CN1738908A - 使用生物标记谱诊断脓毒或者sirs - Google Patents

Abstract

脓毒的早期预测或诊断有利地允许在该疾病从最初阶段快速发展到与高死亡率有关的更严重的阶段如严重脓毒或者脓毒性休克之前实施临床干预。使用分子诊断方法实现早期预测或诊断，该方法将个体的生物标记表达谱与从一种或多种对照或者参比群体得到的图谱比较，该参比群体可以包括患脓毒的群体。认识该个体的生物标记谱中脓毒发作的特征性特征使得临床医生可以从一个时间点从个体分离的体液诊断脓毒的发作。因此，在一段时间内监视患者的必要性被避免了，有利地允许在脓毒的严重症状发作前实施临床干预。

Description

使用生物标记谱诊断脓毒或者SIRS

本申请要求2002年11月12日提交的美国临时专利申请序号60/425,322的优先权和2003年9月17日提交的美国临时专利申请序号60/503,548的优先权，这两个美国临时专利申请都被完整并入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及诊断或者预测个体中脓毒或者其发展阶段的方法。本发明还涉及诊断个体中系统性炎性应答综合症的方法。

发明背景

疾病状态的早期检出通常容许更有效的治疗性治疗和相应的更有利的临床结果。然而，在许多情况中，疾病症状的早期检出存在问题；所以，在可能诊断之前疾病可能变成相对的晚期。系统性炎性病症代表一类这种疾病。这些病症，尤其是脓毒，通常由病原微生物和宿主的防御系统的相互作用引起，该相互作用在宿主中引发过度且调节异常的炎性反应。系统性炎性反应期间宿主应答的复杂性使得针对理解疾病病理的努力错综复杂(Healy，Annul.Pharmacother.36：648-54(2002)中的综述)。疾病病理的不完全理解又使发现诊断性生物标记变得困难。然而，由于脓毒非常快地发展成威胁生命的病症，所以迫切需要早期并且可靠的诊断。

脓毒遵循一种明确的时间历程，从系统性炎性应答综合症(“SIRS”)-阴性到SIRS-阳性到脓毒，然后脓毒发展成严重脓毒、脓毒性休克、多种器官功能异常(“MOD”)，最终死亡。当受感染的个体随后发生SIRS时，该个体中也可以出现脓毒。“SIRS”通常被定义为存在下面参数的两种或多种：体温大于38℃或者小于36℃；心率大于每分钟90次；呼吸率大于每分钟20次呼吸；P_CO2小于32mm Hg；和白细胞数小于4.0×10⁹个细胞/L或者大于12.0×10⁹个细胞/L，或者具有大于10％不成熟带形。“脓毒”通常被定义为具有确定的感染过程的SIRS。“严重脓毒”与MOD、低血压、弥漫性血管内凝血(“DIC”)或者灌注不足异常，其包括乳酸中毒症、少尿、和精神状态的改变。“脓毒性休克”通常被定义为脓毒诱导的低血压，其抗液体复苏并且还存在灌注不足异常。

记载临床上对脓毒重要的病原微生物的存在已经被证明是困难的。通常通过培养患者的血液、痰、尿、伤口分泌物、内在的线导管表面，等等来检测致病微生物。然而，致病微生物可能仅存在于某些身体的微环境中，从而所培养的具体材料可能不含有污染性微生物。可以由于感染部位存在的微生物数目少而使得检测更加复杂。血样中病原数目少给通过培养血液诊断脓毒带来了特别的问题。在一个研究中，例如，仅在17％的具有脓毒临床表现的患者中得到阳性培养结果(Rangel-Frausto等人，JAMA 273：117-23(1995).)。非病原微生物污染样品可以使诊断进一步复杂化。例如，仅12.4％的被检测的微生物在707名败血病患者的研究中是临床上重要的。(Weinstein等人，Clinical Infectious Diseases 24：584-602(1997).)

脓毒的早期诊断的困难可以由与该疾病相关的高发病和高死亡率反映。当前脓毒是美国第十位主要的死亡原因并且在非冠状重病监护室(ICUs)的住院患者中特别普遍，重病监护室中脓毒是最常见的死亡原因。总死亡率高达35％，估计仅在美国每年就发生750,000例。仅美国治疗脓毒的年花费就为数十美元。

因此，需要足够早地诊断并且允许有效干预和防止脓毒的方法。大多数现有的脓毒打分系统或者预测模型仅预测已经被认为是脓毒的患者中晚期并发症(包括死亡)的危险。然而，这些系统和模型不预测脓毒自身的发展。尤其需要将那些患者分成将患脓毒或者不患脓毒的SIRS患者的方法。当前，研究人员通常定义单一的生物标记，该生物标记在脓毒患者组和患者的正常(即，非脓毒)对照组中的表达水平不同。2003年3月26日提交的美国专利申请序号10/400,275(其完整内容被并入作为参考)公开了通过分析各种生物标记的表达水平中的依赖时间的变化揭示早期脓毒的方法。因此，诊断早期脓毒的最佳方法当前需要检测多种生物标记和监视一段时间内这些生物标记的表达。

本领域中持续迫切需要特异且灵敏地诊断脓毒，而不需要随时间监视患者。理想地，通过一种技术进行诊断，该技术准确、快速并且在一个时间点同时检测多种生物标记，从而使在诊断所需的时间内疾病的发展最小化。

发明概述

本发明通过在一个时间点内检测来自生物样品的一种以上的生物标记而允许准确、快速和灵敏地预测和诊断脓毒。通过在一个时间点从个体，尤其具有患脓毒危险、患有脓毒，或者被怀疑患有脓毒的个体得到生物标记谱，并将来自该个体的生物标记谱与参比生物标记谱相比较，实现该预测和诊断。可以从一群个体(“参比群体”)得到参比生物标记谱，这些个体例如，受到脓毒的折磨或者遭受脓毒发作或者处于脓毒发展的特定阶段。如果来自该个体的生物标记谱含有来自参比群体的生物标记谱的适宜的特征性特征，那么该个体被诊断为更可能与参比群体一样发展成脓毒、受到脓毒的折磨或者处于脓毒发展的特定阶段。从各种个体群体也可以得到参比生物标记谱，这些群体包括患有SIRS或者受到感染但是没有SIRS的那些个体。因此，本发明允许临床医生确定哪些患者不患有SIRS，哪些患有SIRS但是不可能在研究的期限内患脓毒，哪些患者患有脓毒，或者哪些处于最终患脓毒的危险中。

尽管本发明的方法尤其可用于检测或预测SIRS患者中脓毒的发作，但是本领域技术人员将理解本发明的方法可以用于任一患者，该患者包括，但不限于，被怀疑患有SIRS或者处于脓毒的任一阶段的患者。例如，可以从患者采集生物样品，并且可以将该样品中的生物标记谱与几种不同的参比生物标记谱相比较，这些参比生物标记谱的每一种来自例如患有SIRS或者处于脓毒的特定阶段的患者。将该患者的生物标记谱分类为相应于来自特定参比群体的图可以预测该患者属于该参比群体中。基于从本发明的方法所得的诊断，可以启动适宜的治疗方案。

用于诊断或者预测SIRS、脓毒或者脓毒发展的阶段的现有方法是基于非特异的临床病征和症状；因此，所得诊断通常具有有限的临床效用。因为本发明的方法准确地检测脓毒的各种阶段，所以这些方法可用于鉴定可能适宜地参加治疗研究的那些个体。因为可以从单个时间点所得的生物样品中生物标记表达的“快照”预测或诊断脓毒，所以该治疗研究可以在严重的临床症状出现之前开始。因为测定生物样品的生物标记谱，所以不必鉴定具体生物标记。然而，本发明提供了鉴定脓毒或者脓毒发展的特定阶段的特征性图谱的特定生物标记的方法。这些生物标记自身将是预测或者诊断脓毒的有用工具。

因此，本发明提供了预测个体中脓毒发作的方法。这些方法包括在单个时间点从个体得到生物标记谱并将该个体的生物标记谱与参比生物标记谱相比较。生物标记谱的比较可以预测个体中脓毒的发作，预测的准确度为至少60％。可以在脓毒发作前任何时间再次重复该方法。

本发明还提供了确定患有或者被怀疑患有脓毒的个体中脓毒发展的方法，该方法包括在单个时间点从该个体得到生物标记谱并将该个体的生物标记谱与参比生物标记谱相比较。生物标记谱的比较可以诊断个体中的脓毒，诊断的准确度为至少60％。可以在任何时间对该个体重复该方法。

本发明还提供了确定患有或者被怀疑患有脓毒的个体中脓毒的发展(例如，阶段)的方法。该方法包括在单个时间点从该个体得到生物标记谱并将该个体的生物标记谱与参比生物标记谱相比较。生物标记谱的比较可以测定个体中的脓毒的发展，该测定的准确度为至少约60％。可以在任何时间对该个体重复该方法。

此外，本发明提供了诊断患有或者被怀疑患有SIRS的个体中SIRS的方法。该方法包括在单个时间点从该个体得到生物标记谱并将该个体的生物标记谱与参比生物标记谱相比较。生物标记谱的比较可以诊断个体中SIRS，该诊断的准确度为至少约60％。可以在任何时间对该个体重复该方法。

在另一实施方案中，本发明提供了确定个体中脓毒状态或者诊断SIRS的方法，该方法包括应用决策规则。该决策规则包括比较(i)在单个时间点从该个体采集的生物样品产生的生物标记谱与(i)从参比群体产生的生物标记谱。应用该决策规则可以确定该个体中的脓毒状态或者诊断SIRS。可以在一个或多个分开的、单一时间点对该个体重复该方法。

本发明还提供了确定个体中脓毒状态或者诊断SIRS的方法，该方法包括从该个体得到生物标记谱并将该个体的生物标记谱与参比生物标记谱相比较。一次这种比较就能够将该个体归为具有参比群体的成员资格。生物标记谱的比较还确定了该个体中脓毒的状态或者诊断SIRS。

本发明还提供了确定个体中脓毒状态或者诊断SIR的方法，该方法包括从采自该个体的生物样品得到生物标记谱并将该个体的生物标记谱与从来自参比群体的生物样品得到的参比生物标记谱相比较。参比群体可以选自正常的参比群体、SIR-阳性参比群体、受感染的/SIRS阴性参比群体、脓毒阳性参比群体、处于脓毒的发展特定阶段的参比群体、通过常规技术在约0到36小时后将被证实患有脓毒的SIR-阳性参比群体、通过常规技术在约36-60小时后将被证实患有脓毒的SIR-阳性参比群体、通过常规技术在约60-84小时后将被证实患有脓毒的SIR-阳性参比群体。一次这种比较就能够将该个体归为是否为该参比群体成员，并且该比较确定该个体中脓毒状态或者诊断SIRS。

在再一个实施方案中，本发明提供了确定个体中脓毒状态或者诊断SIRS的方法。该方法包括比较从该个体采集的生物样品得到的生物标记谱与从参比群体的生物样品得到的生物标记谱之间的至少一种生物标记的可检测的特征。基于该比较，该个体被归为属于或者不属于该参比群体。因此，该比较确定该个体中脓毒状态或者诊断SIRS。在一个实施方案中，这些生物标记选自表2-13的任一个中所示的生物标记群。

在另一实施方案中，本发明提供了确定个体中脓毒状态或者诊断SIRS的方法，该方法包括从个体的生物样品产生的谱中的一组生物标记选择至少两种特征。将这些特征与从参比群体的生物样品产生的谱中的一组相同生物标记相比较。一次这种比较就能够将该个体归为是否为该参比群体成员，准确度为至少约60％，并且该比较确定该个体中脓毒状态或者诊断SIRS。

本发明还提供了确定个体中脓毒状态或者诊断SIRS的方法，该方法包括确定个体的生物样品中所含的至少两种生物标记的丰度的变化并且将该个体的样品中这些生物标记的丰度与参比群体的生物样品中这些生物标记的丰度相比较。该比较能够将该个体归为是否为该参比群体成员，并且该比较确定该个体中脓毒状态或者诊断SIRS。

在另一个实施方案中，本发明提供了确定个体中脓毒状态的方法，该方法包括确定与来自患有脓毒的参比群体和不患脓毒的参比群体的生物样品的至少1、2、3、4、5、10或20种生物标记的丰度的变化相比，该个体的至少1、2、3、4、5、10或20种生物标记的丰度的变化。生物标记选自表2-13任一个中所列的生物标记。备选地，至少1、2、3、4、5、10或20种生物标记的丰度可以与至少1、2、3、4、5、10或20种生物标记的丰度相比。

本发明还提供了分离生物标记的方法，该生物标记在生物样品中的存在可以诊断或者预测脓毒。该方法包括从个体的群体得到参比生物标记谱并鉴定该参比生物标记谱中可以预测或者诊断脓毒或者脓毒发展中的阶段之一的特征。该方法还包括鉴定与该特征相应的生物标记，然后分离该生物标记。

在另一实施方案中，本发明提供了试剂盒，其含有选自表2-13任一个中所列的生物标记的至少1、2、3、4、5、10或所有生物标记。

在另一实施方案中，参比生物标记谱可以含有至少两种特征，优选5、10或20或更多种的组合，其中这些特征是该样品中生物标记所特有的。在该实施方案中，这些特征将有助于预测该个体包括在特定参比群体中。通过数据分析算法可以确定这些特征在预测包括中的相对贡献，该算法预测类包括(Class inclusion)的准确度为至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。在一个实施方案中，特征的组合允许在通过常规技术确定的脓毒的实际发作前约24、约48、或约72小时预测脓毒的发作。

在另一实施方案中，参比生物标记谱可以含有至少两种特征，其中的至少一个是相应生物标记所特有的并且其中该特征将允许预测个体包括在脓毒-阳性或者SIRS-阳性群体中。在该实施方案中，该特征被分配p值，该p值从非参数检验，如Wilcoxon带符号的秩检验得到，该p值与确定性程度直接相关，使用该确定性程度该特征可以将个体分类成属于脓毒-阳性或者SIRS-阳性群体。在另一实施方案中，该特征将个体分类成属于脓毒-阳性或者SIRS-阳性群体，分类的准确度为至少约60％、约70％、约80％、或约90％。在再一个实施方案中，该特征允许通过常规技术确定的脓毒的实际发作前约24、约48、或约72小时预测脓毒的发作。

在再一个实施方案中，本发明提供了颗粒的阵列，这些颗粒表面粘附有捕获分子，可以特异结合选自表2-13任一个中所列的生物标记的至少1、2、3、4、5、10种或所有生物标记。

附图简述

图1图解了SIRS向脓毒的发展。脓毒的病症由至少三个阶段组成，脓毒患者从严重脓毒发展到脓毒性休克到多种器官功能异常。

图2显示了脓毒和SIRS之间的关系。维恩(Venn)图中所示的多个集合相应于具有所表示的病症的个体的群体。

图3显示了脓毒阳性群体相对于SIRS-阳性群体，约400种离子的平均标准化峰强度中比例的自然对数。

图4显示了在ESI-质谱图谱中m/z为437.2Da并且在C₁₈反相柱上保留时间为1.42分钟的离子的强度。图4A显示了患有脓毒的个体的多种群体中离子存在的变化。脓毒组中脓毒的临床怀疑在“时间0”发生，该临床怀疑通过常规技术检测。“时间-24小时”和“时间-48小时”代表分别在脓毒组中脓毒发作的临床怀疑前约24小时和约48小时采集的样品。个体在“天1”进入研究。图4B表明从在时间0时没有患脓毒的个体的群体采集的样品中存在该相同的离子。

图5是对10名脓毒患者和10名SIRS患者中从时间0开始的数据拟合的分类树，表明通过电喷雾质谱鉴定的三种生物标记与辨别脓毒与SIRS有关。

图6显示了使用实施例中描述的配置，从血浆样品得到的代表性LC/MS和LC/MS/MS谱。

图7A和7B显示了在转化成脓毒前在血浆中以更高水平被调节长达48小时的蛋白质。

图8A和8B显示了在转化成脓毒前在血浆中以更低水平被调节长达48小时的蛋白质。

优选实施方案详述

本发明允许利用在一个时间点(“快照”)或者在疾病发展的过程中从个体得到的一种或多种生物样品快速、灵敏和准确地诊断或预测脓毒。有利地，可以在临床症状发作前诊断或者预测脓毒，从而允许更有效的治疗干预。

“系统性炎性应答综合症”或者“ISRS”指对多种严重的临床损伤的临床应答，其表现为24小时内下面的状况的两种或多种：

^*体温大于38℃(100.4°F)或者小于36℃(96.8°F)；

^*心率(HR)大于90次/分钟；

^*呼吸率(RR)大于20次呼吸/分钟，或者P_CO2小于32mm Hg，或者需要机械通气；和

^*白细胞数(WBC)大于12.0×10⁹/L或者小于4.0×10⁹/L或者大于10％未成熟形式(带)。

SIRS的这些症状代表SIRS的一致定义，该定义在将来可以被修改或者由改良的定义代替。本定义用于阐明当前的临床实践并且不代表本发明的关键方面。

患有SIRS的患者具有临床表现，其被归为如上面定义的SIRS，但是在临床上不被认为是脓毒的。处于发生脓毒的危险中的个体包括ICU中的患者和遭受生理创伤，如烧伤或者其他损伤的患者。“脓毒”指与证实的感染过程相关的SIRS-阳性病症。脓毒的临床怀疑由感染过程导致的SIRS患者的SIRS-阳性病症的怀疑引起。本文中，“脓毒”包括脓毒的所有阶段，包括，但不限于，脓毒的发作、严重脓毒和与脓毒的末期相关的MOD。

