JP2024514404A - 高リスク敗血症患者のための予後経路 - Google Patents

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Abstract

本発明は、敗血症、及び敗血症に罹患しているか、又は敗血症を発症するリスクがある対象の防止及び処置において有用な化合物に関する。本発明は特に、ＡＲ細胞シグナリング経路活性を阻害する化合物、又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を阻害する化合物に関する。本発明はさらに、敗血症を発症するリスクがある、又は敗血症に罹患している対象の血液試料中のＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を測定する方法、並びにＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性がある特定の閾値を超えている場合にＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤を投与する方法に関する。

Description

本発明は、敗血症、及び敗血症に罹患している、若しくは敗血症を発症するリスクがある対象の防止及び処置、又は免疫系の免疫抑制状態の防止において有用な化合物に関する。本発明は特に、ＡＲ細胞シグナリング経路活性を阻害する化合物、及び／又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を阻害する化合物に関する。本発明はさらに、敗血症を発症するリスクがある、又は敗血症に罹患している対象の血液試料中のＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を測定する方法、並びにＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性がある特定の閾値を超えている場合にＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤を投与する方法に関する。
敗血症は、近年、臓器機能不全を伴う感染と再定義されている（１０）。敗血症は、感染に対する脱調節された免疫応答である。敗血症は、一般に、細菌が血流中で増幅する重症細菌感染の合併症である。この状態は、完全には理解されていないメカニズムによって、急速輸液に不応性である血圧低下及び高乳酸塩血症を伴う敗血性ショック、進行性臓器不全及び結果として、死亡をもたらし得る全身炎症応答を特徴とする。敗血症に由来する死亡率は、重症敗血症については２５％～３０％、敗血性ショックについては４０％～７０％の範囲である。敗血症の臨床所見は、病因、すなわち、基礎となる疾患又は状態に応じて非常に可変的である。最も一般的な細菌感染源は、呼吸器、泌尿生殖器、及び消化器系、並びに皮膚及び軟部組織である。臨床所見は可変的であるが、極端な震えを伴う発熱及び頻脈が、敗血症の最初の臨床症状であることが多く、肺炎及び泌尿生殖器感染が、敗血症をもたらす最も一般的な原因である。具体的な処置は主に、血液循環を維持し、低酸素症を防止するための標準的な手段に加えて、感染を処置するための抗生物質を与えることからなる。しかしながら、細菌感染源は未知であることが多く、したがって、原因となる細菌及び抗生物質に対するその感度／耐性に関する情報が、血液培養物から利用可能となるまで、適切な抗生物質処置は経験に基づく推測である。この情報は、細菌種が投与された抗生物質に耐性になる場合に治療の調整を可能にする。しかしながら、血液培養には長くかかり（２４～４８時間）、感染を有する全ての患者の約３０％において陽性になるが、細菌性敗血症を有する患者については、有効な抗生物質を投与するのが遅れるたびに、死亡の相対リスクが増大する。
これらの理由から、多くの患者が敗血性ショックに進行し、この疾患に関する非常に高い死亡率をもたらす。抗生物質の他に、敗血性ショックの対象の処置は一般に、静脈内液体投与及び昇圧剤治療からなる。多くのさらなる処置、例えば、コルチコステロイドが、炎症性敗血性ショック状態を逆転させるために試されてきたが、いずれも臨床利益は証明されていない。しかしながら、それらが今までのところまだ同定できない患者のサブセットに恩恵を与えるかもしれないことは排除できない（１０）。
その理由の１つは、どの細胞メカニズムが敗血性ショックへの移行及び臓器損傷の原因となるかが明確ではないということである。敗血症の病態生理に関する知識は、合理的な様式で敗血症を防止及び処置するための新規薬物標的を提供することが期待される。
内臓の血液循環を維持するための抗生物質及び支援的手段は別として、処置が有効であると証明されていないが、一部の処置は、今までのところ同定できない患者のサブセットに恩恵を与えるかもしれないことは排除できない（１０）。有効な処置を開発するのに失敗する１つの理由は、敗血症患者間の不均質性、すなわち、基礎となる医学的状態の変化及び薬物の使用、並びに個々の患者における免疫応答に影響する遺伝的変化である。
あらゆるものに対する有効な薬物を開発するのに失敗する理由の１つは、おそらく、敗血症の原因となり得る多数の原因及び状態並びにその進行に影響するが、同時に、薬物に対する応答又は耐性を決定付けるさらにより多数の既知及び未知の因子の結果もたらされる、患者間の不均質性である（例えば、細菌種の型、遺伝学、同時に存在する他の疾患など）。
敗血症を有する患者における機能的免疫応答の詳細な評価は、新規な一般的処置アプローチ及び個別化医療アプローチを可能にし、処置の有効性を改善する。免疫機能の診断評価は現在、免疫細胞数及び炎症マーカー（例えば、Ｃ反応性タンパク質）などの日常的な血液測定値に限られているが、敗血症患者における異常な免疫応答の原因となる、様々な型の免疫細胞の機能的活性状態に関する情報を提供しない。
微生物に対する一連の炎症応答は、より古い順に、敗血症、重症敗血症、及び敗血性ショックを置き換えて、現在、感染、敗血症、及び敗血性ショックと分類されている。さらに、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）は、（証明された）感染の非存在下での、４つの基準：発熱、頻脈、多呼吸、及び白血球増加又は白血球減少のうちの２つの存在によって定義される状態であった；より最近では、この診断は、感度及び特異度の欠如のため、放棄されている。
敗血症関連死のリスクが高い、病院における敗血症患者を同定するために使用される臨床基準は、（１）精神状態の変化；（２）１００ｍｍＨｇ未満の収縮期血圧、及び毎分２２回を超える呼吸数である。これらの基準の使用は、高リスク患者の同定の改善を可能にするが、低リスクの患者を同定することはできない。
敗血症に由来する死亡を低減させるための合理的に最良の手段は、敗血症を発症するリスクがある患者をできるだけ早く認識することである。次いで、そのような高リスク患者は、より集中的なモニタリング（例えば、ＩＣＵでの）、感染病巣の同定及び除去（例えば、留置カテーテル）、より頻繁な細菌培養の実施、予防的抗生物質の投与、並びに免疫抑制因子の除去のために階層化できる。
導尿カテーテル、開放創又はドレーンを有する創傷、血管内ラインなどは全て、ある程度の細菌定着とほぼ常に関連し、したがって、感染しやすい患者において敗血症のリスクを呈する。これらの状態は、大部分の入院患者に存在し、そのため、彼らは敗血症及び敗血性ショックのリスクの早期評価時に臨床転帰が改善される患者集団である。患者の遺伝学及び免疫系の機能的状態は、リスクを決定付ける関連因子である可能性が高い。
敗血症を発症し、敗血性ショックに進行する感染を有する患者の感受性は、部分的には、感染性病原体に対して患者が開始する免疫応答によって決定される。
免疫応答の機能性（免疫活性対免疫抑制、炎症性免疫応答対適応性Ｔ細胞媒介性応答）は、年齢、遺伝的変化、併存疾患（例えば、糖尿病のような慢性疾患）、過去の処置（化学療法、骨髄移植、コルチコステロイドのような）などの複数の内因性因子、及び現在の免疫抑制処置などの外因性因子によって決定される。
個々の患者における免疫系の機能に対するこれらの全ての因子の結果は、まだ評価できない。これは現在、（１）感染を有するどの患者が敗血症を発症するリスクがあるか、（２）そのリスクの大きさがどれぐらいか、（３）敗血性ショックへの進行及び最終的には、死亡のリスクがどれぐらいかを予測することを非常に困難にしている。免疫応答の状態が敗血症を発症するリスクの重要な決定因子であることに気づくことも、衰えている免疫機能の改善（すなわち、免疫療法）に基づいて、感染又は敗血症を有する患者のための新規治療の開発を可能にする。
しかしながら、免疫応答と、敗血症を発症する感受性との両方に影響する遺伝子バリアントを含む、患者間の大きい不均質性のため、敗血症における免疫応答の機能障害の分子的原因は、個体間で異なる。これは、最小限の副作用（例えば、サイトカインストーム）で最も有効な免疫標的薬を選択するために、個々の患者における機能的免疫状態を決定する細胞メカニズムの特性評価に基づく個別化医療アプローチが必要であることを意味する。患者の遺伝的プロファイルに基づく個別化医療は、有効であると証明されていない。
明らかに、敗血症に対する感受性に関与する免疫機能障害表現型は、遺伝的プロファイルだけでなく、重要な程度で、患者の多くの環境的手がかり（例えば、細菌種、細菌量、併存疾患、薬剤など）によって決定される。これは、個々の機能的免疫状態を、免疫機能を制御する細胞メカニズムの活性である表現型レベルで特性評価すべきであることを意味する。
免疫細胞機能は、ＴＧＦベータ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ、及びＡＲ経路のような、シグナリング経路間の高度に制御された相互作用によって調整されている。最近、ベイズコンピュータモデルによって解釈され、経路活性スコアに翻訳される、標的遺伝子ｍＲＮＡ測定値に基づく、血液試料を含む、細胞又は組織試料中のシグナリング経路の活性を測定するための新規アッセイが開発された（２）、（３）、（４）。これらの経路の活性の測定は、あらゆる型の免疫細胞の機能的状態の特性評価を可能にする（５）。
敗血症の診断は、部分的には主観的臨床基準に基づき、したがって、主に患者における多種多様性のため、非常に高感度でも、特異的でもない（１）。臨床基準に基づいて敗血症が疑われる場合、患者管理及び処置の計画を成し遂げるためには、診断を迅速に確定することが依然として重要である。例えば、血液培養による確認は、時間消費的なプロセスであり、数日かかることもあり、待つことはできない。
より速い確定診断検査、並びに感染（主に病院内での）を有するどの患者が敗血症を発症するリスクがあるかを予測するための検査、敗血性ショックに進行するリスクを予測するための検査、及び死亡するリスクを予測するための検査が必要である。そのような検査に基づいて採ることができる臨床行為は、例えば、集中治療室（ＩＣＵ）への入室対一般病棟に残ることに関して対象を階層化すること、高リスク患者における感染源に関する外科的検索及びその除去に関して階層化すること、特定の処置、例えば、標的免疫療法に関して階層化することであってよい。
まとめると、迅速に実施でき、（１）感染入院（又は在宅）患者における敗血症のリスクを予測するため、（２）敗血症を早期に診断するため、（３）敗血性ショックへの進行及び死亡のリスクを予測するため、及び（４）個々の患者ベース（個別化医療）での（標的）治療又は免疫療法などの、治療に対する応答を予測するために使用できる、さらなる検査の必要性が高い。さらに、（５）敗血症の処置又は防止のさらなる方法が緊急に必要である。
本発明の第１の態様によれば、上記課題は、対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤によって解決される。
本発明の第２の態様によれば、上記課題は、対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＴＧＦベータ経路阻害剤によって解決される。
実施形態の詳細な説明
免疫細胞の機能的状態は、少数のいわゆる細胞シグナリング経路（ＳＴＰ）によって決定される（［２０］、［２１］、［２２］、［２３］、［２４］；それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。最近、血液試料を含む、細胞及び組織試料中のＳＴＰの活性を定量的に測定するための新規アッセイが開発された（［２５］、［２６］、［２７］、［２８］；それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。血液細胞中でのこれらのＳＴＰの組み合わせた活性の測定は、個体における先天性免疫応答及び適応免疫応答の定量的評価を可能にすることが期待される。
ＳＴＰ分析を、複数の臨床敗血症試験からの公共的に利用可能な遺伝子発現データに対して実施した（［３０］、その全体が参照により組み込まれる）。本明細書に記載される試験は、ＡＲ及びＴＧＦベータの活性が、健康な対照と比較して敗血症患者において増加していたことを示し、これは、これらの経路が敗血症を処置又は防止するための新規薬物標的であることを示している。
経路阻害剤、特に、ＡＲ若しくはＴＧＦベータ経路阻害剤、又はその組合せを用いた処置は、敗血症を有する対象又は敗血症を発症する危険がある対象にとって有益である。ＡＲ阻害剤を用いた敗血症の処置は、以前にマウスモデルにおいて試されたが、成功しなかった。これは、部分的には、アンドロゲン及び／又はテストステロンレベルの性別に基づく差異、その結果として生じるＡＲ経路の活性に起因する。この試験から、ＡＲ阻害剤を用いた敗血症の処置は実行可能ではないと結論付けられた。本開示はここで、まず第１に、患者をＡＲ経路活性によって階層化し、ＡＲ経路活性が強く増加した患者だけの処置を可能にすることを示す。より重要なことに、敗血症を発症するリスクがあり、関連する血液細胞中に高いＡＲ経路活性を有する、感染を有する患者は、ＡＲ阻害剤を用いた防止的処置から恩恵を受けられる。ＡＲ阻害剤を用いたそのような防止的処置は、本発明者らが知る限り、提言されたことがない。この背後にある論拠は、活性ＡＲ経路が免疫抑制をもたらすということである。例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｇｕｂｂｅｌｓ Ｂｕｐｐ及びＪｏｒｇｅｎｓｅｎ ２０１８［５］を参照されたい。
ＡＲタンパク質は、好中球、マクロファージ、肥満細胞、単球、巨核球、Ｂ細胞、及びＴ細胞を含む様々な先天性免疫細胞及び適応免疫細胞中で発現されることが見出されたが、これは、ＡＲ経路が実際にリガンド誘導性であることを示唆しており、本発明者らはここで、単球性細胞について、主な細胞型が敗血症の症状の原因となっていたことを確認する。興味深いことに、ＡＲタンパク質は、造血幹細胞、リンパ球及び骨髄前駆細胞中でも発現される。異なる試験に由来する証拠が、適切な免疫応答にとって重要である炎症性メディエーター及び抗炎症性メディエーターの発現を主に変化させることによる、異なる免疫細胞型におけるアンドロゲンの免疫抑制的役割を指摘する。
敗血症における炎症性応答と一致して、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、及びＩＬ６などの免疫抑制性サイトカインが役割を果たすいくつかの免疫抑制事象が起こる証拠が存在する。臨床観察コホート試験によれば、敗血症患者は、慢性の重病を発症し、その６ヶ月生存率は６３％であり、慢性炎症のサイトカインプロファイル、並びに持続的免疫抑制に特徴的なバイオマーカープロファイルを示し続ける［３１］。Ｈｉｒａｋｉら［３２］からの試験では、マウスの生存の改善をもたらすＴＧＦ－β枯渇抗体を投与するマウス腹部敗血症モデルを使用した。これは、敗血症におけるＴＧＦベータ経路の因果的役割を示唆する。今までのところ、ＴＧＦベータ阻害剤を用いる処置又は防止は、示唆されていない。
本発明はさらに、例えば、ＡＲシグナリング経路の活性を決定すること、及び必要に応じて、ＴＧＦベータ経路、ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路などの追加の、又は別の経路の活性又は複数の活性を決定することに基づいて、血液試料、例えば、少なくとも１つの免疫細胞型又は免疫細胞型の混合集団からなる血液試料を特性評価するために、シグナリング経路活性の分析を使用できるという本発明者らのイノベーションに基づくものである。本発明者らは、ＡＲ経路活性のみに基づいて、全血試料などの血液試料上で決定した場合、それが敗血症を示唆する臨床基準を用いて患者における敗血症の診断を確立又は確定するための試験として機能し得ることを証明する。低いＡＲ経路活性が認められる場合、敗血症は依然として存在するが、患者は生存者である可能性が高い。さらに、ＡＲ経路活性のレベルを使用して、低い死亡リスクと高い死亡リスクとを区別できる。これは、敗血症を有する対象から得られた血液試料に基づいて、高い死亡リスクを有する対象から得られた試料と、低い死亡リスクを有する対象から得られた試料との間で、ＡＲ経路活性に基づいて区別を行うことができることを意味する。最後に、経路活性及び敗血症と対照との間又は低い死亡リスクと高い死亡リスクとの間の相関が、これらの４つの経路に特異的であると認められ、他のシグナリング経路は、全血試料中の敗血症の存在若しくは非存在又は敗血症の重症度（死亡リスクを含む）との相関は認められなかった（データは示されない）。
敗血症において上昇し、予後不良を高度に示す２つの重要な経路は、ＡＲ経路及びＴＧＦベータ経路である。これらの経路は、敗血症前状態においても活性レベルの増大を示す。したがって、本発明者らは次に、これらの経路が原因となるのかどうか、かくして、これらの経路を使用して、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を阻害することによって、患者における敗血症を防止又は処置できるかどうかを調査した。
以前に既に示されたように、敗血症患者間の臨床的不均質性を考慮すれば、個別化医療はさらなる利点をもたらす。今まで、敗血症の防止又は処置のためにＡＲ又はＴＧＦベータ経路阻害剤から恩恵を受ける患者を階層化することは不可能であった。本明細書に記載される方法はここで、血液試料中のＡＲ又はＴＧＦベータ経路活性の正確な評価を可能にする。これは、低い、及び高いＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を有する患者間の区別を可能にし、経路活性を正常化するために、高いＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を有する者にＡＲ及び／又はＴＧＦベータ阻害剤を投与することを可能にする。
本発明者らはしたがって、以下に記載される知見に基づいて、経路阻害剤、特に、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤を用いた処置が、敗血症を有する対象又は敗血症を発症する危険がある対象にとって有益であると理論化した。ＡＲ阻害剤を用いた、敗血症を有するマウスの処置は、以前に記載されたが、部分的には成功したが、部分的には失敗した［１６］。敗血症を有する雄のマウスは、ＡＲ阻害剤を用いた処置から恩恵を受けるが、敗血症を有する雌のマウスはそうではないことが見出された。しかしながら、敗血症に対する応答には性別に基づく大きな差異があることに留意すべきであり（雄のマウスにおいて死亡率がはるかに高い）、したがって、これらの結果をヒトにどの程度外挿できるかはあまり明らかではない。
本発明者らの結果に基づいて、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ阻害剤を用いた処置に対する応答における差異は、全ての敗血症患者が高いＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を示すわけではないという事実によって説明でき、したがって、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性が大きく増加した者のみが、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤を用いた処置から恩恵を受ける。より重要なことには、感染を生じるリスクがあり、高いＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を示す、感染を有する患者は、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ阻害剤を用いた防止的処置から最も恩恵を受ける。この想定の背後にある論拠は、活性ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路が、免疫抑制をもたらすということである。例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｇｕｂｂｌｅｌｓ Ｂｕｐｐ及びＪｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ａｎｄｒｏｇｅｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８；９：７９４［１１］を参照されたい。
ＡＲは、好中球、マクロファージ、肥満細胞、単球、巨核球、Ｂ細胞、及びＴ細胞を含む様々な先天性免疫細胞及び適応免疫細胞中で発現されることが見出された。興味深いことに、ＡＲは、造血幹細胞、リンパ球及び骨髄前駆細胞中でも発現される［１３］。異なる試験に由来する証拠が、主に、炎症性及び抗炎症性メディエーターの発現を減少させる、及び／又は促進することによる、異なる免疫細胞型におけるアンドロゲン及びＴＧＦベータのかなりの免疫抑制的役割を指摘する。
今まで、敗血症の防止又は処置のためにＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤から恩恵を受ける患者を階層化することは不可能であったが、本明細書に記載される方法は、血液試料中でのＡＲ及びＴＧＦベータ経路活性の正確な評価を可能にする。これは、低い、及び高いＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を有する患者間を簡単に区別することを可能にし、高いＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を有する者にＡＲ及び／又はＴＧＦベータ阻害剤を投与することを可能にする。
この仮説を検証するために、単球をＬＰＳで刺激した後、様々なＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤で処置するｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を設計した。単球は敗血症において主要な役割を果たすと記載されているため、それらを選択した。例えば、両方ともその全体が参照により組み込まれる、Ｓｕｋｈａｃｈｅｖａ、Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｅｐｓｉｓ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｔ．２６ Ａｕｇｕｓｔ ２０２０［１４］又はＨａｖｅｒｍａｎら、Ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｓｅｐｓｉｓ：ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌｕｍｅ ５５、Ｉｓｓｕｅ ３、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９９、Ｐａｇｅｓ １３２～１４１［１５］を参照されたい。本発明者らは、（細菌）ＬＰＳが単球におけるＡＲ及びＴＧＦベータシグナリング経路を刺激でき、この効果を、刺激後にＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤と共に単球をインキュベートすることによって大きく弱めることができることを証明できた。
単球は、ＡＲシグナル伝達活性が増加する敗血症において役割を果たす重要な細胞型の１つであり、この活性を単球において測定できることが知られており、ＡＲ及びＴＧＦベータシグナル伝達は免疫抑制的役割並びに炎症的役割を有することが知られているため、高いＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を有する患者の処置が、敗血症の防止若しくは処置の成功をもたらすか、又は少なくとも症状を軽減することは、全体として妥当と思われる。実施例１０は、ＴＨＰ－１細胞モデルを使用することによって、ＡＲ経路阻害剤を使用して敗血症を処置又は防止できる初めての概念実証を提供する。データは、ＬＰＳがＴＨＰ－１単球細胞中でＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路活性を誘導し、ＡＲ経路活性レベルを、ＡＲ経路阻害剤の添加によってほぼベースラインレベルまで戻すことができることを示す。
実施例１１は、ＡＲ阻害剤及びＴＧＦベータ阻害剤を敗血症の防止及び処置のために使用できることをさらに支持するデータを提供する。これを支持するために、防止及び処置モデルを設計して、ＡＲ及びＴＧＦベータ阻害剤を試験した。単球は敗血性応答における関連細胞の１つと見なされており、敗血症患者においてＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路活性の上方調節をもたらすことが示されているため（以前の実施例を参照されたい）、これらのモデルでは、単球性細胞系（ＴＨＰ－１）が使用される。
防止モデルでは、細胞を、経路阻害剤又は陰性対象（ＤＭＳＯ）と共に２４時間予備インキュベートした後、ＬＰＳ（又は陽性対照としてのジヒドロテストステロン（ＤＨＴ））と共に２４時間インキュベートした。次いで、ＲＮＡを細胞から抽出し、本明細書に記載の方法によって経路活性を決定した。これらのデータは、表７、表８及び表１０に記載される。
処置モデルでは、経路阻害剤及びＬＰＳを同時に添加し、ＴＨＰ－１細胞を２４時間インキュベートした後、ＲＮＡを単離し、経路活性を決定した。これらのデータは、表９Ａ及び表１１に記載される。
ＬＰＳによって誘導されるＡＲ及びＴＧＦベータ経路活性の増加の効果が細胞型特異的であることを証明するために、単球性細胞（ＴＨＰ－１）と、リンパ細胞系（ＭＯＬＴ－４）との間で比較を行った。これらのデータは、表９Ａ及び表９Ｂに見られ、ＬＰＳがＴＨＰ－１細胞中でＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路活性の活性化を引き起こすが、ＭＯＬＴ－４は経路活性化におけるいかなる変化も示さないことを証明する。ＴＨＰ－１細胞中で、ビカルタミド又はエンザルタミドを添加することによって活性をわずかに低下させるが、使用されるＬＰＳの濃度が非常に高く、この特定の実験におけるこれらの経路阻害剤の効果がごくわずかであることを説明することに留意すべきである。
次に、健康な対象に由来するＰＢＭＣ上でも同様に効果が観察されるかどうかを再検討した。ＰＢＭＣはわずか５～１０％の単球を含有するため、効果はごくわずかであると予想された。実際、表１２Ａ及び表１２Ｂ中のデータは、効果が予想される単球の低いパーセンテージにおそらく起因して、ＬＰＳが、健康なボランティアから得られたＰＢＭＣ中でＡＲ又はＴＧＦベータ経路活性を有意に上方調節しなかったことを示す。それにも拘わらず、ＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路活性のわずかな低下が、ＬＰＳを（Ｒ）－ビカルタミドと組み合わせた場合に観察され、この効果を、バクトセルチブも含有させることによって劇的に増大させることができた。
上記にも拘わらず、敗血症を有する患者に由来するＰＢＭＣを取得及び分析し、異なる経路阻害剤で処置しなかった、及び処置した。ＡＲ及びＴＧＦベータ経路活性は一般に、敗血症患者において上昇することが見出され、ＰＢＭＣをＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤と共に２４時間インキュベートすることによって、驚くほど低下させることができたが、これは、ＡＲ及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤を敗血症の処置において使用できるさらなる証拠を提供する。
まとめると、実施例１～９は、いくつかの経路が、敗血症を有する患者又は敗血症を発症するリスクがある患者において上方調節され、さらに、経路分析が、例えば、致命的な結果のリスクが最も高い患者を選択するために患者を階層化することを可能にすることの証拠を提供する。
したがって、第１の態様では、本発明は、対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤に関する。或いは、本発明は、それを必要とする対象における敗血症を防止又は処置する方法であって、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤を対象に投与するステップを含む方法に関する。
本明細書で使用される場合、経路阻害剤による敗血症の防止又は処置は、敗血症を有する対象又は敗血症を発症するリスクがある対象を意味する、それを必要とする対象に、経路阻害剤を投与することを指す。投与経路は、一般に、当業者には公知であり、化合物に依存する。したがって、本明細書に記載の方法及び使用は、特定の投与経路に限定されず、例えば、経腸、非経口又は局所投与を指す。使用できる経腸投与経路の例としては、経口、直腸、舌下、唇下又は頬投与が挙げられ、経口投与が好ましい。非経口投与は、例えば、注射針による、硬膜外、脳室内、経皮、舌下若しくは頬、舌下、経鼻、動脈内、関節内、心臓内、陰茎海綿体内、病変内、筋肉内、眼内、骨内、腹腔内、髄腔内、膣内、静脈内、膀胱内、硝子体内、皮下、経皮、血管周囲又は経粘膜投与を含んでもよい。好ましい非経口経路は、皮下又は筋肉内投与である。
本明細書で使用される場合、防止とは、対象が敗血症を有しないと見なされるが、敗血症を発症する高いリスクがある状況であって、防止が敗血症を発症する前記対象の機会を低減させることを意味すると考えられる状況を指す。本明細書で使用される場合、処置は、対象が敗血症を有する状況であって、対象がそれぞれの処置を受けていない状況と比較して、処置が、症状を低減させること、対象が敗血症である時間を短縮すること、死亡の機会を低減させること、又は対象を治癒させることを指す状況を指す。処置はまた、対象の免疫抑制状態を低減させることも指す。
対象は、ヒト又は非ヒト哺乳動物である。好ましくは、対象はヒトである。ある実施形態では、対象は、上昇したＡＲ細胞シグナリング経路活性を有するか、又はＡＲ細胞シグナリング経路活性が閾値を超えている。或いは、本発明は、敗血症を防止又は処置する方法であって、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤を、ＡＲ細胞シグナリング経路活性が上昇した対象又はＡＲ細胞シグナリング経路活性が閾値を超えている対象に投与するステップを含む方法に関する。
本明細書で使用される場合、経路活性に言及する場合の上昇は、ベースライン又は対照レベルと比較した場合により高いか、又は増加していることを意味すると解釈されるべきである。例えば、ＡＲ又はＴＧＦベータ経路活性などの経路活性を、健康な個体のコホートの血液試料上で決定して、ベースライン又は対照レベルとしての平均経路活性値を確立できる。次いで、対象の血液試料中で測定された経路活性を、この平均値と比較する。健康なコホートにおける観察された経路活性には自然の変動があるため、閾値は、経路活性が増加又は上昇したと言われるものよりも上に設定できる。同様に、閾値は、経路活性が減少又は低下したと言われるものよりも下に設定できる。例えば、健康な対象のコホートから得られた経路活性を使用する場合、閾値は、平均経路活性プラス又はマイナス標準偏差の１倍を使用して設定できる。閾値を、平均プラス又はマイナス健康なコホートの血液試料から得られた経路活性の標準偏差の２倍、３倍又はさらには４倍にすることによって、より厳密な閾値を設定できる。
