MXPA05005072A - Diagnostico de la sepsis o sirs usando perfiles de biomarcadores. - Google Patents

Abstract

La prediccion o diagnostico tempranos de sepsis es una ventaja para la intervencion clinica antes de que la enfermedad progrese con rapidez mas alla de las etapas iniciales a las etapas mas graves, como pueden ser sepsis y shock septico grave, que estan asociadas con elevada mortalidad. La prediccion o diagnostico temprano se logra utilizando un enfoque de diagnostico molecular, el cual consiste en comparar el perfil del individuo de la expresion de un biomarcador con los perfiles que se obtienen de una o mas poblaciones testigo o de referencia, las cuales pueden incluir una poblacion que desarrolle sepsis. El reconocimiento de las caracteristicas del perfil del biomarcador del individuo que son caracteristicas del inicio de sepsis permite a un clinico diagnosticar el comienzo de sepsis a partir de un fluido corporal tomado del individuo en un solo punto en el tiempo. La necesidad de supervisar al paciente durante un lapso de tiempo, por tanto, se evita ventajosamente permitiendo la intervencion clinica antes de que se inicien los sintomas graves de sepsis.

Description

DIAGNOSIS DE SEPSIS O SIRS UTILIZANDO PERFILES DE BIOMARCADORES La presente solicitud reclama prioridad ante la solicitud de Patente provisional de Estados Unidos Serie No. 60/425,322, presentada el 12 de noviembre de 2002, la cual se incorpora en la presente como referencia en su entereza.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los métodos para diagnosticar o predecir sepsis o sus estados de progreso en un individuo. La presente invención también se refiere a los métodos para diagnosticar el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica en un individuo.

ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN La detección temprana de un estado de enfermedad por lo regular permite un tratamiento terapéutico más eficaz con un resultado clínico más favorable en consecuencia. Sin embargo, en muchos casos la detección temprana de síntomas de enfermedad es un problema; de aquí que, una enfermedad pueda avanzar relativamente antes de que sea posible su diagnóstico. Los estados inflamatorios sistémicos representan una de esta clase de enfermedades. Estos estados, particularmente sepsis, por lo regular resultan de una interacción entre un mecanismo patogénico y el sistema de defensa del hospedero que activa una respuesta inflamatoria excesiva y desregulada en el hospedero. La complejidad de la respuesta del hospedero durante la respuesta inflamatoria sistémica ha dificultado los esfuerzos hacia la comprensión de la etiología de la enfermedad. (Revisado en Healy, Annual. Pharmacother. 36: 648-54 (2002) .) Una comprensión incompleta de la etiología de la enfermedad, a su vez, contribuye a la dificultad de encontrar biomarcadores diagnósticos. La diagnosis temprana y confiable es muy importante, no obstante, debido al progreso notablemente rápido de sepsis a un estado que pone en riesgo la vida.

La sepsis sigue un curso bien descrito, progresa de síndrome de respuesta inflamatoria sistémica ("SIRS")-negativo a SIRS-positivo a sepsis, la cual puede entonces progresar a sepsis grave, shock séptico, disfunción de órganos múltiples ("MOD") y finalmente la muerte. La sepsis también puede originarse en un individuo infectado cuando el individuo posteriormente desarrolla SIRS . El "SIRS" se define comúnmente como la presencia de dos o más de los siguientes parámetros: temperatura corporal mayor de 38 °C o menos de 36 °C; frecuencia cardiaca mayor de 90 latidos por minuto; frecuencia respiratoria mayor de 20 respiraciones de minuto; PC02 menor de 32 mm Hg; y un recuento de células sanguíneas blancas menor de 4.0 x 109 células/L o mayor de 12.0 x 109 células/L, o tener más de 10% de formas de banda inmaduras. La "sepsis" se define comúnmente como SIRS con un proceso infeccioso confirmado. La "sepsis grave" se asocia con OD, hipotensión, coagulación intravascular diseminada ("DIC") o anormalidades de hipoperfusión, incluida la acidosis láctica, oliguria y cambios en el estado mental. El "shock séptico" se define comúnmente como hipotensión inducida por sepsis resistente a la resucitación con fluidos [sic] con la presencia adicional de anormalidades de hipoperfusión.

Ha sido difícil documentar la presencia de microorganismos patógenos con significado clínico para sepsis . Los microorganismos causales por lo regular se detectan cultivando la sangre, esputo, orina, secreción de heridas, superficies de catéter de la línea de permanencia de un paciente, etc. No obstante, los microorganismos causales pueden recibir solo en algunos microentornos corporales de modo que el material específico que se cultiva puede no contener microorganismos contaminantes . La detección puede complicarse más por los bajos números de microorganismos en el lugar de la infección. Los bajos números de patógenos en la sangre presentan un problema particular para diagnosticar sepsis cultivando sangre. En un estudio, por ejemplo, resultados positivos del cultivo se obtuvieron solo en 17% de pacientes que presentaban manifestaciones clínicas de sepsis. (Rangel-Frausto y col., JAMA 273: 117-23 (1995).) La diagnosis puede además complicarse por contaminación de las muestras por microorganismos no patógenos. Por ejemplo, solo 12.4% de los microorganismos detectados fueron clínicamente significativos en un estudio en 707 pacientes con septicemia. (Weinstein y col., Clinical Infectious Diseas&s 24: 584-602 (1997).) La dificultad en el diagnóstico temprano de sepsis se manifiesta por la elevada morbilidad y mortalidad asociada con la enfermedad. La sepsis actualmente la décima causa principal de muerte en Estados Unidos y es especialmente prevalerte entre pacientes hospitalizados en las unidades de cuidados intensivos no coronarios (las ICü) , donde es la causa de muerte más común. La tasa total de mortalidad es tan alta como 35%, con un estimado de 750,000 casos por año en Estados Unidos solamente. El costo anual de tratar sepsis en Estados Unidos solamente es del orden de miles de millones de dólares.

Por tanto, existe la necesidad de un método para diagnosticar sepsis en una forma suficientemente temprana para permitir la intervención y prevención eficaces . La mayor parte de los sistemas de registro de sepsis o modelos predictivos existentes predicen solo el riesgo de complicaciones en etapa tardía, incluida la muerte, en pacientes que ya son considerados sépticos . Modelos y sistemas como estos, no obstante, no predicen el desarrollo de la propia sepsis. Lo que se necesita particularmente es un modo de clasificar a aquellos pacientes con SIRS que presentarán o no sepsis . En la actualidad, los investigadores por lo regular definirán un solo biotnarcador que se exprese en un nivel diferente en un grupo de pacientes sépticos contra un grupo testigo normal de pacientes (no sépticos) . La Solicitud de Patente de Estados Unidos Serie No. 10/400,275, presentada el 26 de marzo de 2003, el contenido total de la cual se incorpora en la presente como referencia, describe un método para indicar sepsis temprana analizando los cambios en el tiempo del nivel de expresión de los diferentes biomarcadores . Por consiguiente, métodos óptimos para diagnosticar sepsis temprana actualmente necesitan la medición de una pluralidad de biomarcadores y la vigilancia de la expresión de estos biomarcadores durante el tiempo.

Hay una necesidad continua y urgente en la técnica para diagnosticar sepsis con especificidad o sensibilidad, sin la necesidad de vigilar a un paciente con el tiempo. En teoría, la diagnosis se haría por una técnica que mida en forma exacta, rápida y simultánea una pluralidad de biomarcadores en un solo punto del tiempo, reduciendo con ello el progreso de la enfermedad durante el tiempo necesario para la diagnosis.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención permite la predicción y diagnosis exacta, rápida y sensible de sepsis mediante una medición de más de un biomarcador tomado de una muestra biológica en un solo punto del tiempo. Esto se lleva a cabo mediante un abordaje de diagnóstico molecular en el que se obtiene un perfil de biomarcadores en un solo punto en el tiempo de un individuo, particularmente un individuo en riesgo de desarrollar sepsis, que tenga sepsis o se sospeche que tiene sepsis, y comparando el perfil de biomarcador del individuo con un perfil de biomarcador de referencia. El perfil del biomarcador de referencia puede obtenerse de una población de individuos (una "población de referencia" ) que este, por ejemplo, afectada con sepsis o que este sufriendo del inicio de sepsis o un estadio específico en el progreso de sepsis. Si el perfil del biomarcador del individuo contiene las características adecuadas del perfil del biomarcador respecto a la población de referencia, entonces el individuo es diagnosticado con una gran probabilidad de desarrollar sepsis, como estando afectado con sepsis o como en un estadio específico en el progreso de sepsis respecto a la población de referencia. El perfil del biomarcador de referencia también puede obtenerse de diversas poblaciones de individuos que incluyen a aquellos que sufren de SIRS o aquellos que estén sufriendo de una infección pero que no estén sufriendo de SIRS. Por consiguiente, la presente invención permite al clínico determinar, ínter alia, a aquellos pacientes que no tienen SIRS, quienes tienen SIRS pero probablemente no desarrollen sepsis dentro del tiempo de investigación, quienes tienen sepsis o que están en riesgo de finalmente volverse sépticos.

Aunque los métodos de la presente invención son particularmente útiles para detectar o predecir el principio de sepsis en pacientes SIRS, un experto en la técnica comprenderá que los métodos presentes pueden utilizarse para cualquier paciente que incluye, pero no se limita a, pacientes que se sospecha tienen SIRS o que están en algún estadio de sepsis. Por ejemplo, podría tomarse una muestra biológica de un paciente, y podría compararse un perfil de biomarcadores en la muestra respecto a diversos perfiles de biomarcadores de referencia diferentes, cada perfil obtenido de individuos como pueden ser, por ejemplo, aquellos que tienen SIRS o que están en un estadio particular de sepsis . La clasificación del perfil del biomarcador del paciente, correspondiente al perfil obtenido de una población de referencia específica puede predecir que el paciente entra dentro de la población de referencia. Con base en el diagnóstico que resulta de los métodos de la presente invención puede entonces iniciarse un esquema de tratamiento adecuado .

Los métodos existentes para el diagnóstico o predicción de SIRS, sepsis o un estadio en el progreso de sepsis se basan en los signos clínicos y síntomas que no son específicos; por tanto, el diagnóstico resultante muchas veces ha limitado la utilidad clínica. Debido a que los métodos de la presente invención detectan exactamente los diferentes estadios de sepsis, estos pueden utilizarse para identificar a aquellos individuos que puedan participar adecuadamente en un estudio terapéutico. Debido a que la sepsis puede predecirse o diagnosticarse a partir de un "disparo" de la expresión de un biomarcador en una muestra biológica obtenida en un solo punto en el tiempo, este estudio terapéutico puede iniciarse antes del inicio de los síntomas clínicos serios . Debido a que la muestra biológica se ensaya para su perfil de biomarcadores, es no necesaria la identificación de los biomarcadores particulares . No obstante, la presente invención proporciona los métodos para identificar biomarcadores específicos de los perfiles que son característicos de sepsis o de un estadio específico en el progreso de sepsis. Tales biomarcadores serán herramientas útiles para la predicción o diagnóstico de sepsis.

Para este fin, la presente invención proporciona diversos biomarcadores ácidos nucleicos o combinaciones de biomarcadores ácidos nucleicos. Los biomarcadores ácidos nucleicos se identifican a partir de una muestra biológica (puede ser una muestra de sangre) obtenida de un individuo. Sin estar apegado a o limitado a la teoría, los niveles de expresión de algunos mKNA que codifican para proteína involucradas en la respuesta del hospedero a SIRS o diversos estadios de sepsis, incluido el principio de sepsis antes de la sospecha clínica de sepsis utilizando las técnicas tradicionales, son predictivos o diagnósticos del estadio de sepsis o son diagnósticos de SIRS . Las células en la muestra biológica expresan mRNA que codifica estas proteínas, y la detección del nivel de expresión de estos mRNA puede utilizarse para determinar el estado de sepsis o diagnosticar SIRS en un individuo. Los biomarcadores ácidos nucleicos de la invención incluyen, pero no se limitan a, los mRNA, ácidos nucleicos que se preparan a partir de estos mRNA y ácidos nucleicos capaces de formar un dúplex con los mRNA. Los biomarcadores ácidos nucleicos de la presente invención se denominan "biomarcadores de la respuesta del hospedero" .