“脓毒的发作”指脓毒的早期，即，临床表现足够支持脓毒的临床怀疑之前的阶段。因为本发明的方法用于检测使用常规技术怀疑脓毒的时间之前的脓毒，所以只能在脓毒的表现在临床上更明显的时候回顾地证实早期脓毒时该患者的疾病状态。患者形成脓毒的确切机理不是本发明的关键方面。本发明的方法可独立于感染过程的起源检测生物标记谱中的变化。不管脓毒怎样产生，本发明的方法都允许确定患有或者怀疑患有通过前面所用的标准分类的脓毒或者SIR的患者的状态。

“严重脓毒”指与器官功能异常、灌注不足异常、或者脓毒诱导的低血压有关的脓毒。灌注不足异常包括，但不限于，乳酸中毒、少尿或者精神状态的急剧改变。“脓毒性休克”指脓毒诱导的低血压，其对于足够的静脉内液体刺激不响应并且表现为外周低血压。“转变患者”指SIRS阳性患者，该患者在被监视期间，通常在ICU停留期间发展成脓毒的临床怀疑。“非转变患者”指SIRS阳性患者，该患者在被监视期间，通常在ICU停留期间不发展成脓毒的临床怀疑。

“生物标记”是存在于生物样品并且可以从该生物样品分离或者在该生物样品中检测的几乎任一种生物化合物，如蛋白质或者其片段、肽、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、糖、脂质、核酸、有机或无机化学品、天然聚合物，和小分子。此外，生物标记可以是完整分子，或者其可以是该完整分子的部分，该部分可以具有部分功能或者可以被例如，抗体或者其他特异结合蛋白质识别。如果生物标记的可检测方面与该患者的给定状态，如脓毒的特定阶段有关，那么认为该生物标记物是可提供信息的。这种可检测的方面可以包括，例如，来自该个体的生物样品中该生物标记的存在、缺乏，或者浓度，和/或该生物标记作为生物标记谱的一部分存在。生物标记的这种可检测的方面在本文中被定义为“特征”。特征还可以是生物标记的两个或多个可检测方面的比例，这些生物标记例如，可以具有或者不具有公知的同一性。“生物标记谱”包括至少两种这些特征，其中这些特征可以相应于相同的或者不同类别的生物标记，如核酸和糖。生物标记谱还可以含有至少3、4、5、10、20、30或者更多种特征。在一个实施方案中，生物标记谱含有数百，或者甚至数千种特征。在另一实施方案中，生物标记谱含有至少一种内标的至少一个可检测的方面。

“表型变化”是与患者的给定状态有关的参数的可检测的变化。例如，表型变化可以包括体液中生物标记的增加或者减少，其中该变化与脓毒或者脓毒的发作有关。表型变化可以还包括该患者的给定状态的可检测方面的变化，该变化不是生物标记的可检测方面的变化。例如，表型中的变化可以包括体温、呼吸率、脉搏、血压、或者其他生理参数中的可检测的变化。这些变化可通过临床观察和使用技术人员熟知的常规技术检测来确定。本文中，“常规技术“是基于表型变化对个体分类的技术，这些技术不得到根据本发明的生物标记谱。

“决策规则(Decision rule)”是用于将患者分类的方法。该规则可以采取本领域中公知的一种或多种形式，如Hastie等人，“TheElements of Statistical Learning，”Springer-Verlag(Springer，New York(2001))中所例证的形式，该文献被完整并入本文作为参考。对样品内分子的复杂混合物的生物标记分析产生了数据集中的特征。可以用决策规则作用于特征的数据集以预测脓毒的发作、确定脓毒的发展、诊断脓毒，或者诊断SIRS。

决策规则的应用不需要完美分类。在一个实施方案中，分类可以具有至少约90％或者甚至更高的确定性。在其他实施方案中，该确定性为至少约80％、至少约70％、或至少约60％。，确定性的有用的程度可以根据本发明的具体方法而变。“确定性”被定义为被准确分类的个体的总数与被分类的个体总数的商。本文中，“确定性”指“准确度”。分类的特征还在于其“灵敏性”。分类的“灵敏性”涉及当前被鉴定患有脓毒的脓毒患者的百分数。“灵敏性”在本领域中被定义为真阳性数与真阳性和假阴性之和的商。相比，该方法的“特异性”被定义为被正确鉴定为不患有脓毒的患者的百分数。即，“特异性”涉及真阴性与真阴性和假阳性之和的商。在一个实施方案中，灵敏性和/或特异性为至少约90％、至少约80％、至少约70％或至少约60％。可以用于以足够的确定性对个体分类的特征的数目通常为约4个。然而，根据所寻找的确定性的程度，特征数可以更多或更少，但是在所有情况中，特征数为至少1个。在一个实施方案中，用于分类个体的特征数被优化而允许以高确定性对个体分类。

患者中脓毒或者SIRS的“状态确定”包括对患者的生物标记谱分类以(1)检测该患者中脓毒或者SIRS的存在，(2)预测该患者中脓毒或者SIRS的发作，或(3)检测患者中脓毒的发展。“诊断”脓毒或者SIRS指鉴定或者检测患者中的脓毒或者SIRS。因为本发明能够在明显可观察到的临床表现之前更灵敏地检测脓毒，所以脓毒的鉴定或者检测包括检测如上定义的脓毒的发作。即，“预测脓毒的发作”指将该患者的生物标记谱归类为相应于来自一些个体的生物标记谱，这些个体正从SIRS的特定阶段发展到脓毒或者从被感染状态到脓毒(即，从感染到具有相伴的SIRS的感染)。脓毒或者SIRS的“发展检测”或者“发展确定”指对已经被诊断患有脓毒或者SIRS的患者的生物标记谱分类。例如，将已经被诊断为患有脓毒的患者的生物标记分类可以包括检测或者确定该患者从脓毒到严重脓毒或者到具有MOD的脓毒的发展。

根据本发明，通过从个体得到的样品得到生物标记谱可以诊断或者预测脓毒。本文中，“得到”指“拥有”。本发明尤其可用于预测和诊断个体中的脓毒，其中该个体患有感染，或者甚至脓毒，但是该患者还没有被诊断为患有脓毒、怀疑患有脓毒，或者处于发生脓毒的危险中。本发明以相同的方式可用于检测和诊断个体中SIRS。即，本发明可以用于证实SIRS的临床怀疑。本发明还可用于检测脓毒过程的多个阶段，诸如感染、菌血症、脓毒、严重脓毒、脓毒性休克，等等。

将从个体得到的生物标记谱，即，受试生物标记谱与参比生物标记谱向比较。该生物标记谱可以从一个个体或者两个或多个个体的群体产生。该群体例如，可以含有3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多个体。此外，如果受试和参比图从在不同时间点采集的生物样品产生并且相互比较，那么在本发明方法中被比较的参比生物标记谱和个体的(受试)生物标记谱可以从相同个体产生。例如，可以在研究期开始时从个体得到样品。然后从该样品得到的参比生物标记谱可以与从该同一个体的随后样品产生的生物标记谱相比较。这种比较可用于，例如，通过随时间重复分类确定该个体的脓毒状态。

参比群体可以选自没有SIRS(“SIRS-阴性”)的个体、没有SIRS但是经历感染过程的个体、患有SIRS但是不存在脓毒(“SIRS-阳性”)的个体、患有脓毒的发作的个体、脓毒阳性并且处于脓毒发展的阶段之一的个体，或者具有增加发生脓毒的危险性的生理创伤的个体。此外，参比群体可以是SIRS-阳性的并随后用常规技术诊断脓毒。例如，用于产生参比图的SIRS-阳性患者的群体可以在为了产生参比图而从这些患者采集生物样品之后约24、48、72、96或更多小时后被诊断为脓毒。在一个实施方案中，使用常规技术在生物样品采集后约0-36小时、约36-60小时、约60-84小时、或约84-108小时后将SIRS-阳性个体的群体诊断为脓毒。如果该生物标记谱可以预示脓毒或者其发展阶段之一，那么临床医生就可以在脓毒的临床症状表现之前开始治疗。治疗通常包括检查该患者以确定感染源。一旦定位了感染源，临床医生通常将从感染部位得到培养物，这优选在开始相关的经验性抗微生物治疗和可能额外的辅助性治疗措施，如排出脓肿或者除去受感染的导管之前。脓毒的疗法在Healy(如前)中综述。

本发明的方法包括将个体的生物标记谱与参比生物标记谱比较。本文中，“比较”包括辨别个体和参比生物标记谱中至少一处不同的方法。从而，比较可以包括通过视觉检查层析图谱，并且比较可以包括分配给图谱的特征的算术上的和统计学上的比较。这种统计学比较包括，但不限于，应用决策规则。如果生物标记谱含有至少一种内标，那么用以辨别生物标记谱中的差异的比较还可以包括这些内标的特征，从而生物标记的特征与内标的特征相关。该比较可以预测获得脓毒或者SIRS的机会；或者该比较可以证实存在或者不存在脓毒或者SIRS；或者该比较可以指出个体所处的脓毒的阶段。

因此，本发明不需要在监视期内实施时间-密集的测定，也不需要鉴定每种生物标记。尽管本发明不需要监视期来对个体分类，但是应该理解对该个体的重复分类，即重复快照，可以随时间进行直到该个体不再处于危险中。备选地，从该个体得到的生物标记谱可以与在不同时间点从该相同个体得到的一个或多个生物标记谱相比较。技术人员将明白在重复分类过程中做出的每次比较都能够将该个体归类为参比群体中的成员。

通过特征性生物标记谱可以区分具有相应于从无脓毒到MOD的脓毒发展的多个阶段的多种生理状况的个体。本文中，“个体”是动物，优选哺乳动物，更优选人或者非人灵长类。术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。个体可以是正常的、被怀疑患有SIRS或者脓毒、处于患SIRS或者脓毒的危险中，或者被证实患有SIRS或者脓毒。尽管有许多公知的生物标记与脓毒的发展有关，但是并不是所有这些标记都在最初的临床前阶段出现。实际上，仅能通过从最终表现脓毒的临床症状的个体所得样品的回顾分析确定早期脓毒的特征性生物标记的子集。不被理论所束缚，即使导致脓毒的最初病理感染也可以引起生理变化，这些生理变化在生物标记表达中的特定变化中体现。例如，一旦确定了脓毒阶段的特征性生物标记谱，就可以将从个体得到的生物样品的生物标记谱与该参比谱相比较以确定该受试者是否也处于脓毒的那一特定阶段。

群体从脓毒的一个阶段发展到另一阶段，或者从常态(即，特征是不患有脓毒或者SIRS的状态)到脓毒或者SIRS和反之亦然的特征是生物标记谱中的改变，因为某些生物标记谱以更高的水平表达并且其他生物标记的表达被下调。生物标记谱中的这些变化可以反映参比群体对例如感染和/或炎症的生理应答中的渐进性建立。技术人员将明白随着生理应答的消退，参比群体的生物标记谱也将变化。如上所述，本发明的一个优点是能够使用来自单个生物样品的生物标记谱将个体归类为特定群体中的成员。然而，技术人员将明白通过对该个体的随后分类可以有助于确定特定生理应答正在被建立或者正在消退。为此，本发明提供了多种生物标记，在对脓毒或者SIRS的生理应答被建立或者消退时这些生物标记的表达水平有的增加，有的降低。例如，研究人员可以选择个体的生物标记谱的一种特征，公知随着对脓毒的生理应答的建立该特征的强度改变。来自该个体的随后的生物样品的谱中相同特征的比较可以确定该个体是否正在向更严重的脓毒发展或者正在向常态发展。

生物标记的分子身份不是本发明必需的。实际上，本发明不应局限于以前已经鉴定的生物标记(见美国专利申请序号10/400,275，2003年3月26日提交)。因此，预期将鉴定新的生物标记，这些生物标记是给定个体群体，特别脓毒早期之一的群体所特有的。在本发明的一个实施方案中，鉴定并分离的生物标记。然后该生物标记被用于产生特异结合的抗体，该抗体可以促进多种诊断测定中的生物标记检测。为此，任一免疫测定可以使用能够结合生物标记分子的任何抗体、抗体片段或者衍生物(例如，Fab、Fv、或scFv片段)。这些免疫测定是本领域中熟知的。如果该生物标记是蛋白，那么可以用成熟的技术将其测序并且克隆其编码基因。

本发明的方法可以用于筛选，例如，ICU所接纳的患者。当接纳时立即采集生物样品，例如，血。血中蛋白质和其他分子的复杂混合物被分解成生物标记谱。这可以通过使用任一技术或技术的组合实现，该技术可以基于某种物理或者化学性质可再现地区分这些分子。在一个实施方案中，分子被固定在基质上，然后通过激光解吸/电离飞行时间质谱分离和区分这些分子。通过特征性解吸模式产生波谱，该解析模式反映了每个分子或者其片段的质量/电荷比。在另一实施方案中，生物标记选自从细胞提取物得到的多种mRNA种类，并通过将该个体的mRNA种类与cDNAs阵列杂交得到图。cDNA阵列的诊断用途是本领域中熟知的(见，例如，Zou，等人，Oncogene 21：4855-4862(2002))。在再一个实施方案中，联合使用蛋白质和核酸分离方法可以得到图谱。

本发明还提供了试剂盒，该试剂盒可用于确定个体中脓毒的状态或者诊断SIRS。本发明的试剂盒含有至少一种生物标记。用于本发明的特定生物标记在本文中给出。该试剂盒的生物标记可用于产生根据本发明的生物标记谱。试剂盒中化合物类别的实例包括，但不限于，蛋白质、其片段、肽、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、糖类、脂质、核酸、有机和无机化学品，和天然和合成的聚合物。该生物标记可以是阵列的部分，或者该生物标记可以被分开和/或单独地包装。该试剂盒可以还含有至少一种内标，该内标用于产生本发明的生物标记谱。同样，内标可以是上述任一种化合物类别。本发明的试剂盒可以还含有试剂，该试剂可用于可检测地标记生物样品中所含的生物标记，其中生物标记谱从该生物样品产生。为此，试剂盒可以含有一组抗体或者它们的功能片段，这些抗体或者它们的功能片段结合下面列出生物标记的表的任一个表中所给出的生物标记的至少2、3、4、5、10、20或更多种。抗体自身可以被可检测地标记。试剂盒可以还含有特异生物标记结合组分，如适合体(aptamer)。如果生物标记含有核酸，那么试剂盒可以提供寡核苷酸探针，该探针能够与该生物标记或者生物标记的互补链形成双链体。寡核苷酸探针可被检测地标记。

当生物标记被用于产生抗体时，本发明的试剂盒可以还包括药物赋形剂、稀释剂和/或佐剂。药物佐剂的实例包括，但不限于，防腐剂、增湿剂、乳化剂，和分散剂。通过包括多种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等等可以确保防止微生物的作用。可能还希望包括等渗剂，如糖、氯化钠，等等。通过包括延缓吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射的药物形式的吸收。

产生生物标记谱

根据一个实施方案，本发明的方法包括从从个体采集的生物样品得到生物标记谱。生物样品可以是血液、血浆、血清、唾液、痰、尿、脑脊液、细胞、细胞提取物、组织样品、组织活检、粪便样品，等等。例如，从个体的群体可以得到参比生物标记谱，这些个体选自SIRS-阴性个体、SIRS-阳性个体、患有脓毒发作的个体和已经患有脓毒的个体。可以在脓毒发展的任一阶段，如感染、菌血症、严重脓毒、脓毒性休克或者MOD，得到已经患有脓毒的个体的参比生物标记谱。

在一个实施方案中，可以用分离方法产生生物标记谱，从而仅分析样品中生物标记的子集。例如，在样品中分析的生物标记可以由来自细胞提取物的mRNA种类组成，该细胞提取物已经被分级分离而仅样品中的核酸生物标记，或者生物标记可以由样品中蛋白质的总补体的一部分组成，所述蛋白质已经通过层析技术被分级分离。备选地，可以不用分离方法而产生生物标记谱。例如，可以用标记化合物询问(interrogate)生物样品，该标记化合物与样品的中的生物标记形成特异复合物，其中该特异复合物中标记的强度是该生物标记的可检测的特征。适于形成这种特异复合物的化合物是被标记的抗体。在一个实施方案中，使用具有可扩增的核酸作为标记的抗体检测生物标记。在再一个实施方案中，当两种抗体(每种缀合到核酸标记的一条链)与生物标记相互作用时，该核酸标记变得可被扩增，从而，两条核酸链形成可扩增的核酸。

在另一个实施方案中，生物标记谱可来自测定，如核酸的测定，其中生物标记是核酸或者它们的互补物。例如，生物标记可以是核糖核酸。使用选自核磁共振、核酸阵列、点印迹、狭线印迹、反转录扩增和RNA印迹分析的方法可以得到生物标记谱。在另一个实施方案中，通过对该生物标记特异的反应性抗体，或者该抗体的功能片段通过免疫学检测该生物标记谱。抗体的功能片段是抗体的片段，其至少保留结合完整抗体所结合的抗原的一定能力。该片段包括，但不限于，scFv片段、Fab片段和F(ab)2片段，这些片段可以通过重组方法或者酶产生。在另一实施方案中，不同于抗体的特异结合分子，如适合体，可用于结合该生物标记。在再一个实施方案中，生物标记谱可以含有感染物或者其组分的可检测方面。在再一个实施方案中，生物标记谱可以含有小分子的可检测方面，这些小分子可以包括蛋白质或者核酸的片段，或者可以包括代谢物。