ある実施形態では、ＡＲ細胞シグナリング経路は、対象から得られた血液試料中で決定される。経路活性を、全血又は限定されるものではないが、ＰＢＭＣ、単球若しくは好中球などの、単離された血液細胞上で決定する。或いは、本発明は、敗血症を防止又は処置する方法であって、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤を、ＡＲ細胞シグナリング経路活性が上昇した対象又はＡＲ細胞シグナリング経路活性が閾値を超えている対象に投与するステップを含み、ＡＲ細胞シグナリング経路が、対象から得られた血液試料中で決定される方法に関する。
ある実施形態では、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、対象の血液試料中で決定されたＡＲ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合に投与される。閾値は所定のものであってよい。当業者であれば、得られた数値及び経路活性の表示が使用される方法に依存することを知っている。したがって、対象の血液試料中及び例えば、健康な対象などの参考の血液試料中の、ＡＲ経路活性などの経路活性を決定するために、理想的には同じ方法が使用される。
したがって、ある実施形態では、本発明は、敗血症を防止又は処置するのに使用するためのＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤であって、使用が、
－ 対象の血液試料中のＡＲ細胞シグナリング経路活性を決定すること；及び
－ 対象の血液試料中のＡＲ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合に、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤を患者に投与すること
を含む、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤に関する。
当業者であれば、ＡＲ細胞シグナリング経路活性を決定するために利用可能な複数の方法が存在することを知っている。例えば、本明細書に記載の使用及び方法では、リポーターアッセイ、受容体転写複合体の核染色、リン酸化に基づくアッセイ、ＥＬＩＳＡによって、又は本明細書に記載のマーカー若しくは標的遺伝子に基づいて、ＡＲ経路活性を決定できる。しかしながら、当業者であれば、他の方法を使用してもよく、したがって、この一覧は限定と解釈されるべきではないことを知っている。かくして、本明細書に記載の方法及び使用は、経路活性を決定する特定の方法に限定されない。例えば、本明細書の以下に記載される方法を使用してもよい。したがって、ある実施形態では、ＡＲ細胞シグナリング経路の決定は、対象の血液試料中のＡＲシグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること又は受け取ること；試料中のＡＲ細胞シグナリング経路関連転写因子（ＴＦ）エレメントであって、３個以上の標的遺伝子の転写を制御するＴＦエレメントの活性レベルを決定することを含み、決定は、３個以上の標的遺伝子の発現レベルを、ＡＲ細胞シグナリング経路の活性レベルと関連付ける較正された数学的経路モデルを評価すること、及びＡＲ細胞シグナリング経路関連ＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づいて、対象に由来する血液試料中のＡＲ細胞シグナリング経路の活性を推測することに基づくものである。ＴＦエレメントの活性レベルの決定に基づいて経路活性を推測する方法に関する詳細は、以下で提供される。
本明細書で使用される場合、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤という用語は、ＡＲ経路阻害剤という用語と互換的に使用され、活性化されたアンドロゲン受容体複合体によって標的遺伝子の転写を阻害する、低減させる、又は低下させる化合物又は生物製剤を記載するために使用される。ＡＲ経路阻害剤は、直接阻害剤又は間接阻害剤であり、それが、ＡＲ細胞シグナル伝達のシグナル伝達カスケードに直接干渉するか、又はより下流のＡＲ細胞シグナリング経路を調節する経路に間接的に干渉することを意味する。例えば、阻害剤は、テストステロンなどのＡＲ経路のためのリガンドを利用不可能にすること、テストステロンのＤＨＴへの代謝段階の低減を阻害すること、活性化されたＡＲの核への移動を阻害すること、又はＡＲ転写複合体による転写の開始を阻害すること、又は例えば、ＡＲ分解によって、ＡＲ発現を低減させることによって機能する。例えば、エタネルセプト（エンブレルとしても知られる）は主に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を阻害するための化合物として知られるが、本発明者らのデータでは、この化合物が関連モデルシステムにおいて使用される場合、ＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路シグナル伝達の有意な低減が観察され、したがって、本発明の目的のために、エタネルセプトはＡＲ経路阻害剤並びにＴＧＦベータ経路阻害剤であると考えられる。例えば、レサトルビド（ＴＡＫ－２４２としても知られる）は主に、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）のアンタゴニストとして知られるが、本発明者らのデータでは、この化合物が関連モデルシステムにおいて使用される場合、ＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路シグナル伝達の有意な低減が観察され、したがって、本発明の目的のために、レサトルビドはＡＲ経路阻害剤並びにＴＧＦベータ経路阻害剤であると考えられる。例えば、フィルゴチニブ（ジセレカとしても知られる）は主に、ＪＡＫ１阻害剤として知られるが、本発明者らのデータでは、この化合物が関連モデルシステムにおいて使用される場合、ＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路シグナル伝達の有意な低減が観察され、したがって、本発明の目的のために、フィルゴチニブはＡＲ経路阻害剤並びにＴＧＦベータ経路阻害剤であると考えられる。したがって、本明細書で使用される場合、ＡＲ阻害剤は、限定されるものではないが、ＴＨＰ－１細胞などの関連モデルシステムにおいてＡＲ経路活性を阻害することができる任意の化合物又は生物製剤であり、ＡＲ経路活性は、本明細書に記載のモデルによって推測される。ＡＲ経路阻害剤の第２の効果は、例えば、中間体タンパク質の産生、又は様々なシグナリング経路の転写因子間の相互作用による、他のシグナリング経路の活性の変化であってよい。
したがって、ある実施形態では、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、ステロイド性抗アンドロゲン剤、非ステロイド性抗アンドロゲン剤、アンドロゲン合成阻害剤、ＣＹＰ１７Ａ１阻害剤、ＣＹＰ１１Ａ１（Ｐ４５０ｓｃｃ）阻害剤、５αーリダクターゼ阻害剤及び抗性腺刺激ホルモン又はそれらの組合せからなる群から選択される。或いは、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、ビカルタミド、（Ｒ）－ビカルタミド（ＨＹ－１４２４９）、エンザルタミド（ＭＤＶ３１００）、Ｎ－デスメチルエンザルタミド、プロキサルタミド（ＧＴ０９１８）、アパルタミド（ＡＲＮ－５０９）、Ｎ－デスメチル－アパルタミド、ダロルタミド（ＯＤＭ－２０１；ＢＡＹ－１８４１７８８）、ケトダロルタミド（ＯＲＭ－１５３４１）、ガレテロン（ＴＯＫ－００１）、Ｄ４－アビラテロン、Ａ－４８５、デキサメタゾン、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）、酢酸シプロテロン、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、酢酸メゲストロール、酢酸オサテロン、酢酸ノメゲストロール、ジエノゲスト、オキセンドロン、ドロスピレノン、スピロノラクトン、メドロゲストン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、アパルタミド、シメチジン、トピルタミド、酢酸アビラテロン、ケトコナゾール、セビテロネル、アミノグルテチミド、デュタステリド、アルファトラジオール、デュタステリド、エピステリド、フィナステリド、Ａ－４８５、ＡＲＣＣ－４、ＡＲＤ－２６６、ノコギリヤシ抽出物、ロイプロレリン、エストロゲン（例えば、エストラジオール（及びそのエステル）、エチニルエストラジオール、コンジュゲート化エストロゲン、ジエチルスチルベストロール）、ＧｎＲＨアナログ、ＧｎＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、ロイプロレリン）、ＧｎＲＨアンタゴニスト（例えば、セトロレリクス）、及びプロゲストゲン（例えば、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、カプロン酸ゲストノロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール）、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ又はそれらの組合せからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、ビカルタミド、（Ｒ）－ビカルタミド（ＨＹ－１４２４９）、エンザルタミド（ＭＤＶ３１００）、Ｎ－デスメチルエンザルタミド、プロキサルタミド（ＧＴ０９１８）、アパルタミド（ＡＲＮ－５０９）、Ｎ－デスメチル－アパルタミド、ダロルタミド（ＯＤＭ－２０１；ＢＡＹ－１８４１７８８）、ケトダロルタミド（ＯＲＭ－１５３４１）、ガレテロン（ＴＯＫ－００１）、Ｄ４－アビラテロン、Ａ－４８５、デキサメタゾン、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ又はそれらの組合せからなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載される対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤であって、使用が、敗血症を発症するリスクがある対象における敗血症の防止のためのものである、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤に関する。
ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載される対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤であって、使用が、敗血症に罹患している対象における敗血症の処置のためのものである、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤に関する。
ＡＲ阻害剤と、ＴＧＦベータ阻害剤とを組み合わせて、対象における敗血症を防止又は処置することが特に有利である。したがって、ある実施形態では、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤と一緒に投与され、ここで、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤は、同じ化合物であるか、又は異なる化合物である。
ＡＲ及びＴＧＦベータ阻害剤は、単一の治療剤中で組み合わせるか、又は別々に投与する。したがって、ある実施形態では、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤の前に投与されるか、又はＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤と同時に投与されるか、又はＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤の後に投与される。
敗血症及び敗血症を発症するリスクがある対象におけるＡＲ及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路の活性化は、変化する。したがって、一部の対象は、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤からより多くの恩恵を受ける。したがって、処置の前に対象に由来する血液試料中のＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を決定することは、有益である。したがって、ある実施形態では、本発明は、対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤であって、使用が、
－ 対象の血液試料中のＡＲ細胞シグナリング経路活性及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を決定すること；
－ ＡＲ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合、ＡＲ経路阻害剤を患者に投与すること；並びに
－ ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合、ＴＧＦベータ経路阻害剤を患者に投与すること
を含む、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤に関する。
例えば、高いＡＲ経路及び低いＴＧＦベータ経路活性が対象の血液試料中で測定される場合、ＡＲ経路阻害剤を投与するか、又は高いＡＲ経路及び高いＴＧＦベータ経路活性が対象の血液試料中で測定される場合、ＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路阻害剤を投与する。或いは、低いＡＲ経路及び高いＴＧＦベータ経路活性が対象の血液試料中で測定される場合、ＴＧＦベータ経路阻害剤を投与する。
したがって、ある実施形態では、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤は、低分子キナーゼ阻害剤、抗ＴＧＦ－βリガンド抗体、抗ＴβＲ受容体抗体若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれらの組合せからなる群から選択されるか、又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤は、バクトセルチブ（ＥＷ－７１９７）、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ３２００８８２、（Ｅ）－ＳＩＳ３、フレソリムマブ、ＸＰＡ６８１、ＸＰＡ０８９、ＬＹ２３８２７７０、ＬＹ３０２２８５９、ＩＳＴＨ００３６、ＩＳＴＨ００４７、ピロール－イミダゾールポリアミド、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ若しくはそれらの組合せからなる群から選択され；好ましくは、バクトセルチブ（ＥＷ－７１９７）、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ３２００８８２、（Ｅ）－ＳＩＳ３、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ若しくはそれらの組合せからなる群から選択される。
ある実施形態では、使用は、敗血症の防止のためであり、ＡＲ阻害剤は、ビカルタミドである、及び／又はＴＧＦベータ阻害剤は、バクトセルチブである。
ある実施形態では、使用は、敗血症の処置のためであり、ＡＲ阻害剤は、ビカルタミド、（Ｒ）－ビカルタミド、ケトダロルタミド（ＯＲＭ－１５３４１）、Ｄ４－アビラテロン、エタネルセプト、レサトルビド、Ｎ－デスメチルエンザルタミド、Ｎ－デスメチル－アパルタミド、若しくはフィルゴチニブ又はそれらの組合せである、及び／又はＴＧＦベータ阻害剤は、バクトセルチブ、エタネルセプト、レサトルビド若しくはフィルゴチニブ又はそれらの組合せである。
ある実施形態では、ＡＲ阻害剤は（Ｒ）－ビカルタミドであり、ＴＧＦベータ阻害剤はエタネルセプトであるか、又はＡＲ阻害剤は（Ｒ）－ビカルタミドであり、ＴＧＦベータ阻害剤はフィルゴチニブである。好ましくは、使用は、敗血症の処置のためであり、ＡＲ阻害剤は（Ｒ）－ビカルタミドであり、ＴＧＦベータ阻害剤はエタネルセプトであるか、又はＡＲ阻害剤は（Ｒ）－ビカルタミドであり、ＴＧＦベータ阻害剤はフィルゴチニブである。或いは、使用は、敗血症の処置のためであり、ＡＲ阻害剤はエタネルセプト又はフィルゴチニブと組み合わされ、好ましくは、ＡＲ阻害剤は（Ｒ）－ビカルタミドである。
ある実施形態では、本発明は、敗血症の防止又は処置における使用のための化合物に関する。或いは、本発明は、化合物を対象に投与するステップを含む、対象における敗血症を防止するか、又は敗血症を有する対象を処置する方法に関する。化合物は、好ましくは、ビカルタミド、（Ｒ）－ビカルタミド（ＨＹ－１４２４９）、エンザルタミド（ＭＤＶ３１００）、Ｎ－デスメチルエンザルタミド、プロキサルタミド（ＧＴ０９１８）、アパルタミド（ＡＲＮ－５０９）、Ｎ－デスメチル－アパルタミド、ダロルタミド（ＯＤＭ－２０１；ＢＡＹ－１８４１７８８）、ケトダロルタミド（ＯＲＭ－１５３４１）、ガレテロン（ＴＯＫ－００１）、Ｄ４－アビラテロン、Ａ－４８５、デキサメタゾン、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）、酢酸シプロテロン、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、酢酸メゲストロール、酢酸オサテロン、酢酸ノメゲストロール、ジエノゲスト、オキセンドロン、ドロスピレノン、スピロノラクトン、メドロゲストン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、アパルタミド、シメチジン、トピルタミド、酢酸アビラテロン、ケトコナゾール、セビテロネル、アミノグルテチミド、デュタステリド、アルファトラジオール、デュタステリド、エプリステリド、フィナステリド、Ａ－４８５、ＡＲＣＣ－４、ＡＲＤ－２６６、ノコギリヤシ抽出物、ロイプロレリン、エストロゲン（例えば、エストラジオール（及びそのエステル）、エチニルエストラジオール、コンジュゲート化エストロゲン、ジエチルスチルベストロール）、ＧｎＲＨアナログ、ＧｎＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、ロイプロレリン）、ＧｎＲＨアンタゴニスト（例えば、セトロレリクス）、プロゲストゲン（例えば、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、カプロン酸ゲストノロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール）、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ、バクトセルチブ（ＥＷ－７１９７）、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ３２００８８２、（Ｅ）－ＳＩＳ３、フレソリムマブ、ＸＰＡ６８１、ＸＰＡ０８９、ＬＹ２３８２７７０、ＬＹ３０２２８５９、ＩＳＴＨ００３６、ＩＳＴＨ００４７、ピロール－イミダゾールポリアミド又はそれらの組合せから選択される。
ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載される対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤であって、使用が、敗血症を発症するリスクがある対象における敗血症の防止のためのものである、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤に関する。
ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載される対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤であって、使用が、敗血症に罹患している対象における敗血症の処置のためのものである、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤に関する。
第２の態様では、本発明は、対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＴＧＦベータ経路阻害剤に関する。或いは、本発明は、それを必要とする対象における敗血症を防止又は処置する方法であって、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤を対象に投与するステップを含む方法に関する。ある実施形態では、対象は、上昇したＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を有するか、又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が閾値を超えている。或いは、本発明は、敗血症を防止又は処置する方法であって、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤を、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が上昇した対象又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が閾値を超えている対象に投与するステップを含む方法に関する。
ある実施形態では、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路は、対象から得られた血液試料中で決定される。経路活性を、全血又は限定されるものではないが、ＰＢＭＣ、単球若しくは好中球などの、単離された血液細胞上で決定する。或いは、本発明は、敗血症を防止又は処置する方法であって、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤を、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が上昇した対象又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が閾値を超えている対象に投与するステップを含み、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路が、対象から得られた血液試料中で決定される方法に関する。
ある実施形態では、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤は、対象の血液試料中で決定されたＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合に投与される。閾値は所定のものであってよい。当業者であれば、得られた数値及び経路活性の表示が使用される方法に依存することを知っている。したがって、対象の血液試料中及び例えば、健康な対象などの参考の血液試料中の、ＴＧＦベータ経路活性などの経路活性を決定するために、理想的には同じ方法が使用される。
したがって、ある実施形態では、本発明は、敗血症を防止又は処置するのに使用するためのＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤であって、使用が、
－ 対象の血液試料中のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を決定すること；及び
－ 対象の血液試料中のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合に、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤を患者に投与すること
を含む、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤に関する。
当業者であれば、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を決定するために利用可能な複数の方法が存在することを知っている。例えば、本明細書に記載の使用及び方法では、ＴＧＦベータ経路活性は、リポーターアッセイ、受容体転写複合体の核染色、リン酸化に基づくアッセイ、ＥＬＩＳＡによって決定される。しかしながら、当業者であれば、他の方法を使用してもよく、したがって、この一覧は限定と解釈されるべきではないことを知っている。かくして、本明細書に記載の方法及び使用は、経路活性を決定する特定の方法に限定されない。例えば、本明細書の以下に記載される方法を使用してもよい。したがって、ある実施形態では、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路の決定は、対象の血液試料中のＴＧＦベータシグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること又は受け取ること；試料中のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路関連転写因子（ＴＦ）エレメントであって、３個以上の標的遺伝子の転写を制御するＴＦエレメントの活性レベルを決定することを含み、決定は、３個以上の標的遺伝子の発現レベルを、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路の活性レベルと関連付ける較正された数学的経路モデルを評価すること、及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路関連ＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づいて、対象に由来する血液試料中のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路の活性を推測することに基づくものである。ＴＦエレメントの活性レベルの決定に基づいて経路活性を推測する方法に関する詳細は、以下で提供される。
本明細書で使用される場合、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤という用語は、ＴＧＦベータ経路阻害剤という用語と互換的に使用され、活性化されたＳＭＡＤタンパク質複合体によって標的遺伝子の転写を阻害する、低減させる、又は低下させる化合物又は生物製剤を記載するために使用される。ＴＧＦベータ経路阻害剤は、直接阻害剤又は間接阻害剤であり、それが、ＴＧＦベータ細胞シグナル伝達のシグナル伝達カスケード中に直接あるか、又はより下流のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路を調節する経路に間接的に干渉することを意味する。例えば、阻害剤は、ＴＧＦベータなどのＴＧＦベータ経路のためのリガンドを利用不可能にすること、又はそれがＴＧＦベータ受容体に結合するのを防止すること、ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化をもたらす下流のシグナル伝達カスケードを阻害すること、活性化されたＳＭＡＤタンパク質複合体の核への移動を阻害すること、又はＳＭＡＤ転写複合体による転写の開始を阻害することによって機能する。例えば、エタネルセプト（エンブレルとしても知られる）は主に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を阻害するための化合物として知られるが、本発明者らのデータでは、この化合物が関連モデルシステムにおいて使用される場合、ＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路シグナル伝達の有意な低減が観察され、したがって、本発明の目的のために、エタネルセプトはＡＲ経路阻害剤並びにＴＧＦベータ経路阻害剤であると考えられる。例えば、レサトルビド（ＴＡＫ－２４２としても知られる）は主に、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）のアンタゴニストとして知られるが、本発明者らのデータでは、この化合物が関連モデルシステムにおいて使用される場合、ＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路シグナル伝達の有意な低減が観察され、したがって、本発明の目的のために、レサトルビドはＡＲ経路阻害剤並びにＴＧＦベータ経路阻害剤であると考えられる。例えば、フィルゴチニブ（ジセレカとしても知られる）は主に、ＪＡＫ１阻害剤として知られるが、本発明者らのデータでは、この化合物が関連モデルシステムにおいて（Ｒ）－ビカルタミドと組み合わされる場合、ＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路シグナル伝達の有意な低減が観察され、したがって、本発明の目的のために、フィルゴチニブはＡＲ経路阻害剤並びにＴＧＦベータ経路阻害剤であると考えられる。したがって、本明細書で使用される場合、ＴＧＦベータ阻害剤は、限定されるものではないが、ＴＨＰ－１細胞などの関連モデルシステムにおいてＴＧＦベータ経路活性を阻害することができる任意の化合物又は生物製剤であり、ＴＧＦベータ経路活性は、本明細書に記載のモデルによって推測される。
したがって、ある実施形態では、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤は、低分子キナーゼ阻害剤、抗ＴＧＦ－βリガンド抗体、抗ＴβＲ受容体抗体若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれらの組合せからなる群から選択される。或いは、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤は、バクトセルチブ（ＥＷ－７１９７）、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ３２００８８２、（Ｅ）－ＳＩＳ３、フレソリムマブ、ＸＰＡ６８１、ＸＰＡ０８９、ＬＹ２３８２７７０、ＬＹ３０２２８５９、ＩＳＴＨ００３６、ＩＳＴＨ００４７、ピロール－イミダゾールポリアミド、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ又はそれらの組合せからなる群から選択される。好ましい実施形態では、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤は、バクトセルチブ（ＥＷ－７１９７）、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ３２００８８２、（Ｅ）－ＳＩＳ３、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ又はそれらの組合せからなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載される対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤であって、使用が、敗血症を発症するリスクがある対象における敗血症の防止のためのものである、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤に関する。
ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載される対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤であって、使用が、敗血症に罹患している対象における敗血症の処置のためのものである、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤に関する。