Por consiguiente, la presente invención también proporciona un kit que contiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez o más biomarcadores de la respuesta del hospedero seleccionados del grupo que consiste en ácidos nucleicos como se mencionan en la lista de cualquiera de las Tablas 2-10. Los ácidos nucleicos que se mencionan en las Tablas 2-10 se identifican por la proteína que codifican. Un biomarcador de la respuesta del hospedero para el propósito de la invención incluye, pero no se limita a, un mRNA que codifique la proteína identificada, un cDNA preparado a partir del mRNA y un DNA u otra molécula que pueda formar un complejo específico (por ejemplo un dúplex hibridado) con un mRNA que codifique la proteína identificada. En una modalidad, el kit contiene una sonda de DNA (por ejemplo un cDNA u oligonucleótidos) que puede formar un dúplex con un mRNA que corresponda a un biomarcador listado en las tablas 2-10. En otra modalidad, la presente invención propone un método que consiste en utilizar las sondas de DNA para construir un arreglo de ácidos nucleicos capaces de determinar el estado de sepsis o de diagnosticar SIRS en un individuo detectando los biomarcadores de mRNA presentes en una muestra biológica del individuo.

La presente invención además proporciona un perfil de biomarcadores de la repuesta del hospedero que contiene al menos dos, tres, cuatro, cinco, diez o 20 o más características que sean características medibles de los ácidos nucleicos y que contribuyan a la clasificación de un individuo en una población de referencia con una exactitud de al menos aproximadamente 60%, al menos alrededor de 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o aproximadamente 100%. La población de referencia se selecciona del grupo que consiste en: una población de referencia normal, una población de referencia positiva para SIRS, una población de referencia infectada/negativa para SIRS, una población de referencia positiva para sepsis, una población de referencia en un estadio específico en el progreso de sepsis, una población de referencia positiva para SIRS confirmada de que tiene sepsis por las técnicas tradicionales después de aproximadamente 0-36 horas, una población de referencia positiva para SIRS confirmada por tener sepsis por las técnicas tradicionales después de aproximadamente 36-60 horas y una población de referencia positiva para SIRS confirmada de tener sepsis por las técnicas tradicionales después de aproximadamente 60-84 horas.

La presente invención además proporciona un método para aislar un biomarcador de la respuesta del hospedero, donde el biomarcador es capaz de ser utilizado en un método para determinar el estado de sepsis y diagnosticar SIRS en un individuo. Este método consiste en obtener un perfil de biomarcadores de referencia de los biomarcadores de respuesta del hospedero a partir de las muestras biológicas obtenidas de una población de individuos e identificar una característica del perfil del biomarcador de referencia capaz de determinar el estado de sepsis o diagnosticar SIRS en el individuo. Entonces se identifica y aisla un biomarcador de la respuesta del hospedero que corresponda a la característica .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra el progreso de SIRS a sepsis. El estado de sepsis consiste en al menos tres estadios, en el que un paciente séptico progresa de sepsis grave a shock séptico a disfunción de órganos múltiples.

La Figura 2 muestra la relación entre sepsis y SIRS . Las diferentes series mostradas en el diagrama de Venn corresponden a poblaciones de individuos que presentan el estado que se indica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención permite el diagnóstico o predicción rápida, sensible y exacta de sepsis utilizando una o más muestras biológicas obtenidas de un individuo en un solo punto del tiempo ("instantáneo") o durante el transcurso del progreso de la enfermedad. Ventajosamente, es posible diagnosticar o predecir sepsis antes del inicio de los síntomas clínicos, permitiendo con ello la intervención terapéutica más eficaz .

"Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica" o "SIRS" se refiere a la respuesta clínica a una variedad de insultos clínicos graves, como se manifiestan por dos o más de los estados siguientes en el transcurso de 24 horas : temperatura corporal mayor de 38 (100. °F) o menos de 36°C (96.8°F); frecuencia cardiaca (HR) mayor de 90 latidos/minuto frecuencia respiratoria (RR) mayor de 20 respiraciones/minuto, o Pco2 menor de 32 mm Hg, o que requiere ventilación mecánica; y recuento de células sanguíneas blancas ( BC) mayor de 12.0 x 109/L o menor de 4.0 x 109/L o tener más de 10% de formas inmaduras (bandas) .

Estos síntomas de SIRS representan una definición de consenso de SIRS que pueden modificarse o sustituirse por una definición mejorada en el futuro. La presente definición se utiliza para clarificar la práctica clínica actual y no representa un aspecto crucial de la invención.

Un paciente con SIRS tiene una presentación clínica que se clasifica como SIRS, como ya se definió, pero no se le considera séptico desde el punto de vista clínico. Los individuos que están en riesgo de desarrollar sepsis son los pacientes que se encuentran en una ICU y aquellos que de otro modo han sufrido de un trauma fisiológico, como quemadura u otro insulto. "Sepsis" se refiere a un estado positivo para SIRS que se asocia con un proceso infeccioso confirmado. La sospecha clínica de sepsis surge de la sospecha que el estado SIRS positivo de un paciente SIRS es el resultado de un proceso infeccioso. Cuando se utiliza en la presente, "sepsis" incluye todos los estadios de sepsis que incluyen, pero no se limitan a, el inicio de sepsis, sepsis grave y MOD asociados con el estadio final de sepsis .

El "inicio de sepsis" se refiere a un estadio temprano de sepsis, es decir, antes de un estadio cuando las manifestaciones clínicas son suficientes para soportar la sospecha clínica de sepsis. Puesto que los métodos de la presente invención se utilizan para detectar sepsis antes del momento en que utilizando las técnicas tradicionales se sospeche de sepsis, el estado de enfermedad del paciente en sepsis temprana puede solo confirmarse en forma retrospectiva, cuando la manifestación de sepsis sea más evidente desde el punto de vista clínico. El mecanismo exacto por el que un paciente se vuelve séptico no es un aspecto crucial de la invención. Los métodos de la presente invención pueden detectar cambios en el perfil de los biomarcadores independientes del origen de proceso infeccioso. No obstante independientemente de cómo sea el origen de la sepsis, los métodos de la presente invención permiten determinar el estado de un paciente que tiene, o se sospecha que tiene sepsis o SIRS, según la clasificación de los criterios actualmente utilizados .

"Sepsis grave" se refiere a sepsis asociada con disfunción de órgano, anormalidades de hipoperfusión o hipotensión inducida por sepsis. Las anormalidades de la hipoperfusión incluyen, pero no se limitan a, acidosis láctica, oliguria o una alteración aguda en el estado mental. "Shock séptico" se refiere a hipotensión inducida por sepsis que no responde al desafío de fluidos intravenosos adecuados y con manifestaciones de hipoperfusión periférica. Un "paciente convertidor" se refiere a un paciente SIRS positivo que progresa a la sospecha clínica de sepsis durante el tiempo que se vigila al paciente, por lo regular durante una estancia ICÜ. Un "paciente no convertidor" se refiere a un paciente SIRS positivo que no progresa hacia la sospecha clínica de sepsis durante el tiempo que se vigila al paciente, por lo regular durante una estancia en la ICU.

Un "biomarcador" es casi cualquier compuesto biológico, como puede ser una proteína y un fragmento de esta, un péptido, un polipéptido, un proteoglucano, una glucoproteína, una lipoproteína, un carbohidrato, un lípido, un ácido nucleico o una sustancia química orgánica o inorgánica, un polímero natural y una molécula pequeña, que esté presente en la muestra biológica y que pueda ser aislado de, o medido en la muestra biológica. Además, un biomarcador puede ser toda la molécula intacta, o puede ser una parte de ésta que puede ser parcialmente funcional o reconocida, por ejemplo, por un anticuerpo u otra proteína de unión específica. Se considera que un biomarcador es informativo sin un aspecto que pueda medirse del biomarcador se asocia con un estado determinado del paciente, como puede ser un estadio específico de sepsis. Un aspecto que puede medirse de este puede medir, por ejemplo, la presencia, ausencia o concentración del biomarcador en la muestra biológica del individuo y/o su presencia como parte del perfil de los biomarcadores . Un aspecto que puede medirse de un biomarcador se define en la presente como una "peculiaridad" . Una peculiaridad también puede ser una relación de dos o más aspectos que puedan medirse de los biomarcadores, cuyos biomarcadores pueden o no ser de identidad conocida, por ejemplo. Un "perfil de biomarcadores" consiste en al menos dos de estas peculiaridades, donde las peculiaridades pueden corresponder a la misma clase o diferente de biomarcadores, por ejemplo, un ácido nucleico y un carbohidrato. Un perfil de biomarcadores también puede consistir en al menos tres, cuatro, cinco, diez, veinte, treinta o más peculiaridades. En una modalidad, un perfil de los biomarcadores consiste en cientos, e incluso miles, de peculiaridades. En otra modalidad, el perfil de los biomarcadores consiste en al menos un aspecto que puedan dividirse de al menos un patrón interno.

Un "cambio fenotípico" es un cambio que pueda detectarse en un parámetro asociado con un estado determinado del paciente. Por ejemplo, un cambio fenotípico puede incluir un aumento o disminución de un biomarcador, en un fluido corporal, donde el cambio se asocie con sepsis o el inicio de sepsis. Un cambio fenotípico puede además incluir un cambio en un aspecto que pueda detectarse de un estado determinado del paciente que no sea un cambio en un aspecto medible de un biomarcador. Por ejemplo, un cambio en el fenotipo puede incluir un cambio detectable en la temperatura corporal, frecuencia de respiración, pulso, presión arterial u otro parámetro fisiológico. Estos cambios pueden determinarse por observación clínica y la medición utilizando las técnicas tradicionales que son bien conocidas para los expertos. Cuando se utiliza en la presente, "técnicas tradicionales" son aquellas técnicas que clasifican a un individuo con base en los cambios fenotípicos sin obtener un perfil de biomarcadores de acuerdo con la presente invención.

Una "regla de decisión" es un método que se utiliza para clasificar a los pacientes. Esta regla puede tomar una o más formas conocidas en la técnica, como se ejemplifica en Hastie y col., "The Elements of Statistical Learning" , Springer-Verlag (Springer, New York (2001)), en la presente incorporada como referencia en su entereza. El análisis de los biomarcadores en la mezcla compleja de moléculas dentro de la muestra genera peculiaridades en una serie de datos. Una regla de decisión puede utilizarse para actuar sobre una serie de datos de las peculiaridades para, ínter alia, predecir el principio de sepsis, para determinar el progreso de sepsis, para diagnosticar sepsis o para diagnosticar SIRS .

La aplicación de la regla de decisión no necesita clasificación perfecta. Es posible hacer una clasificación con al menos 90% de certidumbre, o incluso más, en una modalidad. En otras modalidades, la certidumbre es al menos de aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 70%, o al menos aproximadamente 60%, el grado de certidumbre útil puede variar, dependiendo del método especifico de la presente invención. "Certidumbre" se define como el número total de individuos exactamente clasificados divididos entre el número total de individuos sometidos a clasificación. Cuando se utiliza en la presente, "certidumbre" significa "exactitud". La clasificación también puede caracterizarse por su "sensibilidad". La "sensibilidad" de la clasificación se refiere al porcentaje de pacientes con sepsis quienes fueron identificados correctamente de tener sepsis . "Sensibilidad" se define en la técnica como el número de positivos reales dividido entre la suma de positivos reales y negativos falsos. Por el contrario, la "especificidad" del método se define como el porcentaje de los pacientes que se identificaron correctamente de no tener sepsis. Es decir, "especificidad" se refiere al número de negativos reales dividido entre la suma de los negativos reales y los positivos falsos. En una modalidad, la sensibilidad y/o especificidad es de al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 60%. El número de peculiaridades que puede utilizarse para clasificar a un individuo con certidumbre adecuada es por lo regular aproximadamente 4. Dependiendo del grado de certidumbre buscado, no obstante, el número de peculiaridades puede ser más o menos, pero en todos los casos es al menos una. En una modalidad, el número de peculiaridades que puede utilizarse para clasificar a un individuo se optimiza para permitir una clasificación de un individuo con elevada certidumbre .