使用一种或多种分离方法可以产生生物标记谱。例如，适宜的分离方法可以包括质谱方法，如电喷雾电离质谱(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)(n是大于0的整数)、基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、表面增强的激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、硅上解吸/电离(DIOS)、二级离子质谱(SIMS)、四极飞行时间(Q-TOF)、大气压化学电离质谱(APCI-MS)ⁿ、APCI-MS/MS、APCI-(MS)、大气压光电离质谱(APPI-MS)、APPI-MS/MS，和APPI-(MS)ⁿ。其他质谱方法可以包括四极、傅立叶变换质谱(FTMS)和离子阱。其他适宜的分离方法可包括化学萃取分配、柱层析、离子交换层析、疏水(反相)液体层析、等电聚焦、一维聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)或者其他层析，如薄层、气相或液相层析，或者它们的组合。在一个实施方案中，生物样品可以在应用分离方法前被分级分离。

通过不需要生物标记自身的物理分离的方法也可以产生生物标记谱。例如，可以用核磁共振(NMR)波谱学从分子的复杂混合物分辨生物标记谱。用NMR对肿瘤分类的类似用途在例如Hagberg，NMRBiomed.11：148-56(1998)中公开。额外的方法包括核酸扩增技术，这些技术可用于产生生物标记谱而不用物理分离各个生物标记。(见例如，Stordeur等人，J.Immunol.，Methods 259：55-64(202)和Tan等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 99：11387-11392(2002))。

在一个实施方案中，使用激光解吸/电离飞行时间质谱产生生物标记谱，其中生物标记是蛋白质或者蛋白质片段，它们已经被入射激光辐射电离或者从固定支持物蒸发。通过每种蛋白的特征性飞行时间产生图谱，该特征性飞行时间取决于其质荷比(“m/z”)。多种激光解吸/电离技术也是本领域中公知的。(见，例如，Guttman等人，Anal.Chem.73：1252-62(2001)和Wei等人，Nature 399：243-46(1999))。

激光解吸/电离飞行时间质谱允许在相对短的期限内产生大量信息。生物样品被应用于多种支持体之一，该支持体结合样品中的所有生物标记，或者这些生物标记的子集。细胞裂解物或者样品以少至0.5μL的体积被直接应用于这些表面，这些细胞裂解物或者样品被或者不被预先纯化或者分级分离。裂解物或样品在应用于支持体表面上时可以被浓缩或稀释。然后用激光解吸/电离在少至3个小时内产生样品的质谱。

在另一实施方案中，测定了来自该个体的细胞提取物的总mRNA，并且将从该生物样品所得多种mRNA种类用作生物标记。例如，使用本领域中公知的标准方法，通过将这些mRNA与探针阵列杂交可以得到图谱，该探针阵列可以含有寡核苷酸或者cDNA。备选地，可以将mRNA实施凝胶电泳或者印迹方法，如点印迹、狭线印迹或者RNA印迹分析，所有这些方法都是本领域中公知的(见，例如，Sambrook等人，“Molecular Cloning，第三版”，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001))。通过逆转录，然后如Stordeur等人(如前)公开的扩增并检测所得cDNA也可以得到mRNA图。在另一实施方案中，使用组合方法，如核酸阵列与质谱的组合，可以得到该图。

数据分析算法的使用

在一个实施方案中，个体生物标记谱与参比生物标记谱的比较包括应用决策规则。该决策规则可以包括数据分析算法，如计算机模式识别算法。其他适宜的算法包括，但不限于，可以检测特征值的分布中的差异的逻辑回归或者非参数算法(例如，Wilcoxon有符号的秩检验)。决策规则可以基于1、2、3、4、5、10、20或更多种特征。在一个实施方案中，决策规则基于数百或者更多特征。应用决策规则也可以包括使用分类树算法。例如，参比生物标记谱可以含有至少三种特征，其中这些特征是分类树算法中的预测值。数据分析算法预测群体(或者类)中的成员资格，其准确度为至少约60％、至少约70％、至少约80％和至少约90％。

适宜的算法是本领域中公知的，一些算法在Hastie等(如前)中综述。这些算法将来自生物材料，如血样的复杂光谱分类以将个体区分为正常的或者具有特定病态的特征性生物标记表达水平。尽管这些算法可用于增加应用决策规则的速度和效率并避免研究人员偏倚，但是本领域技术人员将认识到不需要基于计算机的算法来实施本发明的方法。

不管用于产生生物标记谱的方法，都可以应用算法比较生物标记谱。例如，适宜的算法可应用于使用气相色谱产生的生物标记谱，如Harper，“Pyrolysis and GC in Polymer Analysis”Dekker，New York(1985)中所讨论的。此外，Wagner等人，Anal.Chem 74：1824-35(2002)公开了一种算法，该算法提高了基于通过静态飞行时间二级离子质谱(TOF-SIMS)得到的光谱对个体分类的能力。此外，Bright等人，J.Microbiol.Methods 48：127-38(2002)公开了通过分析MALDI-TOF-MS光谱以高确定性(79-89％正确分类率)区分细菌株系的方法。Dalluge，Fresenius J.Anal.Chem.366：701-11(2000)讨论了使用MALDI-TOF-MS和液相色谱-电喷雾电离质谱(LC/ESI-MS)对复杂生物样品中生物标记谱分类。

生物标记

通过产生生物标记谱可以实施本发明的方法，这些生物标记谱可以诊断或者预测脓毒或者SIRS。因为图谱产生足够实施本发明，所以组成该图谱的生物标记不必已知或者被随后鉴定。

可用于产生本发明的生物标记谱的生物标记可以包括公知提供关于应答感染中免疫系统的状态的信息的那些生物标记；然而，这些生物标记不总是同等地提供信息。这些生物标记可以包括激素、自身抗体、可溶的和不可溶的受体、生长因子、转录因子、细胞表面标记和可溶的标记，这些生物标记来自宿主或者来自病原自身，如外壳蛋白、脂多糖(内毒素)、脂磷壁酸质，等等。其他生物标记包括，但不限于，细胞表面蛋白，如CD64蛋白；CD11b蛋白；HLA II类分子，包括HLA-DR蛋白和HLA-DQ蛋白；CD54蛋白；CD71蛋白；CD86蛋白；表面结合的肿瘤坏死因子受体(TNF-R)；模式识别受体如类似Toll的受体；可溶的标记如白介素IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、和IL-18；肿瘤坏死因子α(TNF-α)；新喋呤；C-反应蛋白(CRP)；原降钙素(PCT)；6-酮F1α；血栓烷B₂；白三烯B4、C3、C4、C5、D4和E4；γ干扰素(IFN γ)；α/β干扰素(IFNα/β)；α淋巴毒素(LTα)；补体组分(C’)；血小板活化因子(PAF)；缓激肽、一氧化氮(NO)；粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)；巨噬细胞抑制因子(MIF)；白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)；可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFr)；可溶性白介素受体sIL-1r和sIL-2r；转化生长因子β(TGFβ)；前列腺素E₂(PGE₂)；粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)；和其他炎症介质。(在Oberholzer等人，Shock 16：83-96(2001)和Vincent等人，“The Sepsis Text，”Carlet等人，编者，(KluwerAcademic Publishers，2002)中综述)。通常和在临床上与菌血症有关的生物标记也是用于本发明的生物标记的候选者，条件是这些生物标记在生物样品中通常和经常发生。生物标记可以包括低分子量化合物，它们可以是蛋白质或者核酸的片段，或者它们可以包括代谢物。低分子量化合物，如代谢物的存在或者浓度可以反映与脓毒和/或SIRS有关的表型变化。具体地，小分子量生物标记的浓度的变化与应答SIRS和/或脓毒过程中任何生理变化产生的细胞代谢的变化相关，这些生理变化为诸如低体温或者高体温、心率或者呼吸率增加、组织低氧、代谢性酸中毒或者MOD。生物标记还可以包括编码蛋白质生物标记的RNA和DNA分子。

生物标记还可以包括与白细胞调节，如嗜中性粒细胞活化或者单核细胞失活有关的至少一种分子。CD64和CD11b的表达增加被认为是嗜中性粒细胞和单核细胞活化的信号。(Oberholzer等人，如前和Vincent等人，如前中综述)。可用于本发明的那些生物标记包括与巨噬细胞裂解产物相关的生物标记，如细胞因子代谢变化的标记(见，Gognon等人，Cell 110：119-31(2002)；Oberholzer，等人，如前；Vincent，等人，如前)。

生物标记可以还包括公知参与或者被发现参与炎症过程的信号因子。信号因子可以启动细胞内事件级联，包括受体结合、受体活化、细胞内激酶的活化、转录因子的活化、基因转录和/或翻译水平的变化，和代谢过程的变化，等。为了本发明的目的，这些分子活化的信号分子和过程被全体定义为“与脓毒途径有关的生物分子”。相关的预测性生物标记可以包括与脓毒途径有关的生物分子。

因此，尽管本发明的方法可以使用无偏的方法鉴定预测性生物标记，但是技术人员清楚与生理应答或者与多种信号途径相关的生物标记的特定组可以是具体关注的主题。这对于如下情况尤其是如此：来自生物样品的生物标记与阵列(例如，抗体阵列或核酸阵列)接触，其中该阵列可通过与生物标记的直接和特异相互作用用于检测多种生物标记的量。在该情况中，阵列组分的选择可基于如下提示，即具体途径与个体中脓毒或者SIRS的状态的确定有关。特定生物分子具有可以预测或者诊断脓毒或SIRS的特征的指示可以导致预期在生理上以一致方式被调节的其他生物分子同样可以提供预测或者诊断特征。然而，技术人员将明白，由于生物系统的复杂性这种预期可能不被实现。例如，如果特定mRNA生物标记的量是预测性特征，如果另一生物标记的表达在翻译后水平上被调节，那么该另一生物标记的mRNA表达中的一致变化可能不能被检测。此外，生物标记的mRNA表达水平可以受到多种会聚途径的影响，这些途径可以与对脓毒的生理应答有关或者无关。

可以从任一生物样品得到生物标记，作为实例但不限制，该生物样品可以是血液、血浆、唾液、血清、尿、脑脊液、痰、粪便、细胞和细胞提取物，或者其他生物流体样品、来自宿主或患者的组织样品或者组织活检样品。从个体所得的确切的生物样品可以不同，但是采样优选侵入性最小并且容易通过常规技术实施。

通过任一常规技术可以实施表型变化的检测。通过临床观察和检测可以实现体温、呼吸率、脉搏、血压、或其他生理参数的检测。生物标记分子的检测可以包括，例如，指出存在、浓度、表达水平、或者任何其他与生物标记分子相关的值的检测。生物标记分子的检测形式通常取决于用于从生物样品形成这些生物标记谱的方法。例如，通过考马斯蓝染色或者通过银染可以检测通过2D-PAGE分开的生物标记，所述染色方法是本领域中成熟的。

分离有用的生物标记

预期有用的生物标记将包括还没有鉴定或者与相关生理状态有关的生物标记。在本发明的一方面，有用的生物标记被鉴定为来自生物样品的生物标记谱的组分。这种鉴定可以通过本领域中任一种熟知的方法实施，该方法包括免疫测定或者自动化微测序。

一旦鉴定了有用的生物标记，就可以通过许多熟知的分离方法之一分离该生物标记。因此，本发明提供了分离可以诊断或者预测脓毒的生物标记的方法，该方法包括从个体的群体得到参比生物标记谱，鉴定可以预测或者诊断脓毒或者脓毒发展阶段之一的参比生物标记谱的一种特征，鉴定与该特征相应的生物标记，并分离该生物标记。一旦分离，例如，如果该生物标记是蛋白，那么该生物标记就可用于产生结合该标记的抗体，如果该生物标记是核酸，那么该生物标记可用于开发特异寡核苷酸探针。

技术人员将容易明白可以进一步表征有用的特征以确定该生物标记的分子结构。以这种方式表征生物分子的方法是本领域中熟知的并且包括高分辨率质谱、红外光谱、紫外分光法和核磁共振。确定核酸生物标记的核苷酸序列、多肽生物标记的氨基酸序列，和糖生物标记的组成和序列的方法是本领域中熟知的。

本发明应用于SIRS患者

在一个实施方案中，当前描述的方法被用于筛选尤其处于患脓毒的危险中的SIRS患者。从SIRS阳性患者采集生物样品，并将该样品中生物标记谱与来自最终发展成脓毒的SIRS-阳性患者的参比图相比较。将该患者的生物标记谱归类成相应于发展成脓毒的SIRS-阳性群体的参比图可以诊断该SIRS-阳性患者将同样发展成脓毒。然后可以启动治疗方案以阻止或者防止脓毒的发展。

在另一实施方案中，当前描述的方法被用于证实患者患有SIRS的临床怀疑。在该情况中，将样品中生物标记谱与患有SIRS或者不患有SIRS的个体的参比群体比较。将该患者的生物标记谱归类为相应于一个群体或者另一群体可以用于诊断该个体患有SIRS或者不患有SIRS。

实施例

下面的实施例是本发明所包括的实施方案的代表并且绝不限制本发明所包括的主题。

实施例1：使用定量液相层析/电喷雾电离质谱(LC/ESI-MS)鉴定小分子生物标记

1.1接受和分析的样品

为患者的两个群体建立参比生物标记谱。第一个群体(“SIRS组”)代表患有SIRS并且在“天1”进入本研究但是在它们的住院期间没有发展成脓毒的20名患者。第二个群体(“脓毒组”)代表同样患有SIRS并且在天1进入本研究但是在进入研究至少数天后发展成脓毒的患者。约每24小时从每个研究组采集血样。脓毒组中脓毒的临床怀疑在“时间0”发生，该临床怀疑通过常规技术检测。“时间-24小时”和“时间-48小时”分别代表脓毒组中脓毒发作的临床怀疑前约24小时和约48小时采集的样品。即，来自脓毒组的样品包括在进入研究当天(天1)、脓毒的临床怀疑前48小时(时间-48小时)、脓毒的临床怀疑前24小时(时间-24小时)、和脓毒发作的临床怀疑当天(时间0)采集的样品。共分析了160个血样：80个样品来自脓毒组的20名患者，另外80个样品来自SIRS组的20名患者。

1.2样品制备

在血浆中，许多种小分子可以结合到蛋白质，这可以降低通过模式-产生方法检测到的小分子的数量。因此，从血浆样品除去多数蛋白质，然后释放可以结合这些蛋白质的小分子。除去蛋白质的适宜方法包括，但不限于，用冰预冷的甲醇、乙腈(CAN)、丁醇，或者三氯乙酸(TCA)萃取血浆或者热变性或者酸水解。在该实例中，用冰预冷的甲醇萃取血浆。优选甲醇萃取，因为其导致可以检测到最高数目的小分子。从每种血浆样品取50μL与100μL冰预冷的100％甲醇混合，甲醇的最终体积百分数为67％。将该溶液涡旋混合60秒。然后将样品在4℃孵育20分钟，通过以12,000rpm离心10分钟沉淀蛋白。除去上清液，将其干燥，并重悬在50μL水中。LC/MS分析前，向被萃取的血浆样品加入两种低分子量分子：磺胺氯哒酮和十八胺。这些分子作为使离子强度和保留时间标准化的内标。磺胺氯哒酮的m/z为285.0Da(通过MS确定)，在44％ACN处洗脱(通过LC确定)；十八胺的m/z为270.3Da，在89％ACN处洗脱。

1.3LC/ESI-MS分子

将10μL重悬的上清液注射到2.1×100mm C₁₈ Waters SymmetryLC柱(颗粒大小＝3.5μm，内部孔径＝100)。在25℃下用溶于0.1％甲酸中的ACN的三步线性梯度以300μL/分钟洗脱柱子。对于t＝0-0.5分钟，ACN浓度为9.75％到24％；对于t＝0.5-20分钟，ACN浓度为24％到90.5％；对于t＝20-27分钟，ACN浓度为90.5％到92.4％。前面提到的实验条件在此处被称作“LC实验条件”。在LC实验条件下，磺胺氯哒酮在44％ACN处洗脱，保留时间为6.4分钟，十八胺在89％ACN处洗脱，保留时间为14.5分钟。使用Agilent MSD 1100四级质谱仪通过ESI-MS分析通过LC分级分离的样品，该质谱仪串联到LC柱(LC/ESI-MS)。以阳离子模式和4000V的毛细管电压为质/荷比(m/z)为100或者150-1000Da的离子得到质谱数据。对每种样品实施三次LC/ESI-MS分析。数据可表达为每种离子的m/z(道尔顿)和保留时间(分钟)(“m/z，保留时间”)，其中离子的保留时间是在线性ACN梯度中从反相柱洗脱所需的时间。然而，为了计算每次实验中保留时间的轻微变化，数据也可以表达为m/z和离子从C₁₈柱洗脱时ACN的百分数，其代表该离子的内在性质，不会受到实验变异性的显著影响。保留时间和洗脱时的百分数ACN之间的关系可通过下面的方程表达：

％ACN＝28.5t+9.75(0＜t＜0.5)；

％ACN＝3.4103(t-0.5)+24(0.5＜t＜20)；

％ACN＝0.27143(t-20)+90.5(20＜t＜27)