ＡＲ阻害剤と、ＴＧＦベータ阻害剤とを組み合わせて、対象における敗血症を防止又は処置することが特に有利である。したがって、ある実施形態では、ＴＧＦベータ経路阻害剤は、ＡＲ経路阻害剤と一緒に投与され、ＴＧＦベータ経路阻害剤及びＡＲ経路阻害剤は、同じ化合物であるか、又は異なる化合物である。ＡＲ及びＴＧＦベータ阻害剤は、単一の治療剤中で組み合わせるか、又は別々に投与する。したがって、ある実施形態では、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤の前に投与されるか、又はＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤と同時に投与されるか、又はＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤の後に投与される。ある実施形態では、本発明は、対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤であって、使用が、
－ 対象の血液試料中のＡＲ細胞シグナリング経路活性及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を決定すること；
－ ＡＲ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合、ＡＲ経路阻害剤を患者に投与すること；並びに
－ ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合、ＴＧＦベータ経路阻害剤を患者に投与すること
を含む、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤に関する。
ある実施形態では、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、ステロイド性抗アンドロゲン剤、非ステロイド性抗アンドロゲン剤、アンドロゲン合成阻害剤、ＣＹＰ１７Ａ１阻害剤、ＣＹＰ１１Ａ１（Ｐ４５０ｓｃｃ）阻害剤、５αーリダクターゼ阻害剤及び抗性腺刺激ホルモン又はそれらの組合せからなる群から選択される。或いは、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、ビカルタミド、（Ｒ）－ビカルタミド（ＨＹ－１４２４９）、エンザルタミド（ＭＤＶ３１００）、Ｎ－デスメチルエンザルタミド、プロキサルタミド（ＧＴ０９１８）、アパルタミド（ＡＲＮ－５０９）、Ｎ－デスメチル－アパルタミド、ダロルタミド（ＯＤＭ－２０１；ＢＡＹ－１８４１７８８）、ケトダロルタミド（ＯＲＭ－１５３４１）、ガレテロン（ＴＯＫ－００１）、Ｄ４－アビラテロン、Ａ－４８５、デキサメタゾン、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）、酢酸シプロテロン、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、酢酸メゲストロール、酢酸オサテロン、酢酸ノメゲストロール、ジエノゲスト、オキセンドロン、ドロスピレノン、スピロノラクトン、メドロゲストン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、アパルタミド、シメチジン、トピルタミド、酢酸アビラテロン、ケトコナゾール、セビテロネル、アミノグルテチミド、デュタステリド、アルファトラジオール、デュタステリド、エピステリド、フィナステリド、Ａ－４８５、ＡＲＣＣ－４、ＡＲＤ－２６６、ノコギリヤシ抽出物、ロイプロレリン、エストロゲン（例えば、エストラジオール（及びそのエステル）、エチニルエストラジオール、コンジュゲート化エストロゲン、ジエチルスチルベストロール）、ＧｎＲＨアナログ、ＧｎＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、ロイプロレリン）、ＧｎＲＨアンタゴニスト（例えば、セトロレリクス）、プロゲストゲン（例えば、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、カプロン酸ゲストノロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール）、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ又はそれらの組合せからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤は、ビカルタミド、（Ｒ）－ビカルタミド（ＨＹ－１４２４９）、エンザルタミド（ＭＤＶ３１００）、Ｎ－デスメチルエンザルタミド、プロキサルタミド（ＧＴ０９１８）、アパルタミド（ＡＲＮ－５０９）、Ｎ－デスメチル－アパルタミド、ダロルタミド（ＯＤＭ－２０１；ＢＡＹ－１８４１７８８）、ケトダロルタミド（ＯＲＭ－１５３４１）、ガレテロン（ＴＯＫ－００１）、Ｄ４－アビラテロン、Ａ－４８５、デキサメタゾン、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ又はそれらの組合せからなる群から選択される。
ある実施形態では、本発明は、かくして、感染に罹患している対象における敗血症の防止における使用のためのＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤であって、好ましくは、対象が、対象から得られた血液試料中で決定した場合に上昇したＡＲ及び／又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を有する、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤に関する。
必要に応じて、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性は、対象から得られた血液試料上で決定され、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤は、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合に投与される。ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路は、本明細書に記載の方法、特に、本発明の第１の態様に記載の方法を使用して決定される。
現在、敗血症を防止するための方法は、抗生物質の投与などの、基礎となる感染を低減させることを目的とする。ここで、本明細書に記載の方法を使用して、敗血症を発症するリスクがある感染を有する患者を同定及び処置することが初めて可能となる。血液試料中の対象のＡＲ及び／又はＴＧＦベータ活性を決定することによって、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤処置のための候補を、ここで容易に同定できる。ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性の増加と、感染に起因する敗血症の発症との強力な相関が認められた。これはおそらく、例えば、単球中でのＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性の免疫抑制作用によって引き起こされる。単球は、先天性免疫応答において強力な炎症的役割を有し、全身炎症は敗血症の特質である。したがって、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性が原因となり、かくして、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ活性の阻害が、敗血症が防止又は軽減される機会を増加させることは妥当と思われる。ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を決定する代わりに、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤を投与する決定はまた、遺伝子ＡＢＣＣ４、ＡＰＰ、ＡＲ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＤＨＣＲ２４、ＥＡＦ２、ＥＬＬ２、ＦＧＦ８、ＦＫＢＰ５、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＩＧＦ１、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＬＣＰ１、ＬＲＩＧ１、ＮＤＲＧ１、ＮＫＸ３＿１、ＮＴＳ、ＰＬＡＵ、ＰＭＥＰＡ１、ＰＰＡＰ２Ａ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＮ１、ＳＧＫ１、ＴＡＣＣ２、ＴＭＰＲＳＳ２、及びＵＧＴ２Ｂ１５、好ましくは、ＡＲ、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＤＨＣＲ２４、ＥＡＦ２、ＥＬＬ２、ＦＫＢＰ５、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＩＧＦ１、ＫＬＫ３、ＬＣＰ１、ＬＲＩＧ１、ＮＤＲＧ１、ＮＫＸ３＿１、ＰＭＥＰＡ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＴＭＰＲＳＳ２、より好ましくは、ＡＲ、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＤＨＣＲ２４、ＥＡＦ２、ＥＬＬ２、ＦＫＢＰ５、ＬＣＰ１、ＬＲＩＧ１、ＮＤＲＧ１、ＰＭＥＰＡ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＴＭＰＲＳＳ２、さらにより好ましくは、ＤＨＣＲ２４、ＥＡＦ２、ＥＬＬ２、ＦＫＢＰ５、ＬＣＰ１、ＬＲＩＧ１、ＰＭＥＰＡ１、ＰＲＫＡＣＢからなるグループ１から選択される３個以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上のＡＲ標的遺伝子の発現レベルを決定することに基づくものである、並びに／又は遺伝子ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＮＫＸ２＿５、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＩＭＰ１及びＶＥＧＦＡ、好ましくは、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＮＫＸ２＿５、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＴＩＭＰ１、ＶＥＧＦＡ、より好ましくは、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ９、ＰＤＧＦＢ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＴＩＭＰ１、ＶＥＧＦＡ、さらにより好ましくは、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ９、ＰＤＧＦＢ、ＳＧＫ１、ＳＭＡＤ５、ＴＩＭＰ１、ＶＥＧＦＡからなるグループ２から選択される３個以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上のＴＧＦベータ標的遺伝子の発現レベルを決定することに基づくものである。
本発明はさらに、敗血症に罹患している対象の処置又は緩和における使用のためのＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤であって、対象が、対象から得られた血液試料中で決定した場合、上昇したＡＲ及び／若しくはＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性又はある特定の閾値を超えているＡＲ及び／若しくはＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を有する、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤に関する。
必要に応じて、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性は、対象から得られた血液試料上で決定され、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路阻害剤は、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合に投与される。ある実施形態では、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性は、本明細書に記載の方法によって決定される。ＴＧＦベータ経路活性もまた、敗血症を有する患者において上昇していると認められるため、ＴＧＦベータ経路活性をＡＲ経路活性と共に阻害することが有益であると推測される。これは、２つの異なる化合物としてのＡＲ阻害剤及びＴＧＦベータ阻害剤を投与することによって達成されるか、又はＡＲとＴＧＦベータとの両方を阻害する単一の化合物を使用することができる。例えば、化合物Ａ－４５８は、ＡＲとＴＧＦベータ経路との両方を特異的に阻害することが認められ、この目的のために有益に使用できた。したがって、本発明による使用の実施形態では、さらに、ＴＧＦベータ経路活性が決定される。ある実施形態では、ＴＧＦベータ経路活性は、本明細書に記載の方法によって決定される。
ＴＧＦベータ経路活性を決定する代わりに、ＴＧＦベータ経路阻害剤を投与するための決定はまた、遺伝子ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＮＫＸ２＿５、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＩＭＰ１及びＶＥＧＦＡ、好ましくは、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＮＫＸ２＿５、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＴＩＭＰ１、ＶＥＧＦＡ、より好ましくは、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ９、ＰＤＧＦＢ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＴＩＭＰ１、ＶＥＧＦＡ、さらにより好ましくは、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ９、ＰＤＧＦＢ、ＳＧＫ１、ＳＭＡＤ５、ＴＩＭＰ１、ＶＥＧＦＡからなるグループ２から選択される３個以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の遺伝子の発現レベルを決定することに基づくものである。
好ましい実施形態では、ＡＲ経路阻害剤は、ＴＧＦベータ経路阻害剤と一緒に投与され、ＡＲ経路阻害剤及びＴＧＦベータ経路阻害剤は、同じ化合物であるか、又は異なる化合物である。
ＡＲ経路阻害剤は、ステロイド性抗アンドロゲン剤、非ステロイド性抗アンドロゲン剤、アンドロゲン合成阻害剤、ＣＹＰ１７Ａ１阻害剤、ＣＹＰ１１Ａ１（Ｐ４５０ｓｃｃ）阻害剤、５α－リダクターゼ阻害剤及び抗性腺刺激ホルモンであってもよい。非限定例は、酢酸シプロテロン、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、酢酸メゲストロール、酢酸オサテロン、酢酸ノメゲストロール、ジエノゲスト、オキセンドロン、ドロスピレノン、スピロノラクトン、メドロゲストン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、アパルタミド、ダロルタミド、エンザルタミド、プロキサルタミド、シメチジン、トピルタミド、酢酸アビラテロン、ケトコナゾール、セビテロネル、アミノグルテチミド、デュタステリド、アルファトラジオール、デュタステリド、エプリステリド、フィナステリド、Ａ－４８５、ＡＲＣＣ－４、ＡＲＤ－２６６、ノコギリヤシ抽出物、ロイプロレリン、エストロゲン（例えば、エストラジオール（及びそのエステル）、エチニルエストラジオール、コンジュゲート化エストロゲン、ジエチルスチルベストロール）、ＧｎＲＨアナログ、ＧｎＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、ロイプロレイン）、ＧｎＲＨアンタゴニスト（例えば、セトロレリクス）、プロゲストゲン（例えば、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、カプロン酸ゲストノロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール）、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ又はそれらの組合せである。
したがって、ある実施形態では、ＡＲ阻害剤は、酢酸シプロテロン、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、酢酸メゲストロール、酢酸オサテロン、酢酸ノメゲストロール、ジエノゲスト、オキセンドロン、ドロスピレノン、スピロノラクトン、メドロゲストン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、アパルタミド、ダロルタミド、エンザルタミド、プロキサルタミド、シメチジン、トピルタミド、酢酸アビラテロン、ケトコナゾール、セビテロネル、アミノグルテチミド、デュタステリド、アルファトラジオール、デュタステリド、エプリステリド、フィナステリド、Ａ－４８５、ＡＲＣＣ－４、ＡＲＤ－２６６、ノコギリヤシ抽出物、ロイプロレリン、エストロゲン（例えば、エストラジオール（及びそのエステル）、エチニルエストラジオール、コンジュゲート化エストロゲン、ジエチルスチルベストロール）、ＧｎＲＨアナログ、ＧｎＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、ロイプロレイン）、ＧｎＲＨアンタゴニスト（例えば、セトロレリクス）、プロゲストゲン（例えば、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、カプロン酸ゲストノロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール）、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ又はそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、ＡＲ阻害剤は、Ａ－４８５、ＡＲＣＣ－４、ＡＲＤ－２６６、ビカルタミド、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ又はそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、ＡＲ阻害剤は、Ａ－４８５である。
ＴＧＦベータ経路阻害剤は、低分子キナーゼ阻害剤、抗ＴＧＦ－βリガンド抗体、抗ＴβＲ受容体抗体又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。非限定例は、ＴＥＷ－７１９７、ガルニセルチブ、ＬＹ２１５７２９９、フレソリムマブ、ＸＰＡ６８１、ＸＰＡ０８９、ＬＹ２３８２７７０、ＬＹ３０２２８５９、ＩＳＴＨ００３６、ＩＳＴＨ００４７、ピロール－イミダゾールポリアミド、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ又はそれらの組合せである。
したがって、ある実施形態では、ＴＧＦベータ阻害剤は、ＴＥＷ－７１９７、ガルニセルチブ、ＬＹ２１５７２９９、フレソリムマブ、ＸＰＡ６８１、ＸＰＡ０８９、ＬＹ２３８２７７０、ＬＹ３０２２８５９、ＩＳＴＨ００３６、ＩＳＴＨ００４７、ピロール－イミダゾールポリアミド、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ又はそれらの組合せを含む一覧から選択される。
本発明にとって重要なのは、ＡＲ、ＴＧＦベータ、ＭＡＰＫ－ＡＰ１、及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路の活性が免疫抑制と関連するということである。これらの経路、特に、ＡＲ経路が、敗血症を有する患者において平均して異常に活性化されているという知見は重要である。その理由は、それが、この経路の正常な活性がおそらく正常な免疫機能と関連することを示すからである。これは、感染を有しない対照となる対象と同様、正常なＡＲ経路活性を有する少数の患者が敗血症生存者であるという本発明者らの知見によって実証されると考えられる。これは、正常な免疫機能が敗血症の生存にとって必要であることを示唆すると考えられる。全体として、感染の防止のため、敗血症の発症のため、及び敗血症関連死の防止のために、良好な免疫応答が重要であることが明らかである。これを、全血中の測定されたシグナリング経路活性上で決定できるのは驚くべきことであることが再度強調される。
血液試料上、又は全血試料に由来する細胞の特定のサブセット上での経路活性の測定は、感染を有する患者の免疫状態に関する情報を提供する。膀胱カテーテルと関連する泌尿生殖器感染などの感染を有する患者は、免疫応答が抑制されている場合、敗血症を発症するリスクがより高いと推測できる。感染を有する患者の血液試料中の、ＡＲ経路、また、ＴＧＦベータ、ＭＡＰＫ－ＡＰ１、及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路の活性の測定は、これらの経路、特に、ＡＲ経路の活性が増加している場合に高い、敗血症の発症のリスクに関する情報を提供する。これは、感染、特に、細菌感染を有する患者における敗血症のリスクの適時の予測を可能にする。
経路活性の決定を使用して、患者における敗血症を診断し、対象から得られた血液試料を階層化して、例えば、敗血症と敗血性ショックとを区別できることを、本発明者らが初めて証明する。しかしながら、より驚くべきことは、この分析を全血試料などの血液試料に対して実施できるという知見である。
本発明は、健康な対照となる対象、回収された敗血症対象及び敗血性ショックの結果として死亡した敗血症の対象から得られた血液試料中で、ＡＲシグナリング経路、ＴＧＦベータ経路、ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路などのいくつかのシグナリング経路の活性を徹底的に試験することによって達成された。
次に、同定された関連経路の標的遺伝子を、予測を行うための基礎として使用できるかどうか（例えば、対象が敗血症を有するか否か）を評価した。遺伝子発現レベルに基づいて、遺伝子発現レベルの相関（上方又は下方調節された）についてのみ補正された単純なモデルを使用して、ＡＲ細胞シグナリング経路標的遺伝子、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路標的遺伝子、又はプールされたＡＲ及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路標的遺伝子のいずれかからの３個の遺伝子の選択が、非常に高い特異度及び良好な感度での予測を行うのに十分であることが見出された。アッセイにおいて使用される遺伝子の量を増加させることによって、又は遺伝子をより選択的に選択することによって（実施例９に示されるように）、又は本明細書に記載の経路活性モデルにおいて３個（以上）の遺伝子を使用することによって、予測の感度を増大させることができる。
実施例９に提示されるデータは、本明細書に記載の予測（例えば、敗血症を有する対象を診断する、高いか又は低い死亡機会を予測する、細菌感染を有する対象について敗血症を発症するリスクを予測する）を、本明細書に記載の一覧に由来する３個以上の遺伝子の発現レベルに基づいて行うことができることを示す。したがって、以下でより詳細に記載される経路モデルを使用できるが、そうすることは必須ではない。
本発明で想定される３個以上の遺伝子は、以下のように使用できる：３個以上の遺伝子の発現レベルは、試料（例えば、対象から得られた血液試料）中のｍＲＮＡレベルに基づいて決定される。３個以上の遺伝子の発現レベルは、１つ又は複数の参照、例えば、ハウスキーピング遺伝子を使用して正規化される。３個以上の遺伝子の正規化された発現レベルに、経路活性とのその相関に応じて、「１」又は「－１」を乗じる（遺伝子発現がより高い経路活性で増加する場合、＋１及び遺伝子発現がより高い経路活性で減少する場合、－１、各遺伝子の相関は実施例９にも示される）。次に、発現相関について補正された正規化された発現レベルは、合計されるか、又は乗じられる。ここで、３つ以上の発現レベルに関する得られた値を、参照試料（例えば、敗血症を有する対象若しくは健康な対象）に由来する３個以上の遺伝子の発現レベルから得られた値と比較できるか、又はそれを複数の参照と比較できる。或いは、３つ以上の発現レベルに関する得られた値を、１つ又は複数の設定された値と比較できる。例えば、健康な対象及び敗血症の対象から得られた参照試料に基づいて、非敗血症の対象の上限と、敗血症の対象の下限とを定義するカットオフ値を決定できる。非限定例として、３個の遺伝子の発現レベルに基づいて、３の健康な対象において、以下の値が算出された：５、８、４；３の敗血症の対象において、以下の値が算出された：４３、３０、２４。これらの結果に基づいて、１９の閾値が算出される。ここで、対象について、スコアを算出するために同じ３個の遺伝子が使用され、スコアが１９より下である場合、対象は非敗血症であると考えられ、スコアが１９より上である場合、対象は敗血症であると考えられる。
したがって、ＡＲ及び／若しくはＴＧＦベータ経路活性又は血液試料の機能的状態が、本明細書に記載の方法、予測又は診断において使用される場合、ＡＲ及び／若しくはＴＧＦベータ経路活性又は血液試料の機能的状態を、方法、予測又は診断に、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路標的遺伝子から選択される３個以上の遺伝子を単に基準として用いることによって置き換える。
同じ原理を、感染、特に、細菌感染を有する患者に適用でき、ここで、ＡＲ（及びＴＧＦベータ）シグナリング経路活性の増加は、敗血症を発症する機会の増加と相関する。かくして、本明細書に記載のＡＲ及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路の標的遺伝子から選択される３個以上の遺伝子を使用して、感染（例えば、細菌感染）を有する患者が敗血症を発症するリスクを予測又は算出できる。
実施例９では、異なる遺伝子発現レベルと、経路活性との相関をさらに使用して、遺伝子のより選択的な一覧のためのカットオフ値を提供した。これらのものは、Ｔ＝０が選択がないことを意味し（全ての標的遺伝子が使用される）、Ｔ＝０．３は０．３の相関のカットオフ値を指す、Ｔ値を用いて示される。それぞれのＴ値に関する遺伝子のそれぞれの一覧（Ｔ＝０、Ｔ＝０．３、Ｔ＝０．４、Ｔ＝０．５）は、ＡＲ及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路について決定され、実施例９に列挙される。実施形態に列挙される遺伝子並びにグループ１及びグループ２に関する好ましい実施形態は、それぞれ、ＡＲ及びＴＧＦベータ経路に関する選択された標的遺伝子に対応し、異なるＴ値の一覧を表す。
対象又は個体から得られる血液試料が敗血症を有する対象又は個体から得られるかどうかを確実に決定する能力が、いくつかの理由から望ましい。現在、敗血症の診断は、初期は、呼吸数、心拍数及び血圧のような臨床パラメータに基づくものであり、乳酸、ＣＲＰ、電解質、尿素、クレアチニンなどの、単純かつ非特異的な臨床化学検査値によって補完できる。これは、あまり正確な診断ではなく（十分な感度及び特異度ではない）、したがって、対象において敗血症が疑われる場合、原因となる病原体を検出し、その抗生物質耐性をプロファイルするための血液病原体培養によって診断を確定する必要があり、これは時間消費的なプロセスであり、完了に数日かかる。対照的に、抽出されたｍＲＮＡに基づいて１つ又は複数の経路活性を決定することによる血液試料の機能的状態の決定を、わずか２～３時間で達成できる。
本明細書に記載の方法又は他の手段によって敗血症の診断が行われたら、対象が敗血性ショックに進行するリスクが高いか又は低いか、及び患者が高いか又は低い死亡リスクを有するかを決定することが有利である。現在、敗血症の対象、特に、敗血性ショック患者は一般に、費用が高い集中治療室又は救命救急治療室で処置される。本明細書で定義される血液試料の機能的状態を使用して、敗血性ショックへの進行のリスク及び対象の死亡リスクを決定できることを考慮すると、これは常に必要となるわけではない。したがって、敗血症が診断されたら、血液試料の機能的状態に基づいて、例えば、決定されたＡＲ経路活性に基づいてリスク評価を実施して、対象が敗血性ショックへの進行の高い若しくは低いリスク又は高いか若しくは低い死亡リスクを有するかどうかを決定できる。対象が敗血性ショックのリスクが低い、又は死亡リスクが低い場合、その後の処置は、ＩＣＵで行うことを必ずしも必要とせず、かくして、実質的な費用を節減する。さらに、対象が高リスクであると決定される場合、ＩＣＵでの処置が有益であり、追加のモニタリング又は処置を保証して、リスクをさらに軽減し、例えば、原因となる病原体の検索を強化し、その起源を根絶する。
記載された理由から、血液試料の機能的状態は、有用な手段である。本明細書で使用される場合、「血液試料の機能的状態」は、活性又は複数の活性が決定された経路又は複数の経路の決定された活性又は複数の活性の合わせた情報と定義される。一般に、経路の活性を、活性である、若しくは活性ではないと決定できるか、又は活性を、対照試料を参照して決定できる。対照試料は、健康な対象から得られた血液試料であってもよいが、それはまた、経路活性を決定するために使用されるモデルを較正するために使用される試料又はデータを指してもよい。したがって、対照試料は、必ずしも血液試料ではないが、経路の既知の機能的状態（すなわち、活性であるか、又は活性ではない）を有する異なる試料であってもよい。活性を、対照試料などの参照と比較することによって、活性をバイナリー値（すなわち、経路が活性であるか、又は活性ではないか）として表すか、又はそれを数で表される相対値として表すことができる。したがって、例えば、血液試料上でＡＲ経路のみが決定される場合、血液試料の機能的状態は、対照試料を参照した活性ＡＲ活性又は不活性ＡＲ活性として定性化できる。或いは、経路活性の相対値が数によって表され、不活性対照試料が０の値を有すると定義され、活性対照試料が１の値を有すると定義される場合、対象から得られた血液試料中で決定される経路活性は、例えば、０．８１であり、これは、経路活性が不活性よりも活性に近いことを示す。
したがって、決定された遺伝子発現レベルに基づく経路活性は、好ましくは、数値として表される。以下に記載されるモデルを使用して、経路の遺伝子発現レベルを使用して、経路遺伝子の較正された発現レベルを参照して、及び／又は対照試料（例えば、健康な対象から得られた血液試料）を参照して経路活性を定量できる。この定量化は、単純なバイナリーモデル（例えば、不活性な経路については０の値、活性な経路について１の値）であってよいか、又は必要に応じて、重み因子を乗じた、発現レベルが決定された各遺伝子の寄与を定量することによる、より複雑なものであってよい。したがって、本明細書に記載される「血液試料の状態」は、決定された経路活性の数値であるか、又は複数の経路活性が決定される場合、それは決定された経路に起因する合わせた数値である。
したがって、好ましくは、対象から得られた血液試料の状態は、シグナリング経路の１つ又は複数の活性を含み、前記シグナリング経路活性は、好ましくは、ＡＲシグナリング経路活性、ＡＲ及びＴＧＦベータシグナリング経路活性、ＡＲ及びＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性、ＡＲ及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性、ＡＲ、ＴＧＦベータ及びＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性、ＡＲ、ＴＧＦベータ及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナル伝達活性並びに／又はＡＲ、ＴＧＦベータ、ＭＡＰＫ－ＡＰ１及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナル伝達活性であり、前記シグナル伝達活性は、それぞれの経路の３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づく。
