMA AMOSTRA LÍQUIDA, MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA E/OU QUANTIDADE DE PELO MENOS UM ANALITO EM UMA AMOSTRA, E, USO DE UM DISPOSITIVO”

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um dispositivo para separar pelo menos um analito em uma amostra de líquido e ainda analisar dito analito por espectrometria de dessorção/ionização a leiser (LDI).

A invenção refere-se ainda ao uso de dispositivos parta separar pelo menos um analito em uma amostra de líquido e subsequentemente determinar a presença e/ou quantidade de dito pelo menos um analito por detecção de LDI.

A invenção também refere-se a um método para separar pelo menos um analito em uma amostra de líquido e subsequentemente determinar a presença e/ou quantidade de dito pelo menos um analito por espectrometria de massa LDI.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

São usados bioensaios para sondar quanto à presença e/ou a quantidade de um analito em uma amostra biológica. Uma aplicação típica de tais bioensaios são métodos de diagnóstico in vitro, que se tomaram mais comuns durante os anos e crescentemente complementa ou mesmo substituem abordagens diagnosticas mais tradicionais como palpação, vascularização, formação de imagem diagnostica, endoscopia e coleta de biópsia.

Muitos dos bioensaios que são comumente usados hoje em dia também no campo de diagnósticos in vitro são chamados ensaios baseados em superfície. Exemplos de ensaios baseados em superfície são, p. ex., microarranjos de DNA, ELISAs ou ensaios de radioimunoprecipitação baseados em placa de microtítulo etc.

Um maior obstáculo nestes e em outros bioensaios permanece na preparação da amostra. Os métodos com frequência elaborados, requeridos pra a preparação de uma amostra, frequentemente incluem um grande número de etapas críticas, tais como Iise de, p. ex., amostras celulares, desnaturação de proteínas etc., que potencialmente podem ter uma influência negativa sobre a sensibilidade e a precisão do ensaio. Por exemplo, no caso de microarranjos de DNA e ELISAs baseados em placa de microtítulo, a contribuição do ruído da preparação da amostra permanece um fator a ser considerado quando validando um teste diagnóstico in vitro.

Para algumas aplicações, métodos de espectrometria de massa estão crescentemente substituindo outros bioensaios como o método de escolha. Esforços para melhorar a sensibilidade e capacidades de produção dos ensaios baseados em espectrometria de massa resultaram no desenvolvimento de numerosos formatos espectométricos para a análise de amostras de relevância biológica. Além das inovações das tecnologias de espectometria de massa (fontes de leiser, materiais matriz, unidades de detecção), os substratos que mais eficiente e especificamente absorvam um analito foram tentados e os projetos iniciais foram melhorados.

Dessorção/ionização de leiser diretas de biomoléculas como originalmente realizadas pra espectrometria de massa geralmente resultaram em fragmentação de grandes biomoléculas, tais como polipeptídeos e ácidos nucleicos. Para obter-se dessorção/ionização de biomoléculas intactas de diversos 10-100 kDa, várias técnicas foram usadas.

Uma metodologia particularmente adequada, que é comumente referida como espectrometria de massa de dessorção/ionização a leiser assistida por matriz (MALDI-MS), utiliza biomoléculas que são misturadas em solução com uma molécula orgânica absorvedora de energia (EAM), que é referida como o material matriz. Tipicamente, a matriz é permitida cristalizar em uma sonda de espectrometria de massa capturando biomoléculas dentro da matriz. Em MALDI-MS o analito que tipicamente são moléculas biológicas é assim misturado com uma solução contendo uma matriz e uma gota do líquido é colocada na superfície de uma sonda. A solução de matriz então co-cristaliza com as moléculas biológicas. A sonda é inserida dentro do espectrômetro de massa e energia leiser é então direcionada para a superfície da sonda, onde ela dessorve e ioniza as moléculas biológicas sem significativamente fragmentá-las. Em outras formas de realização de MALDI- MS, a matriz é primeiro cristalizada como uma película fina, com as biomoléculas sendo adicionadas mais tarde ou vice-versa. Entretanto, MALDI-MS tem limitações como uma ferramenta analítica. Ele assim não fornece meios para fracionamento da amostra e um líquido biológico complexo, tal como sangue, não é adequado para MALDI-MS, sem etapas preparatórias anteriores.

Estes problemas foram parcialmente responsáveis por mais desenvolvimento, tal como espectrometria de massa de dessorção/ionização a leiser aumentada na superfície (SELDI-MS).

Na SELDI-MS, a superfície da sonda é modificada a fim de que forme um participante ativo no processo de preparação da amostra. Em uma variante a superfície é, por exemplo, derivada com reagentes de afinidade, que seletivamente ligam-se ao analito de interesse. Em outra variante, a superfície é derivada com componentes cromatográfícos que se ligam a um subgrupo de moléculas de amostra. Em ainda outra variante, a superfície é derivada com moléculas absorvedoras de energia, que não são dessorvidas quando sondadas com um leiser. Em ainda outra variante, a superfície é derivada com moléculas que se ligam ao analito e que contêm uma ligação fotolítica que é rompida na aplicação do leiser.

SELDI é assim a combinação de um alvo MS de superfície seletivo com MALDI-MS. Entretanto, SELDI não necessariamente inclui matriz imobilizada no alvo MS - esta variante é tipicamente chamada SEND. Os princípios de MALDI e SELDI são, p. ex., apresentados em detalhes, p.ex., na Patente US No. 5.118.937, US 5.045.694, US 5.719.060 e US 2002/0060290 Al.

A tecnologia SELDI foi comercializada por Ciphergen Biosystems Inc. na forma da chamada plataforma ProteinChip®. Como pode ser observado pelo guia de aplicações para a ProteinChip®, análise paralela de amostras biológicas é possível pelo fato de que chips cromatográfícos individuais são acomodados em um suporte especial, para obter-se um formato de placa semelhante a microtítulo. Após a incubação da amostra nos chips, as moléculas não ligadas são removidas, p. ex., por lavagem de tampão e uma medição MALDI-MS é realizada diretamente da superfície cromatográfica. A matriz pode ser adicionada como uma última etapa antes da medição MS ou já é covalentemente ligada à superfície do chip.

Mesmo embora a abordagens SELDI bem como MALDI acima descritas constituam os principais avanços com respeito à análise multi- fatorial de alta produção de amostras biológicas, permanecem obstáculos que devem ser superados para desenvolvimento espectometria de massa robusta, baseada em métodos diagnósticos in vitro.

Como exposto no início, a maior parte dos problemas de hoje são relacionados com o manuseio e preparação de amostras, bem como as um tanto complexas exigências de automação para análise multi-fatorial.

Se, por exemplo, na tecnologia SELDI uma análise multi- fatorial for para ser realizada, diferentes superfícies de afinidade têm que ser criadas que têm que ser investigadas com diferentes amostras separadamente. Isto significa que não é possível multiplexação conveniente. Além disso, a preparação e análise da amostra são realizadas próximo (no tempo e espaço) da unidade de detecção e usualmente requerem um ambiente químico-úmido.

Como diferentes pontos da superfície têm que ser investigados, a tecnologia SELDI usualmente também requer numerosas etapas de lavagem e correspondentemente idealmente um grau significativo de automação. Em vista desta situação, há uma contínua necessidade de dispositivos e métodos que permitam combinar a separação dos analitos de amostras biológicas em uma maneira conveniente, sem necessidade de elementos construtivos extensos.

OBJETIVOS E RESUMO DA INVENÇÃO

E um objetivo da presente invenção prover um dispositivo que possa ser usado para separar analitos em uma amostra de líquido e que possa ser diretamente usado para análise da presença e/ou quantidade do analito por métodos de espectrometria de massa, tais como MALDI-MS.

É um outro objetivo da presente invenção fornecer métodos para separar analitos de amostras de líquido e determinar a presença e/ou quantidade de ditos analitos por métodos de espectrometria de massa, tais como MALDI-MS.

Estes e outros objetivos da presente invenção, à medida que eles se tomam evidentes pela seguinte descrição, são resolvidos pelo assunto das reivindicações independentes. As reivindicações dependentes referem-se a formas de realização preferidas da invenção.

A presente invenção refere-se em um aspecto a um dispositivo para separar pelo menos um analito em uma amostra líquida compreendendo pelo menos um substrato com:

- pelo menos uma zona para carregar uma amostra líquida;

- pelo menos uma zona para transportar dita amostra líquida;

- pelo menos uma zona para separar dito pelo menos um analito dos outros componentes de dita amostra líquida; e

- pelo menos uma zona para detecção por espectrometria de massa de dessorção ionização (LDI) a leiser

em que dita pelo menos uma zona de transporte compreende um arranjo de estruturas elevadas de uma forma, dimensões e espaçamento no meio de ditas estruturas elevadas, de modo que um fluxo, acionado por força capilar de dita amostra a partir de dita zona de carga, através de dita zona de separação, para dita zona de detecção de LDI, é conseguido.

As estruturas elevadas podem ter diferentes formas, incluindo um formato redondo, um formato cilíndrico, um formato retangular, um formato triangular etc.

A altura destas estruturas elevadas tipicamente será mais elevada do que aproximadamente 1 μιη e mais baixa do que 1000 μηι.

A largura e comprimento destas estruturas elevadas tipicamente será a altura vezes um fator 0,5-1, p. ex., 5-10 μιη para uma estrutura com a altura de 10 μηι.

Na área de detecção, que é usada como plataforma para LDI, os pilares tipicamente será de < 50 μηι de altura, a fim de não prejudicar a resolução de massa na medição MS de tempo de voo.

O espaçamento entre estas estruturas elevadas, que podem ter

uma aparência similar a pilastra, é escolhido para assegurar um transporte acionado por força capilar da amostra líquida da zona de carga através da zona de separação para a zona de detecção de LDI. O espaçamento tipicamente será em uma faixa de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 μιη.

A zona de separação pode ser localizada adjacente à e/ou na zona de carga, zona de transporte e/ou zona de detecção de LDI. A zona de separação pode fornecer uma funcionalidade física, química e/ou biológica, a fim de permitir separação do pelo menos um analito dos outros componentes da amostra líquida.

Uma funcionalidade física pode ser provida pela forma, dimensões e/ou espaçamento, bem como a topografia da distribuição do mesmo tipo de estruturas elevadas quando elas são usadas na zona de transporte. As funcionalidades químicas podem ser providas, p. ex., por diferentes revestimentos. Assim, uma funcionalidade química pode ser provida por um revestimento polimérico hidrofóbico. Alternativa e/ou adicionalmente, uma funcionalidade química pode ser provida por 5 revestimento de polímero iônico, tal como um revestimento de troca de poli- ânions.

Uma funcionalidade biológica será provida por todos os tipos de moléculas que assegurem uma interação biológica específica com um componente da amostra a ser separado. Assim, funcionalidades biológicas 10 incluem anticorpos, moléculas receptoras, moléculas de ácido nucleico e/ou inibidores de molécula pequena, que são revestidos na zona de separação, p. ex., nas estruturas semelhantes a pilastras.

A zona para detecção de LDI compreende pelo menos um metal e/ou pelo menos uma molécula absorvedora de energia (EAM) sendo capaz para uso como material de matriz em uma espectrometria de massa de ionização dessorção leiser assistida por matriz (MALDI-MS) e/ou pelo menos um calibrador.

A zona de detecção de LDI compreenderá um metal ou liga preferivelmente selecionado do grupo compreendendo prata, ouro, platina, paládio, cromo, titânio e cobre com camada de adesão de, p. ex., cromo e/ou titânio.

Alternativa e/ou adicionalmente, a zona de detecção de LDI compreenderá moléculas absorvedoras de energia (EAM) como elas são tipicamente usadas como materiais de matriz na detecção MALDI-MS. 25 Assim, tais moléculas podem sr selecionadas do grupo compreendendo derivados de ácido benzóico, ácido cinâmico e compostos aromáticos relacionados, p. ex., ácido 2,5-diidroxibenzóico (2,5-DHB ou ácido gentísico), ácido a-ciano-4-hidróxi cinâmico (CHCA), ácido 3,5-dimetóxi-4- hidróxi cinâmico (ácido sinápico, ácido sinapínico ou SPA), ácido nicotínico, ácido picolínico, ácido trans-3-metóxi-4-hidróxi cinâmico (ácido ferúlico), ácido 2-(4-hidroxifenilazo)-benzóico (HABA), 6-AZA-2-tiotimina (ATT), 3- HPA, ácido succínico, glicerol, ácido 4-hidroxipicolínico, ácido tartárico, glicerina, 2,4,6-triidróxi acetofenona, ácido 3-hidroxipicolínico, 3- aminoquinolina, 1,8,9-triidróxi-antraceno (ditranol), o corante leiser coumarin 120, pirimidinas substituídas, piridinas e anilinas, p. ex., para-nitroanilina.