然而，这些参数的值应该被理解为近似值并且可能在实验时间轻微变化；然而，离子可被再现地识别，特别当用一种或多种相同的内标制备样品时。在下面所示的数据中，m/z值被确定为在±0.4m/z内，而离子洗脱时百分数ACN被确定为在±10％以内。

1.4.数据分析和结果

从每种血浆样品分析数百种光谱特征。光谱之间进行相似特征的比对。比对算法的选择对于本发明不是关键的，并且技术人员明白多种比对算法可用于该目的。总共分析了4930种光谱特征。对于该实施例，“特征”与相应于特定离子的“峰”互换使用。从5名不同个体得到的样品的代表性峰在表1中显示。第一列在括号中分别列出了每个离子的m/z和洗脱时ACN的百分数。剩余的列是来自每个患者的相应离子的标准化强度，它们通过将强度对两个内标的强度标准化得到。400个以上的峰具有大于0.1的平均标准化强度。

                                      表1

                          多种患者中存在的代表性离子

离子(m/z，％ACN)	患者1	患者2	患者3	患者4	患者5
						(293.2，26.8)	43.39	42.44	53.81	45.86	23.24
(496.5，39.0)	37.43	39.88	33.74	36.32	31.81
						(520.5，37.8)	9.067	9.309	7.512	6.086	6.241
(522.5，37.8)	8.568	8.601	7.234	5.520	5.228
						(524.5，42.2)	11.60	12.73	8.941	7.309	6.810
(275.3，32.0)	6.966	7.000	8.911	5.896	5.590
						(544.5，37.8)	3.545	3.915	3.182	2.365	2.342
(393.3，26.4)	1.517	2.092	2.418	2.439	2.498
						(132.3，24.3)	2.317	2.417	3.953	4.786	2.982
(437.4，27.4)	1.769	1.997	2.418	2.706	2.166
						(518.5，39.0)	3.731	3.792	6.758	3.058	2.605
(349.3，25.6)	1.249	1.663	1.910	1.806	1.660
						(203.2，24.1)	3.722	3.485	4.900	3.155	2.342
(481.4，27.7)	1.570	1.259	1.987	2.246	1.612

可以用多种方法鉴定离子，所述离子为辨别SIRS和脓毒组的决策规则提供信息。在该实施例中，所选的方法为(1)比较两组间平均离子强度，和(2)使用数据分析算法产生分类树。

1.4.1比较平均离子强度

平均离子强度的比较有效突出SIRS和脓毒患者之间个体离子强度中的差异。为脓毒组和SIRS组分别平均了1800个以上的标准化的离子强度。将脓毒组或者SIRS组中平均标准化强度大于0.1的离子与两个组中标准化强度小于0.1的离子分开分析。确定了脓毒组对SIRS组中标准化强度大于0.1的约400种离子的平均标准化强度的比值。这些离子的相对强度比值的分布在图3中显示。

使用该方法，观察到23种离子(表2中列出)显示出在脓毒患者中的强度比SIRS患者中的强度高至少3倍(见图3，其中离子强度的自然对数大于约1.1)并且存在于至少半数脓毒患者中并且通常存在于约1/3或者1/4的SIRS患者中。在该上下文中，生物标记的“存在”指特定患者中该生物标记的平均标准化强度为所有患者的标准化强度的至少25％。尽管这些离子，或者其子集将可用于实施本发明的方法，但是也可以使用另外的离子或者其他离子的子集。

                                     表2

                        含有所列离子的患者样品的百分数

离子#	(m/z[Da]，保留时间[min])	洗脱的％ACN	离子存在的脓毒患者的百分数	离子存在的SIRS患者的百分数
					1	(520.4，5.12)	39.75	94	35
2	(490.3，5.12)	39.75	76	35
					3	(407.2，4.72)	38.39	76	25
4	(564.4，5.28)	40.30	71	35
					5	(608.4，5.39)	40.68	71	30
6	(564.3，2.14)	29.59	71	25
					7	(476.4，4.96)	39.21	65	30
8	(476.3，1.86)	28.64	65	35
					9	(377.2，4.61)	38.02	65	15
10	(547.4，5.28)	40.30	65	20
					11	(657.4，5.53)	41.15	65	30
12	(481.3，4.96)	39.21	59	25
					13	(432.3，4.80)	38.66	59	30
14	(481.2，1.86)	28.64	59	20
					15	(388.3，4.58)	37.91	59	20
16	(363.2，4.40)	37.30	59	20
					17	(261.2，1.26)	26.59	59	40
18	(377.2，9.32)	54.08	59	15
					19	(534.3，5.30)	40.37	59	30
20	(446.3，4.94)	39.14	59	25
					21	(437.2，1.42)	27.13	53	25
22	(451.3，4.94)	39.14	53	15
					23	(652.5，5.51)	41.08	53	20

在脓毒阳性群体的大多数中这些生物标记的子集以至少3倍高的强度存在。具体地，在脓毒-阳性群体的半数以上中发现这些生物标记的至少12种水平升高，并且在85％的脓毒阳性群体中存在至少7种生物标记，表明这些标记的组合将提供脓毒发作的有用的预测值。对于SIRS-阳性群体所有生物标记的水平都升高，如表3中所示。

                                 表3

                      脓毒组对SIRS组中的离子强度

离子	脓毒组的强度	SIRS组的强度	强度比值：脓毒/SIRS
				(437.2，1.42)	4.13	0.77	5.36
(520.4，5.12)	3.65	0.69	5.29
				(476.4，4.96)	3.34	0.78	3.56
(481.3，4.96)	2.42	0.68	3.56
				(564.4，5.28)	2.39	0.43	5.56
(432.3，4.80)	2.29	0.59	3.88
				(476.3，1.86)	2.12	0.52	4.08
(481.2，1.86)	1.88	0.42	4.48
				(388.3，4.58)	1.83	0.51	3.59
(608.4，5.39)	1.41	0.24	5.88
				(363.2，4.40)	1.35	0.27	5.00
(490.3，5.12)	1.27	0.25	5.08
				(261.2，1.26)	1.24	0.24	5.17
(407.2，4.72)	1.05	0.17	6.18
				(377.2，9.32)	1.04	0.27	3.85
(534.3，5.30)	0.88	0.16	5.50
				(446.3，4.94)	0.88	0.22	4.00
(547.4，5.28)	0.86	0.16	5.38
				(451.3，4.94)	0.86	0.17	5.06
(377.2，4.61)	0.84	0.22	3.82
				(564.3，2.14)	0.62	0.14	4.43
(652.5，5.51)	0.62	0.10	6.20
				(657.4，5.53)	0.39	0.11	3.55

观察到表4中所列的两种离子在SIRS群体的平均标准化强度比脓毒群体中高3倍(见图3，其中离子强度比值的自然对数小于约-1.1)。

                                 表4

                       脓毒组对SIRS组的离子强度

离子#	脓毒组的强度	SIRS组的强度	强度比值：脓毒/SIRS
				(205.0，0.01)	0.26	0.81	0.32
(205.2，3.27)	0.29	0.82	0.35

鉴定了32种平均标准化强度大于0.1的离子，这些离子在脓毒组中的强度比SIRS组中高至少3倍。这些离子在表5A中列出。同样，鉴定了48种平均标准化强度小于0.1的离子，这些离子在脓毒组中的强度比SIRS组中高至少3倍。这些离子在表5B中列出。(负保留时间反映了保留时间对内标标准化这一事实)。

                                        表5A

                             平均标准化强度＞0.1的离子

离子	脓毒组的强度	SIRS组的强度	强度比值：脓毒/SIRS	Ln(比值)
					(365.2，2.69)	1.031828095	0.135995335	7.587231542	2.026467
(305.2，1.87)	3.070957223	0.481494549	6.377968828	1.85285
					(407.2，4.72)	0.913022768	0.166525859	5.482768698	1.70161
(459.1，0.83)	0.58484531	0.106723807	5.479989222	1.701103
					(652.5，5.51)	0.528195058	0.102545088	5.150856731	1.639163
(608.4，5.39)	1.205608851	0.236066662	5.107069514	1.630626
					(415.3，4.80)	2.321268423	0.46651355	4.975779207	1.604582
(319.0，0.69)	1.034850099	0.209420422	4.941495631	1.597668

(534.3，5.30)	0.756349296	0.158850924	4.761378001	1.560537
					(564.4，5.28)	2.037002742	0.432651771	4.708180752	1.549302
(437.2，1.42)	3.536425702	0.770241153	4.591322718	1.524168
					(520.4，5.12)	3.115934457	0.685511116	4.545417838	1.51412
(261.2，1.26)	1.078475479	0.239640228	4.500394154	1.504165
					(363.2，4.40)	1.159043471	0.265797517	4.360625655	1.472616
(451.3，4.94)	0.738875795	0.170611107	4.330760214	1.465743
					(490.3，5.12)	1.084054201	0.25339878	4.278056119	1.453499
(409.3，2.79)	1.172523824	0.281931606	4.158894565	1.425249
					(497.3，4.98)	0.409558491	0.100673382	4.068190437	1.403198
(453.2，2.97)	0.738638127	0.184100346	4.012149581	1.389327
					(481.2，1.86)	1.609705934	0.418739646	3.844168924	1.346557
(564.3，2.14)	0.531918507	0.139341563	3.817371482	1.339562
					(476.4，4.96)	2.847539378	0.784495859	3.629769802	1.289169
(446.3，4.94)	0.752613738	0.216182996	3.481373426	1.247427
					(476.3，1.86)	1.811980008	0.521460142	3.474819762	1.245543
(377.2，4.61)	0.75347133	0.217838186	3.458857892	1.240938
					(344.3，4.21)	0.560262239	0.164687938	3.401962791	1.224353
(377.2，9.32)	0.902933137	0.267048623	3.381156311	1.218218
					(432.3，4.80)	1.957941965	0.588612075	3.326370706	1.201882
(595.4，6.36)	0.41462875	0.125522805	3.303214496	1.194896
					(358.3，4.40)	0.351038883	0.106282278	3.302891964	1.194798
(657.4，5.53)	0.336357992	0.105101129	3.200327108	1.163253
					(388.3，4.58)	1.561368263	0.510848809	3.056419503	1.117244

                                    表5B

                          平均标准化强度＜0.1的离子

离子	脓毒组的强度	SIRS组的强度	强度比值：脓毒/SIRS	Ln(比值)
					(282.2，0.91)	0.16624	0.00024	693.08684	6.54116
(289.2，6.44)	0.13088	0.00143	91.27187	4.51384
					(821.9，2.49)	0.13670	0.00996	13.72695	2.61936
(385.3，1.24)	0.32177	0.03201	10.05211	2.30778

(843.9，2.47)	0.11866	0.01206	9.83497	2.28594
					(407.2，1.17)	0.75611	0.08227	9.19041	2.21816
(350.1，0.86)	0.10369	0.01174	8.83532	2.17876
					(385.3，4.72)	0.32430	0.03725	8.70689	2.16411
(399.2，2.99)	0.15303	0.02091	7.31838	1.99039
					(152.1，1.51)	0.28888	0.04167	6.93310	1.93631
(341.0，0.36)	0.26310	0.03828	6.87289	1.92759
					(451，2，1.42)	0.45398	0.06645	6.83232	1.92166
(231.0，-0.41)	0.19637	0.03362	5.84078	1.76486
					(534.2，2.20)	0.45796	0.08650	5.29427	1.66663
(820.5，7.02)	0.12838	0.02439	5.26324	1.66075
					(578.4，5.46)	0.45661	0.08861	5.15298	1.63957
(355.1，2.85)	0.16920	0.03334	5.07491	1.62431
					(358.0，2.13)	0.27655	0.05565	4.96946	1.60331
(696.5，5.65)	0.20458	0.04223	4.84500	1.57795
					(622.4，5.61)	0.20034	0.04179	4.79410	1.56739
(460.3，4.02)	0.18099	0.03950	4.58160	1.52205
					(718.0，7.02)	0.11733	0.02564	4.57688	1.52102
(305.3，6.11)	0.10194	0.02324	4.38703	1.47865
					(283.2，1.85)	0.41312	0.09709	4.25497	1.44809
(701.4，5.63)	0.18369	0.04321	4.25111	1.44718
					(541.2，1.71)	0.11482	0.02739	4.19217	1.43322
(657.3，2.49)	0.17904	0.04280	4.18327	1.43109
					(239.2，1.04)	0.10637	0.02553	4.16574	1.42689
(608.3，2.35)	0.39410	0.09670	4.07556	1.40501
					(465.0，1.19)	0.10817	0.02718	3.98030	1.38136
(333.1，2.00)	0.35105	0.08919	3.93582	1.37012
					(497.3，0.88)	0.36172	0.09212	3.92666	1.36779
(541.3，5.12)	0.13883	0.03559	3.90124	1.36129
					(627.3，5.75)	0.16498	0.04259	3.87347	1.35415
(652.1，5.87)	0.17554	0.04558	3.85130	1.34841
					(402.2，1.19)	0.25423	0.06860	3.70596	1.30994
(553.3，5.38)	0.16633	0.04578	3.63335	1.29016
					(635.4，5.53)	0.11925	0.03383	3.52512	1.25992

(319.2，6.34)	0.17736	0.05035	3.52259	1.25920
					(231.1，2.62)	0.20535	0.05906	3.47671	1.24609
(283.1，4.96)	0.17190	0.04984	3.44919	1.23814
					(766.0，6.77)	0.13671	0.04032	3.39069	1.22103
(358.0，6.00)	0.20857	0.06194	3.36714	1.21406
					(179.0，10.16)	0.16841	0.05106	3.29838	1.19343
(209.1，10.98)	0.13267	0.04090	3.24363	1.17669
					(509.3，5.28)	0.26857	0.08291	3.23925	1.17534
(337.2，9.32)	0.18169	0.05691	3.19236	1.16076
					(423.2，2.88)	0.16242	0.05097	3.18669	1.15898

从而，本发明的参比生物标记谱可以包含特征的组合，其中这些特征可以是如通过电喷雾离子质谱以阳性模式确定的m/z约100或者150Da到约1000Da的离子强度，并且其中这些特征在脓毒-阳性参比群体与SIRS-阳性参比群体中平均标准化强度的比例为约3∶1或更高。备选地，这些特征在脓毒-阳性参比群体与SIRS-阳性参比群体中平均标准化强度的比例为约1∶3或更低。因为在通过常规技术确定脓毒发作前约48小时从生物样品所得生物标记中存在这些生物标记，所以预期这些生物标记是脓毒发作的预测者。

1.4.2特征强度随时间改变

所检查的生物标记谱显示出一些特征，随着个体向脓毒发作的发展这些特征的表达水平有的升高，有的降低。预期相应于这些特征的生物标记是对个体中感染和/或炎症的生理应答所特有的。由于上面提出的原因，预期这些生物标记将为确定个体中脓毒或SIRS状态提供尤其有用的预测。即，预期从一个个体的不同生物样品所得图谱中这些特征的比较将确定该患者是向严重脓毒发展还是SIRS正向常态发展。

在表2中所列的23种离子中，14种在时间-48小时群体中显示出最大强度，8种在时间-24小时群体中显示出最大强度，1种在时间0群体中显示出最大强度。来自脓毒组的生物样品中生物标记的强度随时间的代表性变化在图4A中显示，而来自SIRS组的生物样品中同一生物标记的强度的变化在图4B中显示。该特定离子的m/z为437.2Da，保留时间为1.42分钟，该离子在通过常规技术诊断这些患者向脓毒的转化之前48小时在脓毒组中的强度达到峰值。从而该离子在生物样品中的相对强度的波峰作为约48小时内该个体中脓毒发作的预测者。

1.4.3交叉验证

当决策规则是基于来自相对少的生物标记谱的大量特征时，选择偏倚可以影响为决策规则提供信息的特征的鉴定。(见Ambroise等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 99：6562-66(2002))。当数据被用于选择特征，并且对所选的特征实施有条件的估计性能而不考虑选择过程中的变异性时，将发生选择偏倚。结果是对分类准确度的过高估计。如果不对选择偏移调整，那么分类准确度可以达到100％，甚至决策规则是基于随机输入参数时也是如此(Id.)。可以在性能估计过程中包括特征选择来避免选择偏倚，而不管该性能估计过程是10倍交叉验证或者一种自举方法(见，例如，Hastie等人，如前，7.10-7.11，被并入本文作为参考)。

在本发明的一个实施方案中，通过10倍交叉验证检测模型性能。通过将数据随机分配到10个排他性组进行10倍交叉验证。然后依次将每组排除，并用模型拟合剩下的9组。将所拟合的模型应用于被排除的组，产生所预测的类别概率。通过简单地产生预测类别可以将预测的类别概率与实际的类别成员资格比较。例如，如果脓毒的概率为，例如，大于0.5，那么该预测的类别是脓毒。

偏差(Deviance)是比较概率与实际结果的一种量度。本文中，“偏差”被定义为：

其中P为特定类别的类别概率。当对于实际的类别类别概率高时，偏差减小。两种模型可以对给定数据做出相同预测，然而优选的模型将具有更小的预测偏差。对于10倍交叉验证中的10次迭代的每一次迭代，对于该迭代期间模型拟合之外的病例计算预测偏差。结果是10个无偏偏差。通常，将这10个偏差相加产生对总数据集的模型性能(即，准确度)的概括。因为实际上10种不同的模型适合时，交叉验证不能证明特定模型的性能。相反，通过通常的建模方法产生10种模型，并且交叉验证证明了该方法的性能。从该方法得到的第11种模型将具有头10个的预测性能。使用10倍交叉验证通常导致模型的性能小于100％，但是当决策规则应用于训练组之外的样品得到的生物标记时，预期10倍交叉验证后所得性能更准确地反映该决策规则的生物学上有意义的预测准确度。