"Determinación del estado" de sepsis o SIRS en un paciente comprende la clasificación de un perfil de biomarcadores del paciente para: (1) detectar la presencia de sepsis o SIRS en el paciente, (2) predecir el comienzo de sepsis o SIRS en el paciente, o (3) medir el progreso de sepsis en un paciente. "Diagnosticar" sepsis o SIRS significa identificar o detectar sepsis o SIRS en el paciente. Por la gran sensibilidad de la presente invención para detectar sepsis antes de una manifestación clínica evidentemente observable, la identificación o detección de sepsis incluye la detección del comienzo de sepsis, como ya se definió. Es decir, "predicción del comienzo de sepsis" significa clasificar el perfil de biomarcadores del paciente como correspondiente al perfil obtenido de individuos que están progresando de un estadio particular de SIRS a sepsis o a partir de un estado de estar infectado a sepsis (es decir, de infección a infección con SIRS concomitante) . "Detectar el progreso" o "determinar el progreso" de sepsis o SIRS significa clasificar el perfil de biomarcadores de un paciente que ya este diagnosticado con sepsis o SIRS. Por ejemplo, la clasificación de perfil de biomarcadores de un paciente que ha sido diagnosticado con sepsis puede comprender la detección o determinación del progreso del paciente desde sepsis a sepsis grave o a sepsis con MOD.

De acuerdo con la presente invención, la sepsis puede diagnosticarse o predecirse obteniendo un perfil de biomarcadores de una muestra obtenida de un individuo. Cuando se utiliza en la presente, "obtener" significa "tener" . La presente invención es particularmente útil para predecir y diagnosticar sepsis en un individuo que tiene una infección, o incluso sepsis, pero que todavía no ha sido diagnosticado de tener sepsis, de quién se sospecha tiene sepsis o que está en riesgo de desarrollar sepsis. De la misma manera, la presente invención puede utilizarse para detectar y diagnosticar SIRS en un individuo. Es decir, la presente invención puede utilizarse para confirmar una sospecha clínica de SIRS . La presente invención también puede utilizarse para detectar diversos estadios del proceso de sepsis como infección, bacteremia, sepsis, sepsis grave, shock séptico, y similares.

El perfil de biomarcadores obtenido de un individuo, es decir, el perfil de biomarcadores de prueba, se compara con un perfil de biomarcadores de referencia. El perfil de biomarcadores de referencia puede generarse de un individuo o una población de dos o más individuos . La población, por ejemplo, puede consistir en tres, cuatro, cinco, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más individuos. Más aún, el perfil de biomarcadores de referencia y el perfil de biomarcadores del individuo (a prueba) que se comparan en los métodos de la presente invención pueden generarse del mismo individuo, a condición de que los perfiles de los biomarcadores de prueba y de referencia sean generados de las muestras biológicas tomadas en diferentes puntos de tiempo y comparadas entre sí. Por ejemplo, una muestra puede obtenerse de un individuo en el comienzo de un periodo de estudio. Un perfil de biomarcadores de referencia de esta muestra entonces se puede comparar con los perfiles de biomarcadores generados de muestras ulteriores del mismo individuo. Una comparación como ésta puede utilizarse, por ejemplo, para determinar el estado de sepsis en el individuo por clasificaciones repetidas con el tiempo.

Las poblaciones de referencia pueden elegirse de individuos que no tengan SIRS ("negativos para SIRS"), de individuos que no tengan SIRS pero que estén sufriendo de un proceso infeccioso, de individuos que estén sufriendo de SIRS sin presencia de sepsis ( "positivos para SIRS" ) , de individuos que estén sufriendo del comienzo de sepsis, de individuos que sean positivos para sepsis y que sufran de uno de los estadios en el progreso de sepsis, o de individuos con un trauma fisiológico que aumente el riesgo de desarrollar sepsis. Además, las poblaciones de referencia pueden ser positivas para SIRS y entonces posteriormente ser diagnosticadas con sepsis utilizando las técnicas tradicionales. Por ejemplo, una población de pacientes positivos para SIRS utilizada para generar el perfil de referencia puede ser diagnosticada con sepsis aproximadamente a las 24, 48, 72, 96 o más horas después de haber tomado las muestras biológicas de estos con el objeto de generar un perfil de biomarcadores de referencia. En una modalidad, la población de individuos positivos para SIRS se diagnostica con sepsis utilizando las técnicas tradicionales aproximadamente a las 0-36 horas, aproximadamente a las 36-60 horas, alrededor de las 60-84 horas o alrededor de las 84-108 horas después de haber tomado las muestras biológicas. Si el perfil de biomarcadores es indicativo de sepsis o de uno de sus estadios de progreso, un clínico puede comenzar el tratamiento antes de la manifestación de los síntomas clínicos de sepsis. El tratamiento por lo regular incluirá examinar al paciente para determinar el origen de la infección. Una vez localizado el origen, el clínico por lo regular obtendrá cultivos del lugar de la infección, de preferencia antes de comenzar la terapéutica anti-microbiana empírica pertinente, y tal vez medidas terapéuticas adjuntivas adicionales, como drenar un absceso o retirar un catéter infectado . Las terapias para sepsis se revisan en Healy, supra.

Los métodos de la presente invención comprenden comparar un perfil de biomarcadores de un individuo con un perfil de biomarcadores de referencia. Cuando se utiliza en la presente, "comparación" incluyen cualquier medio para distinguir al menos una diferencia en los perfiles de los biomarcadores del individuo y los de referencia. Así pues, una comparación puede consistir en una inspección visual de los espectros cromatográficos, y una comparación puede incluir comparaciones aritméticas o estadísticas de los valores asignados a las peculiaridades de los perfiles. Tales comparaciones estadísticas pueden ser, pero no se limitan a, aplicar una regla de decisión. Si los perfiles de los biomarcadores comprenden al menos un patrón interno, la comparación para distinguir una diferencia en los perfiles de los biomarcadores también puede consistir en las peculiaridades de estos patrones internos, de modo que las peculiaridades del biomarcador estén correlacionadas con las peculiaridades de los patrones internos. La comparación puede predecir, entre otras cosas, las oportunidades de adquirir sepsis o SI S; o la comparación puede confirmar la presencia o ausencia de sepsis o SIRS; o la comparación puede indicar el estadio de sepsis en el que puede estar el individuo.

La presente invención, por tanto, evita la necesidad de llevar a cabo ensayos que requieren mucho tiempo durante un periodo de supervisión, así como la necesidad de identificar cada biomarcador. Aunque la invención no requiere un periodo de supervisión para clasificar a un individuo, se entenderá que las clasificaciones repetidas del individuo, es decir, instantáneas repetidas, pueden tomarse con el tiempo hasta que el individuo ya no este en riesgo. De otro modo, es posible comparar un perfil de biomarcadores obtenidos del individuo con uno o más perfiles de biomarcadores obtenidos del mismo individuo en diferentes puntos en el tiempo. El técnico apreciará que cada comparación hecha en el proceso de clasificación es repetidas es capaz de clasificar al individuo como perteneciente o no perteneciente a la población de referencia.

Los individuos que tienen una variedad de estados fisiológicos correspondientes a los diferentes estadios en el progreso de sepsis, desde la ausencia de sepsis hasta MOD, pueden distinguirse por un perfil de biomarcadores característico. Cuando se utiliza en la presente, "individuo" es un animal, de preferencia un mamífero, más preferentemente un primate humano o no humano. Los términos "individuo", "sujeto" y "paciente" se utilizan de manera indistinta en la presente. El individuo puede ser normal, un individuo del que se sospecha tiene SIRS o sepsis, en riesgo de desarrollar SIRS o sepsis o un individuo que tenga confirmado SIRS o sepsis. Aunque hay muchos biomarcadores conocidos que han sido involucrados en el progreso de sepsis, no todos estos marcadores parecen estar en las etapas iniciales, preclínicas . La subserie de biomarcadores característicos de sepsis en etapa temprana puede, de hecho, determinarse solo por un análisis retrospectivo de las muestras obtenidas de los individuos que finalmente manifiestan síntomas clínicos de sepsis. Sin apegarse a la teoría, incluso una infección patológica inicial que resulte en sepsis puede provocar cambios fisiológicos que se manifiesten en cambios específicos en la expresión de los biomarcadores. Una vez que se determina por ejemplo el perfil característico de los biomarcadores de un estadio de sepsis, el perfil de biomarcadores de una muestra biológica obtenida de un individuo puede compararse con este perfil de referencia para determinar si el individuo aprueba también se encuentra en este estadio específico de sepsis.

El progreso de una población de un estadio de sepsis a otro, o de normalidad (es decir, una condición caracterizada por no tener sepsis ni SI S) a sepsis o SIRS y viceversa, será caracterizado por cambios en los perfiles de los biomarcadores, a medida que algunos biomarcadores sean expresados en concentraciones cada vez más altas y la expresión de otros biomarcadores muestren regulación hacia abajo. Estos cambios en los perfiles de los biomarcadores pueden manifestar la determinación progresiva de una respuesta biológica en la población de referencia para infección y/o inflamación, por ejemplo. El experto en la técnica se dará cuenta que el perfil de biomarcadores de la población de referencia también cambiará a medida que se reduzca la respuesta fisiológica. Como ya se mencionó, una de las ventajas de la presente invención es la capacidad de clasificar a un individuo, utilizando un perfil de biomarcadores de una sola muestra biológica, como miembro de una población especifica. El experto se dará cuenta, no obstante, que el hecho de determinar si una respuesta fisiológica específica se está haciendo evidente o esta cediendo puede facilitarse por una clasificación ulterior del individuo. Para este fin, la presente invención propone numerosos biomarcadores que aumentan y disminuyen en el nivel de expresión a medida que se inicia o aminora una respuesta fisiológica para sepsis o SIRS. Por ejemplo, un investigador puede elegir una peculiaridad de un perfil de biomarcadores de un individuo que para su conocimiento cambie de intensidad a medida que se establece una respuesta fisiológica para sepsis. Una comparación de la misma peculiaridad en un perfil de una muestra biológica posterior del individuo puede determinar si el individuo esta progresando hacia sepsis más grave o esta progresando hacia la normalidad.

La identidad molecular de los biomarcadores no es primordial para la invención. En realidad, la presente invención no debe limitarse a los biomarcadores que se han identificado anteriormente. (Véase, por ejemplo, la solicitud de Patente US Serie No. 10/400,275, presentada el 26 de marzo de 2003.) Por tanto, se espera que se identifique biomarcadores novedosos que sean característicos de una población determinada de individuos, en especial una población en una de las etapas tempranas de sepsis . En una modalidad de la presente invención, se identifica y aisla un biomarcador, entonces puede utilizarse para aumentar un anticuerpo de unión específica, que pueda facilitar la detección del biomarcador en una variedad de ensayos diagnósticos . Para este fin, cualquier inmunoensayo puede utilizar cualquier anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo capaz de unirse a las moléculas biomarcadoras (por ejemplo los fragmentos Fab, Fv ó scFv) . Estos inmunoensayos se conocen bien en la técnica. Si el biomarcador es una proteína, ésta puede ser secuenciada y su gen codificante puede ser clonado utilizando las técnicas bien establecidas .

Los métodos de la presente invención pueden emplearse para tamizar, por ejemplo, a pacientes admitidos a una ICU. Por ejemplo, se puede tomar una muestra biológica, como sangre, inmediatamente con la admisión. La mezcla compleja de proteínas y otras moléculas dentro de la sangre se resuelve como un perfil de biomarcadores. Esto puede llevarse a cabo mediante el uso de cualquier técnica o combinación de técnicas que distinga de manera reproducible estas moléculas con base en alguna propiedad física o química. En una modalidad, las moléculas son inmovilizadas en una matriz y luego se separan y se distinguen por espectrometría de masas por desorción láser/ionización en tiempo de vuelo. Se crea un espectro por el patrón de desorción característico que manifiesta la relación masa/carga de cada molécula o sus fragmentos . En otra modalidad, los biomarcadores son seleccionados de las diferentes especies de mR A obtenidas de un extracto celular, y se obtiene un perfil de biomarcadores hibridando las especies de mRNA del individuo para un arreglo de cDNA. El uso diagnóstico de la matriz de cDNA es bien conocido en la técnica. (Véase por ejemplo Zou y col., Oncogene 21: 4855-4862 (2002).) En todavía otra modalidad, puede obtenerse un perfil utilizando una combinación de métodos de separación de proteínas y ácidos nucleicos .