O calibrador pode ser qualquer espécie molecular como é comumente usada para fins de referência e calibração em MALDI-MS.

A amostra líquida pode ser uma amostra ambiental, uma amostra retirada de um animal ou um ser humano, de provisões/alimento- substâncias ou de plantas. Outros específicos são expostos abaixo.

Em outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um método para determinar a presença e/ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra, compreendendo as etapas de:

a) prover um dispositivo para separar pelo menos um analito em uma amostra líquida compreendendo pelo menos um substrato com:

- pelo menos uma zona para carregar uma amostra líquida;

- pelo menos uma zona para transportar dita amostra líquida; e

- pelo menos uma zona para separar dito pelo menos um analito de outros componentes de dita amostra líquida;

em que dita pelo menos uma zona de transporte compreende um arranjo de estruturas elevadas de uma forma, dimensões e espaçamento no meio de ditas estruturas elevadas, de modo que um fluxo acionado por força capilar de dita amostra de dita zona de carga através de dita zona de separação é conseguido.

b) carregar uma amostra líquida sobre a zona de carga de dito dispositivo da etapa a);

c) separar dito pelo menos um analito de outros componentes de uma dita amostra utilizando-se dito dispositivo de a); d) determinar a presença e/ou quantidade de dito pelo menos um analito por LDI.

Observamos que nesta forma de realização da presente invenção, o dispositivo não necessariamente compreende uma zona de 5 detecção de LDI com pelo menos um metal e/ou pelo menos uma molécula absorvedora de energia (EAM) sendo apta para uso como material de matriz em espectrometria de massa de ionização dessorção a leiser assistida por matriz (MALDI-MS) e/ou pelo menos um calibrador. Contudo, a presença de tais zonas de detecção de LDI, como descrito acima, pode constituir uma 10 forma de realização preferida da presente invenção.

A zona de separação pode novamente ser localizada adjacente à e/ou na zona de carga, zona de transporte e/ou zona(s) de detecção de LDI, se a(s) última(s) estiver(em) presentes. Naturalmente, a zona de separação pode ser física, química ou biologicamente funcionalizada como descrito acima.

A natureza da amostra pode novamente ser a mesma descrita

acima.

Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser usados para transportar uma amostra líquida ao longo da zona de transporte e 20 separá-la na pelo menos uma zona de separação. Em seguida, a presença e/ou quantidade de um analito são determinadas por espectrometria de massa baseada em LDI, tal como MALDI-MS, inserindo-se o dispositivo diretamente dentro de um correspondente espectrômetro de massa.

A presente invenção também refere-se ao uso dos dispositivos 25 acima descritos para separar analitos dentro de uma amostra líquida e determinar a presença e/ou quantidade por espectrometria de massa baseada em LDI, tal como MALDI-MS. Os dispositivos no mínimo compreendem uma zona para carregar a amostra líquida, uma zona para transportar a amostra líquida e uma zona para separar pelo menos um analito de outros componentes da amostra líquida. A zona de transporte é caracterizada pelo fato de compreender um arranjo de estruturas elevadas, de modo que um fluxo acionado por força capilar da amostra líquida da zona de carga através da zona de separação é conseguido. Tais dispositivos em uma forma de 5 realização preferida compreendem uma zona para uma separação e detecção de massa baseada em dessorção/ionização a leiser, que é caracterizada pela presença de pelo menos um componente metálico e/ou pelo menos uma molécula absorvedora de energia (EAM) sendo apta para uso como material matriz em espectrometria de massa de ionização dessorção leiser assistida por 10 matriz (MALDI-MS).

A presente invenção, portanto, também refere-se ao uso destes dispositivos em bioensaios e, preferivelmente, para métodos diagnósticos in vitro. Uma aplicação particularmente preferida é o uso de tais dispositivos para métodos diagnósticos in vitro em corpos fluidos, tais como sangue, soro, 15 plasma e/ou urina com um foco particular na detecção de marcadores de padrões proteômicos sendo indicativos de doenças, tais como câncer.

Assim, uma forma de realização preferida refere-se à análise de sangue retirado de um ser humano ou animal e análise desta amostra de sangue por MALDI-MS após purificação anterior da amostra, de acordo com um método e dispositivos reivindicados e descritos aqui.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Fig. 1 representa diferentes formas de seção transversal das estruturas elevadas da zona de transporte.

A Fig. 2 representa como estruturas elevadas da mesma forma porém com diferentes espaçamento no meio das estruturas podem ser dispostas na zona de transporte. A topografia específica cria um fluxo acionado por força capilar. Ao mesmo tempo, um efeito de filtro ao longo da seta é estabelecido.

A Fig. 3 mostra um leiaute esquemático de um dispositivo de acordo com a presente invenção. A zona de carga, zona de transporte e zona de detecção de LDI são mostradas. A zona de separação é formada pela modificação de superfície e leiaute físico da zona de transporte.

A Fig. 4 mostra um leiaute esquemático de um dispositivo de 5 acordo com a presente invenção. A zona de carga, zona de transporte e zona de detecção de LDI são mostradas. A zona de separação é formada pela modificação de superfície e um leiaute físico da zona de transporte. A zona de transporte é dividida em diferentes trajetos de fluxo. Uma diferente vazão pode ser conseguida dentro dos diferentes trajetos de fluxo por diferentes 10 formas, dimensões, espaçamentos e distribuições das estruturas elevadas dentro dos diferentes trajetos de fluxo.

A Fig. 5 mostra um leiaute similar à da Fig. 3. Novamente há uma zona de carga, zona de transporte e zona de detecção de LDI. Uma zona de separação é formada pela modificação de superfície e leiaute físico da zona de transporte. Há uma separação ou barreira adicional que pode ser funcionalizada por um anticorpo ou um revestimento cromatográfico.

A Fig. 6 mostra um leiaute similar à da Fig. 4. Há uma zona de carga, zona de transporte e zona de detecção de LDI. Uma zona de separação é formada pela modificação de superfície e leiaute físico da zona de 20 transporte. Há uma adicional zona de separação, que pode ser funcionalizada por um anticorpo ou um revestimento cromatográfico. A zona de transporte é dividida em diferentes trajetos de fluxo. Uma diferente vazão pode ser conseguida dentro de diferentes trajetos de fluxo por diferentes formas, dimensões, espaçamento e distribuição das estruturas elevadas dentro dos 25 diferentes trajetos de fluxo.

A Fig. 7 mostra um leiaute similar à da Fig. 5. Novamente, há uma zona de carga, zona de transporte e zona de detecção de LDI. Uma zona de separação é formada pela modificação de superfície e leiaute físico da zona de transporte. Há duas ou uma zonas de separação adicionais, que podem ser funcionalizadas, p. ex., por um revestimento de anticorpo, troca de cátion, troca de ânion ou uma resina IMAC.

A Fig. 8 mostra um leiaute similar à da Fig. 6. Há uma zona de carga, zona de transporte e zona de detecção de LDI. Uma zona de separação 5 é formada pela modificação de superfície e leiaute físico da zona de transporte. Há duas zonas de separação adicionais, que podem ser funcionalizadas, p. ex., por um revestimento de anticorpo e uma resina IMAC. A zona de transporte é dividida em diferentes trajetos de fluxo. Uma diferente vazão pode ser conseguida dentro dos diferentes trajetos de fluxo por 10 diferentes forma, dimensões, espaçamento e distribuição das estruturas elevadas dentro dos diferentes trajetos de fluxo.

A Fig. 9 mostra uma outra forma de realização. A zona de carga (110) é conectada à zona de transporte, que se estende por todas as partes remanescentes do dispositivo. Uma zona de separação (120) está 15 presente na zona de transporte, bem como duas zonas de detecção de LDI (130, 140). Nesta forma de realização, a zona LDI distante (140) fornecerá um espectro de massa similar ao da zona LDI próxima (130), porém sem o(s) componente(s) removido(s) na zona de separação (120).

DESCRJCÀO DETALHADA DA INVENÇÃO Como foi exposto acima, há uma necessidade contínua de

dispositivos que permitam a separação de amostras biológicas em uma maneira fácil de conduzir e possibilitem análise multiplex da amostra separada por espectrometria de massa.

A presente invenção provê dispositivos e métodos para resolver esta necessidade. Antes destes aspectos da invenção serem descritos mais detalhadamente, algumas definições gerais são providas que se aplicam por toda a descrição da presente invenção.

Como usado neste relatório e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um” e “uma” também incluem os respectivos plurais, a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Assim, o termo “um analito” pode incluir mais do que um analito, isto é, dois, três, quatro, cinco etc. analitos, bem como um padrão de analitos que, juntos, tenham propriedades diagnosticas decisivas.

O termo “cerca de” no contexto da presente invenção indica

um intervalo de precisão que uma pessoa hábil na técnica entenderá como ainda assegurando o efeito técnico da característica em questão. O termo tipicamente indica um desvio do valor numérico indicado de ± 10% ou, preferivelmente, ± 5%.

O termo “amostra” significa um volume de um líquido em

uma solução, emulsão ou suspensão, que se pretende usar para uma determinação qualitativa ou quantitativa de qualquer uma de suas propriedades, tais como a presença ou ausência de um componente, a concentração de um componente etc.

Uma amostra pode ser uma amostra retirada de um organismo,

tal como um ser humano ou animal, da bioesfera tal como amostra de água ou lama ou de um fluido de processo industrial incluindo fluidos de processamento de processos de manufatura de medicamentos, alimento ou alimentos, da purificação de água de beber ou de fluidos de refugo de 20 efluentes. A amostra pode ser diretamente submetida a determinação qualitativa ou quantitativa ou após adequado pré-tratamento, tal como homogeneização, sonicação, lise, filtragem, sedimentação, centrifiigação, tratamento térmico etc.

Amostras típicas no contexto da presente invenção são fluidos corporais tais como sangue, plasma, soro, linfa, urina, saliva, sêmen, fluido gástrico, escarro, lágrimas etc.

Outras amostras típicas são fluidos ambientais tais como água de superfície, água subterrânea, lama etc.

Amostras industriais incluem fluidos de processo, tais como leite, soro de leite, caldo, soluções de nutrição, meio de cultura de célula etc.

Embora a presente invenção é destinada a ser utilizável para todo tipo das amostras acima mencionadas, as amostras de fluidos corporais e amostras de sangue integral constituem um tipo de amostra preferido.

O termo “analito” para fins da presente invenção é usado

sinonimamente ao termo “marcador” e descreve qualquer substância que está presente dentro de uma amostra e cuja presença e/ou quantidade é para ser confirmada por métodos de separação de massa baseada em LDI e detecção.

A presente invenção em uma forma de realização provê um dispositivo para separar pelo menos um analito em uma amostra líquida compreendendo pelo menos um substrato com:

- pelo menos uma zona para carrregar uma amostra líquida;

-pelo menos uma zona para transportar dita amostra líquida;

- pelo menos uma zona para separar dito pelo menos um analito de outros componentes de dita amostra líquida; e

- pelo menos uma zona para detecção de espectrometria de massa por dessorção ionização a leiser (LDI);

em que dita pelo menos uma zona de transporte compreende um arranjo de estruturas elevadas de uma forma, dimensões e espaçamento no meio de ditas estruturas elevadas, de modo que é conseguido um fluxo acionado por força capilar de dita amostra de dita zona de carga através de dita zona de separação para dita zona de detecção de LDI.

O dispositivo é assim caracterizado pela presença de uma zona de carga, uma zona de transporte, uma zona de detecção de dessorção ionização a leiser (LDI) e uma zona de separação. Como será exposto abaixo, a zona de separação pode ser localizada adjacente a e/ou na zona de carga, zona de transporte e/ou zona de detecção de LDI.

O termo “substrato” significa a substância, veículo, superfície, matriz ou chip sobre o qual a zona de carga, zona de transporte, zona de detecção de LDI e/ou zona de separação são dispostos.