分类树分析

分析该数据的一种方法是使用分类树算法，该算法研究大数据集中的模式和关系。“分类树”是使用一系列问题将特定患者分类到特定类别(例如，脓毒或者SIRS)的递归划分，这些问题被设计使得将该患者准确置于一个类别中。每个问题询问患者的条件是否满足给定预测值，每个问题被用于使用者沿着分类树下降直到可以确定该患者进入的类别。本文中，“预测值”是一系列特征的值的范围，在该实例中为具有特征m/z和来自ACN中C₁₈柱的洗脱图的离子的离子强度。“条件”是在个体的生物标记谱中检测特征的单一的、特定的值。在该实例中，“类别名”是脓毒和SIRS。从而，分类树使用者将首先提问在该个体的生物标记谱中检测的第一离子强度是否在第一个离子的预测范围的给定范围内。第一个问题的回答将在确定该个体为SIRS或者脓毒中是决定性的。另一方面，对第一个问题的回答还可以指导使用者询问在该个体的生物标记谱中检测的第二离子强度是否在第二个离子的预测范围的给定范围内。再次，对该第二个问题的回答可以决定或者指导使用者进一步沿着分类树向下直到患者的分类被最终确定。

用分类树算法分析了时间0时从脓毒和SIRS群体收集的离子强度的代表性集合，其结果在图5中显示。在该情况中，所分析的离子集合包括标准化强度小于0.1的那些离子。分类树中的第一个决策点是具有m/z为约448.5道尔顿和洗脱处百分数ACN为约32.4％的离子的标准化强度是否小于约0.0414。如果该问题的回答是“是”，那么继续沿着左枝向下到另一个问题或者另一个类名。在该情况中，如果标准化强度小于约0.0414，那么进行到类名“SIRS”并且该个体被归类为SIRS-阳性，但是脓毒阴性。如果答案是“否”，那么沿着右枝向下到另一个决策点，如此直到达到类名。在该实例中，用三个决策点为个体预测类名。尽管可以用单个决策点将患者分类为SIRS-或者脓毒-阳性，但是使用其他离子的额外的决策点通常提高分类的准确度。技术人员将明白从大数据集可以得到许多不同的分类树。即，例如，生物标记的许多可能组合可用于将个体分类为属于SIRS群体或者脓毒群体。

1.4.5多重累加回归树

使用一种自动化的灵活的建模技术将特征的集合归类为属于两个群体之一，该技术使用多重累加回归树(MART)。MART模型使用最初偏移量，该偏移量指定应用于所有预测的常数，然后指定一系列回归树。该模型的拟合由每种树中决定点的数目指定、用于拟合的树的数目、和指定特定树怎样根本地影响MART模型的“粒度常数”指定。对于每次迭代，回归树被拟合以估计拟合标准的最陡峭的下降的方向。在该方向采取具有该粒度常数指定的长度的步骤。这样MART模型由最初的偏移量加上回归树提供的步骤组成。再次计算观察值和预测值之间的差异，并继续进行该循环，导致预测的不断完善。该过程持续预定的循环数或者直到引发停止规则。

每棵树中分枝的数目是尤其有意义的拟合参数。如果每个树仅有一个分枝，那么该模型仅考虑一个特征并且不能组合两个预测值。如果每棵树有两个分枝，那么该模型可以容纳特征之间的二路相互作用。使用三棵树，该模型可以容纳三路相互作用，等等。

使用特征和公知的类别状态(例如，脓毒或SIRS)为数据集确定预测类别状态中特征集的值。MART提供了个体特征对分类决策规则的贡献或者重要性的量度。具体地，可以检测对给定树分枝单个特征的选择时该单个特征对该决策规则的贡献程度以通过这些特征对决定最终的决策规则的重要性对这些特征排序。对同一数据集重复MART分析可以产生特征的稍微不同的排序，特别是关于对于建立决策规则较不重要的那些特征。可用于本发明的预测性特征和它们的相应生物标记的集合可以随着本文提出的那些集合而稍微改变。

MART技术的一个实现在R统计编程环境中的一个模块，或者“包”中发现(见Venables等人，Modern Applied Statistics with S，第四版(Springer，2002)；www.r-project.org)。使用R版本1.7.0和1.7.1计算该文件中的报导的结果。实现MART的模块(Greg Ridgeway编写)被称为“gbm”并且可以免费下载(见www.r-project.org)。该MART算法被修改以适于十倍交叉验证。粒度参数被设置为0.05，gbm包的内部停止规则是基于在每个标记的迭代处忽略20％的数据组。迭代的程度被设为1，因此不考虑这些特征之间的相互作用。Gbm包基于百分数估计每个特征的相对重要性，对于生物标记的所有特征，相对重要性的累积等于100％。具有最高重要性的特征占总重要性的至少90％，该具有最高重要性的特征被报告为可能具有预测值。注意到在拟合每个MART模型中停止规则为模型拟合和特征选择贡献了一个随机组分。因此，基于相同数据运行的多个MART建模运行可以选择稍微不同，或者可能完全不同的特征集合。这些不同的集合传达相同的预测信息；因此，所有集合都可用于本发明。预期给MART模型拟合足够的次数将产生生物标记谱内的预测特征的所有可能的集合。因此，公开的预测值的集合仅代表可用于将个体分类到群体的那些特征的集合。

1.3.4逻辑回归分析

逻辑回归分析提供来自上述LC/MS分析的数据流的另一种方法。通过在给定m/z位置处光谱中出现的峰的高度检测“峰强度”。在给定m/z位置缺少峰导致给该峰强度分配“0”。然后从合并的SIRS和脓毒群体的光谱得到给定m/z位置的峰强度的标准差(SD)。如果SIRS和脓毒群体之间峰强度没有变化(即SD＝0)，那么不进一步考虑峰强度。在回归分析前，使用本领域中熟知的方法检测峰强度。检测算法通常在Hastie等人，如前，11章中描述。

该特征选择方法从时间0生物标记谱鉴定了26个输入参数(即，生物标记)，它们在表6中列出。尽管输入参数以统计学重要性排列，但是仍然可以证明较低级别的输入参数仍然是有临床价值的并且可用于本发明。此外，技术人员将理解，如果参比群体以任何方式改变，那么给定输入参数的排列的重要性可以改变。

                                   表6

                            时间0样品的输入参数

输入参数重要性排序	m/z(Da)	洗脱的％ACN	输入参数重要性排序	m/z(Da)	洗脱的％ACN
						1	883.6	44.84	14	377.0	25.26
2	718.1	44.94	15	194.1	27.07
						3	957.3	44.84	16	413.4	92.04
4	676.1	44.84	17	651.5	59.98
						5	766.0	44.77	18	114.2	34.40
6	416.3	40.10	19	607.5	45.21
						7	429.4	75.80	20	282.3	37.30
8	820.6	44.84	21	156.2	39.99
						9	399.4	90.43	22	127.3	64.68
10	244.2	26.59	23	687.9	41.84
						11	593.5	43.51	24	439.5	43.34
12	300.4	59.54	25	462.4	72.70
						13	285.3	25.88	26	450.4	64.79

使用该相同的逻辑回归分析，可以按照使用在时间-48小时采集的样品预测脓毒的发作中的重要性排列生物标记。该特征选择方法为时间-48小时样品产生了37个输入参数，如表7中所示。

                                       表7

                          来自时间-48小时样品的输入参数

输入参数重要性排序	m/z(Da)	洗脱的％ACN	输入参数重要性排序	m/z(Da)	洗脱的％ACN
						1	162.2	28.57	20	379.3	38.63
2	716.2	46.41	21	423.3	39.04
						3	980	54.52	22	463.4	87.50
4	136.2	24.65	23	965.3	54.15
						5	908.9	57.83	24	265.3	40.10
6	150.2	25.13	25	287.2	40.47
						7	948.7	52.54	26	429.4	83.13
8	298.4	25.52	27	886.9	54.42
						9	293.3	30.45	28	152.2	28.33
10	188.2	30.65	29	431.4	61.34
						11	772.7	47.53	30	335.4	30.72
12	327.4	100.60	31	239.2	43.75
						13	524.5	90.30	32	373.4	61.10
14	205.2	33.28	33	771	24.03
						15	419.4	87.81	34	555.4	41.43
16	804.8	54.86	35	116.2	24.95
						17	496.5	79.18	36	887.2	54.62
18	273.1	29.39	37	511.4	40.95
						19	355.4	95.51

1.4.7Wilcoxon带符号的秩检验分析

在再一个方法中，可以用非参数检验如Wilcoxon带符号的秩检验鉴定单个目标生物标记。生物标记谱中的特征被分配“p值”，其表示生物标记可用于将个体分类为特定参比群体的确定性程度。通常，具有预测价值的p值低于约0.05。具有低p值的生物标记可被自身用于分类个体。备选地，两种或多种生物标记的组合可用于分类个体，其中基于生物标记的相对p值选择组合。通常，对于生物标记的给定组合，优选具有更低p-值的那些生物标记。也可以以这种方式用至少3、4、5、6、10、20、30或更多种生物标记的组合对个体分类。技术人员将明白任一给定生物标记的相对p-值可以根据参比群体的大小而变。

使用Wilcoxon带符号的秩检验，对从在时间0、时间-24小时和时间-48小时采集的生物样品得到的生物标记谱的特征分配p值。这些p值分别在表8、9和10中列出。

                      表8

               时间0小时样品的p值

离子号	m/z(Da)，保留时间(min)	p值
			1	(179.0，10.16)	7.701965e-05
2	(512.4，10.44)	1.112196e-04
			3	(371.3，4.58)	2.957102e-04
4	(592.4，15.69)	3.790754e-04
			5	(363.2，4.40)	4.630887e-04

6	(679.4，5.92)	1.261515e-03
			7	(835.0，7.09)	1.358581e-03
8	(377.2，4.61)	1.641317e-03
			9	(490.3，5.12)	1.959479e-03
10	(265.2，4.72)	3.138371e-03
			11	(627.3，5.75)	3.438053e-03
12	(266.7，14.83)	3.470672e-03
			13	(774.9，7.39)	3.470672e-03
14	(142.2，3.38)	4.410735e-03
			15	(142.0，-0.44)	4.443662e-03
16	(231.0，-0.41)	5.080720e-03
			17	(451.3，4.94)	5.096689e-03
18	(753.8，9.34)	5.097550e-03
			19	(399.2，2.99)	5.217724e-03
20	(534.4，10.53)	5.877221e-03
			21	(978.8，6.72)	6.448607e-03
22	(539.3，5.30)	6.651592e-03
			23	(492.2，1.36)	6.697313e-03
24	(730.4，6.54)	6.724428e-03
			25	(842.6，10.11)	6.724428e-03
26	(622.4，5.61)	7.249023e-03
			27	(331.7，19.61)	8.137318e-03
28	(564.3，14.16)	8.419814e-03
			29	(415.3，4.80)	8.475773e-03
30	(229.2，2.39)	8.604155e-03
			31	(118.2，5.26)	8.664167e-03
32	(410.7，0.77)	8.664167e-03
			33	(733.5，4.55)	9.271924e-03
34	(503.3，5.12)	9.413344e-03
			35	(453.2，2.97)	9.802539e-03
36	(534.3，5.30)	1.089928e-02
			37	(459.3，4.96)	1.100198e-02
38	(337.8，5.51)	1.136183e-02
			39	(525.4，15.11)	1.136183e-02
40	(495.3，18.52)	1.282615e-02
			41	(763.4，19.81)	1.282615e-02
42	(256.2，6.03)	1.286693e-02
			43	(319.1，15.67)	1.286693e-02
44	(548.3，5.24)	1.286693e-02
			45	(858.8，7.79)	1.287945e-02
46	(671.4，5.77)	1.310484e-02
			47	(353.2，7.38)	1.323194e-02

48	(844.1，9.68)	1.333814e-02
			49	(421.2，4.89)	1.365072e-02
50	(506.4，19.65)	1.438363e-02
			51	(393.3，4.58)	1.459411e-02
52	(473.3，5.12)	1.518887e-02
			53	(189.1，2.87)	1.602381e-02
54	(528.1，16.18)	1.603446e-02
			55	(137.2，9.60)	1.706970e-02
56	(163.1，10.98)	1.706970e-02
			57	(176.1，10.29)	1.706970e-02
58	(179.1，6.23)	1.706970e-02
			59	(271.5，5.01)	1.706970e-02
60	(272.2，6.49)	1.706970e-02
			61	(399.3，27.26)	1.706970e-02
62	(467.5，5.95)	1.706970e-02
			63	(478.0，2.36)	1.706970e-02
64	(481.3，26.85)	1.706970e-02
			65	(931.9，6.72)	1.706970e-02
66	(970.5，7.00)	1.706970e-02
			67	(763.2，16.60)	1.730862e-02
68	(544.4，15.56)	1.732997e-02
			69	(666.4，5.77)	1.750379e-02
70	(337.2，9.32)	1.812839e-02
			71	(407.2，1.17)	1.852695e-02
72	(597.2，5.32)	1.895944e-02
			73	(333.1，2.00)	1.930165e-02
74	(490.3，13.78)	1.989224e-02
			75	(139.1，16.05)	2.026959e-02
76	(991.7，16.60)	2.046716e-02
			77	(814.2，6.66)	2.121091e-02
78	(665.4，15.46)	2.127247e-02
			79	(875.9，10.08)	2.127247e-02
80	(144.0，0.25)	2.137456e-02
			81	(622.7，4.14)	2.178625e-02
82	(377.2，12.32)	2.240973e-02
			83	(509.3，5.28)	2.243384e-02
84	(349.2，2.69)	2.252208e-02
			85	(302.0，19.54)	2.266635e-02
86	(411.0，2.20)	2.303751e-02
			87	(296.2，16.48)	2.373348e-02
88	(299.6，15.62)	2.440816e-02
			89	(162.1，0.49)	2.441678e-02

90	(372.0，0.62)	2.472854e-02
			91	(377.2，9.32)	2.514306e-02
92	(979.6，10.14)	2.530689e-02
			93	(417.3，15.61)	2.550843e-02
94	(281.7，19.54)	2.563580e-02
			95	(276.2，5.27)	2.598704e-02
96	(229.2，-0.79)	2.626971e-02
			97	(346.1，7.46)	2.654063e-02
98	(356.2，9.88)	2.654063e-02
			99	(616.4，8.05)	2.683578e-02
100	(850.4，7.65)	2.697931e-02
			101	(495.3，5.12)	2.712924e-02
102	(446.3，4.94)	2.739049e-02
			103	(476.3，1.86)	2.770535e-02
104	(520.4，5.12)	2.774232e-02
			105	(428.3，6.20)	2.808469e-02
106	(536.3，17.97)	2.863714e-02
			107	(860.3，6.94)	2.894386e-02
108	(762.9，16.65)	2.958886e-02
			109	(788.9，6.43)	2.967800e-02
110	(970.1，6.47)	2.967800e-02
			111	(853.8，5.77)	3.039550e-02
112	(913.6，9.50)	3.039550e-02
			113	(407.2，4.72)	3.041346e-02
114	(335.2，16.10)	3.047982e-02
			115	(331.2，12.93)	3.075216e-02
116	(512.3，13.80)	3.075216e-02
			117	(895.8，6.80)	3.084773e-02
118	(120.2，8.37)	3.110972e-02
			119	(238.2，9.32)	3.110972e-02
120	(506.3，8.10)	3.110972e-02
			121	(949.9，6.66)	3.115272e-02
122	(176.1，6.96)	3.161957e-02
			123	(664.9，2.41)	3.275550e-02
124	(551.4，18.56)	3.290912e-02
			125	(459.0，5.98)	3.389516e-02
126	(811.5，7.73)	3.389516e-02
			127	(919.9，10.01)	3.414450e-02
128	(547.4，5.28)	3.444290e-02
			129	(895.4，6.62)	3.460947e-02
130	(132.2，0.79)	3.549773e-02
			131	(944.8，9.65)	3.567313e-02

132	(730.7，6.46)	3.581882e-02
			133	(529.5，16.70)	3.666990e-02
134	(449.3，24.40)	3.687266e-02
			135	(465.3，5.08)	3.725633e-02
136	(481.3，4.96)	3.956117e-02
			137	(250.1，14.23)	3.982131e-02
138	(565.3，16.05)	3.982131e-02
			139	(559.0，15.30)	3.994530e-02
140	(555.3，4.18)	4.078620e-02
			141	(568.4，15.49)	4.118355e-02
142	(120.0，11.52)	4.145499e-02
			143	(120.2，14.91)	4.145499e-02
144	(167.0，5.00)	4.145499e-02
			145	(173.0，19.96)	4.145499e-02
146	(324.9，2.27)	4.145499e-02
			147	(328.8，19.98)	4.145499e-02
148	(345.7，16.95)	4.145499e-02
			149	(407.2，12.07)	4.145499e-02
150	(478.3，3.69)	4.145499e-02
			151	(484.2，8.40)	4.145499e-02
152	(502.2，4.55)	4.145499e-02
			153	(597.4，11.40)	4.145499e-02
154	(612.3，6.40)	4.145499e-02
			155	(700.3，9.40)	4.145499e-02
156	(730.5，11.63)	4.145499e-02
			157	(771.4，6.02)	4.145499e-02
158	(811.9，10.99)	4.145499e-02
			159	(859.9，2.47)	4.145499e-02
160	(450.3，11.99)	4.145499e-02
			161	(619.3，11.42)	4.165835e-02
162	(102.1，6.16)	4.238028e-02
			163	(717.5，9.11)	4.238028e-02
164	(606.0，7.63)	4.317929e-02
			165	(627.2，2.48)	4.317929e-02
166	(252.1，6.62)	4.318649e-02
			167	(657.4，5.53)	4.332436e-02
168	(635.7，7.94)	4.399442e-02
			169	(167.2，14.42)	4.452609e-02
170	(812.5，10.24)	4.528236e-02
			171	(575.4，10.00)	4.533566e-02
172	(379.3，15.55)	4.644328e-02
			173	(468.3，13.44)	4.644328e-02