これによれば、血液試料の機能的状態の決定が、それぞれの参照シグナリング経路活性又はシグナリング経路の参照活性の組合せにさらに基づくことは、本発明の実施形態である。同様に、診断の決定又は死亡リスクは、それぞれのシグナリング経路の参照活性にさらに基づく。参照活性は、健康な対象から得られた血液試料及び既知の臨床転帰（例えば、敗血性ショックの回復、敗血性ショックによる死亡）を有する敗血症患者から得られた血液試料中で認められるそれぞれのシグナリング経路の活性を反映する。
本発明の目的のために、抽出されたＲＮＡに基づく遺伝子又は標的遺伝子の発現レベルの決定は、方法の一部であり、これは、方法が、当業者には公知の、又は本明細書に記載の方法を使用して患者から得られた血液試料から抽出されたＲＮＡ上で遺伝し又は標的遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む。方法は、ＲＮＡを抽出するために患者に由来する血液試料を取得するステップをさらに含む。或いは、発現レベルは、別々に決定されたものであり、除去ステップ（標的遺伝子の発現レベルの）は、本発明の方法における能動的なステップではない。そのような場合、発現レベルは、入力値、例えば、１つ又は複数の対照遺伝子発現レベルを参照した相対発現レベルとして提供される。
診断される対象における、３つ以上の遺伝子発現レベルのそれぞれと、３つ以上の参照発現レベルとを比較することによって、対象の状態（例えば、敗血症又は非敗血症、敗血症を発症する可能性、敗血症で死亡する可能性）に関する予測を行うことができる。或いは、参照経路活性のそれぞれと、診断される対象におけるそれぞれの経路活性のそれぞれとを比較することによって、それぞれの経路活性のそれぞれを含む血液試料の状態を決定できる。
本明細書で使用される場合、「発現レベル」とは、遺伝子から転写されるｍＲＮＡコピーの数を定量することを指す。一般に、この数は、絶対値ではなく相対値であり、したがって、好ましくは、例えば、１つ又は複数のハウスキーピング遺伝子の発現を参照して正規化される。ハウスキーピング遺伝子は、細胞型及び／又は細胞の機能的状態（すなわち、疾患を有する対象又は健康な対象に由来する）と関係なく一定の発現レベルを有すると推測される遺伝子であり、したがって、実験的に決定された相対発現レベルを正規化するために使用できる。ハウスキーピング遺伝子は、当業者には一般に公知であり、正規化のために使用できるハウスキーピング遺伝子の非限定例は、ベータ－アクチン、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及び転写因子ＩＩＤ ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）である。
発現レベルが好ましく分析される細胞シグナリング経路標的電子のセットは同定されており、或いは、好適な標的遺伝子を同定するための方法は、本明細書に記載される。例えば、数学的モデルによって経路活性を決定するための使用のために、それぞれの評価された細胞シグナリング経路に由来する３個以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子を分析して、経路活性を決定できる。
対象から得られる血液試料は、任意の型の血液試料であってよい、すなわち、血液は、例えば、カニューレを使用して引き出したものであり、全血又は単離されたＰＢＭＣ、単離されたＣＤ４＋細胞、混合したＣＤ８＋及びＴ細胞、単離された好中球若しくは単離された単球などの、血液の規定の画分である。好ましくは、試料は、全血である。提供される発明は、全血を、そこに含まれる細胞の多用途性にも拘わらず、前記血液試料の機能的状態を決定するための経路分析に使用でき、前記血液試料の前記機能的状態を、例えば、血液試料が得られた、敗血症を有するか、又は敗血症を有することが疑われる対象の診断及び予後診断のために使用できるという驚くべき知見に基づく。
かくして、１つ又は複数のシグナリング経路の活性を、感染を有する患者における敗血症の発症の早期予測、対象における敗血症の診断、敗血症を有する対象の敗血性ショックへの進行及び死亡リスクの予測、並びに敗血症を有する対象のための療法の選択にとって有用である、血液試料の機能的状態を特徴付けるバイオマーカーとして使用できる。
ある実施形態では、シグナリング経路測定は、ｑＰＣＲ、多重ｑＰＣＲ、多重化ｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、ＲＮＡｓｅｑ、ＲＮＡ発現アレイ又は質量分析を使用して実施される。例えば、遺伝子発現マイクロアレイデータ、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ、又はＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定装置のようなＲＮＡ配列決定法を使用できる。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、任意の生物を指す。一部の実施形態では、対象は、動物、好ましくは、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、医療対象などの、人間である。本発明は特定の対象群に必ずしも限定されないが、敗血症を有する対象又は敗血症を有すると疑われる対象又は敗血症を発症するリスクがある対象は、本明細書に記載される発明から最大の利益を得ることが明らかである。したがって、血液試料が得られた対象は、敗血症が別の手段（例えば、血液培養若しくは特許請求される方法による）で既に確定されている場合、敗血症を有する対象であるか、又は敗血症を有すると疑われる対象若しくは敗血症を発症するリスクがある対象であるのが好ましい。敗血症を有すると疑われる対象は、発熱、頻脈、及び／又は白血球増加若しくは白血球減少の存在などの、ＳＩＲＳ又は敗血症を定義する１つ又は複数の基準を満たす対象である。或いは、敗血症を有すると疑われる対象は、敗血症を有するか、又は発症するリスクがある対象、例えば、敗血症をもたらす感染を有する対象又はがん、糖尿病、免疫低下を有する対象、集中治療室で長時間費やした対象、出産予定日より早く生まれ、低いＡＰＧＡＲスコアを有する対象などである。対象はまた、敗血症を発症するリスクがある対象であってもよく、本明細書で使用される場合、「敗血症を発症するリスクがある対象」とは、現在は敗血症を有しないが、対象に敗血症を発症させる１つ又は複数の増加した危険因子、例えば、導尿カテーテル、開放創又はドレーンを有する創傷、血管内ラインなどの存在を有する対象を指す。
本明細書で使用される場合、用語「臨床パラメータ」とは、呼吸数、心拍数、血圧を指す。用語「臨床パラメータ」はさらに、発熱、悪寒、非常に低い体温、通常より少ない排尿、吐き気、嘔吐、下痢、疲労、虚弱、発疹だらけの肌若しくは変色した肌、発汗、べとべとした肌又は強い痛みから選択される症状を指してもよい。
本発明に従って使用される血液試料は、抽出された試料、すなわち、対象から抽出された試料であってもよい。試料の例としては、限定されるものではないが、全血試料、単離されたＰＢＭＣ、単離されたＣＤ４＋細胞、混合したＣＤ８＋及びＴ細胞、単離された好中球又は単離された単球が挙げられる。単離されたＰＢＭＣ、単離されたＣＤ４＋細胞、混合したＣＤ８＋及びＴ細胞、単離された好中球又は単離された単球は一般に、当業者には公知の方法によって全血試料から得られる。さらに、当業者であれば、採血するための従来の方法を使用して対象から全血試料を得るやり方に精通している。本明細書で使用される用語「試料」はまた、例えば、細胞、組織及び／又は体液が対象から採取された、例えば、顕微鏡スライド又は固定剤の上に置かれた場合、並びに特許請求される方法を実施するために、この試料の一部が、例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）によって、又は穿孔によって、又はスライドから目的の細胞を擦り取ることによって、又は蛍光活性化細胞選別技術によって抽出される場合も包含する。さらに、本明細書で使用される用語「試料」はまた、例えば、細胞、組織及び／又は体液が対象から採取され、顕微鏡スライド上に置かれた場合も包含し、特許請求される方法は、スライド上で実施される。好ましくは、試料は、体液、特に、全血、又は全血試料から単離された１つ若しくは複数の細胞型である。
用語「経路」、「シグナル伝達経路」、「シグナリング経路」及び「細胞シグナリング経路」は、本明細書では互換的に使用される。
「シグナリング経路の活性」は、試料中のシグナリング経路関連転写因子（ＴＦ）エレメントの活性を指し、ＴＦエレメントは、標的遺伝子の発現の駆動における、標的遺伝子の転写、すなわち、例えば、高い活性（すなわち、高速）若しくは低い活性（すなわち、低速）を単位として、標的遺伝子が転写される速度、又はそのような活性（例えば、速度）と関連するレベル、値若しくは同様のものなどの他の次元を制御する。したがって、本発明の目的のために、本明細書で使用される用語「活性」はまた、本明細書に記載の「経路分析」の間に中間結果として得られる活性レベルを指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「転写因子エレメント」（ＴＦエレメント）は、好ましくは、活性転写因子の中間体若しくは前駆体タンパク質若しくはタンパク質複合体、又は特定の標的遺伝子発現を制御する活性転写因子タンパク質若しくはタンパク質複合体を指す。例えば、タンパク質複合体は、１つ又は複数のコファクターと共に、それぞれのシグナリング経路タンパク質の１つの少なくとも細胞内ドメインを含有し、それによって、標的遺伝子の転写を制御する。好ましくは、この用語は、細胞内ドメインをもたらすそれぞれのシグナリング経路タンパク質の１つの切断によって誘発されるタンパク質又はタンパク質複合体転写因子を指す。
本明細書で使用される場合、用語「標的遺伝子」は、転写が、それぞれの転写因子エレメントによって直接的又は間接的に制御される遺伝子を意味する。「標的遺伝子」は、「直接標的遺伝子」及び／又は「間接標的遺伝子」（本明細書で使用される）である。
経路分析は、それぞれのシグナリング経路と関連する転写因子のよく検証された直接標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの測定値からシグナル伝達経路の活性を推測することに基づいて、血液細胞中のシグナル伝達経路活性の定量的測定を可能にする（例えば、Ｗ Ｖｅｒｈａｅｇｈら、２０１４、上掲；Ｗ Ｖｅｒｈａｅｇｈ、Ａ ｖａｎ ｄｅ Ｓｔｏｌｐｅ、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、２０１４、５（１４）：５１９６を参照されたい）。
これによれば、血液試料の機能的状態の決定及び／又は患者の診断若しくは死亡リスクの予測などのその後の使用が、シグナリング経路の参照活性のそれぞれの組合せにさらに基づくというのが本発明の実施形態である。同様に、シグナリング経路異常因子の決定は、それぞれのシグナリング経路の参照活性にさらに基づく。参照活性は、健康な対象の血液試料中に認められるそれぞれのシグナリング経路の活性を反映する。
参照経路活性のそれぞれと、診断される対象におけるそれぞれの経路活性のそれぞれとを比較することによって、それぞれの経路活性のそれぞれを含む血液試料の機能的状態を決定できる。血液試料の機能的状態は、それぞれの経路の活性が、それぞれの経路の参照活性から（異常に）逸脱しているかどうかを示す。次いで、血液試料の機能的状態は、診断又は死亡リスクに翻訳される。血液試料の機能的状態はまた、経路活性の組合せから直接的に計算される。血液試料の機能的状態は、多経路スコア、ＭＰＳと考えられ、対象が敗血症を有する可能性、又は敗血症の結果としての死亡のリスクを示す。したがって、「血液試料の機能的状態」は、経路活性の組合せを、対象が敗血症を有する可能性、又は敗血症の結果としての死亡のリスクと関連付ける次元、例えば、レベル又は値を指す。
本明細書で使用される場合、用語「敗血症」とは、感染に対する身体の応答が、その組織及び臓器に対する傷害を引き起こす場合に生じる状態を指す。敗血症は、感染によって誘発される炎症性免疫応答である。細菌感染は、最も一般的な原因であるが、真菌、ウイルス、及び原生動物感染も敗血症をもたらすことがある。一次感染の一般的な位置としては、肺、脳、尿路、皮膚、及び腹部臓器が挙げられる。
血液試料の機能的状態は、単一の細胞シグナリング経路活性又は「細胞シグナリング経路の活性の組合せ」に基づく。これは、血液試料の機能的状態が１つ又は複数の細胞シグナリング経路の活性によって影響されることを意味する。１つ又は複数の細胞シグナリング経路の活性を、本明細書に記載の数学モデルによって推測する、及び／又は組み合わせることができる。好ましい実施形態では、血液試料の機能的状態は、２つより多い細胞シグナリング経路の活性を含むシグナリング経路活性の組合せに基づく。シグナリング経路活性のそのような組合せは、３つ若しくは４つの、又はさらには５、６、７若しくは８つなどの４つより多くの、又はさらにより多くの、異なるシグナリング経路の活性を含む。
一般に、対象における２つ以上の細胞シグナリング経路の活性の組合せに基づくものである、血液試料の機能的状態を決定するために、多くの異なる式を考案することができる、すなわち、
ＭＰＳ＝Ｆ（Ｐｉ）＋Ｘであり、ｉ＝１．．．Ｎであり、
ここで、ＭＰＳは、血液試料の機能的状態及び／又はリスクスコアを示し（用語「ＭＰＳ」は、血液試料の機能的状態が２つ以上の細胞シグナリング経路の活性によって影響され得ることを示すために、「多経路スコア」の省略形として本明細書で使用される）、Ｐｉは、細胞シグナリング経路ｉの活性を示し、Ｎは、血液試料の機能的状態を算出するために使用される細胞シグナリング経路の総数を示し、Ｘは、式に入る可能なさらなる因子及び／又はパラメータの代用語である。そのような式は、より具体的には、所与の変数、又は変数の線形結合におけるある特定の程度の多項式である。そのような多項式における重み付け係数及び力は、専門知識に基づいて設定されるが、典型的には、上の式の重み付け係数及び力の推定値を得るために、既知の地上検証データ、例えば、生存データを含む訓練データセットが使用される。活性を、上の式を使用して組み合わせた後、ＭＰＳを生成する。次に、高いＭＰＳが、患者が敗血症を有する、及び／又は高い死亡リスクを有する、及びその逆であるより高い確率と相関するように、スコアリング関数の重み付け係数及び力を最適化する。既知のデータとのスコアリング関数の相関の最適化を、複数の分析技術、例えば、勾配降下法又は手動適合化などの標準的な最適化技術と併用した、Ｃｏｘ比例ハザード検定（好ましくは本明細書で使用されるもの）、ログランク検定、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ推定値を使用して行うことができる。
本明細書で使用される場合、用語「リスクスコア」又は「リスク因子」は一般に、血液試料の機能的状態に基づく対象に関する予測、リスク評価又は診断を指す。例えば、リスクスコアは、敗血症を有する対象の診断（対象が敗血症であるリスク）、敗血症の対象の死亡リスク、及び／又は非敗血症の対象が敗血症を発症するリスク、敗血症と以前に診断された対象の再発リスクである。
好ましくは、シグナリング経路の活性又は複数の活性の決定、複数の経路活性の組合せ及びその適用は、例えば、以下の文献に記載されたように実施される。それらはそれぞれ、それぞれのシグナリング経路の活性を決定する目的でその全体が本明細書に組み込まれる：国際特許出願公開ＷＯ２０１３０１１４７９（「ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＯＦ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＵＳＩＮＧ ＰＲＯＢＡＢＩＬＩＳＴＩＣ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＯＦ ＴＡＲＧＥＴ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」の表題）、ＷＯ２０１４１０２６６８（「ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＯＦ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＵＳＩＮＧ ＬＩＮＥＡＲ ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ（Ｓ） ＯＦ ＴＡＲＧＥＴ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＳ」の表題）、ＷＯ２０１５１０１６３５（「ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＯＦ ＴＨＥ ＰＩ３Ｋ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＵＳＩＮＧ ＭＡＴＨＥＭＡＴＩＣＡＬ ＭＯＤＥＬＬＩＮＧ ＯＦ ＴＡＲＧＥＴ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」の表題）、ＷＯ２０１６０６２８９１（「ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＯＦ ＴＧＦ－β ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＵＳＩＮＧ ＭＡＴＨＥＭＡＴＩＣＡＬ ＭＯＤＥＬＬＩＮＧ ＯＦ ＴＡＲＧＥＴ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」の表題）、ＷＯ２０１７０２９２１５（「ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＯＦ ＮＦＫＢ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＵＳＩＮＧ ＭＡＴＨＥＭＡＴＩＣＡＬ ＭＯＤＥＬＬＩＮＧ ＯＦ ＴＡＲＧＥＴ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」の表題）、ＷＯ２０１４１７４００３（「ＭＥＤＩＣＡＬ ＰＲＯＧＮＯＳＩＳ ＡＮＤ ＰＲＥＤＩＣＴＩＯＮ ＯＦ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＵＳＩＮＧ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ」の表題）、ＷＯ２０１６０６２８９２（「ＭＥＤＩＣＡＬ ＰＲＯＧＮＯＳＩＳ ＡＮＤ ＰＲＥＤＩＣＴＩＯＮ ＯＦ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＵＳＩＮＧ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ」の表題）、ＷＯ２０１６０６２８９３（「ＭＥＤＩＣＡＬ ＰＲＯＧＮＯＳＩＳ ＡＮＤ ＰＲＥＤＩＣＴＩＯＮ ＯＦ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＵＳＩＮＧ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ」の表題）、ＷＯ２０１８０９６０７６（「Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ＦＯＸＯ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ」の表題）、及び特許出願ＷＯ２０１８０９６０７６（「Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ＦＯＸＯ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ」の表題）、ＷＯ２０１９０６８５８５（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」の表題）、ＷＯ２０１９１２０６５８（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ＭＡＰＫ－ＭＡＰＫ－ＡＰ１ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」の表題）、ＷＯ２０１９０６８５４３（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ＪＡＫ－ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」の表題）、ＷＯ２０１９０６８５６２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ１／２ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」の表題）、及びＷＯ２０１９０６８６２３（「Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ」の表題）。
これらのモデルは、いくつかの細胞型上でＥＲ、ＡＲ、ＰＩ３Ｋ－ＦＯＸＯ、ＨＨ、Ｎｏｔｃｈ、ＴＧＨＧ－β、Ｗｎｔ、ＮＦκＢ、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ－ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３及びＭＡＰＫ－ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路について生物学的に検証されている。
発現レベルが好ましく分析される細胞シグナリング経路標的遺伝子の独自のセットが同定されている。数学的モデルにおける使用のために、それぞれの評価された細胞シグナリング経路に由来する３個以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子を分析して、経路活性を決定できる。
本発明の目的のために本明細書で好ましく適用される概念である、本明細書に開示される異なるシグナリング経路の活性を決定するための経路分析法に共通して、血液試料中に存在する細胞などの細胞中のシグナリング経路の活性は、シグナリング経路の１個又は複数の、好ましくは、３個以上の標的遺伝子の発現レベルを受け取ること、試料中のシグナリング経路関連転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルを決定することによって決定可能であり、ＴＦエレメントは、３個以上の標的遺伝子の転写を制御し、決定は、１個又は複数の、好ましくは、３個以上の標的遺伝子の発現レベルを、シグナリング経路の活性レベルと関連付ける較正された数学的経路モデルを評価すること、及び必要に応じて、シグナリング経路関連ＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づいて血液試料中に存在する細胞中のシグナリング経路の活性を推測することに基づく。本明細書に記載されるように、活性レベルは、血液試料の機能的状態及び／又は診断及び／又はリスクスコアを決定するための入力として直接使用でき、これも本発明によって企図される。
本明細書で使用される場合、ＴＦエレメントの「活性レベル」という用語は、その標的遺伝子の転写に関するＴＦエレメントの活性のレベルを示す。
較正された数学的経路モデルは、シグナリング経路関連ＴＦエレメントの活性レベルと、３個以上の標的遺伝子の発現レベルとを関連付ける条件的確率に基づく、確率モデル、好ましくは、ベイジアンネットワークモデルであるか、又は較正された数学的経路モデルは、３個以上の標的遺伝子の発現レベルの１つ若しくは複数の線形結合に基づく。本発明の目的のために、較正された数学的経路モデルは、好ましくは、センロトイド若しくは線形モデル、又は条件的確率に基づくベイジアンネットワークモデルである。
特に、対象における発現レベルの決定及び必要に応じて、シグナリング経路の活性の推測は、例えば、特に、（ｉ）対象の試料中で測定された細胞シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを含む入力のセットのための細胞シグナリング経路を表す、較正された確率経路モデル、好ましくは、ベイジアンネットワークの一部の評価、（ｉｉ）細胞シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の転写を制御する、シグナリング経路関連転写因子（ＴＦ）エレメントの、対象における活性レベルの推定であって、シグナリング経路関連ＴＦエレメントの活性レベルと、対象の試料中で測定された細胞シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルとを関連付ける条件的確率に基づく推定、及び必要に応じて（ｉｉｉ）対象の試料中のシグナリング経路関連ＴＦエレメントの推定された活性レベルに基づく細胞シグナリング経路の活性の推測によって実施される。これは、国際特許出願公開ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）に詳細に記載されており、その内容はその全体が本明細書に組み込まれる。
例示的な代替手段では、対象における発現レベルの決定及び必要に応じて、細胞シグナリング経路の活性の推測は、特に、（ｉ）対象の試料中での、細胞シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の転写を制御する、シグナリング経路関連ＴＦエレメントの活性レベルの決定であって、細胞シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルと、シグナリング経路関連ＴＦエレメントの活性レベルとを関連付ける、３個以上の標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の線形結合に基づく、較正された数学的経路モデルの評価に基づく決定、及び必要に応じて（ｉｉ）対象の試料中のシグナリング経路関連ＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づく、対象における細胞シグナリング経路の活性の推測によって実施される。これは、国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｎｅａｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ） ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ」）に詳細に記載されている。
標的遺伝子発現の数学的モデリングを使用する細胞シグナリング経路活性の推測に関するさらなる詳細は、Ｗ Ｖｅｒｈａｅｇｈら、２０１４、上掲に見出すことができる。
参考文献の迅速な同定を容易にするために、上記参考文献は、ここで目的の各シグナリング経路に割り当てられており、シグナリング経路の活性の決定にとって好適な例示的な対応する標的遺伝子が示されている。これに関して、上記参考文献と共に提供される標的遺伝子の配列表も特に参照される。
ＡＲ：ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３ １、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ及びＥＡＦ２（ＷＯ２０１３／０１１４７９、ＷＯ２０１４／１０２６６８）；ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３ １、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ、及びＥＡＦ２（ＷＯ２０１４／１７４００３）；ＴＧＦ－β：ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮＩＡ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＮＫＸ２－５、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＩＭＰ１及びＶＥＧＦＡ（ＷＯ２０１６／０６２８９１、ＷＯ２０１６／０６２８９３）；ＭＡＰＫ－ＡＰ－１：ＢＣＬ２Ｌ１１、ＣＣＮＤ１、ＤＤＩＴ３、ＤＮＭＴ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ２、ＥＺＲ、ＦＡＳＬＧ、ＦＩＧＦ、ＧＬＲＸ、ＩＬ２、ＩＶＬ、ＬＯＲ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＧＳ２、ＳＮＣＧ、ＴＩＭＰ１、ＴＰ５３及びＶＩＭ（ＷＯ２０１９／１２０６５８）；並びにＪＡＫ－ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３：ＡＫＴ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＤ１、ＣＤ２７４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＲＰ、ＦＧＦ２、ＦＯＳ、ＦＳＣＮ１、ＦＳＣＮ２、ＦＳＣＮ３、ＨＩＦ１Ａ、ＨＳＰ９０ａａ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ１０、ＪｕｎＢ、ＭＣＬ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＭＵＣ１、ＭＹＣ、ＮＯＳ２、ＰＯＵ２Ｆ１、ＰＴＧＳ２、ＳＡＡ１、ＳＴＡＴ１、ＴＩＭＰ１、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＩＭ及びＺＥＢ１（ＷＯ２０１９／０６８５４３）。
ある実施形態では、シグナリング経路測定は、ｑＰＣＲ、多重ｑＰＣＲ、多重化ｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、ＲＮＡｓｅｑ、ＲＮＡ発現アレイ又は質量分析を使用して実施される。例えば、遺伝子発現マイクロアレイデータ、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ、又はＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定装置のようなＲＮＡ配列決定法を使用できる。
較正された数学的経路モデルは、好ましくは、センロトイド若しくは線形モデル、又は条件的確率に基づくベイジアンネットワークモデルである。例えば、較正された数学的経路モデルは、血液試料の機能的状態及び／若しくはリスクスコアと、シグナリング経路の活性とを関連付ける条件的確率に基づく、確率モデル、好ましくは、ベイジアンネットワークモデルであるか、又は較正された数学的経路モデルは、シグナリング経路の活性の１つ若しくは複数の線形結合に基づく。
発現レベルが好ましく分析される細胞シグナリング経路標的遺伝子の独自のセットが同定されている。数学的モデルにおける使用のために、それぞれの評価された細胞シグナリング経路に由来する３個以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子を分析して、経路活性を決定できる。
非限定例として、以下の方法を使用して、シグナリング経路活性を決定するためのモデルを生成できる：複数のデータセットにおいて、異なる遺伝子の発現ＲＮＡレベルが、経路が活性であると仮定される試料及び経路が活性ではないと仮定される試料において決定される。発現レベルは、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルに基づいて正規化される。経路が活性であると仮定される、又は不活性であると仮定される試料の正規化された発現レベルに基づいて、閾値を決定でき、試料中の遺伝子の正規化された発現レベルが閾値より下である場合、経路は不活性である可能性がより高く、発現レベルが閾値より上である場合、経路は活性である可能性がより高い。この閾値に基づいて、敗血症を有するか、又は敗血症を有すると疑われる対象の血液試料中で決定された値が発現レベルに割り当てられ、経路活性が、発現レベルが決定される各遺伝子のこれらの値の合計として決定される、単純なモデルを構築できる。或いは、それぞれの経路の各遺伝子について得られた値を、健康な対象（すなわち、敗血症を有しない対象）に由来する参照血液試料中の前記遺伝子について得られた値と比較できる。