La invención también proporciona los kits útiles para determinar el estado de sepsis o diagnosticar SIRS en un individuo. Los kits de la presente invención contienen al menos un biomarcador. Los biomarcadores específicos, útiles en la presente invención, se establecen en la presente. Los biomarcadores del kit pueden utilizarse para generar perfiles de biomarcadores de acuerdo con la presente invención. En general, los biomarcadores del kit se unirán, con al menos una especificidad, a las moléculas biomarcadoras contenidas en la muestra biológica de las cuales se genera el perfil de biomarcadores. Los ejemplos de las clases de compuestos del kit incluyen, pero no se limitan a, proteínas y fragmentos de estas, péptidos, polipéptidos , proteoglucanos , glucoproteínas, lipoproteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, sustancias químicas orgánicas e inorgánicas y polímeros naturales y sintéticos. El (los) biomarcador (es) puede (n) ser parte de un arreglo, o el (los) biomarcador (es) puede (n) estar empacado por separado y/o en forma individual, el kit también puede contener al menos un patrón interno para utilizarlo en la generación de los perfiles y de biomarcadores de la presente invención. Del mismo modo, los patrones internos pueden ser cualquiera de las clases de compuestos antes descritas . Los kits de la presente invención también pueden contener reactivos que pueden utilizarse para marcador en forma detectable los biomarcadores contenidos en las muestras biológicas de las cuales se generan los perfiles de los biomarcadores. Para este propósito, el kit puede contener una serie de anticuerpos o fragmentos funcionales de estos que se unan específicamente a al menos dos, tres, cuatro, cinco, diez veinte o más de los biomarcadores establecidos en cualquiera de las siguientes TABLAS que enlistan los biomarcadores . Los propios anticuerpos pueden ser etiquetados para que sean detectados . El kit también puede contener un componente de unión a biomarcador específico, como un aptámero. Si los biomarcadores consisten en un ácido nucleico, el kit puede proporcionar una sonda oligonucleótida que pueda formar un dúplex con el biomarcador o con una hebra complementaria de un biomarcador. La sonda oligonucleótida puede etiquetarse para que sea detectada.

Los kits de la presente invención también pueden tener los excipientes, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticos cuando el biomarcador vaya a utilizarse para aumentar un anticuerpo. Los ejemplos de los adyuvantes farmacéuticos pueden ser, pero no se limitan a, preservadores, agentes humectantes, agentes emulsificadores y agentes dispersores. La prevención de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante la inclusión de algunos agentes antibacterianos y antimicóticos , por ejemplo parabeno, clorobutanol, ácido sórbico fenol y similares . También puede ser necesario incluir agentes isotónicos como azúcares, cloruro de sodio y similares . La absorción prolongada de una forma farmacéutica inyectable puede obtenerse mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción como monoestearato de aluminio y gelatina.

Generación de perfiles de biomarcadores De acuerdo con una modalidad, los métodos de la presente invención consisten en obtener un perfil de biomarcadores a partir de una muestra biológica tomada de un individuo. La muestra biológica puede ser sangre, plasma, suero, saliva, esputo, orina, fluido cerebroespinal, células, un extracto celular, una muestra de tejido, una biopsia de tejido, una muestra de eses y similares . El perfil de biomarcadores de referencia puede obtenerse, por ejemplo, de una población de individuos seleccionados del grupo que consiste en individuos SIRS negativos, individuos SIRS positivos, individuos que estén sufriendo del comienzo de sepsis e individuos que ya tengan sepsis. El perfil de biomarcadores de referencia de individuos que ya tengan sepsis puede obtenerse en cualquier estadio en el progreso de sepsis, como infección, bacteremia, sepsis grave, shock séptico MOD.

En una modalidad, puede utilizarse un método de separación para crear un perfil de biomarcadores , para que se analice solo una subserie de biomarcadores dentro de la muestra. Por ejemplo, los biomarcadores que se analizan en una muestra pueden consistir en especies de mRJNIA de un extracto celular, el cual haya sido fraccionado para obtener solo los biomarcadores ácidos nucleicos de la muestra, o los biomarcadores pueden consistir en fracción del complemento total de proteínas dentro de la muestra, la cual ha sido fraccionada por técnicas cromatográficas . De otro modo, un perfil de biomarcadores puede crearse sin emplear un método de separación. Por ejemplo, una muestra biológica puede ser interrogada con un compuesto etiquetado que forme un complejo especifico con un biomarcador de la muestra, donde la intensidad de la etiqueta en el complejo especifico sea una característica que pueda medirse de un biomarcador. Un compuesto conveniente para formar un complejo específico como éste es un anticuerpo marcado. En una modalidad, un biomarcador se mide utilizando anticuerpo con un ácido nucleico amplificable como etiqueta. En todavía otra modalidad, la etiqueta de ácido nucleico se vuelve amplificable cuando dos anticuerpos, cada uno conjugado a una hebra de la etiqueta de ácido nucleico, interacciona con el biomarcador, de modo que dos hebras de ácido nucleico formen un ácido nucleico que pueda ser amplificado.

En otra modalidad, el perfil de biomarcadores puede obtenerse de un ensayo, como puede ser un arreglo, de ácidos nucleicos, donde los biomarcadores sean ácidos nucleicos o complementos de estos. Por ejemplo, los biomarcadores pueden ser ácidos ribonucleicos . El perfil de biomarcadores también puede obtenerse utilizando un método seleccionado del grupo que consiste en: resonancia magnética nuclear, arreglos de ácidos nucleicos, absorción de puntos, absorción de ranuras, amplificación de la transcripción inversa y análisis Northern. En otra modalidad, el perfil de biomarcadores se detecta en forma inmunológica haciendo reaccionar anticuerpos, o fragmentos funcionales de estos , específicos para los biomarcadores . Un fragmento funcional de un anticuerpo es una parte de un anticuerpo que conserva al menos alguna habilidad para unirse al antígeno al que se une el anticuerpo completo. Los fragmentos, que incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos scFv, los fragmentos Fab y los fragmentos F(ab)2, pueden producirse en forma recombinante o en forma enzimática. En otra modalidad, las moléculas de unión específicas diferentes de los anticuerpos, los aptámeros, pueden utilizarse para unirse a los biomarcadores . En todavía otra modalidad, el perfil de biomarcadores puede comprender un aspecto que pueda medirse de un agente infeccioso o un componente de este. En todavía otra modalidad, el perfil de biomarcadores puede comprender aspectos que puedan medirse de moléculas pequeñas, las cuales pueden incluir fragmentos de proteínas o ácidos nucleicos, o que pueden incluir metabolitos .

Los perfiles de biomarcadores pueden generarse mediante el uso de uno o más métodos de separación. Por ejemplo, los métodos de separación convenientes pueden consistir en un método de espectrometría de masas, como puede ser la espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) , ESI- S/MS, ESI-MS/ (MS) n (n es un entero mayor de 0 , espectrometría de masas por ionización de desorción láser en tiempo de vuelo, asistido por matriz (MALDI-TOF-MS) , espectrometría de masas por desorción de láser/ionización en tiempo de vuelo, de superficie aumentada (SELDI-TOF-MS) , desorción/ionización sobre silicio (DIOS) , espectrometría de masas de ión secundario (SIMS) , cuadripolar en tiempo de vuelo (Q-TOF) , espectrometría de masas de ionización química a presión atmosférica (APCI-MS) , APCI-MS/MS, APCI- (MS) n, espectrometría de masas de fotoionización a presión atmosférica (APPI-MS) , APPI-MS/MS y APPI- (MS)n. Otros métodos de espectrometría de masas pueden incluir, entre otros, la espectrometría de masas de las transformadas de fourier (FTMS) , cuadripolar y la trampa de iones . Otros métodos de separación convenientes pueden incluir el reparto por extracción química, cromatografía en columna, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía líquida hidrofóbica (fase inversa) , electroforesis en gel de poliacrilamida, unidimensional, con enfoque isoeléctrico (PAGE) , electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional (2D-PAGE) u otras cromatografías, como la de capa fina, la cromatografía de gases o líquidos o cualquier combinación de éstas. En una modalidad, la muestra biológica puede fraccionarse antes de la aplicación del método de separación.

Los perfiles de biomarcadores también pueden generarse por los métodos que no necesitan separación física de los propios biomarcadores. Por ejemplo, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (UMR) puede utilizarse para resolver un perfil de biomarcadores a partir de una mezcla compleja de moléculas. Un uso semejante de la WM para clasificar tumores está descrito en Hagberg, NMR Biomed. 11: 148-56 (1998), por ejemplo. Otros procedimientos incluyen las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos que pueden utilizarse para generar un perfil de biomarcadores sin separación física de los biomarcadores individuales . (Véase Stordeur y col., J. Immunol. Methods 259: 55-64 (2002) y Tan y col, Proc Nati Acad Sci USA 99: 1138-11392 (2002), por ej emplo .

En una modalidad, se utiliza espectrometría de masas de desorción/ionización láser en tiempo de vuelo .para crear un perfil de biomarcadores donde los biomarcadores son proteínas o fragmentos de proteínas que sean ionizado y vaporizado de un soporte inmovilizador por radiación láser incidente . Entonces se crea un per il por el tiempo de vuelo característico de cada proteína, el cual depende de la relación masa a carga ( n /z" ) . En la técnica se conocen diversos métodos de desorción/ionización láser. (Véase Guttman y col., Anal. Chem. 73: 1252-62 (2001). Y Wei y col., Nature 399: 243-46 (1999)).

La espectrometría de masas por desorción/ionización de láser en tiempo de vuelo permite la generación de grandes cantidades de información en un tiempo relativamente corto. Se aplica una muestra biológica a uno de las diferentes variedades de soporte que une todos los biomarcadores, o una subserie de estos, en una muestra. Los lisados celulares o muestras se aplican directamente a esta superficie en volúmenes tan pequeños como 0.5 µL, con o sin purificación o fraccionación previas . Los lisados o la muestra pueden ser concentrados o diluidos antes de la aplicación sobre la superficie del soporte . La desorción/ionización láser entonces se utiliza para generar espectros de masas de la muestra, o las muestras, en tan poco tiempo como tres horas.

En otra modalidad se ensaya el mRNA total de un extracto celular del individuo, y las diferentes especies de mRNA que se obtienen de la muestra biológica se utilizan como biomarcadores. Los perfiles pueden obtenerse, por ejemplo, hibridando estos mRNA para un arreglo de sondas, que puede comprender oligonucleótidos o los cDNA, utilizando los métodos normales conocidos en la técnica. De otro modo, es posible someter los mRNA a electroforesis en gel o métodos de absorción como los dot blots, slot blots o análisis Northern, todos los cuales son conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo Sambrook y col., en "Molecular Cloning 3a ed.," Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001).) Los perfiles del mR A también pueden obtenerse por transcripción inversa seguida por amplificación y determinación de los cDNA resultantes, como se describe por Stordeur y col., supra, por ejemplo. En otra modalidad, es posible obtener el perfil utilizando una combinación de métodos, como un arreglo de ácidos nucleicos combinados por espectrometría de masas .

Uso de un algoritmo de análisis de datos En una modalidad, la comparación de un perfil de biomarcadores del individuo a un perfil de biomarcadores de referencia consiste en aplicar una regla de decisión. La regla de decisión puede comprender un algoritmo de análisis de datos, como puede ser un algoritmo de reconocimiento de patrones por computadora. Otros algoritmos convenientes pueden ser, pero no se limitan a, regresión logística o un algoritmo no paramétrico que detecte las diferencias en la distribución de los valores de las peculiaridades (por ejemplo una prueba de ilcoxon Signed Rank) . La regla de decisión puede basarse en una, dos, tres, cuatro, cinco, 10, 20 o más peculiaridades en una modalidad, la regla de decisión se basa en cientos o más de peculiaridades. La aplicación de la regla de decisión también puede comprender el uso de un algoritmo de árbol de clasificación. Por ejemplo, el perfil de biomarcadores de referencia puede comprender al menos tres peculiaridades, donde las peculiaridades sean predictores en un algoritmo de árbol de clasificación. El algoritmo de análisis de datos predice la membresia dentro de una población (o clase) don una exactitud de al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80% y al menos aproximadamente 90%.