Assim, o termo “substrato” descreve uma estrutura veículo sobre a qual a separação real e determinação qualitativa e/ou quantitativa são realizadas. O substrato pode ser produzido do mesmo material que o da zona de carga, transporte, separação e/ou detecção de LDI e, assim, pode ser produzido de qualquer um dos materiais plásticos abaixo mencionados. Entretanto, o substrato pode também ser produzido de outro material que não os materiais que são usados para produzir as zonas de carga, transporte, separação e/ou detecção de LDI. Assim, se as zonas supracitadas forem produzidas de, p. ex., silício, o substrato em uma forma de realização pode ser produzido de uma sobrelâmina de vidro, de um metal ou de qualquer outro material que seja compatível com o uso pretendido do dispositivo, isto é, a introdução em um espectrômetro de massa. Materiais de substrato típicos são silício, vidro, quartzo, cerâmica, metal ou material plástico, p. ex., PMMA ou Teflon.

Tipicamente, as várias zonas (zona de carga, zona de transporte, zona de separação e/ou zona de detecção de LDI) serão construídas em um substrato plástico, que preferivelmente é termoplástico ou um substrato tendo uma camada superior plástica. As várias zonas não 20 necessitam ser fisicamente separadas,como descrito nas figuras 3 e 6. O substrato pode, por sua vez. ser revestido ou derivado usando-se técnicas tais como faiscação, evaporação, revestimento sol-gel, deposição de pastilha e similares, para fornecer, p. ex., um revestimento de silício, metal ou outros materiais. Os substratos da presente invenção podem também ser produzidos 25 de substratos de silício.

Os termos “zona”, “área” e “sítio”, quando eles são usados no contexto deste relatório, exemplos e reivindicações, definem parte do trajeto de fluxo de uma amostra líquida no substrato supracitado.

O termo “arranjo” descreve um leiaute regular ordenado de estruturas elevadas em uma superfície.

Os diferentes tipos de zonas como mencionado acima serão agora explicados mais detalhadamente.

Zona de Carga

A zona de carga é projetada para receber a amostra líquida.

Ela, assim, pode tomar qualquer forma que seja adequada para acomodar a amostra líquida. Tais formas incluem uma forma redonda, uma forma elíptica, uma forma retangular etc. A zona de carga pode fornecer um rebaixo ou depressão, de modo que a amostra líquida na derrame sobre o substrato. Em 10 qualquer caso, a zona de carga será projetada para permitir uma comunicação da amostra líquida da zona de carga com a zona de transporte e outras zonas. Zona de transporte

A zona de transporte compreende um arranjo de estruturas elevadas de uma forma, tamanho e espaçamento no meio de ditas estruturas elevadas, de modo que seja conseguido um fluxo acionado por força capilar de componentes de amostra líquida da zona de carga ao longo da zona de transporte.

Assim, a presente invenção refere-se a dispositivo que, por meio de seu projeto da zona de transporte, permita um fluxo passivo (isto é, não é aplicada força externa) ao longo da zona de transporte.

As estruturas elevadas podem tomar, p. ex., uma aparência similar a pilar e projetarem-se substancialmente verticais ao plano do substrato. Elas podem, portanto, também ser designadas como pilares, colunas ou projeções.

As estruturas elevadas podem tomar qualquer forma que seja

adequada para fornecer um fluxo acionado por força capilar dos componentes da amostra. Elas podem, assim, ser redondas, elípticas, retangulares, triangulares etc. Aparências típicas das estruturas elevadas são representadas na Figura 1. A altura das estruturas elevadas serão tipicamente mais elevadas do que aproximadamente 1 μηι e tipicamente mais baixas do que aproximadamente 1000 μηι. Em certas formas de realização preferidas, a altura das estruturas elevadas será mais elevada do que 5 μηι e mesmo mais preferivelmente mais elevada do que 20 μηι.

A largura das estruturas elevadas será tipicamente a altura vezes um fator de 0,5-1, p.ex., 5-10 μιη para uma estrutura com altura de μηι.

As estruturas elevadas, por exemplo, serão de tamanho submicrômetro a diversas centenas de micrômetros, tipicamente de 5 - 75 μηι, com diâmetros e espaçamentos similares, o alongamento dos pilares sendo tipicamente de < 2,5).

O espaçamento entre as estruturas elevadas tipicamente será na faixa de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 mm. Uma forma de realização preferida refere-se a dispositivos em que o espaçamento entre as estruturas elevadas é no intervalo de 1 a 100 μηι e, mais preferivelmente, no intervalo de 1 a 50 μηι.

O espaçamento entre as estruturas elevadas não tem que ser o mesmo em todas as direções, mesmo embora tal arranjo possa representar uma forma de realização preferida.

O espaçamento e/ou distância entre as estruturas elevadas podem ser escolhidos por uma pessoa hábil na técnica que baseará sua escolha dependendo do tipo de amostra. Assim, a pessoa hábil será claramente cônscia de que as diferentes viscosidades das diferentes amostras apresentarão diferentes exigências de forma, dimensões e espaçamento entre as estruturas elevadas, para assegurar um fluxo acionado por força capilar da amostra líquida ao longo da zona de transporte.

Por exemplo, o espaçamento entre os pilares pode ser escolhido de 5,8 a 6,0 μηι, permitindo que uma esfera com 5,7 μιη de diâmetro encaixe no meio deles, de modo que o espaçamento central entre as esferas é de 10 μηι se analitos menores do que 5,7 μηι forem para ser transportados por fluxo acionado por força capilar.

As estruturas elevadas podem ser projetadas não somente para 5 assegurar um fluxo acionado por força capilar, mas também para exibir uma direção preferida de fluxo, isto pode ser conseguido utilizando-se estruturas elevadas de diferente forma de seção transversal em diferentes partes do trajeto de fluxo, diferente espaçamento entre as estruturas elevadas em diferentes partes do trajeto de fluxo, diferente tratamento químico ou 10 bioquímico de superfície das estruturas elevadas em diferentes partes do trajeto de fluxo ou diferentes níveis de altura em diferentes partes do trajeto de fluxo.

Assim, o trajeto de fluxo da zona de transporte pode ser subdividido em diferentes zonas em que as estruturas elevadas podem ter uma 15 diferente altura, comprimento, largura, forma e/ou espaçamento entre as estruturas elevadas. Se, por exemplo, as estruturas elevadas tomarem a forma de pilares, os pilares podem ser providos em uma zona em estreita proximidade em grupos adjacentes tendo diferentes dimensões e espaçamento.

Dependendo da forma, espaçamento etc., uma pessoa hábil na

técnica será capaz de selecionar uma direção de fluxo preferida, projetando os pilares para prover uma força capilar crescentemente mais forte. Isto tipicamente será conseguido se o espaçamento no meio das estruturas elevadas for reduzido. Assim, pode-se começar no início da zona de 25 transporte com um espaçamento de pilar de aproximadamente 100 μηι, que será crescentemente estreitado até aproximadamente 10 μιη. Como o estreitamento do espaçamento resulta em uma força capilar aumentada, a amostra líquida será forçada na direção das estruturas tipo pilar com reduzido espaçamento. Tal forma de realização da invenção é esquematicamente representada na Figura 2.

A pessoa hábil na técnica, naturalmente, tem conhecido de que diminuindo-se continuamente o espaçamento entre as estruturas elevadas também se criará um efeito de filtro, que pode ser usado para separar alguns 5 componentes da amostra líquida, como será explicado abaixo no contexto da zona de separação.

Por exemplo, o dispositivo pode usar uma primeira “região densa” na zona de transporte, em que o espaçamento no meio das estruturas elevadas é comparavelmente pequeno. Tal região atuará como uma peneira ou IO cerca, evitando que partículas maiores, tais como células, passem ao longo da zona de transporte. Em seguida, pode haver uma região com estruturas elevadas tendo relativamente maior espaçamento entre as estruturas elevadas. Isto pode servir para temporariamente diminuir o tempo para uma interação de fase líquida-sólida se for, por exemplo, desejado que a amostra seja 15 exposta a algum componente ligado a superfície por um tempo especificado, a fim de uma reação particular prosseguir para um término razoável. Após esta região de baixa velocidade, pode ser provida uma região adicional de estruturas mais elevadas, tendo passagens razoavelmente estreitas entre elas. O projeto e leiaute da estrutura elevada terá assim um impacto sobre a

separação, bem como no trajeto de fluxo da amostra líquida.

O trajeto de fluxo da amostra pode também ser influenciado füncionalizando-se parte da superfície das estruturas elevadas. Assim, pode ser considerado fixar ou aprisionar partículas no meio das estruturas elevadas. Estas partículas podem ser escolhidas entre comercialmente disponíveis ou 25 partículas feitas sob medida, tais como micro ou nanopartículas e podem ter um núcleo de vidro, metal ou polímero, ou uma combinação destes, e podem opcionalmente conter em sua superfície componentes químicos ou biológicos, tais como proteínas, anticorpos, aminoácidos, ácidos nucleicos, carboidratos, componentes carboxílicos, componentes de amina etc. As partículas podem ser química ou fisicamente ligadas ao substrato ou mecanicamente aprisionadas dentro da região coberta por estruturas tipo pilar por auto-montagem. Dependendo da afinidade da amostra líquida para tais superfícies funcionalizadas das estruturas elevadas, o fluxo da amostra líquida pode ser direcionado em uma certa direção.

Em outra forma de realização, as propriedades das estruturas elevadas, como forma, dimensões e/ou espaçamento, em combinação com adicionalmente funcionalização da superfície de parte das estruturas elevadas, podem ser usadas para formar um gradiente, isto é, uma mudança contínua 10 sobre a parte da zona de transporte causando retenção gradual, filtragem e/ou mudança da vazão da amostra.

A direção de fluxo, p. ex., a prevenção de contracorrente indesejada da amostra, pode entretanto não somente ser influenciada pelo projeto e leiaute das estruturas elevadas, como descrito acima, mas também por influências externas escolhidas entre aquecimento, esfriamento, irradiação com luz visível e/ou luz UV e/ou a aplicação de uma corrente elétrica ou uma combinação deles atuando em pelo menos uma parte da zona de transporte. Esfriamento, irradiação com luz visível e/ou UV e/ou a aplicação de uma corrente elétrica ou uma combinação deles atuando em pelo menos uma parte da zona de transporte. O projeto das estruturas elevadas pode novamente ser usado para suportar e aumentar o efeito destas forças externas. Por exemplo, a altura da estrutura elevada pode ser reduzida para aumentar a vaporização mediada por calor. Sim, perfeitamente correto (mas o dispositivo tem o objetivo de separar amostras sem fontes externas como o caso mais importante).

A zona de transporte pode também compreender um dois ou mais trajetos de fluxo, cada um dos quais podendo, por exemplo, ser conectado a uma zona de detecção de LDI específica. Tal dispositivo seria adequado para realizar análises múltiplas em paralelo com uma única amostra, começando de uma zona de carga (multiplexação). Neste caso, cada zona de transporte pode, por exemplo, compreender estruturas elevadas de diferentes formas, dimensões e/ou espaçamento entre as estruturas elevadas. Similarmente, cada trajeto de fluxo pode ser ainda funcionalizado, por 5 exemplo, utilizando-se diferentes revestimentos químicos ou moléculas biológicas. Os diferentes trajetos de fluxo da zona de transporte podem ser separados, por exemplo, por uma parede que seja mais elevada do que as estruturas elevadas, a fim de evitar extravasamento e,assim, contaminação cruzada entre os diferentes trajetos de fluxo. Os diferentes trajetos de fluxo 10 podem também ser separados meramente pela ausência de estruturas elevadas se a distância entre as estruturas elevadas for suficientemente grande para evitar fluxo acionado por força capilar.

Há diferentes possibilidades de manufaturar as estruturas elevadas em um substrato como mencionado acima. Estas incluem litografia 15 de silício, eletrogalvanização, estampagem em relevo, fundição, moldagem por injeção de, p. ex., PMMA, policarbonato, poliolefinas tais como Zeonor ou Topas e os correspondentes materiais carregados de carbono, que são condutivos. Outros métodos incluem ornamentação com dados ou cauterização DRIE de silício (vide abaixo).

Tipicamente, o processo de manufatura inclui fabricação de

um padrão de silício, eletrogalvanização de uma ferramenta de molde de níquel do padrão de silício e replicação de grandes volumes de substratos poliméricos por moldagem por injeção pela ferramenta de molde, exatamente como é feito para, p. ex., um CD de música. Assim, o padrão de silício é 25 manufaturado com a precisão da indústria semicondutora e, subsequentemente, replicado com uma economia de produção do negócio de CD de música.