本発明の実施形態によれば、ＡＲシグナリング経路、ＴＧＦベータシグナリング経路、ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路及び／又はＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルの前記決定は、
好ましくは、ＡＲ経路の標的遺伝子のセットが、ＥＬＬ２、ＦＫＢＰ５、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＬＲＩＧ１、ＰＬＡＵ、ＰＭＥＰＡ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＳＧＫ１、ＮＤＲＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＤＨＣＲ２４若しくはＰＴＰＮ１からなる群から選択される３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２個の標的遺伝子を含む、ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３ １、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ及びＥＡＦ２からなる一覧から選択されるＡＲシグナリング経路の３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること、及び／又は；
好ましくは、ＴＧＦベータ経路の標的遺伝子のセットが、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＤ１、ＭＭＰ９、ＳＧＫ１、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ７、ＶＥＧＦＡ、ＪＵＮＢ、ＴＩＭＰ１、ＳＫＩＬ及びＣＣＫＮ１Ａからなる群から選択される３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２個の標的遺伝子を含む、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡからなる一覧から選択される３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定することを含む、ＴＧＦベータシグナリング経路の３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること、及び／又は；
好ましくは、ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路の標的遺伝子のセットが、ＤＮＭＴ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ２、ＧＬＲＸ、ＭＭＰ９、ＰＬＡＵＲ、ＴＩＭＰ１、ＬＯＲ、ＥＺＲ、ＤＤＩＴ３及びＴＰ５３からなる群から選択される３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは１１個の標的遺伝子を含む、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＣＣＮＤ１、ＤＤＩＴ３、ＤＮＭＴ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ２、ＥＺＲ、ＦＡＳＬＧ、ＦＩＧＦ、ＧＬＲＸ、ＩＬ２、ＩＶＬ、ＬＯＲ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＧＳ２、ＳＮＣＧ、ＴＩＭＰ１、ＴＰ５３、及びＶＩＭからなる一覧から選択される３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定することを含む、ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること、及び／又は；
好ましくは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路の標的遺伝子のセットが、ＢＣＬ２、ＢＩＲＣ５、ＣＤ２７４、ＦＯＳ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ９、ＳＴＡＴ１、ＴＩＭＰ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＰＯＵ２Ｆ１及びＩＣＡＭ１からなる群から選択される３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子を含む、ＡＫＴ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＤ１、ＣＤ２７４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＲＰ、ＦＧＦ２、ＦＯＳ、ＦＳＣＮ１、ＦＳＣＮ２、ＦＳＣＮ３、ＨＩＦ１Ａ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ１０、ＪｕｎＢ、ＭＣＬ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＭＵＣ１、ＭＹＣ、ＮＯＳ２、ＰＯＵ２Ｆ１、ＰＴＧＳ２、ＳＡＡ１、ＳＴＡＴ１、ＴＩＭＰ１、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＩＭ、及びＺＥＢ１からなる一覧から選択される３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定することを含む、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること
を含む。
したがって、ある実施形態では、本発明による方法は、血液試料が得られた対象を診断するステップであって、
－ 臨床パラメータ、及び
－ 血液試料の機能的状態
に基づいて、前記対象が、敗血症を有すると診断されるか、又は前記対象が敗血症を有しないと診断される、ステップ
を含み、方法は、対象の血液試料の機能的状態と、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた血液試料の少なくとも１つの機能的状態とを比較することをさらに含む。好ましい実施形態では、血液試料の機能的状態が、ＡＲシグナリング経路活性が健康な、又は非敗血症の対照から得られた対照血液試料中で決定されたＡＲシグナリング経路活性よりも高いと決定されたＡＲシグナリング経路活性を含み、血液試料が得られた対象が、敗血症と関連する少なくとも１つの臨床パラメータを有する場合、対象は敗血症を有すると診断される。対象から得られた血液試料上で決定された経路活性を使用して、前記対象が敗血症を有するか、又は有しないかを診断できることが、本発明者らによって見出された。実験データにおいて詳述されるように、ＡＲシグナリング経路の決定は、敗血症を有する対象から得られた血液試料と、健康な個体から得られた血液試料とを区別するのに十分である。必要に応じて、ＴＧＦベータシグナリング経路活性、ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性、及び／又はＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性などの、他の経路活性を診断に含有させてもよい。したがって、本明細書で決定される血液試料の機能的状態を、対象を迅速に診断するための診断手段として使用できる。
ＡＲ経路に由来する３個以上の標的遺伝子の血液試料中の発現レベルに基づいて、ＡＲシグナリング経路活性、かくして、血液試料の機能的状態を決定できる。このＡＲシグナリング経路を、定量値として表し、健康な対象又は既知の敗血症の対象から得られた血液試料上で決定されたＡＲシグナリング経路活性と比較できる。したがって、対象を診断するステップは、好ましくは、対象の血液試料の機能的状態と、既知の敗血症患者から得られた血液試料の機能的状態とを比較することをさらに含む。診断ステップは血液試料の機能的状態に基づくため、このステップは、必要に応じて、ＴＧＦベータ、ＭＡＰＫ－ＡＰ１、及び／又はＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性が決定された場合、決定されたそれらをさらに使用する。さらなる経路を含有させることによって、診断の確実性はさらに改善される。
血液試料の機能的状態は、数値として表される少なくともＡＲシグナリング経路活性を含む。かくして、対象に由来する血液試料の機能的状態と、健康な対象から得られた対照血液試料の機能的状態とを比較することによって、少なくともＡＲシグナリング経路活性によって表される数値の差異又は類似性に基づいて診断を行うことができる。したがって、前記比較は、好ましくは、精度を増大させるために参照血液試料の複数の機能的状態を使用して行われる。より好ましくは、前記比較は、既知の敗血症の対象から得られた血液試料の、１つ又は複数の、好ましくは、複数の追加の参照機能的状態と比較することをさらに含む。
例えば、健康な個体の複数の参照血液試料を使用する場合、ＡＲシグナリング経路活性を、それぞれの試料について算出し、平均値を決定できる。診断しようとする対象のＡＲシグナリング経路活性は、平均参照ＡＲシグナリング経路活性と類似してもよく（例えば、算出された平均活性の１又は２標準偏差以内）、その場合、対象は敗血症を有しないと診断される。或いは、ＡＲシグナリング経路は、算出された平均ＡＲシグナリング経路活性と比較して高くてもよく（例えば、平均値より少なくとも１又は２標準偏差高い）、その場合、対象は、敗血症を有すると診断される。必要に応じて、他の経路活性を、この比較に含有させてもよい。同じ方法が、診断しようとする対象に由来する試料及び参照試料について使用されるという条件で、シグナリング経路活性を算出するために使用される方法に関係なく、上記方法を使用できる。
好ましくは、敗血症を有する対象を診断するために、ＡＲシグナリング経路、ＴＧＦベータシグナリング経路、ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路及び／又はＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルの決定は、
３個以上、例えば、３、４、若しくは５個の標的遺伝子が、ＦＫＢＰ５、ＬＲＩＧ１、ＰＭＥＰＡ１、ＤＨＣＲ２４及びＬＣＰ１からなる群から選択される、ＡＲシグナリング経路の３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること、及び／又は；
３個以上、例えば、３、４、若しくは５個の標的遺伝子が、ＭＭＰ９、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＴＩＭＰ１及びＳＭＡＤ５からなる群から選択される、ＴＧＦベータシグナリング経路の３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること、及び／又は；
３個以上、例えば、３、４、若しくは５個の標的遺伝子が、ＭＭＰ９、ＴＩＭＰ１、ＤＮＭＴ１、ＦＡＳＬＧ及びＰＬＡＵＲからなる群から選択される、ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路の３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定することを含む、ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること、及び／又は；
３個以上、例えば、３、４、若しくは５個の標的遺伝子が、ＭＭＰ９、ＢＣＬ２、ＴＩＭＰ２、ＨＳＰＡ１Ａ及びＨＳＰＡ１ＡＢからなる群から選択される、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること
を含む。
したがって、本発明はさらに、対象から得られた血液試料から抽出されたＲＮＡに基づいて、対象を診断するための方法であって、
－ ＡＲ経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＡＲシグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＡＲシグナリング経路活性を決定するステップ；
及び必要に応じて、
－ ＴＧＦベータ経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＴＧＦベータシグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＴＧＦベータシグナリング経路活性を決定するステップ；
－ ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性を決定するステップ；
－ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性を決定するステップ；
を含み、血液試料が得られた対象を診断するステップをさらに含み、
－ 臨床パラメータ、及び
－ 血液試料中の決定されたシグナリング経路の活性
に基づいて、前記対象が、敗血症を有すると診断されるか、又は前記対象が敗血症を有しないと診断され、
対象の血液試料中の決定されたシグナリング経路の活性と、健康な対象又は非敗血症の対照となる対象から得られた少なくとも１つの血液試料中の決定されたシグナリング経路の活性とを比較することをさらに含み、
前記血液試料が、敗血症を有する対象から得られるか、又は敗血症を有すると疑われる対象若しくは敗血症を発症するリスクがある対象から得られる、方法に関する。好ましい実施形態では、ＡＲシグナリング経路活性が、健康な、又は非敗血症の対照から得られた対照血液試料中で決定されたＡＲシグナリング経路活性よりも高いと決定され、血液試料が得られた対象が、敗血症と関連する少なくとも１つの臨床パラメータを有する場合、対象は敗血症を有すると診断される。
したがって、本発明のある実施形態では、血液試料の機能的状態が、ＡＲシグナリング経路活性が健康な対象から得られた参照血液試料中で決定されたＡＲシグナリング経路活性よりも高いと決定されたＡＲシグナリング経路活性を含む場合、対象は敗血症を有すると診断される。或いは、診断は、３個以上の遺伝子の発現レベルに直接基づくものであってよい。或いは、比較は、既知の敗血症の対象から得られた参照血液試料をさらに含んでもよい。そのような場合、対象の３個以上の遺伝子の発現レベル又は血液試料の機能的状態を、健康な個体の３個以上の遺伝子の発現レベル又は血液試料の機能的状態と、既知の敗血症の対象の３個以上の遺伝子の発現レベル又は血液試料の機能的状態との両方と比較できる。そのような場合、ＡＲシグナリング経路活性（及び決定された場合、他の経路活性）に割り当てられた数値を比較できる。例えば、対象が既知の敗血症の対象に関する平均値に近い、例えば、１若しくは２標準偏差以内であるＡＲシグナリング経路を有する場合、対象は敗血症を有すると診断されるか、又はその値が健康な対象に関する平均値に近い、例えば、１若しくは２標準偏差以内である場合、対象は非敗血症と診断される。或いは、統計的方法を使用して、対象が非敗血症又は敗血症群にある可能性がより高いかどうかを決定できる（ＡＲシグナリング経路に割り当てられた数値が、正常な（健康な）平均により近いか、又は敗血症の平均値により近いことを意味する）。他のシグナリング経路活性を、必要に応じて、この算出に含有させてもよい。診断ステップのための複数のシグナリング経路活性、例えば、ＡＲシグナリング経路活性と、ＴＧＦベータシグナリング経路活性との両方を使用する場合、診断しようとする対象が健康群又は敗血症群に入るかどうかを確立するために、クラスタリング法を使用して、健康な対照となる対象、既知の敗血症の対象及び診断しようとする対象をクラスター化する。本明細書で使用される場合、既知の敗血症の対象に由来する参照血液試料は、例えば、血液培養により、後に敗血症の診断が確定された対象から得られた血液試料である。
本発明による方法の実施形態では、３個以上の遺伝子の前記発現レベルは、血液試料が得られた対象の死亡リスクを予測するのに使用され、
前記予測は、対象の３個以上の遺伝子の発現レベルと、参照対象から得られた３個以上の遺伝子の複数の参照発現レベルとの比較に基づくものであり、参照対象から得られた３個以上の遺伝子の前記複数の参照発現レベルは、非生存者である敗血症を有する対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベル及び生存者である敗血症を有する対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルを含み、必要に応じて、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルをさらに含み、
血液試料が得られた対象は、敗血症を有すると確定され、
敗血症を有する対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルが、生存者である敗血症を有する参照対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルと類似している場合又は敗血症を有する対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルが、少なくとも１の健康な、若しくは非敗血症の対照となる対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルと類似している場合、低い死亡リスクが予測され、
敗血症を有する対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルが、非生存者である敗血症を有する参照対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルと類似している場合、高い死亡リスクが予測される。
本発明の代替的な実施形態では、血液試料の機能的状態は、血液試料が得られた対象の死亡リスクを予測するのに使用され、
前記予測は、対象の血液試料の機能的状態と、参照対象から得られた血液試料の複数の参照機能的状態との比較に基づくものであり、参照対象から得られた血液試料の前記複数の参照機能的状態は、非生存者である敗血症を有する対象から得られた血液試料の少なくとも１つの機能的状態及び生存者である敗血症を有する対象から得られた血液試料の少なくとも１つの機能的状態を含み、必要に応じて、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた血液試料の少なくとも１つの機能的状態をさらに含み、
血液試料が得られた対象は、敗血症を有すると確定され、
敗血症を有する対象から得られた血液試料の機能的状態が、生存者である敗血症を有する参照対象から得られた血液試料の少なくとも１つの機能的状態と類似する場合又は敗血症を有する対象から得られた血液試料の機能的状態が、少なくとも１の健康な、若しくは非敗血症の対照となる対象から得られた血液試料の少なくとも１つの機能的状態と類似している場合、低い死亡リスクが予測され、
敗血症を有する対象から得られた血液試料の機能的状態が、非生存者である敗血症を有する参照対象から得られた血液試料の少なくとも１つの機能的状態と類似している場合、高い死亡リスクが予測される。
ある実施形態では、対象から得られた血液試料の３個以上の遺伝子又は機能的状態と、対照となる対象から得られた血液試料の複数の機能的状態との前記比較は、好ましくは、階層的クラスタリングによる、決定された経路活性のクラスタリングを使用して実施される。
死亡リスクに関する予測は、対象から得られた血液試料の３個以上の標的遺伝子又は機能的状態に基づいて行うことができることが本発明者らによって見出された。対象に由来する血液試料の３個以上の標的遺伝子の発現レベル又は機能的状態と、死亡した、及び生存した敗血症の対象の参照試料とを比較することによって、対象が敗血症で死亡する可能性を算出できる。異なる決定されたシグナリング経路活性、例えば、ＡＲシグナリング活性、又はＡＲとＴＧＦベータとのシグナリング活性の組合せを表す数値を使用し、これらの値と、参照群について得られた値とを比較することによって、この予測を行うことができる。或いは、この予測は、３個以上の遺伝子の発現レベルに直接基づくものであってよい。統計的方法を使用して、又は例えば、クラスタリングを使用することによって、この比較を行うことができる。クラスタリングを使用する場合、対象は、対象が、死亡した参照対象と一緒にクラスター化される場合に高い死亡リスクを有すると予測されるか、又は生存した参照対象と一緒にクラスター化される場合に低い死亡リスクを有すると予測される。
好ましくは、予測は、敗血症を有する患者から得られた血液試料に対して実施される、本発明による方法において行われる。好ましくは、予測は、例えば、本明細書に記載の方法によって、対象が敗血症を有すると既に確立された対象について行われる。
好ましくは、予測は、対象から得られた血液試料の３個以上の遺伝子の発現レベル又は機能的状態と、対照となる対象から得られた血液試料の３個以上の遺伝子の複数の発現レベル又は機能的状態との前記比較が、好ましくは、階層的クラスタリングによる、決定された経路活性のクラスタリングを使用して実施される、本発明による方法において行われる。決定されたシグナリング活性に基づくクラスタリングによって、結果として敗血症で死亡する敗血症患者から得られた試料を同定できる。したがって、対象から得られた血液試料中で決定されたシグナリング活性と、既知の参照患者とを比較することによって、それぞれのシグナリング活性が死亡した患者とクラスター化する場合、死亡リスクを高いと予測できるか、又はそれぞれのシグナリング活性が生存した患者とクラスター化する場合、リスクを低いと予測できる。
好ましくは、敗血症を有する対象の生存確率を予測するために、ＡＲシグナリング経路、ＴＧＦベータシグナリング経路、ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路及び／又はＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルの決定は、
３個以上、例えば、３、４、若しくは５個の標的遺伝子が、ＥＬＬ２、ＦＫＢＰ５、ＥＡＦ２、ＮＤＲＧ１及びＤＨＣＲ２４からなる群から選択される、ＡＲシグナリング経路の３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること、及び／又は；
３個以上、例えば、３、４、若しくは５個の標的遺伝子が、ＩＤ１、ＳＫＩＬ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＨＭＧＡ２及びＳＭＡＤ４からなる群から選択される、ＴＧＦベータシグナリング経路の３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること、及び／又は；
３個以上、例えば、３、４、若しくは５個の標的遺伝子が、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＥＺＲ、ＥＮＰＰ２、ＭＭＰ３及びＰＬＡＵＲからなる群から選択される、ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路の３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定することを含む、ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること、及び／又は；
３個以上、例えば、３、４、若しくは５個の標的遺伝子が、ＢＩＲＣ５、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＭＭＰ３、ＩＬ１０、ＨＩＦ１Ａからなる群から選択される、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定すること
を含む。
したがって、ある実施形態では、本発明は、３個以上の遺伝子の前記発現レベルが、血液試料が得られた対象の死亡リスクを予測するのに使用され、
前記予測が、対象の３個以上の遺伝子の発現レベルと、参照対象から得られた３個以上の遺伝子の複数の参照発現レベルとの比較に基づくものであり、参照対象から得られた３個以上の遺伝子の前記複数の参照発現レベルが、非生存者である敗血症を有する対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベル及び生存者である敗血症を有する対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルを含み、必要に応じて、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルをさらに含み、
血液試料が得られた対象が、敗血症を有すると確定され、
敗血症を有する対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルが、生存者である敗血症を有する参照対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルと類似している場合又は敗血症を有する対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルが、少なくとも１の健康な、若しくは非敗血症の対照となる対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルと類似している場合、低い死亡リスクが予測され、
敗血症を有する対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルが、非生存者である敗血症を有する参照対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルと類似している場合、高い死亡リスクが予測される、方法に関する。
代替的な実施形態では、本発明は、対象に由来する血液試料から抽出されたＲＮＡに基づいて、対象の死亡リスクを決定するための方法であって、
－ ＡＲ経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＡＲシグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＡＲシグナリング経路活性を決定するステップ；
及び必要に応じて、
－ ＴＧＦベータ経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＴＧＦベータシグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＴＧＦベータシグナリング経路活性を決定するステップ；
－ ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性を決定するステップ；
－ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性を決定するステップ
を含み、
血液試料中のシグナリング経路活性が、血液試料が得られた対象の死亡リスクを予測するのに使用され、
前記予測が、対象の血液試料中のシグナリング経路活性と、参照対象から得られた複数の血液試料中のシグナリング経路活性との比較に基づくものであり、参照対象から得られた複数の血液試料中の前記シグナリング経路活性が、非生存者である敗血症を有する対象から得られた少なくとも１つの血液試料及び生存者である敗血症を有する対象から得られた少なくとも１つの血液試料を含み、必要に応じて、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた少なくとも１つの血液試料をさらに含み、
血液試料が得られた対象が、敗血症を有すると確定され、
敗血症を有する対象から得られた血液試料中のシグナリング経路活性が、生存者である敗血症を有する参照対象から得られた少なくとも１つの血液試料中のシグナリング経路活性と類似している場合又は敗血症を有する対象から得られた血液試料中のシグナリング経路活性が、健康な、若しくは非敗血症の対照となる対象から得られた少なくとも１つの血液試料中のシグナル経路活性と類似している場合、低い死亡リスクが予測され、
敗血症を有する対象から得られた血液試料中のシグナリング経路活性が、非生存者である敗血症を有する参照対象から得られた少なくとも１つの血液試料中のシグナリング経路活性と類似している場合、高い死亡リスクが予測される、方法に関する。
ある実施形態では、対象から得られた血液試料中の３個以上の遺伝子の発現レベル又はシグナリング経路活性と、対照となる対象から得られた複数の血液試料中の３個以上の遺伝子の発現レベル又はシグナリング経路活性との前記比較は、好ましくは、階層的クラスタリングによる、決定された経路活性のクラスタリングを使用して実施される。
さらなる実施形態では、血液試料が得られた対象は、敗血症を有せず、３個以上の遺伝子の発現レベルは、対象が敗血症を発症するリスクを決定するために使用され、方法は、血液試料が得られた対象の３個以上の遺伝子の発現レベルと、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルとを比較することをさらに含む。
代替的な実施形態では、血液試料が得られた対象は、敗血症を有せず、血液試料の機能的状態は、対象が敗血症を発症するリスクを決定するために使用され、
方法は、血液試料が得られた対象の血液試料の機能的状態と、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた血液試料の少なくとも１つの機能的状態とを比較することをさらに含み、
好ましくは、血液試料が得られた対象は、血液試料の機能的状態が、ＡＲシグナリング経路活性が健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた対照血液試料中で決定されたＡＲシグナリング経路活性よりも高いと決定されたＡＲシグナリング経路活性を含む場合、敗血症を発症するリスクがあると予測される。好ましい実施形態では、敗血症を有しない対象に関する敗血症を発症するリスクの予測は、ＴＧＦベータシグナリング経路活性にさらに基づくものであり、対象は、ＴＧＦベータシグナリング経路活性が、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた対照血液試料中で決定されたＴＧＦベータシグナリング経路活性よりも高いと決定された場合、敗血症を発症するリスクがある。より好ましい実施形態では、ＡＲとＴＧＦベータとの両方のシグナリング経路活性が、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた対照血液試料中で決定されたＡＲ及びＴＧＦベータシグナリング経路活性よりも高いと決定された場合、血液試料が得られた対象は、敗血症を有せず、敗血症を発症するリスクがあると決定される。好ましくは、敗血症を有しない対象は、細菌感染を有する対象である。
敗血症を有しないが、敗血症を発症するリスクがある患者、例えば、細菌感染を有する患者において、ＡＲ及び必要に応じて、ＴＧＦベータシグナリング経路活性の増加と相関する、敗血症を発症するリスクが高い患者を、高リスクとして同定できることが、本発明者らによって見出された。
したがって、本発明はさらに、対象に由来する血液試料から抽出されたＲＮＡに基づいて、非敗血症の対象が敗血症を発症するリスクを決定するための方法であって、
－ ＡＲ経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＡＲシグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＡＲシグナリング経路活性を決定するステップ；
及び必要に応じて、
－ ＴＧＦベータ経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＴＧＦベータシグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＴＧＦベータシグナリング経路活性を決定するステップ；及び／又は
－ ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性を決定するステップ；及び／又は
－ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性を決定するステップ
を含み、
血液試料中のシグナリング経路活性が、対象が敗血症を発症するリスクを決定するために使用され、
血液試料が得られた対象が、敗血症を有せず、
血液試料が得られた対象の血液試料中のシグナリング経路活性と、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた少なくとも１つの血液試料中のシグナリング経路活性とを比較することをさらに含む、方法に関する。
好ましくは、敗血症を有しない対象は、細菌感染を有する対象である。
ある実施形態では、血液試料が得られた対象は、ＡＲシグナリング経路活性が、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた対照血液試料中で決定されたＡＲシグナリング経路活性よりも高いと決定された場合、敗血症を発症するリスクがあると予測される。
本発明のさらなる実施形態では、血液試料が得られた対象は敗血症から回復しており、血液試料の３個以上の遺伝子の発現レベルは、対象が敗血症の再発を生じるリスクをモニタリングするために使用され、
方法は、血液試料が得られた対象の３個以上の遺伝子の発現レベルと、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた３個以上の遺伝子の発現レベルとを比較することをさらに含む。
代替的な実施形態では、血液試料が得られた対象は、敗血症から回復しており、血液試料の機能的状態は、対象が敗血症の再発を生じるリスクをモニタリングするために使用され、
方法は、血液試料が得られた対象の血液試料の機能的状態と、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた血液試料の少なくとも１つの機能的状態とを比較することをさらに含み、
好ましくは、血液試料が得られた対象は、血液試料の機能的状態が、ＡＲシグナリング経路活性が健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた対照血液試料中で決定されたＡＲシグナリング経路活性よりも高いと決定されたＡＲシグナリング経路活性を含む場合、敗血症の再発を生じるリスクがあると予測される。好ましい実施形態では、敗血症から回復した対象に関する敗血症の再発を生じるリスクの予測は、ＴＧＦベータシグナリング経路活性にさらに基づくものであり、対象は、ＴＧＦベータシグナリング経路活性が、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた対照血液試料中で決定されたＴＧＦベータシグナリング経路活性よりも高いと決定された場合、敗血症の再発を生じるリスクがある。より好ましい実施形態では、ＡＲとＴＧＦベータとの両方のシグナリング経路活性が、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた対照血液試料中で決定されたＡＲ及びＴＧＦベータシグナリング経路活性よりも高いと決定された場合、敗血症から回復した対象は、敗血症の再発を生じるリスクがあると決定される。
敗血症の回復後、患者は長期間にわたって敗血症の再発を生じやすいままであることが見出された。本発明者らは、より高い再発リスクが、ＡＲ及びＴＧＦベータシグナリング経路活性の増大と相関すること、並びにＡＲシグナリング経路活性のみに基づいて、又はＴＧＦベータシグナリング経路活性と組み合わせた場合、敗血症の再発を生じるリスクがある対象を同定できることを証明する。
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、対象に由来する血液試料から抽出されたＲＮＡに基づいて、敗血症から回復した対象の再発リスクを決定するための方法であって、
－ ＡＲ経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＡＲシグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＡＲシグナリング経路活性を決定するステップ；
及び必要に応じて、
－ ＴＧＦベータ経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＴＧＦベータシグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＴＧＦベータシグナリング経路活性を決定するステップ；及び／又は
－ ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性を決定するステップ；及び／又は
－ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するか、又はその決定の結果を受け取るステップ；
－ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性を決定するステップ
を含み、
血液試料が得られた対象が、敗血症から回復しており、血液試料のシグナリング経路活性が、対象が敗血症の再発を生じるリスクをモニタリングするために使用され、
血液試料が得られた対象の血液試料中のシグナリング経路活性と、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた少なくとも１つの血液試料中のシグナリング経路活性とを比較することをさらに含む、方法に関する。
ある実施形態では、血液試料が得られた対象は、ＡＲシグナリング経路活性が、健康な、又は非敗血症の対照となる対象から得られた対照血液試料中で決定されたＡＲシグナリング経路活性よりも高いと決定された場合、敗血症の再発を生じるリスクがあると予測される。
本発明の好ましい実施形態によれば、血液試料は、全血試料、単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、単離されたＣＤ４＋細胞、単離されたＣＤ８＋細胞、調節性Ｔ細胞、混合したＣＤ８＋及びＴ細胞、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、樹状細胞、単離された好中球、単離されたリンパ球又は単離された単球である。
本発明の実施形態では、前記シグナリング経路活性又は複数のシグナリング経路活性は、血液試料から抽出されたＲＮＡに基づいて経路又は複数の経路について決定された３つ以上の発現レベルと、シグナリング経路又は複数のシグナリング経路の活性又は複数の活性とを関連付ける較正された数学的モデルを評価することに基づいて決定される。
本発明の好ましい実施形態によれば、血液試料の機能的状態は、血液試料中のシグナリング経路の活性と、数値とを関連付ける較正された数学的モデルを評価することに基づいて決定される。診断しようとする対象の血液試料の機能的状態を決定し、必要に応じて、診断又は死亡リスクを提供するためにこの機能的状態をさらに使用するために経路活性の組合せを解釈するように、このモデルをプログラミングする。特に、血液試料の機能的状態の決定は、（ｉ）診断しようとする対象の血液試料中のそれぞれのシグナリング経路の活性を受け取ること、（ｉｉ）決定が、それぞれのシグナリング経路の活性と、血液試料の機能的状態とを関連付ける較正された数学的モデルを評価することに基づくものである、前記対象の血液試料の機能的状態を決定することを含む。
較正された数学的経路モデルは、好ましくは、センロトイド若しくは線形モデル、又は条件的確率に基づくベイジアンネットワークモデルである。例えば、較正された数学的経路モデルは、血液試料の機能的状態及びシグナリング経路の活性を関連付ける条件的確率に基づく、確率モデル、好ましくは、ベイジアンネットワークモデルであるか、又は較正された数学的経路モデルは、シグナリング経路の活性の１つ若しくは複数の線形結合に基づく。
数学的モデルによれば、シグナリング経路の活性は、血液試料の機能的状態を提供するように解釈され、これは、さらに診断に翻訳されるか、又は診断を直接提供するように解釈される。血液試料の機能的状態は、対象が敗血症を有する確率及び／又は敗血症を有する対象が敗血性ショックの結果として死亡する確率を予測又は提供する。
したがって、診断の決定又は死亡リスクの決定は、血液試料中の細胞シグナリング経路の活性の組合せに基づいて血液試料の機能的状態を決定すること、及び機能的状態を診断又は死亡リスクに翻訳することを含む。本発明の好ましい実施形態によれば、それぞれのシグナル経路の活性は、本明細書に記載の経路分析によって決定されるか、又は決定可能である。
したがって、本発明の好ましい実施形態では、方法は、対象から得られた血液試料を提供するステップ、及び前記血液試料からＲＮＡを抽出するステップを含む。
本発明のある実施形態では、対象は、小児対象である。
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様及びその様々な実施形態の方法を実施するためのコンピュータに実装された方法に関する。
第３の態様によれば、本発明は、血液試料の機能的状態を決定するため、及び／又は敗血症を有する対象を診断するため、及び／又は対照の死亡リスクを予測するための装置であって、本発明の第１の態様及びその様々な実施形態の方法を実行するためのデジタルプロセッサを含む、装置に関する。好ましい実施形態では、本発明は、血液試料の機能的状態を決定するための装置であって、ＡＲシグナリング経路の３個以上の標的遺伝子に関する標的遺伝子発現プロファイルを示すデータ、必要に応じて、ＴＧＦベータシグナリング経路及び／又はＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子に関する標的遺伝子発現プロファイルを示すデータを受け取るための入力装置を含む、上記方法を実行するためのデジタルプロセッサを含む、装置に関する。
第４の態様によれば、本発明は、血液試料の機能的状態を決定するため、及び／又は敗血症を有する対象を診断するため、及び／又は対照の死亡リスクを予測するための非一時的記録媒体であって、本発明の第１の態様及びその様々な実施形態の方法を実施するためにデジタルプロセッシングデバイスによって実行可能である指示を記憶している非一時的記録媒体に関する。好ましい実施形態では、本発明は、プログラムがコンピュータによって実行された場合に、コンピュータに、
－ ＡＲシグナリング経路の３個以上の標的遺伝子に関する標的遺伝子発現プロファイルを示すデータを受け取ること、必要に応じて、ＴＧＦベータシグナリング経路及び／又はＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路及び／又はＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の標的遺伝子発現レベルを示すデータをさらに受け取ること、
－ ＡＲシグナリング経路及び必要に応じて、ＴＧＦベータシグナリング経路及び／又はＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路及び／又はＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路の前記３個以上の標的遺伝子の決定された発現レベルに基づいて、ＡＲシグナリング経路活性、及び必要に応じて、ＴＧＦベータシグナリング経路活性及び／又はＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性及び／又はＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性を決定すること、
－ 決定されたＡＲシグナリング経路活性及び必要に応じて、ＴＧＦベータシグナリング経路活性及び／又はＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性及び／又はＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性に基づいて、血液試料の機能的状態であって、決定されたＡＲシグナリング経路活性及び必要に応じて、ＴＧＦベータシグナリング経路活性及び／又はＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性及び／又はＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性を有すると決定されている、前記血液試料の前記機能的状態を決定すること、並びに
－ 必要に応じて、血液試料の機能的状態に基づいて診断又は予測を提供すること
を含む方法を実行させる指示を含むコンピュータプログラム製品に関する。
非一時的記録媒体は、ハードドライブ又は他の磁気記録媒体、光ディスク若しくは他の光記録媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリ、又は他の電子記録媒体、ネットワークサーバーその他などのコンピュータ可読記録媒体であってよい。デジタルプロセッシングデバイスは、携帯用デバイス（例えば、携帯情報端末又はスマートフォン）、ノートブックコンピュータ、デスクトップコンピュータ、タブレットコンピュータ又はデバイス、リモートネットワークサーバーその他であってもよい。
第５の態様によれば、本発明は、血液試料の機能的状態を決定するため、及び／又は敗血症を有する対象を診断するため、及び／又は対象の死亡リスクを予測するためのコンピュータプログラムであって、コンピュータプログラムがデジタルプロセッシングデバイス上で動作する時に、デジタルプロセッシングデバイスに、本発明の第１の態様及びその様々な実施形態による方法を実施させるためのプログラムコード手段を含む、コンピュータプログラムに関する。コンピュータプログラムを、他のハードウェアと一緒に、又はその一部として供給される、光記録媒体又はソリッドステート媒体などの好適な媒体上に保存／分配できるが、インターネット又は他の有線若しくは無線電気通信システムなどを介して他の形態で分配することもできる。
第６の態様では、本発明は、３個以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の遺伝子の発現レベルを決定するためのプライマー及び必要に応じて、プローブを含む、キットオブパーツであって、
３個以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の遺伝子が、グループ１及びグループ２から選択され、グループ１が、ＡＢＣＣ４、ＡＰＰ、ＡＲ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＤＨＣＲ２４、ＥＡＦ２、ＥＬＬ２、ＦＧＦ８、ＦＫＢＰ５、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＩＧＦ１、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＬＣＰ１、ＬＲＩＧ１、ＮＤＲＧ１、ＮＫＸ３＿１、ＮＴＳ、ＰＬＡＵ、ＰＭＥＰＡ１、ＰＰＡＰ２Ａ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＮ１、ＳＧＫ１、ＴＡＣＣ２、ＴＭＰＲＳＳ２、及びＵＧＴ２Ｂ１ ５からなり、
グループ２が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＮＫＸ２＿５、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＩＭＰ１及びＶＥＧＦＡからなる、キットオブパーツに関する。
プライマー及びプローブの設計は、遺伝子検出及び定量化の分野における日常的な技術である。プライマーを、例えば、プライマー３（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｉｍｅｒ３．ｕｔ．ｅｅ／）などのオンラインプログラムによって設計できる。ｑＰＣＲのためのプローブは、典型的には、増幅産物に結合し、結合状態と未結合状態とを区別することを可能にする、蛍光部分及びクエンチャーを有するように設計される。上記遺伝子のゲノム配列は、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ又はＮＣＢＩ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａ Ｖｉｅｗｅｒなどのゲノムデータベースに容易に見出すことができる。
ある実施形態では、グループ１は、遺伝子ＡＲ、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＤＨＣＲ２４、ＥＡＦ２、ＥＬＬ２、ＦＫＢＰ５、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＩＧＦ１、ＫＬＫ３、ＬＣＰ１、ＬＲＩＧ１、ＮＤＲＧ１、ＮＫＸ３＿１、ＰＭＥＰＡ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＴＭＰＲＳＳ２、好ましくは、ＡＲ、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＤＨＣＲ２４、ＥＡＦ２、ＥＬＬ２、ＦＫＢＰ５、ＬＣＰ１、ＬＲＩＧ１、ＮＤＲＧ１、ＰＭＥＰＡ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＴＭＰＲＳＳ２、より好ましくは、ＤＨＣＲ２４、ＥＡＦ２、ＥＬＬ２、ＦＫＢＰ５、ＬＣＰ１、ＬＲＩＧ１、ＰＭＥＰＡ１、ＰＲＫＡＣＢからなる、及び／又はグループ２は、遺伝子ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＮＫＸ２＿５、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＴＩＭＰ１、ＶＥＧＦＡ、好ましくは、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ９、ＰＤＧＦＢ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＴＩＭＰ１、ＶＥＧＦＡ、より好ましくは、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ９、ＰＤＧＦＢ、ＳＧＫ１、ＳＭＡＤ５、ＴＩＭＰ１、ＶＥＧＦＡからなる。ある実施形態では、３個以上の遺伝子は、グループ１から選択される。
代替的な実施形態では、本発明はさらに、それぞれの細胞シグナリング経路の標的遺伝子の１つ又は複数のセットの発現レベルを決定することによって１つ又は複数の細胞シグナリング経路の活性を推測するためのプライマーを含む、キットオブパーツであって、細胞シグナリング経路が、ＡＲ経路を含み、必要に応じて、ＴＧＦベータ経路、ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路のうちの１つ又は複数をさらに含み、
ＡＲ経路の標的遺伝子のセットが、ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３＿１、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ及びＥＡＦ２を含む群から選択される３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子を含み、好ましくは、ＡＲ経路の標的遺伝子のセットが、ＥＬＬ２、ＦＫＢＰ５、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＬＲＩＧ１、ＰＬＡＵ、ＰＭＥＰＡ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＳＧＫ１、ＮＤＲＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＤＨＣＲ２４若しくはＰＴＰＮ１からなる群から選択される３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２個の標的遺伝子を含み、
ＴＧＦベータ経路の標的遺伝子のセットが、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡを含む群から選択される３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子を含み、好ましくは、ＴＧＦベータ経路の標的遺伝子のセットが、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＤ１、ＭＭＰ９、ＳＧＫ１、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ７、ＶＥＧＦＡ、ＪＵＮＢ、ＴＩＭＰ１、ＳＫＩＬ及びＣＣＫＮ１Ａからなる群から選択される３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２個の標的遺伝子を含み、
ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路の標的遺伝子のセットが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＣＣＮＤ１、ＤＤＩＴ３、ＤＮＭＴ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ２、ＥＺＲ、ＦＡＳＬＧ、ＦＩＧＦ、ＧＬＲＸ、ＩＬ２、ＩＶＬ、ＬＯＲ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＧＳ２、ＳＮＣＧ、ＴＩＭＰ１、ＴＰ５３、及びＶＩＭからなる一覧から選択される３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子を含み、好ましくは、ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路の標的遺伝子のセットが、ＤＮＭＴ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ２、ＧＬＲＸ、ＭＭＰ９、ＰＬＡＵＲ、ＴＩＭＰ１、ＬＯＲ、ＥＺＲ、ＤＤＩＴ３及びＴＰ５３からなる群から選択される３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは１１個の標的遺伝子を含み、
ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路の標的遺伝子のセットが、ＡＫＴ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＤ１、ＣＤ２７４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＲＰ、ＦＧＦ２、ＦＯＳ、ＦＳＣＮ１、ＦＳＣＮ２、ＦＳＣＮ３、ＨＩＦ１Ａ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ１０、ＪｕｎＢ、ＭＣＬ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＭＵＣ１、ＭＹＣ、ＮＯＳ２、ＰＯＵ２Ｆ１、ＰＴＧＳ２、ＳＡＡ１、ＳＴＡＴ１、ＴＩＭＰ１、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＩＭ、及びＺＥＢ１を含む群から選択される３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子を含み、好ましくは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路の標的遺伝子のセットが、ＢＣＬ２、ＢＩＲＣ５、ＣＤ２７４、ＦＯＳ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ９、ＳＴＡＴ１、ＴＩＭＰ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＰＯＵ２Ｆ１及びＩＣＡＭ１からなる群から選択される３個以上の標的遺伝子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の標的遺伝子を含む、キットオブパーツに関する。
本発明の好ましい実施形態では、キットオブパーツは、本発明の第３の態様による装置、及び／又は本発明の第４の態様による非一時的記録製品、及び／又は本発明の第５の態様によるコンピュータプログラムをさらに含む。
ある実施形態では、本発明は、第１の態様による方法における第６の態様によるキットの使用に関する。
第７の態様では、本発明は、本発明の第６の態様によるキットを使用して、対象が敗血症を有する、敗血性ショックを有する、又は敗血症の結果として高い死亡リスクを有するかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで診断又は予後診断するための方法に関する。好ましくは、ＡＢＣＣ４、ＡＰＰ、ＦＧＦ８、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＤＨＣＲ２４、ＮＤＲＧ１、ＬＣＰ１、ＥＡＦ２、ＰＴＰＮ１、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＧＦ１、ＩＬ１１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ９、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ６、ＳＮＡＩ２、ＴＩＭＰ１及びＶＥＧＦＡの発現の増加；又はＣＤＫＮ１Ａ、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ２＿５、ＮＫＸ３＿１、ＮＴＳ、ＰＬＡＵ、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＰＰＡＰ２Ａ、ＬＲＩＧ１、ＴＡＣＣ２、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＭＭＰ２、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＲＫＡＣＢ、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ７及びＳＮＡＩ１の発現の減少は、敗血症と相関する。
代替的な実施形態では、本発明は、キットを使用して、対象が敗血症を有する、敗血性ショックを有する、又は敗血症の結果として高い死亡リスクを有するかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで診断又は予後診断するための方法であって、キットが、それぞれの細胞シグナリング経路の標的遺伝子の１つ又は複数のセットの発現レベルを決定することによって１つ又は複数の細胞シグナリング経路の活性を推測するためのプライマーを含み、細胞シグナリング経路が、ＡＲ経路を含み、必要に応じて、ＴＧＦベータ経路、ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路のうちの１つ又は複数をさらに含み、
ＡＲ経路の標的遺伝子のセットが、ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３＿１、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ及びＥＡＦ２を含む群から選択される３個以上の標的遺伝子を含み、
ＴＧＦベータ経路の標的遺伝子のセットが、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡを含む群から選択される３個以上の標的遺伝子を含み、
ＭＡＰＫ－ＡＰ１経路の標的遺伝子のセットが、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＣＣＮＤ１、ＤＤＩＴ３、ＤＮＭＴ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ２、ＥＺＲ、ＦＡＳＬＧ、ＦＩＧＦ、ＧＬＲＸ、ＩＬ２、ＩＶＬ、ＬＯＲ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＧＳ２、ＳＮＣＧ、ＴＩＭＰ１、ＴＰ５３、及びＶＩＭを含む群から選択される３個以上の標的遺伝子を含み、
ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３経路の標的遺伝子のセットが、ＡＫＴ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＤ１、ＣＤ２７４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＲＰ、ＦＧＦ２、ＦＯＳ、ＦＳＣＮ１、ＦＳＣＮ２、ＦＳＣＮ３、ＨＩＦ１Ａ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＩＣＡＭ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ１０、ＪｕｎＢ、ＭＣＬ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＭＵＣ１、ＭＹＣ、ＮＯＳ２、ＰＯＵ２Ｆ１、ＰＴＧＳ２、ＳＡＡ１、ＳＴＡＴ１、ＴＩＭＰ１、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＩＭ、及びＺＥＢ１を含む群から選択される３個以上の標的遺伝子を含む、方法に関する。
本出願は、いくつかの好ましい実施形態を記載する。前記詳細な説明を読み、理解すれば、他者は改変及び変更に想到できる。本出願は、そのような改変及び変更が添付の特許請求の範囲又はその等価物の範囲内にある限り、それらを全て含むと解釈されることが意図される。
当業者であれば、図面、本開示、及び添付の特許請求の範囲の試験から、特許請求される発明を実施する際に、開示される実施形態に対する他の変化を理解及び実行できる。
第１の態様の方法、第２の態様のコンピュータに実装された発明、第３の態様の装置、第４の態様の非一時的記録媒体、第５の態様のコンピュータプログラム、第６の態様のキットは、特に、従属請求項に定義される、類似の、及び／又は同一の好ましい実施形態を有することが理解されるべきである。
特許請求の範囲において、単語「含む」は、他の要素又はステップを排除せず、単数形の要素は、複数を排除しない。
単一のユニット又はデバイスは、特許請求の範囲に記載されるいくつかの項目の機能を満たす。ある特定の手段が相互に異なる従属請求項に記載される単なる事実は、これらの手段の組合せを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。
１つ又はいくつかのユニット又はデバイスによって実施される死亡リスクの決定のような計算を、任意の他の数のユニット又はデバイスによって実施できる。
コンピュータプログラムを、他のハードウェアと一緒に、又はその一部として供給される、光記録媒体又はソリッドステート媒体などの好適な媒体上に保存／分配できるが、インターネット又は他の有線若しくは無線電気通信システムなどを介して他の形態で分配することもできる。
本発明の好ましい実施形態は、従属請求項又は上記実施形態と、それぞれの独立請求項との任意の組合せであってもよいことが理解されるべきである。
本発明のこれらの態様及び他の態様は、本明細書の以降に記載される実施形態から明らかであり、それを参照して説明される。
全般：シグナル伝達経路分析スコアが描写される全ての図面において、これらのものは、ベイジアン経路モデル分析によって提供される経路活性の確率スコアから誘導される、経路活性のｌｏｇ２ｏｄｄｓとして与えられる。Ｌｏｇ２ｏｄｄｓスコアは、線形スケールでのシグナリング経路の活性のレベルを示す。
分析された公共データセットは、そのＧＳＥ番号と共に示され（原則として、各図面の下部）、個々の試料はそのＧＳＭ番号と共に示される（原則として、クラスター図の最も右側の列）。
シグナリング経路モデル又は免疫応答／免疫系モデルに関する全ての検証試料は、独立した試料であり、検証しようとするそれぞれのモデルの較正のために使用されていない。