174	(295.3，16.10)	4.721618e-02
			175	(715.8，7.68)	4.736932e-02
176	(810.6，19.21)	4.759452e-02
			177	(159.1，13.02)	4.795773e-02
178	(435.2，0.83)	4.795773e-02
			179	(443.0，11.99)	4.795773e-02
180	(468.4，19.65)	4.795773e-02
			181	(909.8，9.52)	4.795773e-02
182	(647.2，2.45)	4.838671e-02
			183	(564.4，5.28)	4.958429e-02

表9

               时间24小时样品的p值

离子号	m/z(Da)，保留时间(min)	p值
			1	(265.2，4.72)	0.0003368072
2	(785.5，9.30)	0.0006770673
			3	(685.1，6.85)	0.0010222902
4	(608.4，5.39)	0.0014633974
			5	(141.1，5.13)	0.0018265874
6	(652.5，5.51)	0.0022097623
			7	(228.0，3.12)	0.0029411592
8	(660.1，3.90)	0.0032802432
			9	(235.1，4.04)	0.0038917632
10	(287.1，4.72)	0.0045802571
			11	(141.2，1.46)	0.0049063026
12	(553.3，5.38)	0.0053961549
			13	(114.2，2.49)	0.0060009121
14	(490.3，5.12)	0.0064288387
			15	(142.0，-0.44)	0.0064784467
16	(428.3，6.20)	0.0064784467
			17	(564.4，5.28)	0.0081876219
18	(678.8，2.37)	0.0089256763
			19	(155.1，2.87)	0.0091072246
20	(377.2，4.61)	0.0098626515
			21	(221.0，1.92)	0.0102589726
22	(463.2，1.88)	0.0102589726
			23	(142.2，3.38)	0.0106568532
24	(231.0，-0.41)	0.0106568532
			25	(256.2，6.03)	0.0106568532
26	(597.2，2.05)	0.0106568532
			27	(638.8，2.35)	0.0112041041
28	(800.6，1.53)	0.0112041041
			29	(385.3，24.07)	0.0113535538
30	(578.4，5.46)	0.0114707005
			31	(352.3，11.76)	0.0115864528
32	(858.2，10.41)	0.0115864528
			33	(889.7，16.16)	0.0115864528
34	(190.1，3.99)	0.0120870451
			35	(493.3，26.36)	0.0120870451
36	(608.3，2.35)	0.0122930750
			37	(958.8，6.36)	0.0127655270
38	(235.0，0.51)	0.0128665507
			39	(739.5，9.45)	0.0139994021
40	(525.2，1.92)	0.0141261152
			41	(372.4，11.66)	0.0148592431
42	(415.3，4.80)	0.0154439839

43	(439.2，9.40)	0.0154583510
			44	(819.0，2.11)	0.0156979793
45	(459.3，20.83)	0.0161386158
			46	(372.2，5.10)	0.0169489151
47	(875.4，19.37)	0.0170124705
			48	(989.2，10.14)	0.0184799654
49	(179.0，10.16)	0.0190685234
			50	(231.0，6.41)	0.0191486950
51	(460.9，1.77)	0.0194721634
			52	(813.5，9.83)	0.0194721634
53	(274.2，4.67)	0.0194863889
			54	(158.2，10.93)	0.0203661514
55	(676.7，1.07)	0.0208642732
			56	(171.2，25.87)	0.0213201435
57	(520.4，5.12)	0.0214439678
			58	(523.3，22.32)	0.0216203784
59	(329.0，1.27)	0.0222231947
			60	(585.2，15.27)	0.0222231947
61	(534.3，5.30)	0.0224713144
			62	(349.2，2.69)	0.0234305681
63	(263.2，5.05)	0.0240107773
			64	(278.1，5.24)	0.0240107773
65	(425.9，6.20)	0.0240107773
			66	(575.4，10.00)	0.0240107773
67	(649.3，5.75)	0.0240107773
			68	(152.1，1.51)	0.0244163058
69	(785.1，9.29)	0.0244163058
			70	(509.3，5.28)	0.0257388421
71	(525.4，15.11)	0.0259747750
			72	(261.2，21.02)	0.0259960666
73	(914.1，10.04)	0.0260109531
			74	(465.3，5.08)	0.0260926970
75	(433.3，18.18)	0.0271021410
			76	(300.0，21.90)	0.0275140464
77	(811.6，19.44)	0.0276109304
			78	(710.5，5.90)	0.0295828987
79	(569.2，2.00)	0.0302737381
			80	(388.3，4.58)	0.0308414401
81	(173.1，6.52)	0.0308972074
			82	(266.7，14.83)	0.0308972074
83	(286.2，12.60)	0.0308972074
			84	(619.3，19.04)	0.0308972074
85	(682.6，9.44)	0.0308972074
			86	(717.3，17.96)	0.0308972074
87	(920.6，10.61)	0.0308972074
			88	(988.4，10.46)	0.0308972074
89	(271.1，15.08)	0.0313675727
			90	(740.5，6.02)	0.0316777607

91	(839.6，20.85)	0.0316777607
			92	(610.9，2.44)	0.0329765016
93	(179.1，13.20)	0.0330555292
			94	(701.4，5.63)	0.0330555292
95	(175.1，8.49)	0.0332024906
			96	(279.0，2.32)	0.0337986949
97	(670.4，9.09)	0.0337986949
			98	(415.3，15.42)	0.0338750641
99	(183.1，6.88)	0.0343045905
			100	(160.1，0.50)	0.0344826274
101	(459.3，4.96)	0.0352364197
			102	(305.2，1.87)	0.0353424937
103	(216.2，4.54)	0.0363303150
			104	(603.3，6.48)	0.0363303150
105	(914.1，6.94)	0.0368261384
			106	(205.1，6.75)	0.0368844784
107	(446.3，4.94)	0.0371476565
			108	(513.1，4.48)	0.0380144912
109	(676.0，6.65)	0.0382429645
			110	(366.1，0.86)	0.0383351335
111	(227.9，-0.44)	0.0386073936
			112	(641.4，7.27)	0.0387953825
113	(395.2，24.02)	0.0388820140
			114	(929.6，7.27)	0.0389610390
115	(371.3，4.58)	0.0392271166
			116	(402.2，1.19)	0.0392271166
117	(127.0，4.75)	0.0397364228
			118	(193.0，1.36)	0.0404560651
119	(194.0，1.00)	0.0404560651
			120	(379.3，15.55)	0.0404560651
121	(495.3，12.82)	0.0404560651
			122	(823.4，9.50)	0.0404560651
123	(235.1，8.53)	0.0405335640
			124	(476.4，4.96)	0.0421855472
125	(472.5，11.18)	0.0425955352
			126	(693.1，5.95)	0.0426922311
127	(274.1，7.80)	0.0428211411
			128	(402.2，12.86)	0.0428660082
129	(746.8，2.42)	0.0429101967
			130	(801.0，2.11)	0.0429101967
131	(366.7，5.89)	0.0434178862
			132	(458.4，4.70)	0.0434178862
133	(369.4，26.36)	0.0440035652
			134	(601.0，0.43)	0.0440035652
135	(249.2，6.55)	0.0440434139
			136	(666.4，5.77)	0.0444571249
137	(415.4，12.38)	0.0447164378
			138	(652.1，5.87)	0.0447164378

139	(472.2，11.12)	0.0453906033
			140	(441.4，24.91)	0.0464361698
141	(575.4，20.88)	0.0464361698
			142	(393.3，4.58)	0.0464768588
143	(620.7，0.74)	0.0465716607
			144	(842.9，6.93)	0.0465716607
145	(685.4，17.53)	0.0468826130
			146	(476.3，1.86)	0.0472378721
147	(399.2，2.99)	0.0479645296
			148	(211.1，13.48)	0.0488051357
149	(357.3，9.11)	0.0488051357
			150	(313.2，17.63)	0.0495881957

                     表10

              时间48小时样品的p值

离子号	m/z(Da)，保留时间(min)	p值
			1	(845.2，6.33)	0.001343793
2	(715.8，7.68)	0.002669885
			3	(745.7，6.03)	0.002743002
4	(802.4，8.16)	0.002822379
			5	(648.5，-0.24)	0.003721455
6	(745.3，6.02)	0.005142191
			7	(608.4，5.39)	0.005491954
8	(265.2，4.72)	0.006272684
			9	(505.3，12.78)	0.006518681
10	(371.3，4.58)	0.006931949
			11	(261.2，1.26)	0.008001346
12	(971.4，10.51)	0.008726088
			13	(152.1，1.51)	0.009174244
14	(685.1，6.85)	0.009704974
			15	(456.4，9.80)	0.010451432
16	(214.2，15.68)	0.010792220
			17	(446.0，2.54)	0.010792220
18	(346.1，7.46)	0.011152489
			19	(227.0，23.11)	0.011834116
20	(407.2，1.17)	0.011946593
			21	(435.3，19.92)	0.011946593
22	(451.3，4.94)	0.012261329
			23	(274.1，7.80)	0.012266073
24	(869.0，9.70)	0.012303709
			25	(274.2，4.67)	0.012859736
26	(789.4，6.11)	0.012890139
			27	(576.4，3.29)	0.013087923
28	(930.0，9.75)	0.013087923
			29	(512.4，10.44)	0.014315178

30	(878.9，7.28)	0.014513409
			31	(503.3，5.12)	0.015193810
32	(180.1，4.54)	0.015226001
			33	(209.1，5.03)	0.015254389
34	(616.2，11.90)	0.016782325
			35	(443.3，3.41)	0.017490379
36	(572.6，4.30)	0.017654283
			37	(931.9，6.72)	0.018138469
38	(966.4，10.49)	0.019031437
			39	(541.3，5.12)	0.019316716
40	(470.3，10.72)	0.019821985
			41	(281.3，16.88)	0.020436455
42	(407.2，4.72)	0.021104001
			43	(627.2，2.48)	0.021491454
44	(313.2，6.31)	0.022912878
			45	(173.2，15.68)	0.023189016
46	(675.6，5.75)	0.023820433
			47	(137.2，9.60)	0.023895386
48	(357.2，5.65)	0.023895386
			49	(372.0，0.62)	0.023895386
50	(635.3，2.38)	0.023895386
			51	(743.8，4.55)	0.023895386
52	(185.2，6.29)	0.024742907
			53	(930.4，7.60)	0.024770578
54	(564.4，5.28)	0.024811749
			55	(415.2，9.09)	0.025574438
56	(697.3，16.10)	0.025714289
			57	(657.3，2.49)	0.025825394
58	(996.1，9.94)	0.026026402
			59	(185.0，0.10)	0.027530406
60	(333.1，2.00)	0.027840095
			61	(611.3，6.59)	0.028096875
62	(283.3，18.53)	0.028392609
			63	(506.3，8.10)	0.028392609
64	(726.4，5.67)	0.028392609
			65	(397.3，20.91)	0.029361285
66	(311.9，2.10)	0.029433328
			67	(473.3，8.15)	0.029433328
68	(490.2，8.85)	0.029433328
			69	(493.3，22.99)	0.029433328
70	(577.2，3.56)	0.029433328
			71	(653.7，6.16)	0.029433328
72	(757.5，16.28)	0.029433328
			73	(819.0，2.11)	0.029433328
74	(853.5，13.13)	0.029433328
			75	(889.2，6.42)	0.029433328
76	(929.6，10.60)	0.029433328
			77	(963.3，9.70)	0.029433328

78	(982.1，9.39)	0.029433328
			79	(446.3，4.94)	0.030176399
80	(959.5，10.86)	0.030176399
			81	(169.1，5.03)	0.030177290
82	(906.7，9.75)	0.030212739
			83	(772.1，7.79)	0.030482971
84	(857.0，9.70)	0.030966151
			85	(861.8，9.74)	0.030966151
86	(377.2，1232)	0.031285164
			87	(229.2，-0.79)	0.031539774
88	(229.2，2.39)	0.031539774
			89	(740.4，9.58)	0.031759640
90	(958.3，9.66)	0.031759640
			91	(739.5，18.01)	0.032714845
92	(377.2，4.61)	0.032818612
			93	(144.0，0.25)	0.032941894
94	(459.3，4.96)	0.033735985
			95	(715.8，4.37)	0.034116302
96	(649.0，2.13)	0.034332004
			97	(776.3，6.78)	0.034520017
98	(827.1，9.58)	0.034662245
			99	(439.2，9.40)	0.035385909
100	(376.0，2.11)	0.038036916
			101	(734.6，7.21)	0.038036916
102	(402.2，1.19)	0.038177664
			103	(740.5，6.02)	0.038356830
104	(502.5，4.01)	0.038481929
			105	(694.4，6.02)	0.039047025
106	(331.0，0.74)	0.039943461
			107	(302.1，4.44)	0.040965049
108	(836.1，8.31)	0.041276236
			109	(909.4，9.75)	0.041642229
110	(358.0，2.13)	0.041676687
			111	(502.2，4.55)	0.042049098
112	(302.2，0.79)	0.042062826
			113	(936.9，9.51)	0.042143408
114	(492.2，1.36)	0.042286848
			115	(204.2，5.03)	0.043172669
116	(701.4，5.63)	0.044132315
			117	(373.3，24.05)	0.045041891
118	(657.4，5.53)	0.045102516
			119	(357.3，15.86)	0.045170280
120	(670.9，6.71)	0.045249625
			121	(850.0，7.56)	0.046346695
122	(576.4，16.02)	0.046573286
			123	(670.4，9.09)	0.046609659
124	(578.4，5.46)	0.047297957
			125	(525.3，5.12)	0.047503607

126	(926.0，6.12)	0.047503607
			127	(987.3，9.56)	0.047882538
128	(231.0，-0.41)	0.048437237
			129	(608.3，2.35)	0.048607203
130	(966.7，10.60)	0.048825822

备选地，非参数检验(例如，Wilcoxon带符号的秩检验)可用于基于正向脓毒发展的群体中特征的渐进性出现或者消失发现特征的p值。在该检验形式中，首先检测给定特征的基线值，该检测使用脓毒和SIRS组进入研究(天1样品)时的数据。然后将脓毒和SIRS样品中特征强度与例如，-48小时样品中的特征强度比较以确定该特征强度是否从其基线值增加或者减少了。最后，将p值分配给脓毒群体和SIRS群体中特征强度与基线的不同。当检测p值中与基线的这些不同时得到了下面表11-13中所列的p-值。

                       表11

          与基线不同的特征的p值：时间0样品

离子号	m/z(Da)，保留时间(min)	p值
			1	(991.7，16.6)	0.000225214
2	(592.4，15.69)	0.001008201
			3	(733.5，4.55)	0.001363728
4	(173.1，23.44)	0.001696095
			5	(763.2，16.6)	0.001851633
6	(932.2，6.72)	0.002380877
			7	(842.6，10.11)	0.002575890
8	(295.9，15.78)	0.002799236
			9	(512.4，10.44)	0.004198319
10	(551.4，24.89)	0.005132229
			11	(167.1，10.99)	0.005168091
12	(857.8，8.21)	0.005209485
			13	(763.4，19.81)	0.005541078
14	(931.9，6.72)	0.006142506
			15	(167.2，14.42)	0.006349154
16	(510.4，17.91)	0.006427070
			17	(295.3，16.1)	0.007165849
18	(353.2，7.38)	0.007255100
			19	(653，6.71)	0.007848203

20	(730.4，6.54)	0.008402925
			21	(142，0.44)	0.008578959
22	(331.7，19.61)	0.008807931
			23	(386.3，9.47)	0.009227968
24	(524.4，19.33)	0.010256841
			25	(741.5，23.22)	0.010329009
26	(272.2，6.49)	0.010345274
			27	(448.3，9.24)	0.010666648
28	(713.5，21.99)	0.011150954
			29	(353.3，22.38)	0.011224096
30	(457.2，0.88)	0.011653586
			31	(708.9，0.37)	0.012197946
32	(256.2，6.03)	0.013251532
			33	(721.4，23.49)	0.014040014
34	(496.4，16.6)	0.014612622
			35	(634.9，27.04)	0.015093015
36	(663.3，2.06)	0.015093015
			37	(679.4，5.92)	0.015176669
38	(521.4，23.84)	0.015526731
			39	(358.3，4.4)	0.015795031
40	(409.2，6.95)	0.015875221
			41	(537.3，23)	0.016202704
42	(875.4，19.37)	0.016372468
			43	(875.9，10.08)	0.016391836
44	(265.2，9.37)	0.016924737
			45	(450.3，11.99)	0.017293769
46	(329，1.27)	0.017732659
			47	(534.4，10.53)	0.018580510
48	(616.2，11.9)	0.018703298
			49	(177，0.93)	0.018855039
50	(772.1，16.51)	0.018991142
			51	(424.2，6.12)	0.019195215
52	(277.3，21.72)	0.020633230
			53	(333.2，7.39)	0.020898404
54	(742.8，4.02)	0.021093249
			55	(428.3，6.2)	0.021697014
56	(946，10.49)	0.021935440
			57	(970.5，7)	0.021999796
58	(281.7，19.54)	0.022055564
			59	(568.4，15.49)	0.022208535
60	(700.3，9.4)	0.022500138
			61	(118.2，5.26)	0.022773904
62	(601.3，5.46)	0.023578505
			63	(818.3，7.18)	0.023788872
64	(799.4，9.64)	0.023906673
			65	(244.1，2.22)	0.024125162
66	(145.1，3.99)	0.024385288
			67	(328.8，19.98)	0.024385288