A manufatura de tais estruturas elevadas poderia assim, em sua forma mais simples, ser realizada por cura direta de um mono ou pré- polímero fotossensível depositado em um substrato, empregando-se uma máscara, através da qual luz é irradiada para iniciar a cura e, em seguida, enxaguando-se as áreas não curadas (processo fotorresistivo de película espessa).

5 Outro método direto é através da replicação de um original em

um polímero. O original poderia ser manufaturado de silício através de um processo-DRIE (Deep Reactive Ion Etch — Ataque Iônico Reativo Profundo) onde estruturas de elevado alongamento poderiam ser produzidas. Outras maneiras de produzir tais originais poderia, por exemplo, ser através de 10 processamento a leiser, métodos de eletro descarga, Manufatura de Forma Livre (FFM), cauterização eletroquímica ou química, cauterização de fase gasosa, processamento mecânico, processos fotorresistivo de película espessa ou suas combinações, ou um substrato de, por exemplo, silício, vidro, quartzo, cerâmica, metal ou matéria plástica, como, p. ex., PMMA, policarbonato, 15 poliolefinas ou Teflon.

Um dos métodos mais diretos de replicação seria fundição de um mono ou pré-polímero sobre um original com o desejado formato negativo. Outras maneiras de produzir as réplicas poliméricas poderiam envolver moldagem por injeção ou estampagem em relevo de termoplásticos ou materiais termocurados.

Se o original em alguns aspectos não suportam o processo de replicação, uma réplica intermediária em um material adequado (um estampador) poderia primeiro ser produzida do original. Exemplos de tal processo de estampador poderia ser usado para primeiro depositar uma 25 camada condutora no topo do original e, em seguida, através de eletrogalvanização, formar um negativo do original. Certos materiais de galvanização, tais como Níquel, são bem adequados para a produção repetida e não-destrutiva de cópias do estampador. Isto fornece a possibilidade de tanto mudar a polaridade de negativo para positivo, bem como produzir séries de estampadores idênticos para produção de réplicas de grande volume. Outros exemplos de manufatura de estampador poderia ser em um polímero bem escolhido, dado o formato negativo do original em uma fundição, estampagem em relevo ou processo de moldagem por injeção. A mesma 5 possibilidade de repetidamente e não-destrutivamente fazerem-se cópias do estampador poderia também ser verdadeira para estampadores poliméricos.

Polímeros adequados para moldagem por injeção das estruturas elevadas incluem, p. ex., policarbonato e poliolefmas cíclicas, tais como, p. ex., Zeonor e Topas.

As estruturas elevadas de acordo com a presente invenção

podem ser produzidas de diferentes maneiras. Alguns dos métodos comuns são resumidos acima, porém é também possível fazerem-se estruturas de partes separadas que são montadas após, p. ex., a formação de pilar ter ocorrido em um substrato adequado.

Deve ser entendido que a zona de transporte pode não ser

necessariamente fisicamente distinta da zona de carga e/ou zona de detecção de LDI. Assim, as estruturas elevadas da zona de transporte podem já estar presentes na zona de carga e podem estender-se para dentro da zona de detecção de LDI.

Já foi exposto acima que a escolha da forma, dimensões e

espaçamento entre as estruturas elevadas da zona de transporte pode não somente ter um efeito sobre a direção de fluxo ao prover fluxo mediado por força capilar da amostra, mas também sobre a separação da amostra líquida que é aplicada à zona de carga.

Os princípios que podem ser usados para separar analitos

dentro de uma amostra líquida pela zona de separação serão agora expostos mais detalhadamente.

Zona de separação

Zona de separação refere-se a uma área do dispositivo ao longo do trajeto de fluxo da amostra líquida em que separação de pelo menos um analito de outros componentes da amostra é conseguida.

Para esta finalidade a zona de separação pode ser posicionada adjacente a e/ou na zona de carga, zona de transporte e/ou zona de detecção de LDI.

O inteiro trajeto de fluxo da amostra líquida da zona de carga, através da zona de transporte para a área de detecção de LDI, pode assim ser formado de estruturas elevadas, como descrito acima e por meio do projeto das estruturas elevadas ao mesmo tempo ser a zona de separação completa.

Entretanto, a zona de separação pode também somente ser localizada na (parte da) zona de carga, pode ser localizada somente na (parte da) zona de detecção de LDI ou pode ser localizada somente na (parte da) zona de separação.

Em ainda outra forma de realização pode haver várias zona de separação ao longo da zona de transporte e outras combinações do arranjo de zonas de separação serão óbvias para a pessoa hábil na técnica, particularmente em vista das formas de realização preferidas descritas abaixo.

A zona de separação pode prover separação de analitos de outros componentes da amostra líquida por funcionalidades físicas, químicas ou biológicas.

A separação por funcionalidades físicas já foi parcialmente descrita acima no contexto do projeto da zona de transporte. Assim, as estruturas elevadas que suprem o fluxo acionado por força capilar da amostra líquida da zona de carga para a área de detecção de LDI podem também ser usadas para separar analitos de uma amostra, p. e., filtrando-se e retendo-se matéria particulada relativamente grande amostra. Isto pode ser conseguido por seleção das apropriadas forma, dimensões das e espaçamento entre as estruturas elevadas.

Por exemplo, barreiras para matéria particulada da amostra líquida podem consistir de estruturas elevadas com um espaçamento no meio das estruturas, que evita o transporte da matéria particulada ao longo da zona de transporte do dispositivo. Assim, separação suave das células sanguíneas vermelhas de sangue integral, isto é, separação das células sanguíneas vermelhos sem significativa ruptura de ditas células pode ser conseguida com um gradiente de estruturas tipo pilar, onde o espaçamento dos pilares diminui de cerca de 7 μιη para cerca de 1 μηι através da extensão da zona de separação. Outra matéria particulada inclui mas não é limitada a células, plaquetas, macrófagos, bactérias, partículas virais e tecido sólido homogeneizado.

Isto toma também óbvio que a área de separação, por exemplo, pode já ser localizada na forma das estruturas elevadas acima descritas precisamente próximo da ou na zona de carga, de modo que qualquer penetração de matéria particulada da amostra líquida para dentro do trajeto de fluxo ou outras zonas de separação que são mais a jusante é evitada.

O termo “funcionalidade física”, portanto, compreende funcionalidades envolvidas nas reações e interações que não aquelas que são principalmente químicas ou biológicas. Exemplos são as estruturas elevadas acima mencionadas de diferentes formas, dimensões, espaçamento, topografia de superfície, densidade de superfície, isto é, o número de estruturas elevadas por área unidade, comportamento umectante da superfície de ditas estruturas elevadas ou uma combinação deles e/ou outras funcionalidades influenciando o fluxo, retenção, adesão ou rejeição dos componentes da amostra. Assim, uma zona de separação pode ser feita de elétrodos, a fim de separar componentes da amostra que são eletricamente carregados.

Já foi mencionado acima que uma zona de transporte de um dispositivo de acordo com a presente invenção pode prover diferentes trajetos de fluxo de, p. ex., diferentes vazões. Naturalmente, uma vez que os diferentes trajetos de fluxo de diferentes vazões podem ser realizados por estruturas elevadas de diferentes formas, dimensões e espaçamento entre as estruturas elevadas, tais diferentes trajetos de fluxo também terão diferentes características de separação para uma certa amostra líquida. Assim, projetando-se os trajetos de fluxo com estruturas elevadas de diferentes 5 formas, dimensões e/ou espaçamento dentro de um único dispositivo, todos ser originando da mesma zona de carga, é possível realizar numerosas abordagens de separação em paralelo em um único dispositivo de uma única amostra (multiplexação).

E também possível obter-se a separação dos analitos de outros 10 componentes da amostra usando-se funcionalidades químicas. A expressão “funcionalidade química” compreende qualquer composto ou componente químico necessário para conduzir ou facilitar a separação de um analito de uma amostra líquida. Um grupo de compostos químicos que pode ser usado para aquela finalidade são, por exemplo, revestimentos que exibem uma certa 15 afinidade específica ou capacidade de ligarem-se ou interagirem com um ou mais componentes da amostra. Tais componentes podem, por exemplo, ser revestimentos hidrofóbicos que podem ser produzidos de hidrocarbonetos alifáticos, especificamente hidrocarbonetos Ci-Ci8 alifáticos ou hidrocarbonetos aromáticos compreendendo, p. ex., grupo funcional, tal como 20 grupos fenila. Tais superfícies hidrofóbicas podem ser preferivelmente usadas para analisar interação promovida por sal. Outros materiais que são úteis para analisar interações promovidas por sal incluem absorvência de interação tiofílica, tais como T-GEL® disponível em Pierce, Rockford, Illinois. Outras funcionalidades químicas incluem revestimentos hidrofílicos, tais como 25 óxidos metálicos tais como óxido de titânio, óxido de silício, polímeros hidrofílicos tais como dextrano, polímeros alifáticos lineares ou ramificados, polietileno glicol, agarose, celulose, heparina, poli-L-lisina e seus derivados, epóxidos, detergentes, substâncias biológicas, tais como polímeros, carboidratos, macromoléculas ou suas combinações, etc. Os polímeros podem ser derivados para obterem-se densidades elevadas de, p. ex., grupos carboxílico, amônio ou IMAC.

A zona de separação pode também receber um tratamento hidrofílico antes da funcionalização, p. ex., submetendo-se o substrato a um 5 tratamento oxidativo, p. ex., tratamento de plasma de gás.

As funcionalidades químicas também incluem, por exemplo, cobrir as estruturas elevadas dentro de uma zona de transporte, zona de carga e/ou zona de detecção de LDI com componentes moleculares que permitam separar certos componentes da amostra líquida com base em sua carga. 10 Similarmente, tais funcionalidades químicas podem ser depositadas nas regiões de substrato ao longo do trajeto de fluxo da amostra que não compreendam estruturas elevadas. Em tal caso, tem-se que se tomar certo que a seção não seja de tais dimensões que o fluxo acionado por capilaridade para a próxima zona de transporte/separação seja prejudicado.

Assim, em uma forma de realização pode-se revestir as

estruturas elevadas de uma parte da zona de transporte com resinas, visto que elas são tipicamente usadas para cromatografia de troca catiônica ou aniônica. Similarmente, pode-se revestir partes das estruturas elevadas de uma zona de transporte, zona de carga e/ou zona de detecção de LDI com uma resina como é comumente usado em cromatografia de interação hidrofóbica.

A pessoa hábil na técnica é familiar com tais resinas e estará em uma posição para selecionar o requerido princípio de separação química de acordo com suas necessidades. As matrizes de troca aniônica incluem matrizes de aminas secundárias, terciárias ou quaternárias. Pode-se também 25 usar as entidades moleculares de resinas comuns de cromatografia aniônica, tais como Q-Sefarose, DEAE-Sefarose, como disponíveis na Amersham. Os componentes pertinentes são neste caso aminas quaternárias. No caso de cromatografia de troca catiônica pode-se usar materiais absorventes, tais como matrizes de ânions de sulfato, matrizes de ânions de carboxilato ou ânions de fosfato. Outras funcionalidades químicas incluem materiais de absorvência de interação covalente coordenados, visto que eles são tipicamente usados para captura de afinidade de metal imobilizada (IMAC). Neste contexto, pode-se considerar utilizar superfícies baseadas em ácido nitrilotriacético na zona de separação. Outras modificações químicas serão evidentes para a pessoa hábil na técnica.

A seguir, as funcionalidades químicas de uma zona de separação serão examinadas com respeito à separação das células sanguíneas vermelhas do sangue, que constituem uma das aplicações preferidas da presente invenção. Entretanto, a pessoa hábil na técnica entenderá que estes princípios também se aplicam a outras amostras.

Um grupo de compostos químicos, com particular relevância na presente invenção, são os compostos ou componentes exibindo afinidade específica ou capacidade de ligar-se ou interar-se com um ou mais componentes da amostra de sangue.