Los algoritmos convenientes son conocidos en la técnica, algunos de los cuales se revisan en Hastie y col. r supra. Estos algoritmos clasifican espectros complejos de materiales biológicos, como puede ser una muestra de sangre, para distinguir a los individuos como normales o como poseedores de los niveles de expresión de los biomarcadores característicos de un estado de enfermedad especifico. Aunque estos algoritmos pueden utilizarse para aumentar la velocidad y eficiencia de la aplicación de la regla de decisión, y para evitar el sesgo del investigador, un experto en la técnica se dará cuenta que los algoritmos basados en computación no son necesarios para llevar a cabo los métodos de la presente invención.

Los algoritmos pueden aplicarse a la comparación de los perfiles de los biomarcadores, independientemente del método que se utilizó para generar el perfil de biomarcadores. Por ejemplo, los algoritmos convenientes pueden aplicarse a los perfiles de los biomarcadores generados utilizando cromatografía de gases, como se describe en Harper, "Pyrolysis and GC in Polymer Analysis", Dekker, New York (1985) . Además, agner y col. r Anal. Chem. 74: 1824-35 (2002) describe un algoritmo que mejora la habilidad para clasificar a los individuos basándose en los espectros obtenidos por espectrometría de masas de ión secundario, en tiempo de vuelo, estático (TOF-SIMS) . Además, Bright y col., J. Mlcrobiol . Methods 48: 127-38 (2002) describe un método para distinguir entre cepas bacterianas con alta certidumbre (79-89% de las tasas de clasificación correctas) por análisis de espectros MALDI-TOF-MS . Dalluge, Fresenius J. Anal. Chem. 366: 701-11 (2000) analiza el uso de MALDI-TOD-MS y cromatografía líquida-espectrometría de masas por ionización de electrospray (LC/ESI-MS) para clasificar los perfiles de los biomarcadores en muestras biológicas complejas.

Biomarcadores Los métodos de la presente invención pueden llevarse a cabo mediante la generación de un perfil de biomarcadores que sea diagnóstico o predictivo de sepsis o SIRS. Puesto que para llevar a cabo la invención es suficiente la generación del perfil, no es necesario conocer y después identificar los biomarcadores que constituyen el perfil.

En resumen, los biomarcadores endógenos útiles para determinar el estado de sepsis o diagnosticar SIRS en un individuo de acuerdo con los métodos de la presente invención se definen en la presente como "biomarcadores de la respuesta del hospedero". Los biomarcadores que pueden utilizarse para generar los perfiles de los biomarcadores de la presente invención pueden incluir aquellos conocidos por ser informativos del estado del sistema inmunitario en respuesta a infección; no obstante, no todos estos biomarcadores pueden ser igualmente informativos. Estos biomarcadores pueden consistir en hormonas, auto-anticuerpos, receptores solubles e insolubles, . factores de crecimiento, factores de transcripción, marcadores de la superficie celular y marcadores solubles del hospedero o del propio patógeno, como pueden ser proteínas de cubierta, lipopolisacáridos (endotoxina) , ácidos lipoteicóicos, etc. Otros biomarcadores pueden ser, pero no se limitan a proteínas de la superficie celular como las proteínas CD64; proteínas CDllb; moléculas HLA clase II, incluidas las proteínas HLA-DR y proteínas HLA-DQ; proteínas CD54; proteína CD71; proteínas CD86 receptor del factor de necrosis tumoral unido a la superficie (TNF-R) ; receptores de reconocimiento del patrón como pueden ser los receptores tipo Toll; marcadores solubles como las interleucinas IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13 e IL-18; el factor de necrosis de tumor alfa (TNF-a) ; neopterina; proteína C-reactiva (CRP) ; procalcitonina (PCT) ; d-queto Fia; tromboxano B2; leucotrienos B4, C3, C4, C5, D4 y E4; interferón gama (IFNy) ; interferón alfa/beta (IFN-a/ß) / linfotoxina alfa (LTct) ; componentes del complemento (C ) ; factor activador de plaquetas (PAF) ; bradicinina, óxido nítrico (NO) ; factor estimulador de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF) ; factor inhibidor de macrofagos (MIF) ; agonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra); receptores del factor de necrosis de tumor, soluble (sTNFr); receptores de interleucinas solubles sIL-lr y sIL-2r; el factor de crecimiento transformante beta (TGFP) ; prostaglandina E2 (PGE2) ; factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) ; y otros mediadores de la inflamación. (Revisado en Oberholzer y col.r shock 16: 83-96 (2001) y Vincent y col. r en "The Sepsis Text" Carlet y col-, eds. (Kluwer Academia Publishers, 2002).) Los biomarcadores que se utilizan comúnmente y se asocian desde el punto de vista ciánico con bacteremia también son candidatos para biomarcadores útiles para la presente invención, dada la presencia común y frecuente de estos biomarcadores en muestras biológicas. Los biomarcadores pueden incluir compuestos de peso molecular bajo, los cuales pueden ser fragmentos de proteínas o ácidos nucleicos, o pueden incluir metabolitos. La presencia o concentración de los compuestos de peso molecular bajo, como los metabolitos puede manifestar un cambio fenotípico que se asocia con sepsis y/o SIRS. En particular, los cambios en la concentración de los biomarcadores moléculas pequeñas pueden asociarse con cambios en el metabolismo celular que resulta de cualquiera de los cambios fisiológicos en respuesta a SIRS y/o sepsis, como puede ser hipotermia o hipertermia, frecuencia cardiaca aumentada o frecuencia de respiración, hipoxia de tejido, acidosis metabólica o MOD. Los biomarcadores también pueden incluir moléculas de RNA y DNA que codifiquen proteínas biomarcadoras.

Los biomarcadores también pueden consistir en al menos una molécula involucrada en la modulación de los leucocitos, como puede ser la activación de los neutrófilos o desactivación de los monolitos. La -expresión aumentada de CD64 y CDllb se reconoce como un signo de activación de los neutrófilos y monocitos. (Revisado en Oberholzer y col., supra y Vincent y col., supra) . Entre estos biomarcadores que pueden ser útiles en la presente invención están aquellos que se asocian con los productos de la lisis de macrofagos, como los marcadores de los cambios en el metabolismo de las citocinas. (Véase Gagnon y col., Cell 110: 119-31 (2002) ; Oberholzer, y col . , supra; Vincent, y col. , supra).

Los biomarcadores también pueden incluir factores de señalización conocidos por estar involucrados o que se descubra están involucrados en el proceso inflamatorio. Los factores de la señalización pueden iniciar una cascada de eventos intracelulares, incluida la unión al receptor, activación del receptor, activación de las cinasas intracelulares, activación de los factores de la transcripción, cambios en el nivel de la transcripción y/o traducción génica y cambios en los procesos metabólicos, etc. Las moléculas señalizadoras y los procesos activados por estas moléculas se definen en forma colectiva para el propósito de la presente invención como "biomoléculas involucradas en la vía de la sepsis". Los biomarcadores predictivos pertinentes pueden incluir biomoléculas involucradas en la vía de la sepsis.

Por consiguiente, aunque los métodos de la presente invención pueden utilizar un enfoque no sesgado para identificar biomarcadores predictivos, será evidente para el experto que grupos específicos de biomarcadores asociados con las respuestas fisiológicas o con diferentes vías de señalización que pueden ser objeto de atención particular. Esto es específicamente el caso donde los biomarcadores de una muestra biológica se ponen en contacto con un arreglo que puede utilizarse para medir la cantidad de los diferentes biomarcadores por interacción directa y específica con los biomarcadores (por ejemplo un arreglo de anticuerpos o un arreglo de ácidos nucleicos) . En este caso, la elección de los componentes del arreglo puede basarse en una sugerencia que una vía específica es pertinente para la determinación del estado de sepsis o SIRS en un individuo. La indicación que una vía molécula particular tiene una peculiaridad que puede predecir o diagnosticar sepsis o SIRS puede dar origen a una expectativa que otras biomoléculas que estén fisiológicamente reguladas en un modo concentrado del mismo modo pueden proporcionar una peculiaridad predictiva o diagnostica. El experto se dará cuenta, no obstante, que una expectativa como esta puede no realizarse por la complejidad de los sistemas biológicos. Por ejemplo, si la cantidad del biomarcador mRNA especifico fuera una peculiaridad predictiva, un cambio concertado en la expresión de mRNA de otro biomarcador podría no ser medida, si la expresión del otro biomarcador fuera regulada en un nivel postraduccional . Además, el nivel de expresión del mRNA de un biomarcador puede afectarse por la convergencia múltiple de las vías que pueden o no estar involucradas en una respuesta fisiológica a sepsis.

Los biomarcadores pueden obtenerse de cualquier muestra biológica que puede ser, por ejemplo y no se limita a, sangre, plasma, saliva, suero, orina, líquido cerebroespinal, esputo, heces, células y extractos celulares, y otra muestra de fluido biológico, muestra de tejido o biopsia de tejido procedente de un hospedero o paciente. La muestra biológica precisa que se toma del individuo puede variar, pero el muestreo pref rentemente es lo menos invasivo y se realiza fácilmente por las técnicas tradicionales.

La medición de un cambio fenotipico puede llevarse a cabo por cualquier técnica tradicional. La medición de la temperatura corporal, la frecuencia respiratoria, el pulso, la presión arterial u otros parámetros fisiológicos pueden obtenerse por observación clínica y medición. Las mediciones de las moléculas biomarcadoras pueden incluir, por ejemplo, mediciones que indiquen la presencia, concentración nivel de expresión o cualquier otro valor asociado con una molécula biomarcadora. La forma de detección de las moléculas biomarcadoras por lo regular dependerá del método que se utilice para formar un perfil de estos biomarcadores a partir de una muestra biológica. Por ejemplo, los biomarcadores separados por 2D-PAGE se detectan por tinción de azul de Coomasie y por tinción de plata, como bien se sabe en la técnica.

Aislamiento de los biomarcadores útiles Se espera que los biomarcadores útiles incluyan biomarcadores que todavía no hayan sido identificados o estén asociados con un estado fisiológico relevante. En un aspecto de la invención, se identifican los biomarcadores útiles como componentes de un perfil de biomarcadores de una muestra biológica. Una identificación como esta puede hacerse por cualquier procedimiento bien conocido en la técnica, incluido el inmunoensayo o microsecuenciación automatizada.

Una vez que se ha identificado un biomarcador útil, el biomarcador puede aislarse por uno de los muchos procedimientos de aislamiento o separación bien conocidos. La invención por consiguiente proporciona un método para aislar un biomarcador que sea diagnóstico o predictivo de sepsis, que consiste en obtener un perfil de biomarcadores de referencia obtenidos de una población de individuos, identificar una peculiaridad del perfil de biomarcadores de referencia que sea predictiva o diagnostica de sepsis o uno de los estadios en el progreso de sepsis, identificar un biomarcador que corresponda con esta peculiaridad y aislar el biomarcador. Una vez aislado el biomarcador puede utilizarse para aumentar anticuerpos que se unan al biomarcador si éste es una proteina, o puede utilizarse para desarrollar una sonda oligonucleótida especifica, si es un ácido nucleico, por ejemplo.

El experto fácilmente apreciará que las peculiaridades útiles pueden ser caracterizadas además para determinar la estructura molecular del biomarcador. Los métodos para caracterizar biomoléculas de este modo son bien conocidos en la técnica e incluye espectrometría de masas de alta resolución, espectrometría de infrarrojo, espectrometría ultravioleta y resonancia magnética nuclear. Los métodos para determinar la secuencia de nucleótidos de los biomarcadores ácidos nucleicos, la secuencia de aminoácidos de los biomarcadores polipéptidos y la composición y secuencia de los biomarcadores carbohidrato también son bien conocidos en la técnica.