68	(342.4，13.41)	0.025034251
			69	(356.2，5.6)	0.025034251
70	(321.3，19.96)	0.025128604
			71	(523.3，13.8)	0.025164665
72	(504.3，15.49)	0.025894254
			73	(842.3，10.76)	0.026070176
74	(585.3，25.35)	0.026196933
			75	(176.1，10.29)	0.027193290
76	(399.3，27.26)	0.027193290
			77	(761.8，7.89)	0.027193290
78	(909.8，9.52)	0.027193290
			79	(291.2，12.57)	0.029135281
80	(715.8，7.68)	0.030440991
			81	(546.4，19.33)	0.030479818
82	(795.5，20.72)	0.030479818
			83	(321，19.53)	0.030693238
84	(746.8，10.2)	0.030888031
			85	(831.5，20.87)	0.030888031
86	(872.9，11.6)	0.030888031
			87	(598，8.58)	0.031026286
88	(407.2，12.07)	0.031941032
			89	(645.3，13.42)	0.031941032
90	(662.1，8.16)	0.031941032
			91	(179，10.16)	0.032126841
92	(779.5，19.79)	0.032301988
			93	(171.2，25.87)	0.032868402
94	(979.6，10.14)	0.033098647
			95	(245.2，22.24)	0.033117202
96	(370.3，2.3)	0.033696034
			97	(433.3，5.29)	0.033696034
98	(771.4，10.01)	0.033696034
			99	(876.3，9.94)	0.033696034
100	(893，7.09)	0.033919037
			101	(669.2，2.13)	0.034234876
102	(643.3，5.67)	0.034557232
			103	(991.3，9.72)	0.035680492
104	(577.5，16.48)	0.036136938
			105	(820，6.38)	0.036179853
106	(856.6，10.29)	0.036179853
			107	(453.2，6.62)	0.036689053
108	(652.1，5.87)	0.037082670
			109	(944.8，9.65)	0.037337126
110	(494.4，14.75)	0.037526457
			111	(185，11.17)	0.037568360
112	(229.2，0.79)	0.037574432
			113	(245.1，11.44)	0.038031041
114	(279.3，20.72)	0.038253242
			115	(781.5，20.04)	0.038253242

116	(409.4，22.56)	0.038673618
			117	(315.2，14.29)	0.039895232
118	(759.5，9.33)	0.040499878
			119	(995.1，9.94)	0.040516802
120	(848.3，9.66)	0.040554157
			121	(263.3，22.26)	0.041183545
122	(267.7，16.55)	0.041183545
			123	(544.4，15.56)	0.041183545
124	(617.5，17.71)	0.041406719
			125	(411.5，1.06)	0.041454989
126	(597.4，11.4)	0.041454989
			127	(771.4，6.02)	0.041454989
128	(901.9，1.03)	0.041454989
			129	(415.2，9.09)	0.041542794
130	(430.3，9.1)	0.041922297
			131	(414.3，4.29)	0.043298568
132	(414.9，5.86)	0.043427801
			133	(444.2，6)	0.043665836
134	(505.3，12.78)	0.043665836
			135	(231，0.41)	0.043722631
136	(370.3，10.79)	0.044296546
			137	(653.5，19.99)	0.044296546
138	(291.7，15.37)	0.044815129
			139	(531.3，21.48)	0.044870846
140	(715.4，5.89)	0.044985107
			141	(327.3，16.98)	0.045218533
142	(499.4，15.11)	0.046077647
			143	(766.2，15.77)	0.046332971
144	(664.2，11.84)	0.047191074
			145	(567.4，20.79)	0.047549465
146	(809.6，21.33)	0.047600425
			147	(393.3，21.08)	0.048014243
148	(754.6，7.21)	0.048520560
			149	(298.3，24.36)	0.049732041
150	(883.3，6.69)	0.049768492
			151	(468.3，13.44)	0.049813626
152	(665.4，15.46)	0.049918030

                        表12

       与基线不同的特征的p值：时间-24小时样品

离子号	m/z(Da)，保留时间(min)	p值
			1	(875.4，19.37)	0.0006856941
2	(256.2，6.03)	0.0009911606
			3	(228，3.12)	0.0014153532

4	(227.9，0.44)	0.0015547019
			5	(879.8，4.42)	0.0025072593
6	(858.2，10.41)	0.0029384997
			7	(159，2.37)	0.0038991631
8	(186.9，2.44)	0.0045074080
			9	(609.1，1.44)	0.0047227895
10	(996.1，9.94)	0.0058177265
			11	(430.7，4.21)	0.0063024974
12	(141.1，5.13)	0.0068343584
			13	(839.6，20.85)	0.0072422001
14	(956.1，10.62)	0.0080620376
			15	(113.2，0.44)	0.0081626136
16	(428.3，6.2)	0.0081962770
			17	(802.9，0.39)	0.0081962770
18	(819，2.11)	0.0081968739
			19	(366.1，0.86)	0.0084072673
20	(993.5，9.39)	0.0084773116
			21	(919.5，9.63)	0.0098988701
22	(680.6，7.39)	0.0105489986
			23	(523.3，22.32)	0.0105995251
24	(668.3，8.45)	0.0112292667
			25	(463.2，1.88)	0.0113722034
26	(259，11.71)	0.0115252694
			27	(889.7，16.16)	0.0115864528
28	(810.4，7.42)	0.0119405153
			29	(300，21.9)	0.0123871653
30	(141.2，1.46)	0.0124718161
			31	(785.5，9.3)	0.0126735996
32	(660.1，3.9)	0.0131662199
			33	(575.4，10)	0.0133539242
34	(398.2，8.89)	0.0133977345
			35	(678.8，2.37)	0.0134811753
36	(779.5，19.79)	0.0152076628
			37	(190.1，3.99)	0.0153485356
38	(746.8，2.42)	0.0153591871
			39	(407.2，7.81)	0.0154972293
40	(265.2，9.37)	0.0163877868
			41	(447.8，6.29)	0.0163877868
42	(472.5，11.18)	0.0166589145
			43	(951.9，10.21)	0.0169717792
44	(138.2，10.13)	0.0170020893
			45	(739.5，9.45)	0.0171771560
46	(999，7.71)	0.0177981470
			47	(472.2，11.12)	0.0178902225
48	(138.1，1.89)	0.0180631050
			49	(842.9，6.93)	0.0189332371
50	(717.3，17.96)	0.0193107546
			51	(245.2，5.23)	0.0201247940

52	(666.4，9.29)	0.0211733529
			53	(820，6.38)	0.0216512533
54	(991.7，9.21)	0.0219613529
			55	(177，0.93)	0.0223857280
56	(488.3，9.68)	0.0224061094
			57	(119.1，9.19)	0.0224206599
58	(278.1，5.24)	0.0240107773
			59	(409.2，6.95)	0.0256235918
60	(369.2，3.37)	0.0259379108
			61	(482.4，19.26)	0.0261591305
62	(806.6，21.29)	0.0269790713
			63	(637.9，7.43)	0.0273533420
64	(373.3，11.45)	0.0277220597
			65	(264.2，8.83)	0.0282234106
66	(909.7，6.36)	0.0282234106
			67	(747.4，9.38)	0.0287012166
68	(832.9，6.21)	0.0289271134
			69	(155.1，2.87)	0.0289347031
70	(977.7，9.56)	0.0298654782
			71	(610.9，2.44)	0.0303741714
72	(235.1，4.04)	0.0303830303
			73	(685.1，6.85)	0.0303830303
74	(670.4，9.09)	0.0307328580
			75	(346.1，12.11)	0.0308972074
76	(217.2，8.66)	0.0309517132
			77	(770.9，16.6)	0.0310937661
78	(163.2，6.31)	0.0313614024
			79	(392.3，10)	0.0317350792
80	(469.7，5.98)	0.0317350792
			81	(470，6.32)	0.0317350792
82	(794.9，9.76)	0.0317350792
			83	(357.3，18.91)	0.0318983292
84	(303.7，15.73)	0.0325397156
			85	(221，1.92)	0.0328080364
86	(999.5，7.28)	0.0330940901
			87	(637.3，18.59)	0.0335078063
88	(331，0.74)	0.0336148466
			89	(978.8，6.72)	0.0338444022
90	(271.1，15.08)	0.0347235687
			91	(801，2.11)	0.0348606916
92	(599.5，21.95)	0.0358839090
			93	(769.4，10.46)	0.0371510791
94	(914.1，6.94)	0.0375945952
			95	(363，26.16)	0.0381998666
96	(235.1，8.53)	0.0382752828
			97	(273.2，6.31)	0.0390486612
98	(250.1，14.23)	0.0401201887
			99	(585.2，15.27)	0.0406073368

100	(276.2，5.27)	0.0414046782
			101	(183.1，6.88)	0.0419461253
102	(430.3，9.1)	0.0421855472
			103	(229.2，0.79)	0.0424445226
104	(811.6，19.44)	0.0438285232
			105	(126.2，4.02)	0.0439140255
106	(708.5，15.79)	0.0439143789
			107	(127，4.75)	0.0442108301
108	(338.2，7.89)	0.0444291108
			109	(391.3，14.55)	0.0444291108
110	(714.6，14.02)	0.0444291108
			111	(665.3，9.58)	0.0446481623
112	(875.7，19.83)	0.0446481623
			113	(676，6.65)	0.0447614386
114	(695.1，2.71)	0.0448433123
			115	(480.2，8.03)	0.0451624233
116	(754.6，7.21)	0.0454753333
			117	(494.9，19.41)	0.0454916992
118	(785.1，9.29)	0.0455064285
			119	(265.2，4.72)	0.0456621220
120	(771.9，24.52)	0.0460254955
			121	(467.2，8.55)	0.0464130076
122	(869.9，10.55)	0.0464539626
			123	(479.3，24.87)	0.0473472790
124	(380.3，24.05)	0.0475242732
			125	(194.1，6.48)	0.0475341652
126	(262.6，5.7)	0.0475341652
			127	(694.2，11.76)	0.0475341652
128	(695.9，4.32)	0.0475341652
			129	(660.8，2.32)	0.0475865516
130	(958.8，6.36)	0.0482703924
			131	(504.3，15.49)	0.0484159645

                     表13

     与基线不同的特征的p值：时间-48小时样品

离子号	m/z(Da)，保留时间(min)	p值
			1	(715.8，7.68)	0.0005303918
2	(919.5，9.63)	0.0012509535
			3	(802.4，8.16)	0.0016318638
4	(922.5，7.27)	0.0023943584
			5	(741.5，23.22)	0.0038457139
6	(875.4，19.37)	0.0044466656
			7	(878.9，7.28)	0.0052374088
8	(996.1，9.94)	0.0060309508

9	(295.9，15.78)	0.0070608315
			10	(521.4，23.84)	0.0075730074
11	(676，6.65)	0.0075742521
			12	(703.9，4.35)	0.0075743621
13	(716.2，6.62)	0.0078671775
			14	(346.1，7.46)	0.0080100576
15	(551.4，24.89)	0.0086803932
			16	(415.2，9.09)	0.0088869428
17	(182.1，2.44)	0.0114906565
			18	(310.3，19.13)	0.0121106698
19	(428.3，6.2)	0.0124220037
			20	(908.6，10.83)	0.0127529218
21	(715.8，4.37)	0.0129735339
			22	(444.3，2.8)	0.0135088012
23	(753.3，9.34)	0.0140485313
			24	(779.5，19.79)	0.0149169860
25	(211.1，13.48)	0.0149614082
			26	(285.2，19.8)	0.0155513781
27	(441.4，19.09)	0.0169697745
			28	(483.3，6.17)	0.0171647510
29	(488.3，6.38)	0.0172240677
			30	(616.2，11.9)	0.0176526391
31	(861.8，9.74)	0.0185440613
			32	(485.3，23.17)	0.0186867970
33	(435.1，4.14)	0.0193706655
			34	(612.3，16.87)	0.0193706655
35	(362.3，5.65)	0.0194196263
			36	(227，23.11)	0.0204130271
37	(883.2，9.76)	0.0204386696
			38	(229.2，0.79)	0.0205101165
39	(643.3，5.67)	0.0210117164
			40	(980.6，7.44)	0.0215182605
41	(795.5，20.72)	0.0218437599
			42	(577.2，3.56)	0.0224776501
43	(152.1，1.51)	0.0233549892
			44	(525.4，15.11)	0.0234730657
45	(435.3，19.92)	0.0235646539
			46	(299.2，25.54)	0.0237259148
47	(612.9，0.36)	0.0245420186
			48	(505.3，12.78)	0.0245629232
49	(986.7，7.42)	0.0248142595
			50	(719.2，6.07)	0.0252229441
51	(562.3，19.13)	0.0252471150
			52	(552.4，22.8)	0.0254361708
53	(353.2，19.3)	0.0266840298
			54	(575.4，16.74)	0.0275127383
55	(845.2，6.33)	0.0291304640
			56	(633.7，6.14)	0.0301224895

57	(519.3，13.32)	0.0301986537
			58	(205.1，13.28)	0.0306513410
59	(317.9，1.41)	0.0306513410
			60	(388.3，9.86)	0.0306513410
61	(471.3，26.3)	0.0306513410
			62	(723.2，6.69)	0.0320817369
63	(912.5，10.13)	0.0320817369
			64	(965.2，2.77)	0.0320817369
65	(718.9，5.76)	0.0322905214
			66	(363，26.16)	0.0330856794
67	(897.1，9.53)	0.0331382847
			68	(227.3，6.92)	0.0332507087
69	(778.2，14.75)	0.0335555992
			70	(321，2.35)	0.0337995708
71	(447.8，6.29)	0.0343295019
			72	(536.1，4.09)	0.0343295019
73	(653.5，19.99)	0.0343565954
			74	(667.4，21.32)	0.0343565954
75	(982.7，9.73)	0.0352875093
			76	(789.4，6.11)	0.0364395580
77	(505.3，18.48)	0.0369258233
			78	(277，0.2)	0.0369277075
79	(285.3，12.09)	0.0382728484
			80	(739.5，18.01)	0.0382728484
81	(838.9，0.39)	0.0382728484
			82	(400.2，5.79)	0.0384511838
83	(883.6，7.04)	0.0384732436
			84	(604.3，19.85)	0.0411740329
85	(287.1，4.72)	0.0412206143
			86	(549.9，4.23)	0.0415068077
87	(879.8，4.42)	0.0415426686
			88	(721.7，20.36)	0.0417134604
89	(711.4，16.81)	0.0417360498
			90	(982.1，9.39)	0.0419790105
91	(971.4，10.51)	0.0432043627
			92	(112.7，1.05)	0.0452851799
93	(503.3，14.33)	0.0453240047
			94	(173.1，23.44)	0.0466828436
95	(283.1，4.96)	0.0466865226
			96	(637.4，6.78)	0.0467959828
97	(597.4，15.92)	0.0471002889
			98	(813.5，9.83)	0.0480402523
99	(444.2，6)	0.0486844297
			100	(448.3，9.24)	0.0486916088
101	(502.5，4.01)	0.0493775335
			102	(854.2，5.79)	0.0493775335

实施例2：使用定量液相层析-质谱/质谱(LC-MS/MS)鉴定蛋白生物标记

2.1接受和分析的样品

如上面，从由15名患者组成的第一个群体(“SIRS组”)和由患SIRS并且发展到脓毒的15名患者组成的第二个群体(“脓毒组”)得到参比生物标记谱。在天1、时间0、时间-48小时从患者抽血。在该情况中，将来自患者的50-75μL血浆样品合并成四批：两批分别由5和10名个体组成，这些个体都是SIRS阳性，两批由5和10名个体组成，这些个体都是脓毒阳性。进一步分析来自每个合并的批的6个样品。

2.2样品制备

首先将血浆样品免疫耗竭以除去过多的蛋白，特别是白蛋白、转铁蛋白、触珠蛋白、抗-胰蛋白酶、IgG、和IgA，它们一起组成样品中蛋白质的约85％(wt％)。用Multiple Affinity Removal System柱(Agilent Technologies，Palo Alto，California)实施免疫耗竭，根据生产商的说明使用该柱子。使用该系统从血浆样品除去上述6种蛋白质的至少95％。例如，仅约0.1％的白蛋白保留在耗竭的样品中。并且估计样品中所剩的仅约8％代表剩余的高丰度蛋白，如IgM和α-2巨球蛋白。然后使用本领域中公知的方法将分级分离的血浆样品变性、还原、烷基化并用胰蛋白酶消化。从每个合并的样品得到约2mg消化的蛋白。