Os agentes de separação de células sanguíneas vermelhas constituem um exemplo ilustrativo. Tais agentes podem ser qualquer substância capaz de agregar-se ou ligar-se a células sanguíneas vermelhas, tais como lectinas. Agentes preferidos são materiais positivamente carregados, tais como policátions, incluindo, p. ex., bromidreto de poli-L- lisina; poli (dimetil dialil amônio) cloreto (Merquat TM-100, Merquat TM 280, Merquat TM 550); cloridreto de poli-L-arginina; poli-L-histidina; poli (4-vinilpiridina), cloridreto de poli (4-vinilpiridina); sal quaternário de metilcloreto reticulado por poli (4-vinilpiridina); poli (4-vinilpiridono-co- estireno); poli (4-vinilpiridinío poli (fluoreto de hidrogênio)); poli(4- vinilpiridínio-P-tolueno sulfonato); poli (4-vinilpiridínio-tribrometo); poli (4- vinilpirrolidona-co-2-dimetilaminoetil metacrilato); polivinilpirrolidona, polivinilpirrolidona reticulada, poli(melamina-co-formaldeído); hexadimetrino brometo parcialmente metilado; poli(Glu, Lys) 1:4 bromidreto; poli (Lys, Ala) 3: 1 bromidreto; poli (Lys, Ala) 2: 1 bromidreto; poli-L-lisina succinilada; poli (Lys, Ala) 1: 1 bromidreto; e poli (Lys, Trp) 1: 4 bromidreto. Um dos mais preferidos materiais policatiônicos neste contexto é poli (dimetil 5 dialil amônio) cloreto (Merquat TM-100).

O agente de separação de células sanguíneas vermelhas pode ser usado em qualquer quantidade adequada na zona de separação. Dependendo do design da zona de separação, ele pode assim ser revestido sobre as estruturas elevadas mencionadas acima ou sobre o substrato plano.

Assim, selecionando-se uma combinação de uma certa forma,

dimensão e espaçamento de e entre estruturas elevadas da zona de transporte e aplicando-se uma funcionalidade química a uma área da zona de transporte é, por exemplo, possível que o fluxo de amostra seja finamente sintonizado em uma certa direção e que a separação de certos analitos, bem como remoção de 15 certos componentes da amostra sejam conseguidas ao mesmo tempo. Por exemplo, o fluxo de amostra pode ser finamente sintonizado ajustando-se o diâmetro, altura, formato, seção transversal, espaçamento, topografia de superfície, padrões de superfície e número de estruturas elevadas por área unitária. Além disso, as estruturas elevadas podem ser revestidas na superfície 20 para assegurar um certo comportamento umectante da superfície da estrutura elevada.

Além disso, outra parte da zona de transporte ou do inteiro dispositivo pode ser revestida com um revestimento hidrofílico, submetendo- se, por exemplo esta parte das estruturas elevadas a um tratamento oxidativo, 25 isto é, tratamento de plasma de gás. Ela pode também ser revestida com uma substância hidrofílica, tal como óxido de silício ou polímeros hidrofílicos, tais como dextrano, polietileno glicol, heparina e seus derivados, detergentes etc. Empregando-se tais combinações específicas uma pessoa será capaz de direcionar o fluxo em uma certa direção e separar certos componentes da amostra ao mesmo tempo. Se trajetos de fluxo adicionalmente distintos forem providos dentro da zona de transporte do dispositivo, p. ex., incluindo-se paredes separadoras ou áreas livres de pilar entre os trajetos de fluxo e se os trajetos de fluxo forem revestidos com diferentes funcionalidades químicas, uma análise multiplex da mesma amostra para diferentes propriedades será possível.

Alternativamente ou em adição às funcionalidades físicas e/ou químicas, uma zona de separação pode ser caracterizada por uma funcionalidade biológica.

A expressão “funcionalidade biológica” compreende todas interações biológicas entre um componente de uma amostra e um reagente da e/ou na zona de separação, tal como catálise, ligação, internacionalização, ativação ou outras interações de ligação bioespecíficas. Reagentes típicos adequados, que podem ser usados para funcionalidades biológicas, incluem mas não são limitados a anticorpos, fragmentos de anticorpo e seus derivados, anticorpos de cadeia única, proteína A, proteína G, Estreptavidina, carboidratos, lectinas, DNA, RNA, aptâmeros, ácidos nucleicos modificados, receptores, ligandos, inibidores de molécula pequena etc.

Por exemplo, as estruturas elevadas de uma zona de transporte, zona de carga e/ou zona de detecção de LDI ou uma região planar do substrato podem ser modificadas para conter moléculas escolhidas entre anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, aminoácidos, ácidos nucleicos, carboidratos, componentes carboxílicos etc. Um exemplo de uma lectina é concanavalina A, que pode ser usada para ligar glicoproteínas em uma amostra.

A pessoa hábil na técnica está, naturalmente, também cônscia de que técnicas de separação separadas podem ser aplicadas dentro de diferentes áreas de uma zona de transporte, zona de carga e/ou zona de detecção de LDI. Assim, as estruturas elevadas da zona de transporte podem, p. ex., em uma região ser dispostas de modo que supram uma função de filtragem para, p. ex., células sanguíneas vermelhas, pela seleção das apropriadas forma, dimensões e espaçamento entre as estruturas elevadas, 5 como mencionado acima. Em uma segunda região, as estruturas elevadas de uma zona de transporte podem ser modificadas para prover uma zona de separação baseada em uma funcionalidade química, por exemplo, por revestimento das estruturas elevadas com uma resina IMAC. Em uma terceira área, as estruturas elevadas da zona de transporte podem ser revestidas com 10 um anticorpo que seja específico para uma proteína de interesse.

Se uma amostra de sangue for posicionada na zona de carga, as células sanguíneas vermelhas serão filtradas primeiro por transporte lateral gerado por força de capilaridade. Na segunda etapa os componentes com afinidade para a resina IMAC específica são retidos se eles, por exemplo, 15 forem sabidos serem prejudiciais para outra análise. Em uma etapa posterior, as proteínas podem então ser imobilizadas por anticorpos. Se, como será mostrado abaixo, a zona de detecção de LDI estiver também presente naquela zona de separação, pode-se detectar a presença e/ou quantidade da proteína ligada ao anticorpo sem quaisquer etapas de manipulação significantes 20 durante o manuseio da amostra líquida.

Assim, a pessoa hábil na técnica estará claramente cônscia de que diferentes princípios de separação, tais como revestimentos hidrofóbicos, revestimentos hidrofílicos, revestimentos de troca de íons ou princípios tais como IMAC, funcionalidades biológicas tais como sondas de ácido nucleico, 25 anticorpos, receptores etc., podem ser combinados dentro de diferentes áreas da zona de transporte, zona de carga e/ou zona de detecção de LDI, para assegurar significante separação de uma amostra líquida, sem qualquer influência externa.

O movimento da amostra de líquido através de diferentes zonas de separação será provida pela força de capilaridade que é criada pelo tamanho, dimensões e espaçamento no meio das estruturas elevadas da zona de transporte. Como acima, é considerado que um único dispositivo pode compreender diferentes alamedas de zonas de transporte que são separadas, p. ex., por paredes. Cada alameda pode conter um trajeto de fluxo de diferente princípio de separação. Assim, as várias alamedas permitirão uma análise multiplex da mesma amostra líquida sem a necessidade de adicionar tampões de lavagem, ou dispositivos de pipetagem automatizados. Se cada alameda compreender ainda diferentes princípios de separação, o grau de análise multiplex pode ser mesmo mais aumentado. Opcionalmente, o dispositivo pode ser projetado para e submetido a adição de tampão ou uma etapa de lavagem similar após a adição da amostra.

Zona de detecção de dessorção ionização a leiser

Como mencionado acima, é um aspecto característico dos dispositivos da presente invenção que eles compreendem pelo menos uma zona para detecção por uma dessorção ionização a leiser. As exigências de um ponto a fim de assegurar detecção de um analito por mecanismos baseados em dessorção ionização a leiser, tais como espectrometria de massa, são bem conhecidos da pessoa hábil na técnica.

A zona para detecção de LDI compreende pelo menos um metal e/ou pelo menos uma molécula absorvedora de energia (EAM) sendo apta para uso como material matriz em espectrometria de massa de dessorção/ionização a leiser assistida por matriz (MALDI-MS) e/ou pelo menos um calibrador.

A pessoa hábil na técnica assim será claramente cônscia de que a qualidade da análise de espectrometria de massa pode ser aumentada utilizando-se um ponto de detecção de LDI compreendendo um componente metálico, tal como ouro e/ou prata. Outros metais ou ligas adequados incluem platina, paládio, cromo, titânio e cobre com, . ex., camada de adesão de cromo e/ou titânio.

Tais metais podem ser depositados em uma área de detecção de LDI por sublimação catódica de metais, tais como ouro, nas estruturas elevadas de uma zona de transporte ou em uma região plana do substrato.

Assim, quanto à zona de separação, a zona de detecção de LDI pode ser localizada adjacente a e/ou na zona de transporte e pode coincidir com as zona(s) de separação, significando que a zona de detecção de LDI pode também compreender estruturas elevadas do tipo acima descrito.

Um metal permitirá a transferência de carga durante a dessorção/ionização na análise espectrométrica de massa e, assim, melhorará a qualidade da análise global.

Além disso ou alternativamente ao emprego de metais na zona de detecção de LDI, a zona de detecção de LDI é caracterizada pela presença de uma molécula absorvedora de energia, visto que é adequada para espectrometria de massa de dessorção ionização a leiser associada com matriz (MALDI-MS).

Pelo menos parte da zona de detecção de LDI pode, portanto, ser preparada com uma substância matriz MALDI-MS ligada. Tais substâncias matriz incluem, p. ex., ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico 20 (CHCA), ácido 3,5-dimetóxi-4-hidroxicinâmico (SPA) ou ácido 2,5- diidroxibenzóico (DHB). Outras substâncias matriz podem ser ácido 4- hidroxipicolínico, ácido tartárico ou glicerina.

Estes materiais matriz podem ser depositados no ponto LDI por técnicas comuns. A pessoa hábil na técnica é bem familiar com tais 25 técnicas e está também cônscia de que outros materiais poliméricos podem ser usados para fins de matriz MALDI. Referência é feita neste contexto à US 2003/0207460 Al, que menciona numerosos monômeros e polímeros como materiais matriz EAM que são particularmente adequados para serem depositados em uma zona de detecção de LDI, antes de o analito a ser detectado co-cristalize na matriz. Por exemplo, a copolimerização de ácido alfa-ciano-4-metacrilóxi-cinâmico e metacrilato de octadecila antes de depositar o analito em um certo ponto é um material matriz adequado no contexto da presente invenção. Outros exemplos serão óbvios para a pessoa hábil na técnica. Alguns exemplos são derivados de ácido benzóico, ácido cinâmico e compostos aromáticos relacionados, p. ex., ácido 2,5- diidroxibenzóico (2,5-DHB ou ácido gentísico), ácido a-ciano-4-hidróxi cinâmico (CHCA), ácido 3,5-dimetóxi-4-hidroxicinâmico (ácido sinápico, ácido sinapínico ou SPA), ácido nicotínico, ácido picolínico, ácido trans-3- metóxi-4-hidróxi cinâmico (ácido ferúlico), ácido 2-(4-hidroxifenilazo)- benzóico (HABA), 6-AZA-2-tiotimina (ATT), 3-HPA, ácido succínico, glicerol, 2,4,6-triidróxi acetofenona, ácido 3-hidroxipicolínico, 3- aminoquinolina, 1,8,9-triidróxi-antraceno (ditranol), o corante leiser coumarin 120, substituídas pirimidinas, piridinas e anilinas, p. ex., para-nitroanilina.

Os materiais matriz podem ser covalentemente ou não covalentemente ligados ao substrato e/ou aos estruturas elevadas que podem estar presentes dentro de uma zona de detecção de LDI.

Em uma forma de realização alternativa, a zona de detecção de LDI é definida pela presença de um calibrador, isto é, um padrão de calibração. Tipicamente, pode-se usar qualquer tipo de molécula que seja adequada como padrão de referência e calibração em MALDI-MS. Exemplos específicos de padrões de calibração biológica são expostos abaixo.

Em uma forma de realização preferida a zona de detecção de LDI pode adicionalmente prover um padrão de calibração que tenha sido depositado em uma carta área junto com (ou sem) o(s) material(ais) matriz. Assim, pode-se depositar um padrão de calibração na zona de detecção de LDI. Este pode ser covalente ou não covalentemente ligado. Se um analito alcançar a zona de detecção de LDI e se MALDI for realizado, o padrão de calibração será ionizado e dessorvido junto com o analito, de modo que uma análise do espectro do analito será possível, com base no espectro do padrão de calibração conhecido. Alternativamente, pode haver uma zona LDI separada, não adjacente a uma área de transporte ou separação, com padrão(ões) de calibração fixados. LDI é então realizada de zonas LDI com 5 constituintes de amostra bem como da zona LDI com calibrador(s). Padrões de calibração típicos que podem ser usados são representados na tabela 1 abaixo:

Tabela 1: Padrões de calibração

Foi mencionado acima que controle exato através do fluxo de 10 amostra em uma região com estruturas elevadas pode ser conseguido adaptando-se a forma, dimensões e o espaçamento entre as estruturas elevadas e, p. ex., modificações de superfície. Pela sintonização fina da vazão da amostra em tal região com estruturas elevadas, pode também ser controlada a taxa de cristalização em uma zona de detecção de LDI.