Aplicación de la presente invención a pacientes con SIRS En una modalidad, los métodos actualmente descritos se utilizan para tamizar pacientes con SIRS que estén particularmente en riesgo de desarrollar sepsis. Se toma una muestra biológica de un paciente positivo para SIRS, y un perfil de biomarcadores con la muestra se compara con un perfil de referencia de los individuos positivos para SIRS que finalmente progresan a sepsis. La clasificación del perfil de biomarcadores del paciente como correspondiente al perfil de referencia de una población positiva para SIRS que progresó a sepsis es diagnostica que el paciente positivo para SIRS del mismo progresará a sepsis. Entonces es posible iniciar un esquema de tratamiento para impedir o prevenir el progreso de sepsis.

En otra modalidad, los métodos actualmente descritos se utilizan para confirmar una sospecha clínica que un paciente tiene SIRS . En este caso, un perfil de biomarcadores en una muestra se compara con poblaciones de referencia de individuos que tienen SIRS o que no tienen SIRS. La clasificación del perfil de biomarcadores del paciente como correspondiente a una población o a la otra entonces puede utilizarse para diagnosticar al individuo con SIRS o sin SIRS.

E emplos Los siguientes ejemplos son representativos de las modalidades comprendidas por la presente invención y de ningún modo limitan el tema comprendido por la invención. 1.1 Muestras biológicas recibidas y analizadas v> Los perfiles de biomarcadores de referencia se establecieron para dos poblaciones de pacientes voluntarios. La primera población ("el grupo SIRS") representa pacientes que desarrollaron SIRS y que entraron en el presente estudio en el "día 1", pero que no progresaron a sepsis durante su estancia hospitalaria. La segunda población ( el grupo de sepsis") representa pacientes que del mismo modo desarrollaron SIRS y entraron en el estudio presente en el día 1 pero que progresaron a sepsis por lo regular al menos varios días después de entrar en el estudio. Se tomaron muestras de sangre aproximadamente cada 24 horas de cada grupo de estudio. La sospecha clínica de sepsis en el grupo de sepsis ocurrió en el "tiempo 0". El "tiempo 24 horas" y el "tiempo 48 horas" representa muestras tomadas a las 24 horas y a las 48 horas, respectivamente, antes del día de la sospecha clínica del comienzo de sepsis en el grupo de sepsis . Es decir, las muestras del grupo de sepsis incluyeron aquellas tomadas en el día de entrada en el estudio (día 1) , 48 horas antes de la sospecha clínica de sepsis (tiempo menos 48 horas) , 24 horas antes de la sospecha clínica de sepsis (tiempo -24 horas) y durante el día de la sospecha clínica del comienzo de sepsis (tiempo 0) . 1.2 Análisis de mRNA de las muestras biológicas Las muestras de sangre entera aisladas de un paciente fueron extraídas para retirar mRNA utilizando los métodos conocidos para los expertos en la técnica. Un procedimiento de aislamiento de RNA conveniente se encuentra, por ejemplo, en RNA METHODOLOGIES, A LABORATORY GUIDE FOR ISOLATION AND CHARACTERIZA ION, 2a ed. , R. E. Farrell, Jr . , ed. , Academic Press (1998) at pp. 55-104. Puede utilizarse un abordaje de aislamiento del RNA total con base en filtros como se describe para el uso con el sistema RNAqueous™ (kit para el aislamiento de RNA total libre de fenol, catálogo No. 1912, versión 9908; Austin, Texas) . Los procedimientos utilizados para el aislamiento del RNA y las manipulaciones ulteriores además están descritos en WO 03/040404, la cual está asignada a Source Precisión Medicine.

Una vez aisladas, las especies de RNA seleccionadas fueron amplificadas utilizando cebadores específicos de mensaje o cebadores aleatorios. Los cebadores específicos fueron designados a partir de datos obtenidos de bases de datos públicas, como Unigene (National Center for Biotec nology Information, Biblioteca Nacional de Medicina, Bethesda, Maryland) . Los cebadores fueron designados para amplificar secuencias de RNA específicas presentes en la muestra utilizando RT-PCR, utilizando los principios generalmente conocidos por un experto en la técnica. (Véase WO 03/040404, página 22, líneas 24-32.) Las secuencias de RNA pueden ser aplicadas utilizando un ciclador isotérmico o térmico, como con un ciclador ABI9600, 9700 ó 7700 (Applied Biosystems, Foster City, California.) Los RNA amplificados entonces pueden ser detectados utilizando, por ejemplo, cebadores de detección etiquetados con fluorescencia, como está descrito en el sistema TaqMan™ (kit de reactivos para PCR, protocolo, número de parte 402823, revisión A (1996) , Applied Biosystems, Foster City, California) . La detección y cuantificación de RNA puede realizarse por técnicas bien conocidas (véase, por ejemplo WO 03/040404 en la página 23, lineas 5-13) .

Después de la separación o aislamiento del RNA de la sangre de un paciente y la purificación del RNA, se utilizó el siguiente protocolo para amplificar el RNA y hacerlo reaccionar con un arreglo para expresión génica de 72 miembros que tienen las sondas de ácidos nucleicos establecidas en la Tabla 1 : Materiales 1. Kit de reactivos para transcripción inversa TaqMan Applied Biosystems (P/N 808-0234) . Componentes del Kit: Buffer RT TaqMan 10X, cloruro de magnesio 25 mM, mezcla de deoxiNTP hexámeros aleatorios, inhibidor RNasa, Transcriptasa inversa MultiScribe (50 U/mL) , y agua libre de RNasa/DNasa (agua tratada con DEPC procedente de Ambion (producto número 9915G) , o equivalente) .

Métodos 2. Las muestras de RNA fueron retiradas del congelador a -80°C, se descongelaron a temperatura ambiente y se colocaron inmediatamente sobre hielo .

Para cada reacción RT se preparó el siguiente ctel de reactivos para la transcriptasa inversa.

Por reacción (mL) Buffer RT 10X 10.0 MgCl2 25 mM 22.0 dNTPs 20.0 Hexámeros aleatorios 5.0 Inhibidor RNasa 2.0 Transcriptasa inversa 2.5 Agua 18.5 Total 80.0 4. Cada muestra de RNA se llevó a un volumen de 20 mL en un tubo de microcentrifuga de 1.5 mL [sic] y se adicionaron 80 mL de la mezcla de reacción. La solución se mezcló pipeteando hacia arriba y hacia abajo . 5. La muestra se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. 6. Luego la muestra se incubó a 37 durante una hora. 7. La muestra finalmente se incubó a 90°C durante 10 minutos. 8. Las muestras fueron centrifugadas durante un breve tiempo en una microcentrifuga . 9. Las muestras entonces se colocaron sobre hielo si la PCR iba a ser realizada de inmediato. De otro modo, las muestras se almacenaron a -20°C para uso futuro . 10. Se corrió un control de calidad PCR en todas las muestras RT utilizando como testigos o controles rRNA de 18S y rmr de ß-actina.

El uso de la sonda cebador con la primera hebra cDNA fue como se describe en lo anterior. La medición de los RNA amplificados que se unen al arreglo de expresión génica de 72 miembros se llevó a cabo de acuerdo con el siguiente procedimiento: Materiales 1. La mezcla cebador 2OX/sonda para cada gen de interés; mezcla cebador/sonda 20X para el testigo endógeno 18S; mezcla 2X TaqMan Universal PCR Master; cDNA transcrito a partir de RNA extraído de muestras de sangre; placas de reacción óptica de 96 pozos de Applied Biosystems; tapas ópticas de Applied Biosystems o película clara-óptica; y detector de secuencias Prism 7700 de Applied Biosystems.

Métodos 2. Se prepararon soluciones madre de cada mezcla cebador/sonda con un contenido de cebador/sonda para el gen de interés, cebador/sonda para el control endógeno 18S y mezcla PCR Master 2X. El siguiente ejemplo muestra una preparación común para un gen con muestras cuadruplicadas probando dos condiciones (2 placas) .

IX (por peso) Mezcla Master 2X 12.50 Mezcla cebador/sonda 18S 20X 1.25 Mezcla 20X del cebador/sonda del gen que interese 1.25 Total 15.00 µ?, 3. Se prepararon soluciones madre de los objetivos cDNA diluyendo 95 µ?, de cDNA en 2000 µ?, de agua. Se ajustó la cantidad de cDNA para obtener valores Ct entre 10 y 18, por lo regular entre 12 y 13. 3. Se pipetearon 15 µ? de la mezcla cebador/sonda en los pozos adecuados de una placa de reacción óptica de 96 pozos de Applied Biosystems. 4. 10 ? de la solución madre de cDNA fueron pipeteados en cada pozo de la placa de reacción óptica de 96 pozos de Applied Biosystems. 5. La placa se selló con las tapas ópticas de Applied Biosystems o la película óptica clara. 6. La placa luego se analizó utilizando un detector de secuencias AB Prism 7700.