2.3多维LC/MS

然后将胰蛋白酶消化后的肽混合物用LC柱分级分离并通过以LC/MS/MS排列配置的Agilent MSD/阱ESI-离子阱质谱进行分析。将1mg消化蛋白以10μL/分钟应用于微流C₁₈反相(RP1)柱。RP1柱串联偶联到强阳离子交换(SCX)分级分离柱，该柱子又反过来连接到C₁₈反相捕获柱。样品以0-10％ACN的第一个梯度应用于RP1柱以在RP1柱上分级分离肽。ACN梯度后接着是10mM盐缓冲液洗脱，其将肽进一步分级分离成结合到SCX柱的部分和固定在捕获柱的洗脱级分。然后将捕获柱从其与SCX柱的可操作的连接除去并与另一C18反相柱(RP2)可操作连接。用0-10％ACN以300nL/分钟将捕获柱中固定的级分从该捕获柱洗脱到RP2柱上。该RP柱可操作地连接到AgilentMSD/trap ESI离子阱质谱仪，该质谱仪以1000-1500V的喷雾电压运行。使用总ACN％3从0-80％和高达1M的盐浓度重复该循环(PR1-SCX-Trap-RP2)以分级分离并分开剩余的肽。LC/MS/MS的其他适宜的配置可用于产生可用于本发明的生物标记谱。产生的质谱的m/z范围为200-2200Da。应用依赖数据的扫描和动态排除以实现更高的动态范围。图6显示了用LC/MS和LC/MS/MS产生的代表性生物标记谱。

2.4数据分析和结果

对于以MS/MS模式分析的每种样品，得到约150,000种光谱，相当于约1.5千兆字节信息。共收集了约50千兆字节信息。用SpectrumMill v 2.7软件(Copyright 2003 Agilent Technologies，Inc.)分析光谱。用MS-Tag数据库搜寻算法(Millennium Pharmaceuticals)针对国家生物技术信息中心(NCBI)人非冗余蛋白的数据库匹配MS/MS光谱。用相当于95％置信度的截断得分证实所匹配的肽，然后将所述肽装配以鉴定样品中存在的蛋白。用本发明方法可检测的蛋白质以～1ng/mL的浓度存在于血浆中，覆盖血浆浓度的动态范围为约6个数量级。

通过确定对蛋白“阳性”的质谱数得到血浆中所检测到的蛋白质丰度的半定量估计。为了为正，离子特征的强度可检测地高于光谱中给定m/z值处的噪声。通常，在血浆中以较高水平表达的蛋白质作为正离子特征或者更多光谱中的一组离子特征将是可检测地。通过该蛋白质浓度的量度，很明显在SIRS组对脓毒组中多种蛋白质差别表达。在图7A和7B中显示了被“上调”的多种可检测的蛋白，其中被上调的蛋白在脓毒组中比在SIRS组以更高水平表达。从图7A可清楚地看出蛋白质随时间表达的水平可以以和离子#21(437.2Da，1.42min)相同的方式变化，离子#21在图4中显示。例如，具有GenBank登录号AAH15642和NP_000286的蛋白质在结构上都与丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂相似，两者都在脓毒阳性群体中随时间以渐增的水平表达，而它们在SIRS-阳性群体中以相对恒定的量表达。随时间在个体中出现高水平的这些蛋白，尤其这些蛋白的不断升高的表达，被预期是脓毒发作的预测者。在图8A和8B中显示了随时间在脓毒阳性群体中被下调的多种蛋白。这些蛋白的某些，像具有GenBank登录号NP_079216中所示序列的未命名的蛋白质的表达在SIRS患者中似乎渐增或者保持在相对高的水平，而在脓毒患者中该表达减小。预期这些蛋白质将是尤其可用于诊断SIRS，以及预测脓毒发作的生物标记。

现在参考某些代表性实施方案和细节完全描述了本发明，对本领域中技术人员显而易见的是，可以对这些本发明进行更改和修饰而不背离本文中提出的本发明的精神或范围。

Claims (64)

1.确定个体中脓毒状态的方法，该方法包括：

(a)从自该个体得到的第一生物样品得到第一生物标记谱；和

(b)将所述个体的第一生物标记谱与从参比群体得到的参比生物标记谱比较；

其中一次这种比较就能够将该个体归为属于或者不属于该参比群体；其中所述个体的第一生物标记谱和所述参比生物标记谱含有至少一种低分子量化合物的可检测的方面，所述至少一种低分子量化合物的质量-电荷比为约100道尔顿到约1000道尔顿；并且其中该比较确定该个体中的脓毒状态。

2.确定个体中脓毒状态的方法，该方法包括：

(a)从在单个时间点从该个体得到的生物样品得到第一生物标记谱；和

(b)将所述个体的第一生物标记谱与从参比群体得到的参比生物标记谱比较；

其中所述个体的第一生物标记谱和所述参比生物标记谱含有至少一种低分子量化合物的可检测的方面，所述至少一种低分子量化合物的质量-电荷比为约100道尔顿到约1000道尔顿；并且其中该生物标记谱的比较以至少约60％的准确度确定该个体中的脓毒状态。

3.确定个体中脓毒状态的方法，该方法包括将(i)从在单个时间点从该个体得到的第一生物样品产生的第一生物标记谱与(ii)从参比群体产生的生物标记谱比较，其中所述个体的第一生物标记谱和所述参比生物标记谱含有至少一种低分子量化合物的可检测的方面，所述至少一种低分子量化合物的质量-电荷比为约100道尔顿到约1000道尔顿，并且其中该比较包括应用决策规则，该决策规则确定该个体中的脓毒状态。

4.确定个体中脓毒状态的方法，该方法包括：

(a)从自该个体得到的第一生物样品得到第一生物标记谱；和

(b)将所述个体的第一生物标记谱与从参比群体的生物样品得到的参比生物标记谱比较；

其中参比群体选自正常参比群体、SIRS-阳性参比群体、受感染的/SIRS-阴性参比群体、脓毒阳性参比群体、处于脓毒发展阶段的参比群体、通过常规技术在约0-36小时后证实患有脓毒的SIRS-阳性参比群体、通过常规技术在约36-60小时后证实患有脓毒的SIRS-阳性参比群体、通过常规技术在约60-84小时后证实患有脓毒的SIRS-阳性参比群体；其中一次这种比较就能够将该个体归为属于或者不属于该参比群体；其中所述个体的第一生物标记谱和所述参比生物标记谱含有至少一种低分子量化合物的可检测的方面，所述至少一种低分子量化合物的质量-电荷比为约100道尔顿到约1000道尔顿；并且其中该比较确定该个体中的脓毒状态。

5.确定个体中脓毒状态的方法，该方法包括将(i)从自该个体得到的第一生物样品产生的第一生物标记谱与(ii)从参比群体的生物样品得到的生物标记谱之间的至少一种生物标记的可检测特征相比较，其中该比较将该个体归为属于或者不属于该参比群体，其中所述个体的第一生物标记谱和所述参比生物标记谱含有至少一种低分子量化合物的可检测的方面，所述至少一种低分子量化合物的质量-电荷比为约100道尔顿到约1000道尔顿，并且其中该比较确定该个体中的脓毒状态。

6.确定个体中脓毒状态的方法，该方法包括：

(a)从来自该个体的第一生物样品产生的第一生物标记谱中的一组生物标记中选择至少两种特征；和

(b)将该特征与从来自参比群体的生物样品产生的参比生物标记谱中的一组相同生物标记相比较，

其中一次这样的比较能够以至少约60％的准确度将该个体归为属于或者不属于该参比群体；其中所述个体的第一生物标记谱和所述参比生物标记谱含有至少一种低分子量化合物的可检测的方面，所述至少一种低分子量化合物的质量-电荷比为约100道尔顿到约1000道尔顿；并且其中该比较确定该个体中的脓毒状态。

7.确定个体中脓毒状态的方法，该方法包括：

(a)确定在从来自该个体的第一生物样品得到的第一生物标记谱中至少两种生物标记的丰度或者丰度的变化；和

(b)将该个体的第一生物标记谱中该至少两种生物标记的丰度或者丰度的变化与来自参比群体生物样品的参比生物标记谱中这些生物标记的丰度或者丰度的变化相比较，

其中该比较能够将该个体归为属于或者不属于该参比群体；其中所述个体的第一生物标记谱和所述参比生物标记谱中的所述生物标记具有的质量-电荷比为约100道尔顿到约1000道尔顿；并且其中该比较确定该个体中的脓毒状态。

8.确定个体中脓毒状态的方法，该方法包括与来自(i)患脓毒的SIRS-阳性参比群体和(ii)不患脓毒的SIRS-阳性参比群体的生物样品的至少一种生物标记的丰度或者丰度变化相比较，确定从来自该个体的第一生物样品得到的第一生物标记谱中至少一种生物标记的丰度或者丰度变化，其中生物标记选自表2-13的任一表中所列的生物标记。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中生物样品选自血液、唾液、血清、血浆、尿、脑脊液、细胞、细胞提取物、组织样品、粪便、和组织活检。

10.权利要求1-8任一项的方法，其还包括重复该方法至少一次，其中从每次该方法重复时采集的分离的生物样品得到该个体的生物标记谱。

11.权利要求10的方法，其中来自该个体的生物样品采集的时间相隔约24小时。

12.权利要求1-8任一项的方法，其中确定个体中脓毒的状态包括预测该个体中脓毒的发作。

13.权利要求12的方法，其中在使用常规技术确定个体中脓毒前至少约24小时预测脓毒的发作。

14.权利要求12的方法，其中在使用常规技术确定个体中脓毒前至少约48小时预测脓毒的发作。

15.权利要求12的方法，其中在使用常规技术确定个体中脓毒前至少约96小时预测脓毒的发作。

16.权利要求1-8任一项的方法，其中确定个体中脓毒的状态包括确定该个体中脓毒的发展。

17.权利要求1-8任一项的方法，其中确定个体中脓毒的状态包括诊断该个体中的脓毒。

18.权利要求1-2和4-8任一项的方法，其中该比较包括应用决策规则。

19.权利要求18的方法，其中应用决策规则包括使用数据分析算法。

20.权利要求19的方法，其中数据分析算法包括使用分类树。

21.权利要求19的方法，其中数据分析算法是非参数的。

22.权利要求21的方法，其中数据分析算法检测特征值分布中的差异。

23.权利要求22的方法，其中非参数算法包括使用Wilcoxon带符号的秩检验。

24.权利要求19的方法，其中数据分析算法包括使用多重累加回归树。

25.权利要求19的方法，其中数据分析算法是逻辑回归。

26.权利要求19的方法，其中数据分析算法包括至少两个输入参数。

27.权利要求26的方法，其中数据分析算法包括至少五个输入参数。

28.权利要求27的方法，其中数据分析算法包括至少十个输入参数。

29.权利要求28的方法，其中数据分析算法包括至少20个输入参数。

30.权利要求19的方法，其中数据分析算法使用表2-13之一中所列的至少两种特征作为输入参数。

31.权利要求18的方法，其中决策规则以至少约60％的准确度确定个体中脓毒的状态。

32.权利要求31的方法，其中决策规则以至少约70％的准确度确定个体中脓毒的状态。

33.权利要求32的方法，其中决策规则以至少约80％的准确度确定个体中脓毒的状态。

34.权利要求33的方法，其中决策规则以至少约90％的准确度确定个体中脓毒的状态。

35.权利要求31的方法，其中在使用常规技术确定该个体患有脓毒的临床怀疑前至少约48小时确定该个体中脓毒的状态。

36.权利要求31的方法，其中决策规则受到十倍交叉验证。

37.权利要求1-8任一项的方法，其中参比生物标记谱从含有单个个体的群体得到。

38.权利要求1-8任一项的方法，其中参比生物标记谱从含有至少两个个体的群体得到。

39.权利要求38的方法，其中从含有至少20个个体的群体得到参比生物标记谱。

40.权利要求1-3和5-8任一项的方法，其中参比生物标记谱从选自正常参比群体、SIRS-阳性参比群体、受感染的/SIRS-阴性参比群体、脓毒阳性参比群体、处于脓毒发展阶段的参比群体、通过常规技术在约0-36小时后证实患有脓毒的SIRS-阳性参比群体、通过常规技术在约36-60小时后证实患有脓毒的SIRS-阳性参比群体、通过常规技术在约60-84小时后证实患有脓毒的SIRS-阳性参比群体的群体得到。

41.权利要求1-8任一项的方法，其还包括将来自个体的第二生物标记谱与参比生物标记谱比较，其中该第二生物标记谱从采自该个体的第二生物样品得到。

42.权利要求41的方法，其中在从该个体采集第一生物样品后约24小时采集该第二生物样品。

43.权利要求41的方法，其中将第二生物标记谱与不同于第一生物标记谱的参比生物标记谱比较。

44.权利要求1-8任一项的方法，其中所述至少一种低分子量化合物包含至少一种多肽。

45.权利要求44的方法，其中至少一种多肽存在于血浆。

46.权利要求1-8任一项的方法，其中所述至少一种低分子量化合物选自质量-电荷比(m/z)为约100道尔顿到约1000道尔顿的离子，其中通过电喷雾电离质谱以阳性模式检测所述离子。

47.权利要求1-8任一项的方法，其中所述至少一种低分子量化合物是选自表2-13任一个中所列出的离子组的离子。

48.权利要求1-8任一项的方法，其中在所述得到所述个体的第一生物标记谱之前将所述生物样品分级分离。

49.权利要求1-8任一项的方法，其中至少一种分离方法被用于得到所述个体的第一生物标记谱。

50.权利要求49的方法，其中至少两种分离方法被用于得到所述个体的第一生物标记谱。

51.权利要求50的方法，其中所述至少两种分离方法包括质谱。

52.权利要求51的方法，其中所述质谱选自电喷雾电离质谱(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)ⁿ、基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、表面增强的激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、硅上解吸/电离(DIOS)、二级离子质谱(SIMS)、四极飞行时间(Q-TOF)、大气压化学电离质谱(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS)ⁿ、大气压光电离质谱(APPI-MS)、APPI-MS/MS，和APPI-(MS)ⁿ、四极质谱、傅立叶变换质谱(FTMS)和离子阱质谱，其中n是大于0的整数。

53.权利要求50的方法，其中所述至少两种分离方法包括选自化学萃取分配、离子交换层析、反相液体层析、等电聚焦、一维聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)、薄层层析、气相层析、液相层析，和它们的任一组合的至少一种方法。

54.权利要求49的方法，其中所述至少一种分离方法是LC/MS。

55.权利要求54的方法，其还包括分级分离所述生物样品。

56.权利要求55的方法，其中所述分离分级包括用冰冷的甲醇提取所述生物样品。

57.权利要求56的方法，其中所述提取包括(i)加入所述冰冷的甲醇以形成甲醇的最终体积百分比约67％的混合物，(ii)将该混合物在4℃孵育20分钟，(iii)通过以12,000rpm离心10分钟沉淀蛋白质，和(iv)除去上清液以得到所述个体的第一生物标记谱。

58.预测个体中脓毒发作的方法，该方法包括：

(a)检测生物标记谱中的至少两种特征的一个方面，其中该生物标记谱含有选自表2-13之一中所列的生物标记组的至少两种生物标记；和

(b)将所述至少两种特征的所检测的方面与参比群体中相同的至少两种特征的相应方面的值比较，

其中一次这种比较就能够将该个体归为属于或者不属于该参比群体，并且其中该比较预测该个体中脓毒的发作。

59.权利要求58的方法，其中所述脓毒发作的预测在脓毒发作前约12-36小时作出，其中脓毒的发作通过常规技术确定。

60.权利要求58的方法，其中所述脓毒发作的预测在脓毒发作前约36-60小时作出，其中脓毒的发作通过常规技术确定。

61.权利要求58的方法，其中所述脓毒发作的预测在脓毒发作前约60-84小时作出，其中脓毒的发作通过常规技术确定。

62.诊断个体中SIRS的方法，该方法包括：

(a)从自该个体得到的第一生物样品得到第一生物标记谱；和

(b)将所述个体的第一生物标记谱与从参比群体得到的参比生物标记谱比较，

其中一次这种比较就能够将该个体归为属于或者不属于该参比群体；其中所述个体的第一生物标记谱和所述参比生物标记谱含有至少一种低分子量化合物的可检测的方面，所述至少一种低分子量化合物的质量-电荷比为约100道尔顿到约1000道尔顿；并且其中该比较诊断该个体中的SIRS。

63.诊断个体中SIRS的方法，该方法包括：

(a)从在单个时间点从该个体得到的生物样品得到生物标记谱；和

(b)将所述个体的生物标记谱与参比生物标记谱比较，

其中所述个体的生物标记谱和所述参比生物标记谱含有至少一种低分子量化合物的可检测的方面，所述至少一种低分子量化合物的质量-电荷比为约100道尔顿到约1000道尔顿；并且其中生物标记谱的比较可以至少约60％的准确度诊断个体中的SIRS。

64.诊断个体中SIRS的方法，该方法包括：将(i)在单个时间点从该个体采集的第一生物样品产生的第一生物标记谱与(ii)从参比群体产生的参比生物标记谱比较，其中所述个体的第一生物标记谱和所述参比生物标记谱含有至少一种低分子量化合物的可检测的方面，所述至少一种低分子量化合物的质量-电荷比为约100道尔顿到约1000道尔顿；并且其中该比较包括应用决策规则，该决策规则诊断该个体中的SIRS。

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