Como é óbvio pelas afirmações feitas acima, uma pessoa hábil

na técnica é claramente cônscia de que a área de detecção de LDI pode ser localizada adjacente à e/ou na zona de transporte e/ou separação.

Se, por exemplo, um anticorpo for depositado nas estruturas elevadas de uma parte da zona de transporte e, desse modo, criar uma zona de 20 separação, este anticorpo pode ter a função de pescar componentes a serem analitos por espectrometria de massa, isto é, a zona de separação de anticorpo é também a zona de detecção de LDI. Alternativamente, o anticorpo pode ter a função de pescar componentes a serem removidos antes de uma análise e, neste último caso, a zona de separação pode não coincidir com a zona de 25 detecção de LDI, que seria então localizada a jusante da zona de separação de anticorpo.

Por exemplo, alguns pesquisadores clínicos do campo de diagnósticos baseados em MS, removem a albumina como parte da preparação de amostra antes da análise MS, porque ela está presente no soro do sangue em concentração bastante elevada para dominar o espectro de massa, enquanto que outros capturam a albumina e realizam MS porque a albumina contém em si própria peptídeos diagnosticamente importantes.

Há várias combinações e variações possíveis para o uso supracitado de um componente metálico e/ou um componente de matriz MALDI na área de detecção de LDI. Assim, em um processo exemplificativo, inicia-se com sublimação catódica de uma camada de ouro fina sobre as estruturas elevadas da zona de transporte, a fim de criar uma área de detecção de LDI. Subsequentemente, um composto de alcanotiol, com um grupo funcional, é permitido formar uma monocamada auto-montada na superfície. O grupo funcional é então usado para mais modificação química com, p. ex., dextrano ou polietileno glicol. Esta modificação cria um ponto de detecção de LDI baseado em metal, junto com uma funcionalidade química para certos componentes de amostra.

Além disso ou após a sublimação catódica de uma camada de ouro fina sobre a estruturas elevadas, a fim de criar uma área de detecção de LDI, pode-se preparar uma película fina de uma substância de matriz MALDI como mencionado acima. Alternativamente, a área de detecção de LDI é criada depositando-se somente uma matriz MALDI. Subsequentemente, um composto de alcanotiol com um grupo funcional é permitido formar uma monocamada auto-montada na superfície. O grupo funcional é então usado para mais modificação química com, p. ex., dextrano ou polietileno glicol.

A presente invenção é assim caracterizada em prover um dispositivo que em um substrato contém pelo menos uma zona de carga para uma amostra líquida, pelo menos uma zona de transporte e pelo menos uma zona de detecção de LDI. O fluxo da amostra líquida da zona de carga para a zona de detecção de LDI pela zona de transporte é mediado por estruturas elevadas com um formato, dimensões e espaçamento no meio das estruturas elevadas, para assegurar fluxo passivo acionado por força capilar da amostra líquida. A velocidade do fluxo e a direção do fluxo podem ser escolhidas corrigindo-se a forma, dimensões e/ou espaçamento no meio das estruturas elevadas.

Além disso, os dispositivos de acordo com a presente invenção incluem uma zona de separação, que pode se basear em funcionalidades físicas, químicas e biológicas para obter isolamento de uma analito distintivo dentro da amostra líquida ou remoção de certos componentes dentro da amostra líquida. A pessoa hábil na técnica estará ciente que uma distinção entre funcionalidades químicas, biológicas e físicas não pode sempre ser possível e que uma interação tal como uma interação entre um componente de uma amostra e um reagente no substrato pode envolver elementos tanto químicos, físicos e biológicos. Contudo, as funcionalidades físicas serão principalmente mediadas também pelo formato, dimensões e/ou espaçamento no meio das estruturas elevadas que podem ser encontradas na zona de transporte, zona de carga e/ou áreas de detecção de LDI. Os parâmetros das estruturas elevadas formarão assim restrições físicas, tais como barreiras ou cercas de filtragem que podem remover, por exemplo, matéria particulada da amostra líquida. Funcionalidades químicas e biológicas referem-se à modificação das estruturas elevadas em qualquer uma da zona de carga, zona de transporte e/ou zona de detecção de LDI ou de partes de qualquer uma da zona de carga, zona de transporte e/ou zona de detecção de LDI, que não podem compreender estruturas elevadas para permitir isolamento de um analito desejado ou remoção de outros componentes indesejados da amostra. Naturalmente, pode-se fazer uso de diferentes combinações de funcionalidades físicas, biológicas e químicas e, desse modo, criar um dispositivo que permita aplicar uma única amostra e subsequente análise multiplex dela.

A seguir, algumas das formas de realização preferidas serão descritas com mais detalhes. A Fig. 3 representa uma forma de realização da presente invenção. Ela consiste de uma zona de carga que pode também ser designada como uma área de aplicação de amostra. Esta área de aplicação de amostra fica em contato íntimo com a zona de transporte, que consiste de uma área de pilares com os pilares sendo projetados para assegurar transporte capilar da amostra. Os pilares são esquematicamente representados na Fig. 3.

A amostra líquida é transportada através da zona de transporte pela força capilar gerada pela estrutura de pilar para uma zona de detecção de LDI. Esta zona de detecção de LDI pode compreender as mesmas estruturas tipo pilar que as da zona de transporte, ter estruturas tipo pilar mais curtas ou pode ser substancialmente plana. A zona de detecção de LDI pode ser revestida de metal e/ou pode ter uma matriz MALDI ligada a sua superfície, com ou sem padrão de calibração. Além disso, o dispositivo pode incluir um código de identificação (código ID) para fins de rastreamento de amostra.

Se uma amostra líquida for aplicada à zona de carga, a amostra líquida será passivamente transportada por meio de ação capilar para a zona de detecção de LDI. Uma vez tenha alcançado a zona de detecção de LDI, a amostra pode ser permitida evaporar e, assim, cocristalizar com o material matriz que foi, por exemplo, depositado na zona de detecção de LDI e o inteiro dispositivo pode então ser inserido em um espectrômetro de massa MALDI.

Dependendo do tamanho, da forma, dimensões e espaçamento entre as estruturas tipo pilar e da natureza da amostra, a zona de transporte sozinha pode já permitir uma separação por retenção da matéria particulada ou estruturas maiores, tais como, por exemplo, células sanguíneas vermelhas, no caso de sangue ser a amostra.

A Fig. 4 mostra uma outra forma de realização da presente invenção. Em comparação com o dispositivo representado na Fig. 3, a área de transporte é dividida em cinco diferentes sub-zonas, que podem ser separadas por uma parede fina ou uma área livre de pilar evitando derrame de líquido de uma alameda para dentro da outra. Cada alameda pode compreender estruturas elevadas de diferentes forma, comprimento, largura e altura e com um diferente espaçamento no meio das estruturas. Assim, cada alameda pode ter uma diferente vazão. Naturalmente, como conseqüência da diferente densidade da diferente estrutura elevada, tais alamedas também fornecerão cinco diferentes áreas de separação, que podem ser usadas para filtrar partículas de diferente tamanho da amostra líquida.

Além das diferentes forma, dimensões e espaçamento no meio das estruturas elevadas, as alamedas podem ser adicionalmente funcionalizada por modificação química e/ou biológica como descrito acima. Desta maneira, o dispositivo permite uma separação da amostra líquida de acordo com diferentes princípios em paralelo. Como a amostra líquida é adicionada à mesma zona de carga, o líquido pode penetrar em cinco diferentes alamedas diretamente e não é necessário dispositivo de pipetagem automatizado. Além disso, o dispositivo neste aspecto pode ser usado para purificar a amostra líquida de acordo com diferentes princípios, sem necessidade de utilizarem- se, por exemplo, tampões de lavagem etc.

Na Fig. 5 contudo outra forma de realização é mostrada. Aqui a área de separação é localizada na zona de transporte em estreita proximidade com a zona de detecção de LDI. Embora os estruturas elevadas elevados da área de transporte possam, naturalmente, também contribuir para a separação física de uma sonda de líquido, a área de separação pode prover separação em uma área distinta da zona de transporte. Assim, a área de separação indicada pode compreender estrutura elevada de mais alta densidade do que a parte remanescente da zona de transporte, desse modo criando uma outra barreira de filtragem. Adicional ou alternativamente, a zona de separação pode ser revestida com, p. ex., uma resina aniônica ou um anticorpo. Dependendo das funcionalidades da zona de separação, certos tipos de moléculas podem ser retidos dentro da área de separação. Se, por exemplo, a área de separação compreender uma resina de troca aniônica forte, polipeptídeos positivamente carregados da amostra líquida podem penetrar mais na zona de detecção de LDI. Nesta forma de realização da invenção, a espécie indesejada de proteínas negativamente carregadas será, portanto, retida dentro da zona de separação. Se, por outro lado, for objetivo detectar proteínas negativamente carregadas em uma amostra líquida, a zona de detecção de LDI pode ser movida para dentro da zona de separação ou vice- versa.

A Fig. 6 mostra uma combinação da Fig. 4 e Fig. 5. Assim, o dispositivo compreende numerosos trajetos de fluxo que, dependendo do tipo de funcionalidades, podem prover diferentes barreiras de separação e, adicionalmente, prover superfícies de afinidade para interações químicas ou biológicas.

A Fig. 7 é ainda outra forma de realização da presente invenção como o é a Fig. 8, ambas representando mais elaborações dos princípios supracitados. Assim, novamente uma amostra líquida é transportada por meio de força capilar, como provido pelas estruturas elevadas ao longo da zona de transporte, para áreas de detecção de LDI. A zona de transporte pode compreender uma zona de separação de diferentes princípios, tais como, por exemplo, um revestimento polimérico ou um revestimento anticorpo. Dependendo de se os analitos a serem detectados são retidos na área de separação ou passam através da área de separação, as zonas de detecção de LDI podem coincidir com a área de separação ou podem ser localizadas a seu jusante ou montante. A Fig. 8 mostra como a análise paralela pode ser ainda aumentada pela introdução de diferentes trajetos de fluxo.

Entende-se que os exemplos e figuras acima descritos não são para ser interpretados como limitantes. A pessoa hábil na técnica será claramente capaz de considerar outras modificações dos princípios expostos aqui.

A presente invenção em outro aspecto também refere-se a métodos para determinar a presença e/ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra, compreendendo as etapas de:

a) prover um dispositivo para separar pelo menos um analito em uma amostra líquida, compreendendo pelo menos um substrato com:

- pelo menos uma zona para carregar uma amostra líquida;

- pelo menos uma zona para transportar dita amostra líquida; e

- pelo menos uma zona para separar dito pelo menos um analito de outros componentes de dita amostra líquida;

em que dito pelo menos uma zona de transporte compreende um arranjo de estruturas elevadas de uma forma, dimensões e espaçamento no meio de ditas estruturas elevadas, de modo que um fluxo, acionado por força capilar, de dita amostra de dita zona de carga, através de dita zona de separação, é conseguido;

b) carregar uma amostra sobre a zona de carga de dito dispositivo da etapa a);

c) separar dito pelo menos um analito de outros componentes de uma dita amostra, empregando-se dito dispositivo de a);

d) determinar a presença e/ou quantidade de dito pelo menos um analito por métodos baseados em LDI, tais como MALDI-MS.

Entende-se que os princípios acima mencionados, com respeito ao projeto da zona de carga, zona de transporte e zona de separação, igualmente se aplicam para os dispositivos usados no método para determinar a presença e/ou quantidade de um analito em uma amostra.

Deve também ser entendido que uma forma de realização do dispositivo como preferido também aplica-se aos dispositivos quando eles são usados em um método para determinar a presença e/ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra.

Assim, a zona de transporte pode novamente ser caracterizada pelo fato de que estruturas elevadas de uma forma, dimensões e espaçamento no meio das estruturas são usadas a fim de assegurar que um fluxo acionado por força capilar da amostra ocorra da zona de carga em uma certa direção passivamente.

Entretanto, para fins de determinar a presença e/ou quantidade de um analito na amostra, os dispositivo não necessariamente têm que compreender uma zona de detecção de LDI pré-estabelecida, no sentido de que esta zona compreende um componente metálico e/ou uma molécula EAM sendo adequados para MALDI-MS e/ou um calibrador. Assim, o dispositivo pode ser inserido dentro de um espectrômetro de massa como tal, a fim de realizar a análise.