Si se utiliza una forma TaqMan, el número de ciclos de amplificación necesario para producir un nivel umbral de fluorescencia proporciona un estimado semicuantitativo de la cantidad de mRNA que corresponde a cada gen que estuvo en la muestra. Cuando se realizó en este modo, el coeficiente de variación promedio (DE/promedio x 100) de la medición es por lo regular menor que 5% y puede ser menor que 2%. Un método para cuantificar la amplificación por PCR en tiempo real se describe en Hirayama y col., Blood 92: 46-52 (1998), por ejemplo. Otros aspectos de la amplificación cuantitativa en tiempo real están descritos en WO 03/040404 en las páginas 20-23, por ejemplo, y las variaciones a estos métodos son bien conocidas en la técnica. 1.3 Análisis de datos y resultados Para cada muestra se midieron las concentraciones de los iriRNA que se unieron a las 72 sondas diferentes de cDNA en el arreglo de expresión en este ejemplo, cada mRNA es un biomarcador, y la concentración de cada uno en la muestra puede ser una peculiaridad de este biomarcador. Se determinó la concentración de los biomarcadores por su habilidad para formar dúplex específicos con las diferentes sondas de cDNA del arreglo. Las sondas de cDNA del arreglo corresponde a los genes que codifican las proteínas que incluyen las diferentes citocinas, quimiocinas o factores de crecimiento, marcadores celulares, proteinasas o inhibidores de proteinasas, receptores, reguladores de la transcripción y enzimas, como se muestra en la Tabla 1. Las sondas indicadas con los asteriscos están presentes en el arreglo descrito en las páginas 46-52 de WO 03/040404. TABLA 1 Marcador Descripción Marcador Descripción Factor activador de IL1A* Interleucina 1, alfa proteasa apoptósica 1 ¾RG2 Arginasa extra hepática IL1B* Interleucina 1, beta BPI1 Proteína bactericida/ IL1R1 Interleucina 1 receptor, aurtentadora de la tipo I permeabilidad CIQA* Componente complemento 1, TT.IRN* Interleucina 1 receptor subcornponente q, alfa antagonista polipéptido CSLCA Péptido relacionado con el IL2* Interleucina 2 gen de caLcitonina/ calcitonina CftSPl Caspasa 1 IL4* Interleucina 4 CñSP3 Caspasa 3 IL5* Interleucina 5 CCL3 Quirniocina (motivo CC) IL6* Interleucina 6 ligando 3 (interferón beta 2) CCR1 Qirimiocina (motivo CC) IL8* Interleucina 8 receptor 1 CC 3 Quirniocina (motivo CC) ITGS Integrina, alfa-M receptor 3 CD14* Antigeno CD14 JUN HcmSlogo encogen del virus de sarcoma aviario v-jun 17 TABLA 1 (Continuación) Marcador Descripción Marcador D scrripción CD19* Antígeno CD19 LBP Proteína de unión a lipopolisacáridos CD* Antígeno C4 MBL2 Lecitina de unión a mañosa 2 CD86 Antígeno CD86 MIF Factor inhibidor de la migración de macrofagos CD8A* Antígeno CD8 alfa M P9* Metaloproteinasa de polipéptido matriz 9 CRP Proteína C reactiva NE B1 Factor nuclear del intensificador del gen polipéptido ligero kappa en células B I (pl05) CSF2* Factor estimulador de NFBIB Inhibidor del factor del colonias de granulocitos- intensificador del gen monocitos polipéptido ligero kappa en células B, beta CSF3* Factor estimulador de NOS1 Óxido nítrico sintasa 1 colonias 3 (neuronal) CXCL10 Quiraiocina (motivo CXC) NOS3 Óxido nítrico sintasa 3 ligando 10 (endotelial) L7TR Receptor de toxina PI¾2G7* Fosfolipasa ¾2, grupo diftérica (factor de VII (factor activador de crecimiento tipo factor de plaquetas crecimiento epidermal de acetilhidrolasa, plasma) unión a heparina) EIA2 Neutrófilo elastasa ????* Activador de plasminógeno, urocinasa (Continuación) ífercador Descripción Marcador Descripción F3* Factor de coagulación SERPINEl* Inhibidor de la serina (o III cisterna) proteasa, clade B (ovalbúmina) , miembro 1 FOGRIA Fragmento Fe de IgG, SFTPD Proteina D con asociación receptor IA de alta pulmonar, surfactante afinidad FTL Ferritina, polipéptido ST¾T3 Transducción de la señal y ligero activador de transcripción 3 GZMB Granzyme B TFGB1* Factor de crecimiento transformante-beta 1 HM3X1* Hemo oxigenasa TFGBR2 Receptor del factor de (deciclizante) I crecimiento-beta 2 HSPMA* Proteina de shock TIMP1* Inhibidor de tejido de térmico 70 metaloproteinasa 1 ICñMl* Molécula de adhesión TLR2 Receptor 2 tipo Toll intercelular 1 IFI16 Proteina inducible del ??4 Receptor 4 tipo Toll interferón gaita 16 IFNA2* Interferón alfa 2 TNF* Factor de necrosis de tumor, alfa 1WG* Interferón gama T FRSF13B Superfamilia de receptores del factor de necrosis de tumor, miembro 13b IL10* Interleucina 10 TNFSF13B* Superfamilia del factor de necrosis de tumor (ligando) , miembro 13b (Continuación) 1.3.1. Validación transversal Es posible utilizar diversos enfoques para identificar las peculiaridades que pueden informar una regla de decisión para clasificar a los individuos en los grupos SIRS o sepsis, los cuales se describen más adelante. Un sesgo en la selección puede afectar la identificación de las peculiaridades que informan una regla de decisión, cuando la regla de decisión se basa en un gran número de peculiaridades procedentes de relativamente pocos perfiles de biomarcadores . Véase Abroise y col., Proc. Nat'l Acad. Sci USA 99: 6562-66 (2002).) El sesgo de selección puede ocurrir cuando se utilizan datos para seleccionar peculiaridades, y entonces se estima el desempeño condicionado en las peculiaridades seleccionadas sin tomar en cuenta la variabilidad del proceso de selección. El resultado es una sobre estimación de la exactitud de la clasificación. Sin compensación para el sesgo de selección, las exactitudes de la clasificación pueden alcanzar 100%, incluso cuando la regla de decisión se basa en parámetros de entrada aleatorios. {Id. ) El sesgo de selección puede evitarse incluyendo la selección de las peculiaridades en el proceso de estimación del desempeño, bien sea que el proceso de estimación del desempeño sea diez veces la validación transversal o un tipo de procedimiento autoinducido . (Véase por ejemplo Hastie y col., supra at 7.10 -7.11, incorporado en la presente como referencia.) En una modalidad de la presente invención, el desempeño del modelo se mide por validación transversal diez veces. La validación transversal diez veces procede por partición aleatoria de los datos en grupos exclusivos de diez. Cada grupo a su vez es excluido, y se ajusta a un modelo a los nueve grupos restantes . El modelo ajustado se aplica al grupo excluido, y se generan probabilidades de la clase pronosticada. Las probabilidades de clase pronosticada pueden compararse con las membresias de la clase real generando simplemente clases pronosticadas. Por ejemplo, si la probabilidad de sepsis es, por decir, mayor de 0.5, la clase pronosticada es sepsis.

La desvianza es una medida que compara probabilidades con resultados reales. Cuando se utiliza en la presente "desvianza" se define como: donde P es la probabilidad de clase para la clase especificada. La desvianza se lleva al mínimo cuando las probabilidades de la clase son altas para las clases reales. Dos modelos pueden hacer las mismas predicciones para los datos determinados, pero un modelo preferido tendría una desvianza predictiva más pequeña. Para cada una de las diez iteraciones en la validación transversal diez veces, la desvianza pronosticada se calcula para los casos excluidos del ajuste del modelo durante esta iteración. El resultado es diez desvianzas no sesgadas. Por lo regular, estas diez desvianzas se suman para crear un resumen general del desempeño del modelo (es decir, la exactitud) sobre la serie de datos totales. Debido a que de hecho diez modelos diferentes fueron ajustados, la validación transversal no prueba el desempeño de un modelo específico. En cambio, se generaron los diez modelos mediante un proceso de modelado común, y la validación transversal probó el desempeño de este proceso. Un décimo primer modelo que surge de este proceso probablemente tendrá desempeño predictivo semejante a los de los primeros diez. El uso de una validación transversal diez veces por lo regular da origen a un desempeño del modelo de menos de 100%, pero el desempeño obtenido después de la validación transversal diez veces se espera manifieste más estrechamente una exactitud predictiva con significado biológico de la regla de decisión, si se aplica a los perfiles de biomarcadores obtenidos de las muestras fuera de la serie de capacitación. 1.3.2. Análisis del árbol de clasificación Un enfoque para analizar estos datos es utilizar un algoritmo de árbol de clasificación que busque modelos y relaciones en series de datos grandes . Un "árbol de clasificación" es un reparto recurrente para clasificar a un paciente específico en una clase específica (por ejemplo sepsis o SIRS) utilizando una serie de preguntas que se diseñan para colocar exactamente al paciente en una de las clases. Cada pregunta interroga si el estado de un paciente satisface un predictor determinado, utilizando cada contestación para guiar al usuario hacia abajo del árbol de clasificación hasta que se pueda determinar una clase en la que entre el paciente. Cuando se utiliza en la presente, un "predictor" es un intervalo de valores para una peculiaridad. En este ejemplo, la peculiaridad es una concentración de un biomarcador ácido nucleico. Los biomarcadores ácidos nucleicos pueden ser seleccionados de los enlistados en cualquiera de las tablas 2-10, pero el experto en la técnica comprenderá que pueden ser útiles otros biomarcadores ácidos nucleicos para la invención. El "estado" es el valor especifico único de la peculiaridad que se mide en el perfil de biomarcadores del individuo. En este ejemplo, los "nombres de clase" son sepsis y SIRS. Asi pues, el usuario del árbol de clasificación primero preguntará si una primera concentración del biomarcador ácido nucleico medido en el perfil de biomarcadores del individuo entra dentro de un intervalo determinado del intervalo predictivo de la primera peculiaridad. La respuesta a la primera pregunta puede ser decisiva para determinar si el individuo tiene sepsis o SIRS. Por otra parte, la contestación a la primera pregunta de más puede dirigir al usuario a preguntar si una segunda concentración del biomarcador ácido nucleico medida en el perfil de biomarcadores del individuo entra dentro de un intervalo determinado del intervalo predictivo de la segunda peculiaridad. De nuevo, la contestación a la segunda pregunta puede ser decisiva o puede dirigir al usuario más abajo del árbol de clasificación hasta que se determina finalmente la clasificación de un paciente. 1.3.3 Árboles de regresión aditiva múltiple Se utilizó una técnica de modelado flexible, automatizado que utiliza árboles de regresión aditiva múltiple (MART) para clasificar series de peculiaridades como pertenecientes a una de dos poblaciones. Un modelo MART utiliza un despl zamiento inicial, el cual especifica una constante que aplica a todas las predicciones, seguido por una serie de árboles de regresión. Su ajuste se especifica por el número de puntos de decisión en cada árbol, el número de árboles para ajusfar y una "constante de granularidad" que especifica como un árbol especifico puede influir radicalmente en el modelo MART. Para cada iteración se ajusta un árbol de regresión para estimar la dirección del descenso con más pendiente del criterio de ajuste. Un paso que tiene una longitud especificada por la constante de granularidad se toma en esa dirección. El modelo MART entonces consiste en el desplazamiento inicial más el paso proporcionado por el árbol de regresión. Las diferencias entre los valores observados y pronosticados se vuelven a calcular, y continúa el ciclo otra vez, dando origen a un refinamiento progresivo de la predicción. El proceso continúa durante el número de ciclos predeterminados o hasta que se activa la regla de parada .

El número de divisiones en cada árbol es un parámetro de ajuste particularmente significativo. Si cada árbol tiene solo una división, el modelo busca solo en una peculiaridad y no tiene capacidad para combinar dos predoctores. Si cada árbol tiene dos divisiones, el modelo puede alojar interacciones en dos sentidos entre peculiaridades. Con tres árboles, el modelo puede alojar interacciones en tres sentidos y asi sucesivamente.

El valor de las series de peculiaridades en el estado de la clase predictora se determinó para series de datos con peculiaridades y estado de clase conocido (ejemplo sepsis o SIRS) . El modelo MSRT proporciona una medida de la contribución o importancia de las peculiaridades del individuo para la regla de decisiones de clasificación. Específicamente, el grado en el que una peculiaridad individual contribuye a la regla de decisión tras su selección en una división de árbol determinada puede medirse para proporcionar una clasificación de las peculiaridades por su importancia en la determinación de la regla de decisión final. Al repetir el análisis MART en la misma serie de datos puede producir una clasificación levemente diferente de las peculiaridades, en especial con respecto a aquellas peculiaridades que son menos importantes para establecer la regla de decisión. Las series de peculiaridades predictivas y sus biomarcadores correspondientes útiles en la presente, por tanto, pueden variar levemente de las establecidas en la presente .

La práctica de la tecnología MART se encuentra en un módulo, o "paquete"", para el entorno de programación estadística R (véase Venables et al . , en Modern Applied Statistics with S, 4a ed. (Springer, 2002) ; www.r-project.org) . Los resultados documentados en este artículo fueron calculados utilizando R, versiones 1.7.0 y 1.7.1. El módulo que pone en práctica MART, escrito por Dr. Greg Ridgeway, se denomina "gbm" y también está a la libre disposición (véase www.r-project.org) . El algoritmo MART se puede manejar para validación transversal diez veces . El parámetro de granularidad se estableció en 0.05, y la regla de parada interna del paquete GBM se basó en excluir 20% de los casos de los datos en cada iteración marcada. El grado de interacción se estableció en uno, de modo que no se consideraron interacciones entre peculiaridades. El paquete gbm estima la importancia relativa de cada peculiaridad en porcentaje, el cual en forma acumulada es igual a 100% para todas las peculiaridades del perfil de biomarcadores . Las peculiaridades con la importancia más alta, que juntas representan al menos 90% de la importancia total, se documentan como teniendo un valor predictivo potencial. Debe observarse que la regla de detención en el ajuste de cada modelo MART contribuye al componente estocástico al ajuste del modelo y la selección de la peculiaridad. En consecuencia, el modelado MART múltiple se ejecuta basado en los mismos datos puede elegir ligeramente, o tal incluso completamente, diferentes series de peculiaridades. Diferentes series como estas llevan la misma información predictiva; por tanto, todas las series son útiles en la presente invención. Al ajusfar los modelos MART un número suficiente de veces se espera producir todas las series posibles de peculiaridades predictivas dentro de un perfil de biomarcadores . Por consiguiente, las series de predictores descritas son solo representativas de aquellas series de peculiaridades que pueden utilizarse para clasificar a los individuos en poblaciones .

Los datos de los perfiles de los biomarcadores ácidos nucleicos obtenidos de diferentes muestras se analizaron utilizando MART, como ya se describió. En este análisis, la población con sepsis en el tiempo 0 horas consistió en 23 pacientes y la población SIRS consistió en 24 pacientes, mientras que las poblaciones del tiempo -24 horas y el tiempo -48 horas consistió en 24 y 21 individuos con sepsis y SIRS, respectivamente. Se analizaron las peculiaridades correspondientes a los 72 biomarcadores enlistados en la tabla 1.