図１は、データセットＧＳＥ２６４４０に由来する敗血性ショック患者及び健康な対照となる対象のＡＲシグナリング経路活性（上）及びＴＧＦベータシグナリング経路活性（下）を示す。データは、敗血性ショック患者（生存者）、敗血性ショック患者（非生存者）、対照となる対象（健康な対象）及び対照となる対象（非敗血症生存者）に由来する全血試料から得られる。グラフは、それぞれのシグナリング経路活性のｌｏｇ２ｏｄｄｓを示す；統計的差異はバーの上に示され、ここで、「ｎｓ」（有意でない）は、５．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝１．００ｅ＋００のｐ値を描写し、＊は、１．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝５．００ｅ－０．２のｐ値を描写し、＊＊は、１．００ｅ＾－０３＜ｐ＜＝１．００ｅ－０２のｐ値を描写し、＊＊＊は、１．００ｅ＾－０４＜ｐ＜＝１．００ｅ－０３のｐ値を描写し、＊＊＊＊は、ｐ＜＝１．００ｅ－０４のｐ値を描写する。 図２は、データセットＧＳＥ２６４４０に由来する敗血性ショック患者及び健康な対照となる対象のＭＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性（上）及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性（下）を示す。データは、敗血性ショック患者（生存者）、敗血性ショック患者（非生存者）、対照となる対象（健康な対象）及び対照となる対象（非敗血症生存者）に由来する全血試料から得られる。グラフは、それぞれのシグナリング経路活性のｌｏｇ２ｏｄｄｓを示す；統計的差異はバーの上に示され、ここで、「ｎｓ」（有意でない）は、５．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝１．００ｅ＋００のｐ値を描写し、＊は、１．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝５．００ｅ－０．２のｐ値を描写し、＊＊は、１．００ｅ＾－０３＜ｐ＜＝１．００ｅ－０２のｐ値を描写し、＊＊＊は、１．００ｅ＾－０４＜ｐ＜＝１．００ｅ－０３のｐ値を描写し、＊＊＊＊は、ｐ＜＝１．００ｅ－０４のｐ値を描写する。 図３は、データセットＧＳＥ４６０７に由来する敗血性ショック患者及び健康な対照となる対象のＡＲシグナリング経路活性（上）及びＴＧＦベータシグナリング経路活性（下）を示す。データは、対照となる対象、敗血性ショック患者（非生存者）及び敗血性ショック患者（生存者）に由来する全血試料から得られる。グラフは、それぞれのシグナリング経路活性のｌｏｇ２ｏｄｄｓを示す；統計的差異はバーの上に示され、ここで、「ｎｓ」（有意でない）は、５．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝１．００ｅ＋００のｐ値を描写し、＊は、１．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝５．００ｅ－０．２のｐ値を描写し、＊＊は、１．００ｅ＾－０３＜ｐ＜＝１．００ｅ－０２のｐ値を描写し、＊＊＊は、１．００ｅ＾－０４＜ｐ＜＝１．００ｅ－０３のｐ値を描写し、＊＊＊＊は、ｐ＜＝１．００ｅ－０４のｐ値を描写する。 図４は、データセットＧＳＥ４６０７に由来する敗血性ショック患者及び健康な対照となる対象のＭＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性（上）及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性（下）を示す。データは、対照となる対象、敗血性ショック患者（非生存者）及び敗血性ショック患者（生存者）に由来する全血試料から得られる。グラフは、それぞれのシグナリング経路活性のｌｏｇ２ｏｄｄｓを示す；統計的差異はバーの上に示され、ここで、「ｎｓ」（有意でない）は、５．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝１．００ｅ＋００のｐ値を描写し、＊は、１．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝５．００ｅ－０．２のｐ値を描写し、＊＊は、１．００ｅ＾－０３＜ｐ＜＝１．００ｅ－０２のｐ値を描写し、＊＊＊は、１．００ｅ＾－０４＜ｐ＜＝１．００ｅ－０３のｐ値を描写し、＊＊＊＊は、ｐ＜＝１．００ｅ－０４のｐ値を描写する。 図５は、データセットＧＳＥ６６０９９に由来する敗血性ショック患者及び健康な対照となる対象のＡＲシグナリング経路活性（上）及びＴＧＦベータシグナリング経路活性（下）を示す。データは、対照となる対象、敗血性ショック患者（非生存者）及び敗血性ショック患者（生存者）に由来する全血試料から得られる。グラフは、それぞれのシグナリング経路活性のｌｏｇ２ｏｄｄｓを示す；統計的差異はバーの上に示され、ここで、「ｎｓ」（有意でない）は、５．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝１．００ｅ＋００のｐ値を描写し、＊は、１．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝５．００ｅ－０．２のｐ値を描写し、＊＊は、１．００ｅ＾－０３＜ｐ＜＝１．００ｅ－０２のｐ値を描写し、＊＊＊は、１．００ｅ＾－０４＜ｐ＜＝１．００ｅ－０３のｐ値を描写し、＊＊＊＊は、ｐ＜＝１．００ｅ－０４のｐ値を描写する。 図６は、データセットＧＳＥ６６０９９に由来する敗血性ショック患者及び健康な対照となる対象のＭＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性（上）及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性（下）を示す。データは、対照となる対象、敗血性ショック患者（非生存者）及び敗血性ショック患者（生存者）に由来する全血試料から得られる。グラフは、それぞれのシグナリング経路活性のｌｏｇ２ｏｄｄｓを示す；統計的差異はバーの上に示され、ここで、「ｎｓ」（有意でない）は、５．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝１．００ｅ＋００のｐ値を描写し、＊は、１．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝５．００ｅ－０．２のｐ値を描写し、＊＊は、１．００ｅ＾－０３＜ｐ＜＝１．００ｅ－０２のｐ値を描写し、＊＊＊は、１．００ｅ＾－０４＜ｐ＜＝１．００ｅ－０３のｐ値を描写し、＊＊＊＊は、ｐ＜＝１．００ｅ－０４のｐ値を描写する。 図７は、データセットＧＳＥ９５２３３に由来する敗血性ショック患者及び健康な対照となる対象のＡＲシグナリング経路活性（上）及びＴＧＦベータシグナリング経路活性（下）を示す。データは、対照となる対象（ＣＳ＝健康な対照となる対象；ＰＣ＝非敗血症患者対照）、敗血性ショック患者（ＮＳ＝非生存者）及び敗血性ショック患者（ＳＶ＝生存者）に由来する全血試料から得られる。グラフは、それぞれのシグナリング経路活性のｌｏｇ２ｏｄｄｓを示す；統計的差異はバーの上に示され、ここで、「ｎｓ」（有意でない）は、５．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝１．００ｅ＋００のｐ値を描写し、＊は、１．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝５．００ｅ－０．２のｐ値を描写し、＊＊は、１．００ｅ＾－０３＜ｐ＜＝１．００ｅ－０２のｐ値を描写し、＊＊＊は、１．００ｅ＾－０４＜ｐ＜＝１．００ｅ－０３のｐ値を描写し、＊＊＊＊は、ｐ＜＝１．００ｅ－０４のｐ値を描写する。 図８は、データセットＧＳＥ９５２３３に由来する敗血性ショック患者及び健康な対照となる対象のＭＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路活性（上）及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路活性（下）を示す。データは、対照となる対象（ＣＳ＝健康な対照となる対象；ＰＣ＝非敗血症患者対照）、敗血性ショック患者（ＮＳ＝非生存者）及び敗血性ショック患者（ＳＶ＝生存者）に由来する全血試料から得られる。グラフは、それぞれのシグナリング経路活性のｌｏｇ２ｏｄｄｓを示す；統計的差異はバーの上に示され、ここで、「ｎｓ」（有意でない）は、５．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝１．００ｅ＋００のｐ値を描写し、＊は、１．００ｅ＾－０２＜ｐ＜＝５．００ｅ－０．２のｐ値を描写し、＊＊は、１．００ｅ＾－０３＜ｐ＜＝１．００ｅ－０２のｐ値を描写し、＊＊＊は、１．００ｅ＾－０４＜ｐ＜＝１．００ｅ－０３のｐ値を描写し、＊＊＊＊は、ｐ＜＝１．００ｅ－０４のｐ値を描写する。 図９は、ＡＲ及びＴＧＦベータシグナリング経路に基づくデータセットＧＳＥ２６４４０における個々の試料のクラスター図を示す。グレースケールのコーディングは、個々の経路スコアの対数尺度を表す。階層的クラスタリングを使用した。左側のカラーコーディングは、黒色＝敗血性ショック患者（生存者）；明灰色＝敗血性ショック患者（非生存者）；中灰色＝正常な対照；暗灰色＝対照生存者を描写する。 図１０は、ＡＲ、ＴＧＦベータ及びＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路に基づくデータセットＧＳＥ２６４４０における個々の試料のクラスター図を示す。グレースケールのコーディングは、個々の経路スコアの対数尺度を表す。階層的クラスタリングを使用した。左側のカラーコーディングは、黒色＝敗血性ショック患者（生存者）；明灰色＝敗血性ショック患者（非生存者）；中灰色＝正常な対照；暗灰色＝対照生存者を描写する。 図１１は、ＡＲ、ＴＧＦベータ、ＭＡＰＫ－ＡＰ１及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路に基づくデータセットＧＳＥ２６４４０における個々の試料のクラスター図を示す。グレースケールのコーディングは、個々の経路スコアの対数尺度を表す。階層的クラスタリングを使用した。左側のカラーコーディングは、黒色＝敗血性ショック患者（生存者）；明灰色＝敗血性ショック患者（非生存者）；中灰色＝正常な対照；暗灰色＝対照生存者を描写する。 図１２は、ＡＲ及びＴＧＦベータシグナリング経路に基づくデータセットＧＳＥ４６０７における個々の試料のクラスター図を示す。グレースケールのコーディングは、個々の経路スコアの対数尺度を表す。階層的クラスタリングを使用した。左側のカラーコーディングは、黒色＝対照；明灰色＝敗血性ショック患者（非生存者）；暗灰色＝敗血性ショック患者（生存者）を描写する。 図１３は、ＡＲ、ＴＧＦベータ及びＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路に基づくデータセットＧＳＥ４６０７における個々の試料のクラスター図を示す。グレースケールのコーディングは、個々の経路スコアの対数尺度を表す。階層的クラスタリングを使用した。左側のカラーコーディングは、黒色＝対照；明灰色＝敗血性ショック患者（非生存者）；暗灰色＝敗血性ショック患者（生存者）を描写する。 図１４は、ＡＲ、ＴＧＦベータ、ＭＡＰＫ－ＡＰ１及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路に基づくデータセットＧＳＥ４６０７における個々の試料のクラスター図を示す。グレースケールのコーディングは、個々の経路スコアの対数尺度を表す。階層的クラスタリングを使用した。左側のカラーコーディングは、黒色＝対照；明灰色＝敗血性ショック患者（非生存者）；暗灰色＝敗血性ショック患者（生存者）を描写する。 図１５は、ＡＲ及びＴＧＦベータシグナリング経路に基づくデータセットＧＳＥ６６０９９における個々の試料のクラスター図を示す。グレースケールのコーディングは、個々の経路スコアの対数尺度を表す。階層的クラスタリングを使用した。左側のカラーコーディングは、黒色＝敗血性ショック患者；明灰色＝敗血症患者；暗灰色＝対照となる対象を描写する。 図１６は、ＡＲ、ＴＧＦベータ及びＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路に基づくデータセットＧＳＥ６６０９９における個々の試料のクラスター図を示す。グレースケールのコーディングは、個々の経路スコアの対数尺度を表す。階層的クラスタリングを使用した。左側のカラーコーディングは、黒色＝敗血性ショック患者；明灰色＝敗血症患者；暗灰色＝対照となる対象を描写する。 図１７は、ＡＲ、ＴＧＦベータ、ＭＡＰＫ－ＡＰ１及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路に基づくデータセットＧＳＥ６６０９９における個々の試料のクラスター図を示す。グレースケールのコーディングは、個々の経路スコアの対数尺度を表す。階層的クラスタリングを使用した。左側のカラーコーディングは、黒色＝敗血性ショック患者；明灰色＝敗血症患者；暗灰色＝対照となる対象を描写する。 図１８は、ＡＲ及びＴＧＦベータシグナリング経路に基づくデータセットＧＳＥ９５２３３における個々の試料のクラスター図を示す。グレースケールのコーディングは、個々の経路スコアの対数尺度を表す。階層的クラスタリングを使用した。左側のカラーコーディングは、黒色＝敗血性ショック患者；明灰色＝敗血症患者；暗灰色＝対照となる対象を描写する。 図１９は、ＡＲ、ＴＧＦベータ及びＭＡＰＫ－ＡＰ１シグナリング経路に基づくデータセットＧＳＥ９５２３３における個々の試料のクラスター図を示す。グレースケールのコーディングは、個々の経路スコアの対数尺度を表す。階層的クラスタリングを使用した。左側のカラーコーディングは、黒色＝敗血性ショック患者；明灰色＝敗血症患者；暗灰色＝対照となる対象を描写する。 図２０は、ＡＲ、ＴＧＦベータ、ＭＡＰＫ－ＡＰ１及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナリング経路に基づくデータセットＧＳＥ９５２３３における個々の試料のクラスター図を示す。グレースケールのコーディングは、個々の経路スコアの対数尺度を表す。階層的クラスタリングを使用した。左側のカラーコーディングは、黒色＝血液対照；明灰色＝対照生存者；中灰色＝１日目の非生存者；暗灰色＝１日目の生存者を描写する。 図２１は、単離されたＴＨＰ－１細胞から得られた経路活性を描写する。ＴＨＰ－１細胞を、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細菌と共に直接インキュベートした、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細菌上清と共にインキュベートし、対照ＴＨＰ－１細胞と比較した。ＡＲ、ＥＲ、ＦＯＸＯ、ヘッジホッグ及びＴＧＦベータ経路の活性を決定し、相対値をプロットする。 図２２は、単離されたＴＨＰ－１細胞から得られた経路活性を描写する。ＴＨＰ－１細胞を、異なる濃度の細菌生成物、リポ多糖（ＬＰＳ）と共にインキュベートし、対照ＴＨＰ－１細胞と比較した。ＡＲ、ＥＲ、ＦＯＸＯ、ヘッジホッグ及びＴＧＦベータ経路の活性を決定し、相対値をプロットする。 遺伝子のサブセットの予測能力を示す箱ひげ図である。各図は、ＡＲ細胞シグナリング経路（図２３～図２６）、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路（図２７～図３０）又はＡＲとＴＧＦベータとの細胞シグナリング経路の合わせた標的遺伝子（図３１～図３４）の異なるサブセットに関するＮ＝１、２、３、４、５又は６のＮ個の遺伝子の無作為選択を描写する。標的遺伝子の全セットのいずれかを使用した（Ｔ＝０、図２３、図２７及び図３１）か、又はカットオフを使用して、経路活性スコアへのその寄与に基づいて標的遺伝子のサブセットを選択した（Ｔ＝０．３、０．４若しくは０．５、図２４～図２６、図２８～図３０、図３２～図３４）。遺伝子のそれぞれの選択されたセットから、Ｎ個の遺伝子の無作為選択を１０００回行い、それぞれの遺伝子選択を使用して、敗血症患者を健康な対象から区別できるかどうかを決定した（少なくとも２ＳＤの差異）。その結果を、箱ひげ図の形態でプロットする。ここで、セット１は、ＧＳＥ２６４４０、ＧＳＥ４６０７及びＧＳＥ６６０９９の合わせたデータセットを表し、セット２は、データセットＧＳＥ９５２３３を表し、セット３は、データセットＧＳＥ５７０６５を表す。中央値は箱ひげ図において太線で示され、２５パーセンタイルは箱ひげ図の下方境界で示され、１０パーセンタイルは点線で示される。 図３５は、ＡＲ阻害剤実験の略図である。ＡＲ阻害剤を使用して、単球（ＴＨＰ－１細胞）に対するＬＰＳの降下を軽減できるかどうかを決定するための実験設定を描写する。簡単に述べると、単球細胞（ＴＨＰ－１）を、ＬＰＳと共に、又はＬＰＳを用いずに２４時間培養した後、培地を交換し、次いで、両条件を、ＤＨＴと共に、又はＤＨＴを用いずに培養する。ＬＰＳとＤＨＴとは両方とも、ＡＲ細胞シグナリング経路を活性化すると予想される。平行実験において、ＴＨＰ－１細胞を最初にＬＰＳと共に２４時間培養した後、培地を交換し、細胞をＡＲＣＣ－４、ＡＲＤ－２６６、Ａ－４５８及びビカルタミドのうちの１つと共に培養する。 図３６は、ＡＲ阻害剤実験において決定された経路活性を示す。図３６は、測定された細胞シグナリング経路活性に関して図３５で概略された異なる条件の実験結果を記載する。図面は、それぞれ、異なる実験群において決定されたＡＲ、ＥＲ、ＨＨ（ヘッジホッグ）及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を描写する。実験を３回反復で実施した。測定された活性の標準偏差を、グラフに示す。 図３７は、ＡＲ阻害剤実験において決定された経路活性を示す。図３７は、測定された細胞シグナリング経路活性に関して図３５で概略された異なる条件の実験結果を記載する。図面は、それぞれ、異なる実験群において決定されたＡＲ、ＥＲ、ＨＨ（ヘッジホッグ）及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を描写する。実験を３回反復で実施した。測定された活性の標準偏差を、グラフに示す。 図３８は、ＡＲ阻害剤実験において決定された経路活性を示す。図３８は、測定された細胞シグナリング経路活性に関して図３５で概略された異なる条件の実験結果を記載する。図面は、それぞれ、異なる実験群において決定されたＡＲ、ＥＲ、ＨＨ（ヘッジホッグ）及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を描写する。実験を３回反復で実施した。測定された活性の標準偏差を、グラフに示す。 図３９は、ＡＲ阻害剤実験において決定された経路活性を示す。図３９は、測定された細胞シグナリング経路活性に関して図３５で概略された異なる条件の実験結果を記載する。図面は、それぞれ、異なる実験群において決定されたＡＲ、ＥＲ、ＨＨ（ヘッジホッグ）及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を描写する。実験を３回反復で実施した。測定された活性の標準偏差を、グラフに示す。
以下の実施例は、特に好ましい方法及びそれと関連する選択された態様を単に例示するものである。本明細書で提供される教示を、いくつかの試験及び／又はキットを構築して、例えば、１つ又は複数の血液試料の機能的状態を検出する、予測する、及び／又は診断するために使用できる。さらに、本明細書に記載の方法を使用する際に、薬物の処方を有利に指導し、薬物応答の予測及び薬物の有効性（及び／又は有害効果）のモニタリングを行うことができる。以下の実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
方法及び試料の説明
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｇｄｓ／）を使用する、全血試料（ＧＳＥ２６４４０、ＧＳＥ４６０７、ＧＳＥ６６０９９、ＧＳＥ９５２３３、試料の種類及び調製に関するより多くの情報については、表１を参照されたい）を使用した臨床及び前臨床試験からの試料に由来するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ－Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０データ。シグナル伝達経路活性（ＡＲ、ＥＲ、ＰＲ、ＧＲ、ＨＨ、Ｎｏｔｃｈ、ＴＧＦベータ、ＷＮＴ、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ１／２、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３、ＮＦκＢ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ）を決定するための経路分析を使用した。階層的クラスタリングのために、クラスタリングツールＳｅａｂｏｒｎクラスターマップを使用した。
分析のために、公共のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ｐ２．０データを、ＧＥＯデータベースから使用した（ＧＳＥ２６４４０、ＧＳＥ４６０７、ＧＳＥ６６０９９、ＧＳＥ９５２３３、試料の種類及び調製に関するより多くの情報については、表１を参照されたい）。データセットＧＳＥ２６４４０、ＧＳＥ４６０７、ＧＳＥ６６０９９及びＧＳＥ９５２３３の経路分析により、正常な（健康な）対照となる対象と、敗血性ショックの対象との間で、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ両側検定を使用して、ＡＲ及びＴＧＦベータ経路活性を含む複数の経路において有意差が示された（経路及びｐ値については、図１～図８を参照されたい）。
有意な経路の組合せを使用して、対照から敗血症の対象を同定／診断できた。さらに、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性に基づいて、敗血症で死亡するリスク及び敗血症から生存するリスクに関するリスクスコアを算出するための計算モデルを作製した。階層的クラスタリングを用いて、生存する可能性がより高い、対照／健康な人々に近くにクラスタリングされる試料を同定した。
Figure 2024514404000002
リスクスコアを算出するための計算モデル
さらに、敗血症で死亡するリスクに関して、低リスク、中リスク及び高リスクの敗血症対象を分類できた。低リスク、中リスク及び高リスクの敗血症対象を分類するための複数のシグナリング経路活性スコアの計算モデルに基づく解釈を使用した。
経路活性スコアの解釈のための線形モデルを構築するために、１及び２標準偏差（ＳＤ）を有する平均経路活性を算出することによって、健康な人々における経路活性を評価した。経路活性が正常な健康の２ＳＤの境界の外側にある場合、これを、異常な活性経路と考え、これはモデルにおいて１ポイントを意味する。必要に応じて、平均の３ＳＤなどの別の閾値を使用できる。ポイントを合計することにより、リスクの可能性を直接決定付ける、累積異常経路活性スコアが生成される。
リスクスコアを算出するための他の計算モデルは、ベイジアンモデル、セントロイドに基づくモデルなどであってよい。
較正及び検証セットを使用する線形モデル
このために、訓練セットモデルとしてデータセットＧＳＥ２６４４０を使用し、データセットＧＳＥ４６０７を用いてモデルを検証した。ＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路について、健康な対照集団中で測定された平均経路活性スコアより２ＳＤ上を、分類モデルのために使用した後、この同じ値を、独立検証データセットＧＳＥ４６０７に適用した。ＡＲとＴＧＦベータとが両方とも対照試料よりも２ＳＤ高かった場合、敗血症対象は高リスク（２ポイント）と分類された。ＡＲ又はＴＧＦベータのいずれかが対照よりも２ＳＤ高かった場合、対象は、中リスク（１ポイント）と分類され、２ＳＤ未満の差異は低リスク（０ポイント）と分類された。経路に関する決定された平均、標準偏差及び２ＳＤ上部境界については、表２を参照されたい。
予後モデルについては、低リスク、中リスク及び高リスク群を、対象の階層化のために同定する。中リスク群では、経路の一方が上方調節されるが、高リスク群では、両方の経路が上方調節される。
表３に、予後モデルの性能が示される。ＧＳＥ２６４４０データセット（ｎ＝７６、非生存者１０％（ｎ＝８）、生存者６８％（ｎ＝５１）、対照２２％（ｎ＝１７））について、非生存者群を、高リスクとして３、中リスクとして５及び低リスクとして０に分類できた。検証セットＧＳＥ４６０７（ｎ＝８３、非生存者１７％（ｎ＝１４）、生存者６５％（ｎ＝５４）及び対照１８％（ｎ＝１５））について、上記のモデルを使用して、非生存者群を、高リスクとして１０、中リスクとして２及び低リスクとして２に分類できた。
さらに、合わせたＡＲ及びＴＧＦベータ経路スコアは、対照試料よりも２ＳＤ高かったため、ＡＲ及びＴＧＦベータの合わせた経路の合計スコアを、高リスクが分類される（１ポイント）予後マーカーのために使用することもできる。合わせたＡＲ及びＴＧＦベータスコアが対照と比較して２ＳＤ未満の差異であった場合、試料は低リスク（０ポイント）と分類される（データは示さない）。
他のデータセット（ＧＳＥ６６０９９、ＧＳＥ９５２３３及びＧＳＥ５７０６４）については、低いＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を有する試料も見る。しかしながら、本発明者らは、これらの対象が敗血症から生存するより高い変化を有することを証明する生存データを有しない。
Figure 2024514404000003
Figure 2024514404000004
線形モデル２－データセットあたり上部境界の使用
試験と試料採取との間の差異のため、データセットあたりの上部境界を決定することはおそらくより特異的である。表４に、ＧＳＥ２６４４０及びＧＳＥ４６０７のＡＲの活性の平均値、標準偏差及びＳＤ上部境界を列挙する。表５では、上記線形モデルが使用されるが、本実施例では、それぞれ別々のデータセットに基づいて２ＳＤ上部境界が使用される。全ての非生存者は、中リスク群及び高リスク群に入れられる。対照試料は、低リスク群にのみ位置し、診断マーカーとして使用できる。
Figure 2024514404000005
Figure 2024514404000006
線形モデル３－データセットあたりＡＲ経路のみ及び上部境界の使用
上記と同じ原理が本実施例でも使用され、２ＳＤ上部境界のみが使用され、モデルはＡＲ経路にのみ基づく。リスク群は、この場合、敗血症で死亡する低又は高リスクである。モデルの性能は表６に見出せる。対照試料は、低リスク群にのみ位置し、診断マーカーとして使用できる。
Figure 2024514404000007
クラスタリング法
対象の経路活性に基づいてそれらを分類できるかどうかを決定するために、階層的クラスタリング（ｓｅａｂｏｒｎクラスターマップ）を使用した。ＡＲ、ＴＧＦベータ、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３及びＭＡＰＫ－ＡＰ１経路について、対照群と敗血症群との間の有意なモデルを選択した。
データセットＧＳＥ４６０７について、いくつかの敗血症試料は、対照群（橙色）の近くにクラスター化される。これらの対象はおそらく、より高い生存の機会を有する。これらの試料もまた、ＡＲ及びＴＧＦベータに基づいていた上記のモデルにおいて、低リスク群にクラスター化される。しかしながら、敗血性ショック生存者と非生存者との間の明確な区別は示されない。
Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉを用いた細胞刺激
細菌又は細菌生成物が敗血症を有する患者において観察されたのと同じ経路活性を誘導できるかどうかを精査するために、細菌又は細菌生成物ＬＰＳを、血液中の単球に関するモデル系として、細胞系に由来する単球性細胞に添加するｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を実施した。
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ、３３２７７）細菌を、製造業者の使用説明書を使用して、脱水ＨＢＩ（Ｏｘｏｉｄ、ＣＭ１０３２）を使用する嫌気性培養フード中で培養した。
ＴＨＰ－１細胞を、４ｘ１０５細胞／ウェルの密度で４８時間、６ウェルプレート中で培養した。細胞播種の４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１：１００ＭＯＩの細菌で直接的に、又は３７℃、５％ＣＯ２で４時間の細菌培養の２０％「上清」を使用して処理した。細胞を１：１００のＭＯＩで細菌に曝露し、一晩細菌培養物を０．２μｍフィルターを使用して濾過し、全細菌を除去した後、細胞培養培地中に２０％濃度に希釈することによって、２０％「上清」を調製した。細胞播種の４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１：１００ＭＯＩの細菌で直接的に、又は３７℃、５％ＣＯ２で４時間の細菌培養の２０％「上清」を使用して処理した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０４）に溶解し、さらなるプロセッシングまで－８０℃で保存した。ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０４）を使用してＲＮＡを抽出した。Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＯｎｃｏＳｉｇｎａｌプラットフォームを使用して、ｑＰＣＲを実施した。
ヘリコバクター細菌がＴＨＰ－１細胞の経路活性に対する細菌特異的効果を有するかどうかを決定するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。細胞を、細菌で直接的に、又は細菌培養物の増殖培地で処理した。図２１に示されるように、経路活性は、ＡＲ、ＦＯＸＯ、ＴＧＦベータ及びＷＮＴ経路について増加していた。しかしながら、敗血症試料中では、ＦＯＸＯ及びＷＮＴ経路における有意差は検出されなかった。これは、単球が血液組成の４～８％からなるに過ぎず、他の血液細胞型も重要な役割を果たすという事実に起因する。
ＬＰＳを用いた細胞刺激
炎症プロセスを試験するために、ＴＨＰ－１の培養培地（１０％ＦＢＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ、３７℃、５％ＣＯ２）中で、大腸菌を起源とするＬＰＳの３つの異なる濃度（０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌ）を使用して単球ＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－２０２（商標））を刺激した。刺激後、細胞を収獲し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０４）を使用してＲＮＡを抽出した。Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＯｎｃｏＳｉｇｎａｌプラットフォームを使用して、ｑＰＣＲを実施した。図２２に示されるように、経路活性は、ＬＰＳ刺激した細胞中で、ＡＲ、ＦＯＸＯ、ＴＧＦベータ及びＷＮＴ経路について増加していた。ＡＲ及びＴＧＦベータ経路の活性化も敗血症試料において認められたが、これらの経路の炎症における役割を確認するものである。しかしながら、敗血症試料中では、ＦＯＸＯ及びＷＮＴ経路における有意差は検出されなかった。これは、単球が血液組成の４～８％からなるに過ぎず、他の血液細胞型も重要な役割を果たすという事実に起因する。
標的遺伝子のサブセットの検証