Pode-se, portanto, utilizar um dispositivo como descrito acima, sem uma zona de detecção de LDI pré-estabelecida designada e aplicar uma amostra líquida ao dispositivo. A amostra líquida serão então transportada através da zona de transporte por meio da força capilar gerada pelas estruturas elevadas.

A zona de transporte sozinha assegurará um certo trajeto de fluxo e ao mesmo tempo já pode prover separação física em vista da forma, dimensões e espaçamento das estruturas elevadas. Se, além disso, as estruturas elevadas ou outras partes do substrato forem química ou biologicamente funcionalizadas como descrito acima, o movimento dos analitos em certas direções e a especificidade de separação da amostra podem ser aumentados.

O dispositivo pode, naturalmente, também compreender uma zona de separação como descrito acima e a zona de separação pode ficar adjacente a e/ou localizada na zona de carga e/ou zona de transporte. Como descrito acima, a zona de separação pode coincidir completamente com a zona de carga e/ou transporte ou pode somente fazer parte dela. Assim, a zona de separação pode também ser produzida das estruturas elevadas acima mencionadas e pode ser, além disso, funcionalizada por modificação química ou biológica, a fim de prover diferentes princípios de separação.

Naturalmente, o dispositivo pode também prover diferentes trajetos de fluxo e diferentes zonas de separação de vários princípios de separação, a fim de permitir investigação em paralelo da mesma amostra com respeito a diferentes analitos.

Uma vez a amostra tenha passado através das zonas de carga, transporte e separação, pode-se então preferivelmente adicionar um material matriz como sendo adequado para MALDI-MS em locais de interesse e, subsequentemente, introduzir o dispositivo em um espectrômetro de massa, para a determinação qualitativa e/ou quantitativa da presença de um analito da amostra.

Similarmente, pode-se submeter a sublimação catódica certos metais tais como ouro e prata em áreas de interesse. A pessoa hábil na técnica naturalmente também considerará o uso de materiais tanto metálicos como de matriz sendo adequados para MALDI-MS simultaneamente.

Pode também ser considerado adicionar o material matriz MALDI-MS em uma forma líquida à amostra líquida e deixá-lo transportar-se com a amostra. Subsequentemente, o dispositivo pode ser submetido a evaporação e então MALDI-MS pode ser realizada nestas áreas. A pessoa hábil na técnica estará obviamente ciente de que os padrões de calibração podem ser coadministrados ou pré-aplicados como descrito acima.

Embora o método para determinar a presença e/ou quantidade de um certo componente da amostra possa ser realizado com um dispositivo que não compreenda uma zona de detecção de LDI pré-estabelecida, o uso de tais dispositivos como mencionado acima, que compreendam tais zonas de detecção de LDI pré-estabelecidas pode ser preferido. Neste exemplo, a zona de detecção de LDI compreenderá um componente metálico e/ou componente matriz sendo adequado para MALDI-MS e/ou um calibrador que foi descrito acima.

Em uma forma de realização preferida, múltiplos reagentes,

tampões etc. podem ser serialmente adicionados a um trajeto de fluxo.

A presente invenção refere-se ainda ao uso de um dispositivo compreendendo pelo menos um substrato com:

- pelo menos uma zona para carregar uma amostra líquida;

- pelo menos uma zona para transportar dita amostra líquida; e

-pelo menos uma zona para separar dito pelo menos um analito de outros componentes de dita amostra líquida;

em que dita p uma zona de transporte compreende um arranjo de estruturas elevadas de uma forma, dimensões e espaçamento no meio de ditas estruturas elevadas, de modo que um fluxo acionado por força capilar, de dita amostra de dita zona, de carga através de dita zona de separação, é conseguido;

para separar pelo menos um analito em uma amostra líquida e subsequentemente determinar a presença e/ou quantidade de dito pelo menos um analito por MALDI-MS.

E entendido pela pessoa hábil que todas as modificações acima, que foram descritas no contexto dos dispositivos com referência ao design da zona de carga, zona de transporte, zona de separação e zona de detecção de LDI pré-estabelecida igualmente se aplicam.

Os presentes dispositivos e métodos podem ser vantajosamente

usados para, p.ex., fins diagnósticos in vitro. Algumas das formas de realização preferidas referem-se a análise diagnostica in vitro de fluidos corporais, tais como urina, sangue, plasma sanguíneo, sêmen etc. para marcadores biológicos. Os dispositivos e métodos como descritos acima podem, entretanto, também ser usados para outros fins diagnósticos ou analíticos em amostras tais como amostras ambientais, águas servidas etc.

A presente invenção, portanto, em uma forma de realização refere-se ao uso dos dispositivos e métodos acima descritos no contexto de 5 métodos diagnósticos in vitro, para separar pelo menos um analito de uma amostra líquida e subsequentemente determinar da presença e/ou quantidade de dito pelo menos um analito por MALDI-MS.

Exemplos de determinações diagnosticas para aquela finalidade incluem mas não são limitados a detecção e estagiamento de 10 doenças. O discriminador diagnóstico pode ser um marcador, uma combinação de diversos marcadores ou, p. ex., um padrão proteômico. Doenças de interesse potencial incluem uma variedade de cânceres (p. ex., próstata, pulmão, cólon, mama, câncer ovariano, câncer de célula não- pequena, câncer de cabeça e pescoço, linfomas etc.), doenças cardíacas e 15 neurológicas, tais como esclerose múltipla, mal de Alzheimer e doenças infecciosas (p. ex., sépsis). Uma amostra de sangue poderia ser examinada quanto a numerosas diferentes estados doentios imediatamente usando-se os métodos e dispositivos inventivos.

No contexto destes testes, pode-se usar os dispositivos e 20 métodos da invenção para detectar marcadores de doença comuns para, p. ex., doenças oncológicas (PSA, telomerase para câncer de próstata, CA-125 para câncer ovariano), distúrbios metabólicos crônicos, tais como glicose sanguínea, cetonas sanguíneas, glicose de urina (diabetes), colesterol sanguíneo (aterosclerose, obesidade etc.); marcadores de outras doenças 25 específicas, p. ex., doenças agudas, tais como marcadores de infarto coronário (p. ex., troponina-T), marcadores da função da tiróide (p. ex., determinação do hormônio estimulante da tiróide (TSH)), marcadores de infecções bacterianas ou virais (sépsis vs. SIRS, detecção de anticorpos virais específicos); etc.

Outro importante campo de determinações diagnosticas refere- se a gravidez e fertilidade, p. ex., testes de gravidez (determinação de i.a. da gonadotropina coriônica humana (hCG)), testes de ovulação (determinação de

i.a. de hormônio luteinizante (LH)), testes de fertilidade (determinação de i.a. de hormônio estimulante do folículo (FSH) etc.

Igualmente importante para detecção de marcadores únicos,

como os listados acima, é a detecção e análise de doença específica ou estágio doentio discriminando padrões de peptídeo ou proteína, como descrito, p. ex., por Adam et al. (Cancer Research (2002), 62, 3609 - 3614), por Petricoin et al. (Urol. Oncol. (2004), 22, 322 - 328) e por Liotta et al. (Nature (2003), 10 425). Tais padrões podem ser usados para diagnóstico sensível e seletivo em uma larga variedade de áreas de doença, tais como aquelas listadas acima.

Terapia de acompanhamento é um campo de aplicação relacionado, incluindo, p. ex., monitoramento de dose de quimioterapias, resposta à radiação de paciente, comportamento metastático, resposta de hospedeiro a sépsis, insuficiência cardíaca e extensão de infarto.

As atividades de pesquisa e desenvolvimento como proteômicos, descoberta e análise de padrão proteômico, descoberta de biomarcador ou alvo para, p. ex., formação de imagem ou terapia, e descobrimento e desenvolvimento de medicamento formam outras áreas de aplicação interessantes da presente invenção.

Ainda outro importante campo é aquele de testes de medicamento, para detecção fácil e rápida de medicamentos e metabólitos de medicamento indicando abuso de medicamento; tal como a determinação de medicamentos específicos e metabólitos de medicamento (p. ex., THC) em amostras de urina etc.

Particularmente preferido é o uso de tais dispositivos e métodos no contexto de testes diagnósticos in vitro, para determinar a presença e/ou quantidade de um dos marcadores acima mencionados.

Entretanto, a pessoa hábil na técnica também estará obviamente ciente de que os dispositivos e métodos podem também ser usados em muitas outras aplicações, tais como para detectar toxinas em águas servidas ou fluidos de processo industrial.

Se, por exemplo, a qualidade do alimento for para ser 5 controlada, a amostra pode ser uma matéria prima da cadeia de processamento de leite. A amostra pode também ser carne homogeneizada no matadouro ou flor no moinho. As características da amostra são então medidas usando-se MALDI-MS em um dispositivo e/ou com um método de acordo com a invenção.

No contexto dos processos industriais, deve ser considerado

que muitos de tais processos envolvem líquidos complexos que têm que ser monitorados durante um período de dias ou semanas. Tais processos incluem produção de cerveja, produção de farmacêuticos finos recombinantes por fermentação e/ou uso de cultura de célula e produção de enzimas para lavar 15 pós. Repetindo, os líquidos de tais processos podem ser controlados pelos dispositivos e métodos de acordo com a presente invenção.

Algumas das vantagens da presente invenção serão ilustradas a seguir com respeito à aplicação preferida de testes diagnósticos in vitro. A pessoa hábil na técnica entenderá, contudo, que tais vantagens também se aplicam a outras aplicações como aquelas mencionadas acima.

Uma das vantagens da presente invenção é o uso de dispositivos que compreendem uma zona de transporte e separação, consistindo das estruturas elevadas acima mencionados e que permitem multiplexação SELDI/MALDI-MS. A aa descreve que SELDI é realizado em 25 uma superfície cromatográfíca para uma condição de seletividade específica. Entretanto, a presente invenção permite um aumento de eficiência não somente porque a amostra é retirada através da especificidade provendo superfícies por forças capilares, mas também porque uma preparação de uma única amostra pode ser simultaneamente submetida a numerosas alternativas cromatográficas, sem uma substancial necessidade de pré-tratamento ou automação de amostra separada.

Isto diminui a variabilidade da preparação da amostra porque menos etapas de preparações de amostra são necessárias. Por sua vez, esta 5 variabilidade diminuída da preparação da amostra aumenta a especificidade e precisão da medição SELDI/MALDI-MS, que é um dos fatores decisivos na extensão em que as aplicações diagnosticas estão envolvidas.

Entretanto, a presente invenção também permite aumentar o nível de análise multiplex dentro de um dispositivo por diferentes princípios 10 de separação. Assim, a multiplexação pode ser conseguida não somente incorporando-se mais do que um trajeto de fluxo na zona de transporte do dispositivo, mas também incorporando-se mais do que uma área LDI no mesmo trajeto de fluxo.

Por exemplo, uma amostra de sangue integral pode ser 15 separada com uma zona de separação que se liga a/para as células sanguíneas vermelhas e mais a jusante com uma zona de separação ligando-se a albumina. Quatro zonas de detecção de LDI podem ser incorporadas ao longo de tal trajeto de fluxo. Uma pode ser localizada na zona de ligação/parada de células sanguíneas vermelhas (para análise MALDI-MS de células sanguíneas 20 vermelhas), uma no meio das duas zonas de separação, uma na zona de separação de albumina (para análise MALDI-MS de peptídeos sendo associados com albumina) e uma a jusante da zona de separação de albumina para análise de plasma exaurido de albumina.

As vantagens dos presentes dispositivos e métodos também 25 incluem alta precisão, fornecendo características de fluxo bem definido e de ligação, baixo custo e simplicidade. Por exemplo, não há necessidade de uma tampa, bombas externas ou contatos elétricos para acionar o fluxo, mesmo embora tais medidas possam estar presentes em outras formas de realização da invenção. Etapas de lavagem não são também obrigatórias. Além disso, os presentes dispositivos são de fácil manufaturação visto que microestruturas moldadas por injeção são excelentemente adequadas para preparação de amostra e MALDI-MS.