Para las poblaciones del tiempo 0 horas, el modelo ajustado incluyó 23 árboles, y el modelo permitió ninguna interacción entre las peculiaridades. Al utilizar la validación transversal diez veces, el modelo clasificó correctamente 19 de los 24 pacientes SIRS y 15 de los 23 pacientes con sepsis, dando una sensibilidad del modelo de 65% y una especificidad de 79%. Los biomarcadores se clasificaron en orden de importancia, según se determinó por el modelo, en la tabla 2. Todas las peculiaridades con importancia 0 están excluidas. Los marcadores indicados con un signo de v-l" fueron expresados en niveles progresivamente mayores en las poblaciones positivas para sepsis como con progreso a sepsis, mientras que aquellos biomarcadores con un signo de "1" fueron expresados en niveles progresivamente menores .

TABLA 2 Importancia de la peculiaridad por análisis MART: muestras del tiempo 0 horas El tiempo -24 horas, el modelo ajustado incluyó 12 árboles, y el modelo permitió ninguna interacción entre las peculiaridades. Mediante la validación transversal diez veces, el modelo clasificó correctamente 15 de 21 pacientes con SIRS y 17 de 24 pacientes con sepsis, dando una sensibilidad de modelo de 71% y una especificidad de 71%. Los marcadores se clasificaron en orden de importancia, según lo determina el modelo, en la Tabla 3.

TABLA 3 Importancia de la peculiaridad por análisis MART: muestras del tiempo -24 horas .

Para las poblaciones del tiempo -48 horas, el modelo ajustado incluyó nueve árboles, y el modelo permitió ninguna interacción entre las peculiaridades. Mediante el uso de la validación transversal diez veces, el modelo clasificó correctamente 8 de 21 pacientes con SIRS y 20 de 24 pacientes con sepsis, dando una sensibilidad del modelo de 83%, una especificidad de 38% y una exactitud de 62%. Los biomarcadores se clasificaron en orden de importancia, como lo determinó el modelo, en la Tabla 4.

TABLA 4 Importancia de la peculiaridad por análisis MART: muestras del tiempo -48 horas. 1.3.4 Análisis de regresión logística La regresión logística proporciona todavía otro medio para analizar un flujo de datos a partir del análisis antes descrito. La "intensidad de la señal" es equivalente a una concentración de un biomarcador ácido nucleico específico. La ausencia de una señal para un biomarcador ácido nucleico determinado da como resultado una intensidad de señal asignada de "0". Las desviaciones estándar (DE) de las intensidades de las señales a partir de un biomarcador ácido nucleico determinado entonces se obtiene de los perfiles de las poblaciones SIRS y sepsis combinadas1. Si no hay variación en la intensidad de la señal entre poblaciones SIRS y sepsis (es decir, la DE=0) , ya no se toma en cuenta la intensidad de la señal. Antes del análisis de regresión, se escalan las intensidades de las señales, utilizando los métodos bien conocidos en la técnica. Los algoritmos de escalamiento o graduación se describen/ en general, Hastie y col., Supra, en capitulo 11. 1.3.5. Análisis de la prueba de rango señalado de Wilcoxon Todavía otro método, es posible utilizar una prueba no paramétrica, como puede ser una prueba de rango señalado de Wilcoxon para identificar los biomarcadores individuales que interesen. Las peculiaridades en un perfil de biomarcadores son asignadas con un '"valor p", que indica el grado de certidumbre con el que puede utilizarse el biomarcador para clasificar a los individuos como pertenecientes a una población de referencia específica. En general, un valor p que tenga valor predictivo es menor que aproximadamente 0.05. Los biomarcadores que tienen un valor p bajo pueden utilizarse por si mismos para clasificar a los individuos. De otro modo, es posible utilizar combinaciones de dos o más biomarcadores para clasificar a los individuos, donde las combinaciones se eligen con base en el valor p relativo de un biomarcador. En general, para una combinación determinada de biomarcadores se prefieren aquellos biomarcadores con valores p menores. También es posible utilizar combinaciones de al menos 3, 4, 5, 6, 10, 20 ó 30 o más biomarcadores para clasificar a los individuos de este modo. El experto comprenderá que el valor p relativo de cualquier biomarcador determinado puede variar, dependiendo del tamaño de la población de referencia.

Mediante el uso de la Prueba de Rango Señalado de Wilcoxon, los biomarcadores que forman dúplex específicos con (es decir, hibridan a) un arreglo de expresión que tiene las sondas enlistadas en la tabla 1 fueron asignados con un valor p por comparación de poblaciones con sepsis y SIRS en un tiempo determinado. Es decir, los valores p fueron asignados a las peculiaridades de los perfiles de los biomarcadores obtenidos de las muestras biológicas tomadas en el tiempo 0 horas, tiempo -24 horas y tiempo -48 horas. Estos valores p se enlistan en las Tablas 5, 6, y 7, respectivamente. Para este análisis, las poblaciones con sepsis y SIRS en el tiempo 0 (Tabla 5) constituyeron 23 y 24 pacientes, respectivamente; y las poblaciones con sepsis y SIRS en el tiempo -24 horas y el tiempo -48 horas fueron constituidas por 24 y 21 pacientes, respectivamente.

TABLA 5 Valores p para las peculiaridades : tiempo 0 horas Biornarcador Valor p 1 FCGR1A 2.2792e-06 2 CD4 6.1183e-06 3 IL18R1 3.0476e-05 4 CD86 8.8376e-Ü5 5 A G2 2.3979e-04 6 IL1RN 3.89S2e-04 7 MMP9 5.1390e-04 8 PLA2G7 7.1485e-04 9 1GAM 8.6695e-04 10 NFSFS 9.245 le-04 11 HSPA1A 2.4353e-03 12 LR4 3.6131e-03 13 NFSF13B 3.6140e-Ü3 14 MOS3 4.0315e-03 15 1H0 4.8175e-03 16 CC 1 5.1829e-03 17 IFI16 5.4665e-03 18 NFSF6 6.1913e-03 19 IMP1 7.328Ge-03 20 IL1R1 8.8140e-03 21 GFBÍ 1.1998e-Ü2 22 IL1B 1.7946e-02 23 1CAM1 2.7022e-02 24 CD8Á 2.9415c-02 25 LR2 3.3769e-02 26 CCR3 3. 145e-02 27 G BR2 3.96S7e-02 28 SERPINE1 4.3568e-02 TABLA 6 Valores p para las peculiaridades : tiempo -24 horas Biorna cador Valor p 1 FCGR1A 3.9756-06 2 CD4 1.4742e-03 3 IL18R1 1.6002e-03 4 1110 6.5097e-03 5 PLA2G7 8.1124e-03 6 ÁRG2 8.6978e-03 7 IMP1 9.0121e-03 8 "NFSF13B 1.0058e-02 9 LR4 L5071e-02 10 CC 1 1.7184e-02 11 ILíSN 2.1489e-02 12 ÍGAM 3.0112e-02 13 IL1R.1 3.1000e-02 14 MMP9 3.3S94e-02 15 NFSF5 4.76l6e-02 TABLA 7 Valores p para las peculiaridades: tiempo -48 horas Una prueba no paramétrica (por ejemplo una Prueba de Rango Señalado de Wilcoxon) de otro modo puede utilizarse para encontrar los valores p para las peculiaridades que se basan en la aparición y desaparición progresiva de la peculiaridad en las poblaciones que progresan a sepsis. En esta forma de la prueba, el valor inicial o de la linea base para una peculiaridad determinada se mide primero, utilizando los datos del tiempo de entrada en el estudio (muestras del día 1) para los grupos de sepsis y SIRS . La intensidad de la peculiaridad en las muestras de sepsis y SIRS entonces se compara, por ejemplo, con las muestras del tiempo -48 horas para determinar si la intensidad de la peculiaridad ha aumentado o disminuido a partir de su valor inicial. Por último, se asignan valores p a la diferencia del dato inicial en una intensidad de la peculiaridad en las poblaciones de sepsis contra las poblaciones de SIRS. Los valores p siguientes, enlistados en las tablas 8-10, fueron obtenidos midiendo estas diferencias a partir de los datos iniciales en los valores p.

TABLA 8 Valores p para las peculiaridades diferenciadas a partir de la linea base: tiempo 0 horas Biornarcador Valor p 1 FCGR1A 2.6701e-05 2 ILIRJSf 1.6453e )3 3 IL1S 1 3.29S4e-03 4 M P9 5.553Se-G3 5 IGAM 5.S62óe-03 6 IL1B 8.3804e-03 7 LR2 8.96Ue-03 8 LR4 9.8975e-03 9 CD4 1.1616e-02 10 CCR1 L1619e-02 NFSF13B 3.2I83e-02 12 PLA2G7 1.383 le-02 13 CD86 1.7683e-02 14 ILIO 2.820íe-02 15 CCR3 3.3319e-02 16 ICAM1 3.3319e-02 TABIA 9 Valores p para las peculiaridades diferenciadas de la linea base: tiempo -24 horas TABLA 10 Valores p para las peculiaridades diferenciadas a partir de la linea base: tiempo -48 horas Habiendo ahora descrito por completo la invención con referencia a algunas modalidades representativas y detalles, será evidente para los expertos en la técnica que pueden hacerse cambios y modificaciones a ésta sin apartarse del espíritu o alcance de la invención como se establece en la presente.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un kit que contiene al menos dos biomarcadores ácidos nucleicos de la respuesta del hospedero seleccionados del grupo de ácidos nucleicos como se menciona en cualquiera de las Tablas 2-10 y sus complementos . El kit de la reivindicación 1, caracterizado porque al menos dos biomarcadores de la respuesta del hospedero se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos establecida en la Tabla 2 y sus complementos . El kit de la reivindicación 1, caracterizado porque al menos dos biomarcadores de la respuesta del hospedero se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos establecida en la Tabla 3 y sus complementos . El kit de la reivindicación 1, caracterizado porque al menos dos biomarcadores de la respuesta del hospedero se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos establecida en la Tabla 4 y sus complementos . El kit de la reivindicación 1, caracterizado porque al menos dos biomarcadores de la respuesta del hospedero se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos establecida en la Tabla 5 y sus complementos . El kit de la reivindicación 1, caracterizado porque al menos dos biomarcadores de la respuesta del hospedero se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos establecida en la Tabla 6 y sus complementos . El kit de la reivindicación 1, caracterizado porque al menos dos biomarcadores de la respuesta del hospedero se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos establecida en la Tabla 7 y sus complementos . El kit de la reivindicación 1, caracterizado porque al menos dos biomarcadores de la respuesta del hospedero se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos establecida en la tabla 8 y sus complementos . El klt de la reivindicación 1, caracterizado porque al menos dos biomarcadores de la respuesta del hospedero se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos establecida en la Tabla 9 y sus complementos . El kit de la reivindicación 1, caracterizado porque al menos dos biomarcadores de la respuesta del hospedero se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos establecida en la Tabla 10 y sus complementos . Un kit que contiene al menos dos sondas oligonucleótidas capaces de hibridar a al menos dos biomarcadores de la respuesta del hospedero seleccionados del grupo de los ácidos nucleicos como se mencionan en cualquiera de las Tablas 2-10. Un perfil de biomarcadores que consiste en al menos dos peculiaridades que contribuyen a la predicción de la inclusión de un individuo en una población de referencia con una exactitud de al menos aproximadamente 60%, en donde las peculiaridades son características medibles de un ácido nucleico y en donde la población de referencia se selecciona del grupo que consiste en una población de referencia normal, una población de referencia positiva para SIRS, una población de referencia infectada/negativa para SIRS, una población de referencia positiva para sepsis, una población de referencia en un estadio en progreso de sepsis, una población de referencia positiva para SIRS confirmada por tener sepsis mediante las técnicas tradicionales después de aproximadamente 0-36 horas, una población de referencia positiva para SIRS confirmada por tener sepsis por las técnicas tradicionales después de aproximadamente 36-60 horas, y una población de referencia positiva para SIRS confirmada de tener sepsis por las técnicas tradicionales después de aproximadamente 60-84 horas. Un método para aislar un bxomarcador de la respuesta del hospedero, que consiste en: (a) obtener un perfil de biomarcadores de referencia de una población de individuos; (b) identificar una peculiaridad del perfil de biomarcadores de referencia que sea predictiva o diagnostica de sepsis o uno de los estadios de sepsis, en donde la peculiaridad corresponda a un ácido nucleico; (c) identificar un biomarcador de la respuesta del hospedero que corresponda con la peculiaridad; Y (d) aislar el biomarcador de la respuesta del hospedero .