Além destes aspectos, certas desvantagens de tecnologias 5 SELDI e MALDI comuns são superadas. Como já exposto, a maioria dos problemas de tecnologia SELDI e MALDI-MS clássica são relacionados com o manuseio e preparação da amostra, problemas de automação e a plataforma cromatográfica. Como as abordagens da aa requerem a provisão separada de diferentes superfícies cromatográficas ou a adição posterior de material matriz 10 e calibradores, a presente invenção fornece certas vantagens. A variabilidade originando-se da adição de matriz em cada ponto de amostra pode ser mitigada incorporando-se material matriz em zonas de detecção de LDI pré- estabelecidas do dispositivo de acordo com a presente invenção, resultando em cristalização de amostra padronizada com matriz.

Outras vantagens compreendem o manuseio diário dos

dispositivos. Os dispositivos aqui sugeridos permitem simples envio pelo correio e armazenagem de amostras.

No caso de serem necessárias diversas diferentes superfícies cromatográficas em plataformas SELDI da técnica, alíquotas separadas da 20 amostra têm que ser preparadas e dispostas em cada tipo de superfície. Toda a preparação de amostra é realizada usualmente próximo à unidade de detecção e requer um laboratório químico úmido. Usando-se os dispositivos e métodos inventivos, não é necessária unidade bio-processadora, que usualmente requer o ambiente de química úmida para preparação do dispositivo.

Simplificando-se a preparação da amostra e removendo-se

muitas das etapas preparatórias, tais como troca de tampão, uma preparação de amostra mais controlada e menos ruidosa pode ser obtida.

Além disso, o dispositivo sugerido é uma parte descartável de

baixo custo. A presente invenção será agora ilustrada ainda por exemplos hipotéticos.

Exemplo de manufatura para o dispositivo

- Manufatura de um original com apropriada tecnologia, p. ex., processamento de resistência de película espessa com SU-8, um epóxi positivo baseado em cauterização de resina ou silicone com processo Bosch DRIE.

- Transferência do original para um molde em um material rígido, p. ex., metal através de fundição com epóxis carregados de carbono ou vidro ou eletrogalvanização de, p. ex., cobre ou níquel.

- Montagem do molde em um aparelho de moldagem por injeção como um lado de uma cavidade de molde.

- Enchimento da cavidade de molde com polímero termoplástico derretido em elevada temperatura, p. ex., de 300 0C, para Policarbonato com uma temperatura de molde de aproximadamente 70 0C em uma pressão de 200 Bar.

- Remoção da parte do molde após esfriar por tempo apropriado, a fim de o material do chip descer abaixo da Temperatura de Transição Vítrea (p. ex., PC 100 C).

- Modificação da superfície com um metal condutivo, tal como ouro e revestimento(s) funcional(ais) químicos e bioquímicos.

A Figura 9 descreve um dispositivo de acordo com a presente invenção. O dispositivo tem uma zona de carga de amostra (110) e um trajeto de fluxo que é criado por uma zona de transporte consistindo de estruturas similares a pilar elevadas (120). Esta zona de transporte coincide com a zona de separação visto que ela compreende um revestimento de anticorpo nas estruturas elevadas. Os anticorpos especificamente ligam-se à albumina de soro, evitando que ela se propague mais ao longo do dispositivo.

O dispositivo compreende ainda duas zonas de detecção de LDI (130) e (140). E digno de nota que o inteiro dispositivo consiste das já mencionadas estruturas elevadas, de modo que uma amostra líquida, que será transportada através da zona de separação (120), será ainda transportada para a segunda zona de detecção de LDI (140). A zona de detecção de LDI (130), que é posicionada dentro da zona de separação (120), é também coberta com anticorpos. De acordo com o design do dispositivo, a amostra líquida que alcança a segunda zona de detecção de LDI (140) terá quantidades reduzidas de albumina no soro. Ao contrário, a zona de detecção de LDI (130) conterá principalmente albumina no soro, que é capturada pelo anticorpo presente nas e no meio das estruturas elevadas.

A fim de analisar uma amostra de sangue, uma pessoa aplicará em uma primeira etapa 20 μΐ de soro de sangue na zona de carga de amostra do dispositivo. O dispositivo será então incubado horizontalmente por cinco minutos em temperatura ambiente. As zonas de detecção de LDI terá ainda uma matriz MALDI SPA já disposta ou uma pessoa adicionará 1 μΐ de solução de matriz SPA saturada nas zonas LDI. Subsequentemente, o dispositivo será inserido dentro de um espectrômetro de massa e serão obtidos espectros para cada área LDI por MALDI-MS.

A invenção foi descrita acima com respeito a algumas de suas formas de realização preferidas. Entretanto, isto não é para ser interpretado de qualquer maneira limitante. A pessoa hábil na técnica estará obviamente em uma posição para considerar outras modificações dos princípios que subjazem a invenção acima descrita.

Claims (19)

1. Dispositivo para separar pelo menos um analito em uma amostra líquida, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos um substrato com: - pelo menos uma zona para carregar uma amostra líquida; - pelo menos uma zona para transportar dita amostra líquida; - pelo menos uma zona para separar dito pelo menos um analito dos outros componentes de dita amostra líquida; e - pelo menos uma zona para detecção por espectrometria de massa de dessorção ionização (LDI) a leiser em que dita pelo menos uma zona de transporte compreende um arranjo de estruturas elevadas de uma forma, dimensões e/ou espaçamento no meio de ditas estruturas elevadas, de modo que um fluxo, acionado por força capilar de dita amostra a partir de dita zona de carga, através de dita zona de separação, para dita zona de detecção de LDI, é conseguido.

2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ditas estruturas elevadas terem formas tipo pilar, com o espaçamento entre ditas estruturas de pilar sendo na faixa de aproximadamente 0,1 a 1000 μιη, preferivelmente na faixa de aproximadamente 0,1 a 100 μιη e com a altura de ditas estruturas de pilar sendo mais elevadas do que aproximadamente 1 μιη, preferivelmente sendo mais elevadas do que 10 μιη.

3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de dita pelo menos uma se ser posicionada adjacente à ou em dita zona de carga, dita zona de transporte e/ou dita zona de detecção de LDI.

4. Dispositivo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de dita zona de separação compreender ainda uma funcionalidade física, química e/ou biológica, para permitir separar dito pelo menos um analito de outros componentes de dita amostra.

5. Dispositivo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de dita funcionalidade física ser provida por ditas estruturas elevadas com uma forma, dimensões e espaçamento para permitir separar dito pelo menos um analito dos outros componentes de dita amostra.

6. Dispositivo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de dita funcionalidade química ser provida por revestimentos de natureza hidrofóbica, hidrofílica, IMAC e/ou iônica, para permitir separar dito pelo menos um analito de outros componentes de dita amostra.

7. Dispositivo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de dita funcionalidade biológica permitir separar dito pelo menos um analito de outros componentes de dita amostra por interações baseadas em afinidade.

8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de dita zona para detecção de LDI compreender pelo menos um metal e/ou pelo menos uma molécula absorvedora de energia (EAM) sendo apta para uso como material matriz em espectrometria de massa de dessorção/ionização a leiser assistida por matriz (MALDI-MS) e/ou pelo menos um calibrador.

9. Dispositivo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de dita zona para detecção de LDI compreender pelo menos um metal ou liga selecionado do grupo consistindo de ouro, prata, platina, paládio, cromo, titânio e cobre.

10. Dispositivo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de dita zona para detecção de LDI compreender pelo menos uma matriz selecionada do grupo compreendendo derivados de ácido benzóico, ácido cinâmico e compostos aromáticos relacionados, p. ex., ácido 2,5- diidroxibenzóico (2,5-DHB ou ácido gentísico), ácido a-ciano-4-hidróxi- cinâmico (CHCA), ácido 3,5-dimetóxi-4-hidróxi cinâmico (ácido sinápico, ácido sinapínico ou SPA), ácido nicotínico, ácido picolínico, ácido trans-3- metóxi-4-hidróxi cinâmico (ácido ferúlico) ácido 2-(4-hidroxifenilazo)- benzóico (HABA), 6-aza-2-tiotimina (ATT), 3-HPA, ácido succínico, glicerol, ácido 4-hidroxipicolínico, ácido tartárico, glicerina, 1,4,6-triidróxi acetofenona, ácido 3-hidroxipicolínico, 3-aminoquinolina, 1,8,9-triidróxi- antraceno (ditranol), o corante leiser coumarin 120, substituídas pirimidinas, piridinas e anilinas, p. ex., para-nitroanilina.

11. Método para determinar a presença e/ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) prover um dispositivo para separar pelo menos um analito em uma amostra líquida compreendendo pelo menos um substrato com: - pelo menos uma zona para carregar uma amostra líquida; - pelo menos uma zona para transportar dita amostra líquida; e - pelo menos uma zona para separar dito pelo menos um analito dos outros componentes de dita amostra líquida; em que dita pelo menos uma zona de transporte compreende um arranjo de estruturas elevadas de uma forma, dimensões e/ou espaçamento no meio de ditas estruturas elevadas, de modo que um fluxo acionado por força capilar de dita amostra a partir de dita zona de carga, através de dita zona de separação, é conseguido. b) carregar uma amostra líquida sobre a zona de carga de dito dispositivo da etapa a); c) separar dito pelo menos um analito de outros componentes de uma dita amostra utilizando-se dito dispositivo de a); d) determinar a presença e/ou quantidade de dito pelo menos um analito por MALDI-MS.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ditas estruturas elevadas terem formas tipo pilar, com o espaçamento entre ditas estruturas de pilar sendo na faixa de aproximadamente 0,1 a 1000 μιη, preferivelmente na faixa de aproximadamente 0,1 a 100 μιη e com a altura de ditas estruturas de pilar sendo mais elevadas do que aproximadamente 1 μιη, preferivelmente sendo mais elevadas do que 10 μηι.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de dito dispositivo compreender ainda pelo menos uma zona para detecção de LDI compreendendo pelo menos um metal e/ou pelo menos uma molécula absorvedora de energia (EAM) sendo aptos para uso como material matriz em espectrometria de massa de dessorção/ionização a leiser assistida por matriz (MALDI-MS) e/ou pelo menos um calibrador.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de dita zona para detecção de LDI compreender um metal ou liga selecionado do grupo compreendendo ouro, prata, platina, paládio, cromo, titânio e cobre.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de dita zona para detecção de LDI compreender uma matriz selecionada do grupo compreendendo derivados de ácido benzóico, ácido cinâmico e compostos aromáticos relacionados, p. ex., ácido 2,5- diidroxibenzóico (2,5-DHB ou ácido gentísico), ácido a-ciano-4-hidróxi cinâmico (CHCA), ÁCIDO 3,5-dimetóxi-4-hidróxi cinâmico (ácido sinápico, ácido sinapínico ou SPA), ácido nicotínico, ácido picolínico, ácido trans-3- metóxi-4-hidróxi cinâmico (ácido ferúlico), ácido 2-(4-hidroxifenilazo)- benzóico (HABA), 6-aza-2-tiotimina (ATT), 3-HPA, ácido succínico, glicerol, ácido 4-hidroxipicolínico, ácido tartárico, glicerina, 2,4,6-triidróxi acetofenona, ácido 3-hidroxipicolínico, 3-aminoquinolina, 1,8,9-triidróxi- antraceno (ditranol), o corante leiser coumarin 120, piridiminas substituídas, piridinas e anilinas, p. ex., para-nitroanilina.

16. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de dita pelo menos uma zona de separação ser posicionada adjacente a ou em dita zona de carga, dita zona de transporte e/ou dita zona de detecção de LDI.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de dita zona de separação compreender ainda uma funcionalidade física, química e/ou biológica, para permitir a separação de dito pelo menos um analito de outros componentes de dita amostra.

18. Uso de um dispositivo compreendendo pelo menos um substrato com: - pelo menos uma zona para carregar uma amostra líquida; - pelo menos uma zona para transportar dita amostra líquida; e -pelo menos uma zona para separar dito pelo menos um analito dos outros componentes de dita amostra líquida; em que dita pelo menos uma zona de transporte compreende um arranjo de estruturas elevadas de uma forma, dimensões e espaçamento no meio de ditas estruturas elevadas, de modo que um fluxo, acionado por força capilar de dita amostra a partir de dita zona de carga, através de dita zona de separação, é conseguido. caracterizado pelo fato de ser para separar pelo menos um analito em uma amostra líquida e subsequentemente determinar a presença e/ou quantidade de dito pelo menos um analito por LDI e, preferivelmente, detecção MALDI.

19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de dito dispositivo compreender ainda pelo menos uma zona para detecção de LDI compreendendo pelo menos um metal e/ou pelo menos uma molécula absorvedora de energia (EAM) sendo apta para uso como material matriz em espectrometria de massa de dessorção/ionização a leiser assistida por matriz (MALDI-MS).