経路標的遺伝子のサブセット（例えば、全体から選択された３個の標的遺伝子）が依然として予測的であるかどうかを検証するために、Ｎ個の遺伝子の無作為選択を、ＡＲ及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路標的遺伝子について行って、全リストからのＮ個の遺伝子の無作為選択が予測的である機会を評価した。これを行うために、ＡＲ及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路の個々の標的遺伝子を、以下に記載されるように経路スコア（Ｔ）へのその相対的寄与に基づいて順位付けた。Ｔの異なる閾値について（ここで、Ｔ＝０は全遺伝子セットに対応し、Ｔに関するその後のより高い値はより厳密な選択に対応する）、Ｎ個の遺伝子を無作為に１０００回選択し、非常に単純な線形モデルを使用して、以下に示されるようにスコアを算出した。合わせたデータセットＧＳＥ２６４４０、ＧＳＥ４６０７及びＧＳＥ６６０９９（セット１）、又はＧＳＥ９５２３３（セット２）、又はＧＳＥ５７０６５（セット３）上で１～６の範囲のＮ値について、計算を実施した。さらに、ＡＲ標的遺伝子、ＴＧＦベータ標的遺伝子並びにプールしたＡＲ及びＴＧＦベータ標的遺伝子上で計算を実施した。
プロトコールを、以下のように実施した：
１．目的の経路に対応する遺伝子の一覧を取得し、そのプローブセットを取得する。
２．遺伝子あたり、それが寄与する経路スコアと最大の絶対的相関を示すプローブセットを取得する（全ての敗血症及び対照試料に基づく；遺伝子は複数の経路に関与してもよい）。
３．閾値Ｔより上のその絶対的なプローブセット－経路相関を示す全ての遺伝子を取得することによって候補遺伝子一覧を選択する。
４．繰り返して（１０００回）、候補遺伝子一覧からＮ個の遺伝子の無作為なサブ一覧を選択する。
５．プローブセット－経路相関の兆候に応じて、＋１又は－１の重みをそれらに割り当てることによって、これらのＮ個の遺伝子を含む単純線形分類子を作製する。
６．全ての試料に対してその線形分類子を適用して、スコアを算出する。
７．各試験セット、合わせたＧＳＥ２６４４０、ＧＳＥ４６０７及びＧＳＥ６６０９９、又はＧＳＥ９５２３３、又はＧＳＥ５７０６５について、
ａ．正常な試料上でのスコアの平均及び標準偏差を決定する。
ｂ．平均＋標準偏差の２倍を取得することによって、閾値を算出する。
ｃ．閾値より上の敗血症試料の画分、閾値より上の敗血症非生存者（与えられた場合）の画分、及びチェックのために、閾値より上の正常な試料の画分も決定する。
８．１０００回の無作為なドローにわたって決定された画分の箱ひげ図分布を作製する。
ＡＲ及びＴＧＦＢ経路、手動で選択された遺伝子（図３３）及びＮ＝３の遺伝子の無作為なセットと共に増大した、相関閾値Ｔ＝０．４を考慮する例について、組合せ試験セットＧＳＥ２６４４０、ＧＳＥ４６０７及びＧＳＥ６６０９９は、
－ 検出された敗血症試料の中央画分（ボックス中の太線）は約０．６０であり、これは、無作為な一覧の半分が６０％以上の感度を与えることを意味する。
－ 検出された敗血症試料の２５パーセンタイルは約０．３２であり、これは、無作為な一覧の４分の３が３２％以上の感度を与えることを意味する。
－ 検出された敗血症試料の１０パーセンタイルは約０．１２であり、これは、無作為な一覧の９０％が１２％以上の感度を与えることを意味する。
－ 閾値（平均＋２ｓｔｄｅｖ）の選択による特異度は約９７．５％であり、これは、正常な試料について観察される低い画分によって確認される。
これらのサブセットから得られる箱ひげ図は、図２３～図３４に描写される。これらのデータセットから、使用されるデータセット及び標的遺伝子に関する選択基準に応じて、敗血症の対象から得られた血液試料と、非敗血症の対象から得られた血液試料との間を区別するためには、わずか１個の標的遺伝子で十分であるが、全ての事例において、少なくとも３個の遺伝子での無作為な選択が高い特異度及び望ましい感度を示す遺伝子のセットをもたらすと結論付けることができる。したがって、ＡＲ細胞シグナリング経路、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路の最小で３個の標的遺伝子、又はＡＲ及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路（本明細書で定義される）に由来するプールされた標的遺伝子が、敗血症を有する対象を診断するのに十分であると結論付けられる。
これらのデータから、敗血症の診断を、本明細書で提供される遺伝子の様々なセットから選択される３個の遺伝子の発現レベルに基づいて確実に行うことができる。それぞれのセットの遺伝子は経路モデルを使用して上手く同定されたが、本実施例は、診断において経路モデルを使用することは必要ではなく、純粋に発現レベルのみに基づいて診断を行うことができることを示す。
分析において使用される遺伝子セットは、以下の通りである（遺伝子名の前にある記号は、正又は負の相関を示す）：
ＡＲ－Ｔ＝０
ＡＲ：＋ＡＢＣＣ４、＋ＡＰＰ、－ＡＲ、－ＣＤＫＮ１Ａ、－ＣＲＥＢ３Ｌ４、＋ＤＨＣＲ２４、＋ＥＡＦ２、＋ＥＬＬ２、＋ＦＧＦ８、＋ＦＫＢＰ５、－ＧＵＣＹ１Ａ３、＋ＩＧＦ１、－ＫＬＫ２、－ＫＬＫ３、＋ＬＣＰ１、－ＬＲＩＧ１、＋ＮＤＲＧ１、－ＮＫＸ３＿１、－ＮＴＳ、－ＰＬＡＵ、－ＰＭＥＰＡ１、－ＰＰＡＰ２Ａ、－ＰＲＫＡＣＢ、＋ＰＴＰＮ１、＋ＳＧＫ１、－ＴＡＣＣ２、－ＴＭＰＲＳＳ２、－ＵＧＴ２Ｂ１５
ＡＲ－－Ｔ＝０．３
ＡＲ：－ＡＲ、－ＣＲＥＢ３Ｌ４、＋ＤＨＣＲ２４、＋ＥＡＦ２、＋ＥＬＬ２、＋ＦＫＢＰ５、－ＧＵＣＹ１Ａ３、＋ＩＧＦ１、－ＫＬＫ３、＋ＬＣＰ１、－ＬＲＩＧ１、＋ＮＤＲＧ１、－ＮＫＸ３＿１、－ＰＭＥＰＡ１、－ＰＲＫＡＣＢ、－ＴＭＰＲＳＳ２
ＡＲ－－Ｔ＝０．４
ＡＲ：－ＡＲ、－ＣＲＥＢ３Ｌ４、＋ＤＨＣＲ２４、＋ＥＡＦ２、＋ＥＬＬ２、＋ＦＫＢＰ５、＋ＬＣＰ１、－ＬＲＩＧ１、＋ＮＤＲＧ１、－ＰＭＥＰＡ１、－ＰＲＫＡＣＢ、－ＴＭＰＲＳＳ２
ＡＲ－－Ｔ＝０．５
ＡＲ：＋ＤＨＣＲ２４、＋ＥＡＦ２、＋ＥＬＬ２、＋ＦＫＢＰ５、＋ＬＣＰ１、－ＰＭＥＰＡ１、－ＰＲＫＡＣＢ
ＴＧＦＢ－Ｔ＝０
ＴＧＦＢ：－ＡＮＧＰＴＬ４、＋ＣＤＣ４２ＥＰ３、－ＣＤＫＮ１Ａ、＋ＣＤＫＮ２Ｂ、＋ＣＴＧＦ、＋ＧＡＤＤ４５Ａ、＋ＧＡＤＤ４５Ｂ、＋ＨＭＧＡ２、＋ＩＤ１、＋ＩＬ１１、＋ＩＮＰＰ５Ｄ、＋ＪＵＮＢ、－ＭＭＰ２、＋ＭＭＰ９、－ＮＫＸ２＿５、－ＯＶＯＬ１、－ＰＤＧＦＢ、＋ＰＴＨＬＨ、＋ＳＥＲＰＩＮＥ１、＋ＳＧＫ１、＋ＳＫＩＬ、＋ＳＭＡＤ４、－ＳＭＡＤ５、＋ＳＭＡＤ６、－ＳＭＡＤ７、－ＳＮＡＩ１、＋ＳＮＡＩ２、＋ＴＩＭＰ１および＋ＶＥＧＦＡ
ＴＧＦＢ－－Ｔ＝０．３
ＴＧＦＢ：＋ＣＤＣ４２ＥＰ３、＋ＧＡＤＤ４５Ａ、＋ＧＡＤＤ４５Ｂ、＋ＨＭＧＡ２、＋ＩＤ１、＋ＩＬ１１、＋ＩＮＰＰ５Ｄ、＋ＪＵＮＢ、－ＭＭＰ２、＋ＭＭＰ９、－ＮＫＸ２＿５、－ＯＶＯＬ１、－ＰＤＧＦＢ、＋ＰＴＨＬＨ、＋ＳＧＫ１、＋ＳＫＩＬ、＋ＳＭＡＤ４、－ＳＭＡＤ５、＋ＳＭＡＤ６、＋ＴＩＭＰ１、＋ＶＥＧＦＡ
ＴＧＦＢ－－Ｔ＝０．４
ＴＧＦＢ：＋ＣＤＣ４２ＥＰ３、＋ＧＡＤＤ４５Ａ、＋ＧＡＤＤ４５Ｂ、＋ＩＤ１、＋ＪＵＮＢ、＋ＭＭＰ９、－ＰＤＧＦＢ、＋ＳＧＫ１、＋ＳＫＩＬ、－ＳＭＡＤ５、＋ＳＭＡＤ６、＋ＴＩＭＰ１、＋ＶＥＧＦＡ
ＴＧＦＢ－－Ｔ＝０．５
ＴＧＦＢ：＋ＣＤＣ４２ＥＰ３、＋ＧＡＤＤ４５Ａ、＋ＧＡＤＤ４５Ｂ、＋ＩＤ１、＋ＪＵＮＢ、＋ＭＭＰ９、－ＰＤＧＦＢ、－＋ＳＧＫ１、－ＳＭＡＤ５、＋ＴＩＭＰ１、＋ＶＥＧＦＡ
ＡＲ；ＴＧＦＢ－－Ｔ＝０
ＡＲ：＋ＡＢＣＣ４、＋ＡＰＰ、－ＡＲ、－ＣＤＫＮ１Ａ、－ＣＲＥＢ３Ｌ４、＋ＤＨＣＲ２４、＋ＥＡＦ２、＋ＥＬＬ２、＋ＦＧＦ８、＋ＦＫＢＰ５、－ＧＵＣＹ１Ａ３、＋ＩＧＦ１、－ＫＬＫ２、－ＫＬＫ３、＋ＬＣＰ１、－ＬＲＩＧ１、＋ＮＤＲＧ１、－ＮＫＸ３＿１、－ＮＴＳ、－ＰＬＡＵ、－ＰＭＥＰＡ１、－ＰＰＡＰ２Ａ、－ＰＲＫＡＣＢ、＋ＰＴＰＮ１、＋ＳＧＫ１、－ＴＡＣＣ２、－ＴＭＰＲＳＳ２、－ＵＧＴ２Ｂ１５
ＴＧＦＢ：－ＡＮＧＰＴＬ４、＋ＣＤＣ４２ＥＰ３、－ＣＤＫＮ１Ａ、＋ＣＤＫＮ２Ｂ、＋ＣＴＧＦ、＋ＧＡＤＤ４５Ａ、＋ＧＡＤＤ４５Ｂ、＋ＨＭＧＡ２、＋ＩＤ１、＋ＩＬ１１、＋ＩＮＰＰ５Ｄ、＋ＪＵＮＢ、－ＭＭＰ２、＋ＭＭＰ９、－ＮＫＸ２＿５、－ＯＶＯＬ１、－ＰＤＧＦＢ、＋ＰＴＨＬＨ、＋ＳＥＲＰＩＮＥ１、＋ＳＧＫ１、＋ＳＫＩＬ、＋ＳＭＡＤ４、－ＳＭＡＤ５、＋ＳＭＡＤ６、－ＳＭＡＤ７、－ＳＮＡＩ１、＋ＳＮＡＩ２、＋ＴＩＭＰ１および＋ＶＥＧＦＡ
ＡＲ；ＴＧＦＢ－－Ｔ＝０．３
ＡＲ：－ＡＲ、－ＣＲＥＢ３Ｌ４、＋ＤＨＣＲ２４、＋ＥＡＦ２、＋ＥＬＬ２、＋ＦＫＢＰ５、－ＧＵＣＹ１Ａ３、＋ＩＧＦ１、－ＫＬＫ３、＋ＬＣＰ１、－ＬＲＩＧ１、＋ＮＤＲＧ１、－ＮＫＸ３＿１、－ＰＭＥＰＡ１、－ＰＲＫＡＣＢ、＋ＳＧＫ１、－ＴＭＰＲＳＳ２
ＴＧＦＢ：＋ＣＤＣ４２ＥＰ３、＋ＧＡＤＤ４５Ａ、＋ＧＡＤＤ４５Ｂ、＋ＨＭＧＡ２、＋ＩＤ１、＋ＩＬ１１、＋ＩＮＰＰ５Ｄ、＋ＪＵＮＢ、－ＭＭＰ２、＋ＭＭＰ９、－ＮＫＸ２＿５、－ＯＶＯＬ１、－ＰＤＧＦＢ、＋ＰＴＨＬＨ、＋ＳＧＫ１、＋ＳＫＩＬ、＋ＳＭＡＤ４、－ＳＭＡＤ５、＋ＳＭＡＤ６、＋ＴＩＭＰ１、＋ＶＥＧＦＡ
ＡＲ；ＴＧＦＢ－－Ｔ＝０．４
ＡＲ：－ＡＲ、－ＣＲＥＢ３Ｌ４、＋ＤＨＣＲ２４、＋ＥＡＦ２、＋ＥＬＬ２、＋ＦＫＢＰ５、＋ＬＣＰ１、－ＬＲＩＧ１、＋ＮＤＲＧ１、－ＰＭＥＰＡ１、－ＰＲＫＡＣＢ、＋ＳＧＫ１、－ＴＭＰＲＳＳ２
ＴＧＦＢ：＋ＣＤＣ４２ＥＰ３、＋ＧＡＤＤ４５Ａ、＋ＧＡＤＤ４５Ｂ、＋ＩＤ１、＋ＪＵＮＢ、＋ＭＭＰ９、－ＰＤＧＦＢ、＋ＳＧＫ１、＋ＳＫＩＬ、－ＳＭＡＤ５、＋ＳＭＡＤ６、＋ＴＩＭＰ１、＋ＶＥＧＦＡ
ＡＲ；ＴＧＦＢ－－Ｔ＝０．５
ＡＲ：＋ＤＨＣＲ２４、＋ＥＡＦ２、＋ＥＬＬ２、＋ＦＫＢＰ５、＋ＬＣＰ１、－ＬＲＩＧ１、－ＰＭＥＰＡ１、－ＰＲＫＡＣＢ、＋ＳＧＫ１
ＴＧＦＢ：＋ＣＤＣ４２ＥＰ３、＋ＧＡＤＤ４５Ａ、＋ＧＡＤＤ４５Ｂ、＋ＩＤ１、＋ＪＵＮＢ、＋ＭＭＰ９、－ＰＤＧＦＢ、＋ＳＧＫ１、－ＳＭＡＤ５、＋ＴＩＭＰ１、＋ＶＥＧＦＡ
敗血症のための処置選択肢としてのＡＲ阻害剤の検証
上記データに基づいて、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤を投与することによって、敗血症を処置できるか、又は少なくともその症状を軽減できると理論化された。実施例７及び実施例８、並びに図２１及び図２２から推定できるように、ＡＲ及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性は、単球（ＴＨＰ－１細胞）中でのＨ ｐｙｌｏｒｉ上清又はＬＰＳによる刺激時に増加する。この仮説を確認するために、このモデル系を使用して、敗血症を処置するためのＡＲ経路阻害剤の医学的転帰を予測した。
図３５は、使用した実験設定を記載する。簡単に述べると、単球細胞（ＴＨＰ－１）を、ＬＰＳと共に、又はＬＰＳを用いずに２４時間培養した後、培地を交換し、次いで、両条件を、ＤＨＴと共に、又はＤＨＴを用いずに培養する。ＬＰＳとＤＨＴとは両方とも、ＡＲ細胞シグナリング経路を活性化すると予想される。平行実験において、ＴＨＰ－１細胞を最初にＬＰＳと共に２４時間培養した後、培地を交換し、細胞をＡＲＣＣ－４、ＡＲＤ－２６６、Ａ－４５８及びビカルタミドのうちの１つと共に培養する。
全ての実験条件を、細胞シグナリング経路分析にかける。測定されたＥＲ、ＡＲ、ＨＨ、及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性は、それぞれ、図３６～図３９に示される。図３６は、ＬＰＳ又はＤＨＴが単球においてＡＲ細胞シグナリング経路活性を増加させることを示し、それは小さい付加効果であると考えられる。さらに、図３６は、ＬＰＳによって誘導されるＡＲ活性を、ＡＲ経路阻害剤の添加によってベースラインレベルまで少なくとも部分的に復帰させられることを示す。
図３７及び図３８は、ＥＲ及びＨＨ細胞シグナリング経路活性がＬＰＳ、ＤＨＴ又はＡＲ経路阻害剤のいずれかによって実質的に影響されないことを示し、したがって、図３６に示される効果が特異的であることを示している。
図３９は、ＴＧＦベータシグナリングも、ＬＰＳによって増加することを示し、敗血症がＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路に影響することが示される本明細書に示される他のデータと合致している。予想通り、ＤＨＴはＴＧＦベータ活性を増加させなかった。興味深いことに、Ａ－４５８は、ＬＰＳにより誘導されるＴＧＦベータ活性の低減並びにＡＲ活性の低減を示し、それが二重ＡＲ／ＴＧＦベータ阻害剤として機能することを示唆している。予想通り、残りのＡＲ阻害剤は、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性に対するＬＰＳの効果を軽減できなかった。
これらのデータから、敗血症が血液細胞中のＡＲ及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を上昇させ、これを患者の血液試料中で検出し、敗血症の迅速な診断又は敗血症を発症するリスクがある患者の予測のために使用できると結論付けられる。さらに、これらのデータは、上昇したＡＲ及びＴＧＦベータが少なくとも部分的には単球に起因し得ること、並びにＬＰＳを培養された単球に添加することによって、その効果を再現できることを示す。さらに、これらのデータは、ＬＰＳにより誘導されるＡＲシグナリング経路活性の増加を、単球を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ実験によって示されるように、ＡＲ経路阻害剤によって軽減できることを示す。これは、患者が増加したＡＲ経路活性又は敗血症関連遺伝子の異常な発現を有することを前提として、ＡＲ阻害剤を使用して、敗血症を有する対象を処置する、又は少なくともその症状を低減させる（軽減する）ことができる可能性が高いことを示す。それはさらに、敗血症を発症するリスクがある患者又はＡＲ阻害剤を用いた処置から恩恵を受ける敗血症を有する患者を同定するための比較試験の必要性を強調する。
敗血症のためのＴＨＰ－１モデルにおいて敗血症を防止又は処置するための経路阻害剤のスクリーニング
序論
敗血症は、免疫応答が脱調節され、多臓器障害又は不全をもたらす、生命を脅かす感染である［１７］。敗血症は一般に、重度の細菌感染の合併症であり、全身性免疫応答を特徴とし、敗血性ショックをもたらす。死亡率は、敗血症については２５～３０％及び敗血性ショックについては４０％～７０％の範囲である［４］、［１８］、［１９］。
内臓の血液循環を維持するための抗生物質及び支援的手段は別として、処置が有効であると証明されていないが、一部の処置は、今までのところ同定できない患者のサブセットに恩恵を与えるかもしれないことは排除できない［１７］。有効な処置を開発するのに失敗する１つの理由は、敗血症患者間の不均質性、すなわち、基礎となる医学的状態の変化及び薬物の使用、並びに個々の患者における免疫応答に影響する遺伝的変化である。
敗血症を有する患者における機能的免疫応答の詳細な評価は、個別化医療アプローチを可能にし、処置の有効性を改善する。免疫機能の診断評価は現在、免疫細胞数及び炎症マーカー（例えば、Ｃ反応性タンパク質）などの日常的な血液測定値に限られているが、敗血症患者における異常な免疫応答の原因となる、様々な型の免疫細胞の機能的活性状態に関する情報を提供しない。
免疫細胞の機能的状態は、少数のいわゆる細胞シグナル伝達経路（ＳＴＰ）によって決定される［２０］、［２１］、［２２］、［２３］、［２４］。近年、血液試料を含む、細胞及び組織試料中でＳＴＰの活性を定量的に測定するための新規アッセイが開発されている［２５］、［２６］、［２７］、［２８］。血液細胞中でのこれらのＳＴＰの組み合わせた活性の測定は、個々の患者における先天性免疫応答及び適応免疫応答の定量的評価を可能にすることが期待される［２３］、［２９］。
ＳＴＰ分析を、複数の臨床敗血症試験からの公共的に利用可能な遺伝子発現データに対して実施した［３０］。試験は、ＡＲ及びＴＧＦベータの活性が、健康な対照と比較して敗血症患者において増加していたことを示し、これは、これらの経路が敗血症を処置又は防止するための新規薬物標的であることを示している。
経路阻害剤、特に、ＡＲ及びＴＧＦベータ経路阻害剤を用いた処置は、敗血症を有する対象又は敗血症を発症する危険がある対象にとって有益である。ＡＲ阻害剤を用いた敗血症を有する患者の処置は、以前に試されたが、成功しなかった。本発明者らの結果に基づいて、全ての患者が高いＡＲ経路活性を示すわけではなく、したがって、ＡＲ経路活性が強く増加した患者だけがＡＲ経路阻害剤を用いた処置から恩恵を受けるという事実によって、これを説明できる。より重要なことに、敗血症を発症するリスクがあり、関連する血液細胞中に高いＡＲ経路活性を有する、感染を有する患者は、ＡＲ阻害剤を用いた防止的処置から恩恵を受けられる。この仮定の背後にある論拠は、活性ＡＲ経路が免疫抑制をもたらすということである。例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｇｕｂｂｅｌｓ Ｂｕｐｐ及びＪｏｒｇｅｎｓｅｎ［５］を参照されたい。
ＡＲタンパク質は、好中球、マクロファージ、肥満細胞、単球、巨核球、Ｂ細胞、及びＴ細胞を含む様々な先天性免疫細胞及び適応免疫細胞中で発現され、ＡＲ経路が実際にリガンド誘導性であることを示唆している。興味深いことに、ＡＲタンパク質は、造血幹細胞、リンパ球及び骨髄前駆細胞中でも発現される。異なる試験に由来する証拠が、適切な免疫応答にとって重要である炎症性メディエーター及び抗炎症性メディエーターの発現を主に変化させることによる、異なる免疫細胞型におけるアンドロゲンの免疫抑制的役割を指摘する。
敗血症における炎症性応答と一致して、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、及びＩＬ６などの免疫抑制性サイトカインが役割を果たすいくつかの免疫抑制事象が起こる証拠が存在する。臨床観察コホート試験によれば、敗血症患者は、慢性の重病を発症し、その６ヶ月生存率は６３％であり、慢性炎症のサイトカインプロファイル、並びに持続的免疫抑制に特徴的なバイオマーカープロファイルを示し続ける［３１］。Ｈｉｒａｋｉら［３２］からの試験では、マウスの生存の改善をもたらすＴＧＦ－β枯渇抗体を投与するマウス腹部敗血症モデルを使用した。これは、敗血症におけるＴＧＦベータ経路の因果的役割を示唆する。まとめると、ＡＲ及びＴＧＦベータ経路は、免疫抑制状態及び炎症促進状態に向かう免疫応答を改変することによって敗血症における因果的役割を果たす。
既に以前に示されたように、敗血症患者間の臨床的不均質性を考慮すると、個別化された処置が、臨床利益を得るために必要である可能性が高い。今まで、敗血症の防止又は処置のためにＡＲ又はＴＧＦベータ経路阻害剤から恩恵を受ける患者を階層化することは不可能であったが、本明細書に記載される方法は、血液試料中でのＡＲ及びＴＧＦベータ経路活性の正確な評価を可能にする。これは、低い、及び高いＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を示す患者間の区別並びに経路活性を正規化するために高いＡＲ及び／又はＴＧＦベータ経路活性を示す患者に、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータを阻害する阻害剤の投与を可能にする。
敗血症のための既存薬再開発スクリーニング
個別化された様式で敗血症を防止及び処置するための新規合理的療法を開発するために、敗血症における異常な免疫細胞（単球）機能に関するいくつかの実験室モデルを精査した：
リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した、単球性細胞系（ＴＨＰ－１）
ＬＰＳで刺激した、一次血液由来単球
ＬＰＳで刺激した、健康なボランティア由来ＰＢＭＣ
敗血症患者由来ＰＢＭＣ。
実験室敗血症モデルにおけるＳＴＰ活性に対するＬＰＳの効果を、敗血症を有する患者の血液細胞（全血試料）中で以前に記載されたＳＴＰ活性と比較した。この分析により、ＬＰＳが、ＴＨＰ－１及び敗血症に関する一次単球性細胞モデルにおいてＡＲ及びＴＧＦベータＳＴＰを用量依存的様式で活性化することが確認された（表７～表１０）。ＡＲ及びＴＧＦベータ経路活性は、ＬＰＳによって単球性細胞においてのみ誘導され、リンパ細胞系（ＭＯＬＴ－４、表１０を参照されたい）においては誘導されなかった。単球はＰＢＭＣ試料中の細胞のわずか５～１０％を構成するに過ぎず、他の細胞はリンパ球であり（７０～９０％）、単球に対する効果の過剰の希薄化をもたらすため［３３］、予測通り、ＬＰＳはＰＢＭＣ中のこれらのＳＴＰの活性に対する効果を有しなかった。単球とＰＢＭＣとの間の結果の差異は、ＳＴＰ活性における測定された差異の特異性も強調する。
単球性細胞モデルへのＡＲ及びＴＧＦベータＳＴＰのための元のリガンドの添加により、ＡＲ及びＴＧＦベータ経路が、実際に単球性細胞中で適切に活性化でき、したがって、この細胞型における機能的なＳＴＰであることも確認された。これらの結果に基づいて、単球性細胞中での、敗血症のための潜在的な薬物標的としてＡＲ及びＴＧＦベータＳＴＰが確認される。
続いて、本発明者らは、これらの実験室敗血症モデルにおいて異常なＡＲ及びＴＧＦベータＳＴＰ活性を独立に、又は組み合わせて補正できる薬物のスクリーニングを進めた。２つの臨床適用のためのその潜在的な使用を精査した：
１．敗血症の防止；
２．確立された敗血症の処置。
第１の適用のために、ＴＨＰ－１細胞を、選択された薬物と共に２４時間予備インキュベートした後、２４時間にわたってＬＰＳを添加した。処置適用のために、薬物及びＬＰＳを、２４時間にわたって細胞に同時に添加した。重要なことに、一部の薬物は体内で有効になるようにプロセッシングする必要があり、これは、ビカルタミドなどの、一部のアンドロゲン受容体（ＡＲ）経路阻害剤に当てはまる。この場合、薬物の活性バリアントも試験した（ビカルタミドの場合、（Ｒ）－ビカルタミド）。
以下の薬物（又は薬物の組合せ）を、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータＳＴＰのＬＰＳにより誘導される活性を低減させることによってＴＨＰ－１単球敗血症モデルにおいて試験した：
敗血症防止モデルにおいては、ビカルタミド及びバクトセルチブを試験した（表１０）。
敗血症処置モデルにおいては、（Ｒ）－ビカルタミド、ケトダロルタミド（ＯＲＭ－１５３４１）、Ｄ４－アビラテロン、エタネルセプト、レサトルビド、バクトセルチブ、Ｎ－デスメチルエンザルタミド、Ｎ－デスメチル－アパルタミド、Ｒ－ビカルタミド＋エタネルセプト及びＲ－ビカルタミド＋フィルゴチニブ（表１１）。
敗血症患者のＰＢＭＣ試料に対する薬物の効果
以下の薬物（又は薬物の組合せ）を、ＰＢＭＣ中で試験し、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータＳＴＰの低下を示した。ＴＧＦベータ経路について、以下の化合物が有意な低下を示した：対応のある片側ｔ検定を使用して、バクトセルチブ（ｐ＝０．００７９）、バクトセルチブ＋Ｒ－ビカルタミド（ｐ＝０．０００４）、Ｄ４－アビラテロン（ｐ＝０．０５２７）、ガルニセルチブ（ｐ＝０．００１３）、Ｄ４－アビラテロン＋バクトセルチブ（ｐ＝０．００４０）、バクトセルチブ＋エタネルセプト（１０μｇ／ｍｌ）（ｐ＝０．０２７０）及びＤ４－アビラテロン＋ガルニセルチブ（ｐ＝０．００７５）（表１３）。
ＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路は、ガルニセルチブに関して有意に低かった（ＡＲ ｐ＝０．０３０２）。
以下の化合物は、ＡＲ経路の低減を示したが、有意ではなかった；２／３の患者におけるバクトセルチブ、３／３の患者におけるバクトセルチブ＋Ｒ－ビカルタミド及び４／５の患者におけるバクトセルチブ＋エタネルセプト（１０μｇ／ｍｌ）（表１３）。
敗血症患者においては、ＬＰＳ以外の他の因子も、適応免疫系（リンパ球）の機能の低減に反映される、免疫抑制状態の低減及び先天性、炎症性免疫（単球系列）系の活性の増加のように、症候において役割を果たしている。
ＴＧＦベータは単球の炎症状態及びリンパ球の免疫抑制状態を誘導することが知られている［４１］、［２３］。本明細書に記載される薬物（及び組合せ）を使用して、単球の炎症表現型及びリンパ球の免疫抑制表現型を低減させることができる。敗血症を防止及び処置するためのこれらの薬物の想定される使用：重病敗血症患者においては、薬物の経口投与ができないこと及び不十分な消化管薬物吸収を考慮して、薬物を経口投与することが可能でない、又は好ましくないことを考慮することが重要である。敗血症のリスクがある患者では、経口投与は可能である。かくして、潜在的に、経口的に有効な薬物を使用して、感染患者における敗血症を防止できる。敗血症又は敗血性ショックを有する患者の処置のために、製剤は、好ましくは、静脈内薬物に変化させる必要があるか、又は或いは、皮下若しくは筋肉内製剤であってもよい。
かくして、これらの薬物は全て、経口投与のために利用可能であり、敗血症の防止及び初期敗血症の処置のために別の目的で使用できるが、別の製剤（静脈内、皮下、筋肉内）の開発が、重病敗血症患者の処置にとって好ましい。経口投与と、静脈内／皮下／筋肉内投与との両方のための最も有効な用量を、通常の用量効果試験において決定できる。
方法：
ＴＨＰ－１敗血症モデル
ＬＰＳは、敗血症の症状の主要なメディエーターと考えられる。単球をＬＰＳで刺激した後、種々の阻害剤で処置するｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を設計した。単球は敗血症において主要な役割を果たすと記載されているため、それらを選択した。例えば、Ｓｕｋｈａｃｈｅｖａ、［３４］、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｔ．２６ Ａｕｇｕｓｔ ２０２０又はＨａｖｅｒｍａｎら［１５］、Ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｓｅｐｓｉｓ：ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌｕｍｅ ５５、Ｉｓｓｕｅ ３、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９９、１３２～１４１頁を参照されたい。炎症プロセスを試験するために、培養培地（１０％ＦＢＳ、１％グルタマックス及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ、３７℃、５％ＣＯ２）中で、ＤＭＳＯ又はＬＰＳ（０．５若しくは５ｎｇ／ｍｌ、大腸菌由来）又は薬物と組み合わせたＬＰＳを使用して単球ＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－２０２（商標））を刺激した。
敗血症防止モデル：ＴＨＰ－１細胞を、選択された薬物又はＤＭＳＯと共に２４時間予備インキュベートした後、ＬＰＳ又はＰＢＳと共に２４時間培養した。化合物及び濃度を、表９に記載する。
敗血症処置モデル：処置適用のために、薬物及びＬＰＳを、２４時間にわたって細胞に同時に添加した。化合物及び濃度を、健康なボランティアのＰＢＭＣについて表１１及び表１２に記載する。
ＭＯＬＴ－４細胞系：
ＭＯＬＴ－４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８２）を、１０％ＦＢＳ、１％グルタマックス及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
ＲＮＡ抽出及びＳＴＰ活性スコア
刺激後、細胞を収獲し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０４）を使用してＲＮＡを抽出した。ｑＰＣＲに基づくＳＴＰ活性スコアを、本明細書に記載されるように、Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＯｎｃｏＳｉｇｎａｌプラットフォーム（ｗｗｗ．ｐｈｉｌｉｐｓ．ｃｏｍ／ｏｎｃｏｓｉｇｎａｌ）を使用して算出した。
細胞試料に由来するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータ上でのシグナル伝達経路の活性の測定
ＧＥＯデータベースに由来するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現マイクロアレイデータ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｄｓ／）［３５］から、経路活性スコア（ＰＡＳ）を算出した。それぞれのシグナリング経路について、正規化されたＰＡＳをｌｏｇ２ｏｄｄｓスケールで提示する。経路活性に関するｌｏｇ２ｏｄｄｓスコアは、［３６］、［３７］、［３８］に記載されたような計算モデルによって算出された経路関連転写因子の活性に関する確率スコアから誘導される。
マイクロアレイデータ品質制御
品質制御（ＱＣ）を、以前に記載されたように［３８］、それぞれ個々の試料のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータ上で実施した。まとめると、ＱＣパラメータは、全てのプローブ強度の平均値、負の、又は極端に高い（１６ビットを超える）強度値の存在、ポリＡ ＲＮＡ（試料調製スパイクイン）、及び標識されたｃＲＮＡ（ハイブリダイゼーションスパイクイン）対照、ＧＡＰＤＨ、及びＡＣＴＢ ３’／５’比、強度の中心、Ｒ中のａｆｆｙＱＣＲｅｐｏｒｔパッケージによって決定された正及び負の境界対照の値、並びにＲ中のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘパッケージからのＡｆｆｙＲＮＡｄｅｇ機能によって決定されたＲＮＡ分解値を含む［３９］、［４０］。ＱＣに失敗した試料データを、データ分析の前に取り除いた。
健常者及び敗血症患者に由来するＰＢＭＣ
健康なボランティア及び敗血症患者に由来するＰＢＭＣ試料を、組織溶解によって取得した。簡単に述べると、凍結保存されたＰＢＭＣを最初に洗浄緩衝液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、遠心分離し、ペレットを培養培地（フェノールレッド＋８．５％活性炭処理ＦＢＳ＋１％Ｇｌｘ＋１％ｐ／ｓを含むＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁した。ウェルあたり０．５ｘ１０５～１ｘ１０６個の細胞を、２４ウェルプレート中に播種し、処置実験前に１時間にわたって静止させた。（１）ベースライン経路レベルを測定する、（２）ＬＰＳで活性化するために、健康なドナーに由来する１０個のＰＢＭＣ試料を使用した。
敗血症処置モデル：敗血症患者に由来するＰＢＭＣ（ｎ＝２０）を、化合物、ＤＭＳＯ又は化合物の組合せで２４時間処理した（健常者及び敗血症患者に由来するＰＢＭＣは、試料調製における偏りを最小化するために同じ病院に由来する）。刺激後、細胞を収獲し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０４）を使用してＲＮＡを抽出した。Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＯｎｃｏＳｉｇｎａｌプラットフォームを使用して、ｑＰＣＲを実施した。
結果：
単球性細胞中での機能的なＡＲ及びＴＧＦベータＳＴＰ
ＡＲ及びＴＧＦベータ経路は、単球性細胞中で機能的である（表７）。テストステロンは、ＴＨＰ－１細胞中でＡＲ経路の活性を誘導し、これはビカルタミドによって阻害できた。ＴＧＦベータは、ＴＧＦベータ経路活性の活性を誘導し、これは、特異的かつ既知のＴＧＦベータ経路阻害剤によって阻害された。結論として、両経路は、単球性細胞中で機能的であることが示された。
Figure 2024514404000008
単球性／単球に基づく敗血症モデル
ＬＰＳは、単球性／単球敗血症モデルにおいてＡＲ及びＴＧＦベータＳＴＰ活性を増加させる
ＴＨＰ－１単球性細胞中で、ＳＴＰ活性は、５及び０．５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを使用したＬＰＳ刺激細胞中でＡＲ及びＴＧＦベータ経路について用量依存的様式で増加した（表８Ａ）。ＬＰＳによるＡＲ、ＴＧＦベータＳＴＰ活性の増加は、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで６時間刺激した、ヒトボランティアに由来する一次単球中でも同様に認められた（ＧＥＯデータベースのデータセットＧＳＥ８４１６１）（表８Ｂ）。ＡＲ及びＴＧＦベータ経路活性は、ＬＰＳによって単球性細胞においてのみ誘導され、リンパ細胞系（ＭＯＬＴ－４）においては誘導されなかった（表９）。
Figure 2024514404000009
Figure 2024514404000010
ＴＨＰ１（Ａ）及びＭＯＬＴ－４（Ｂ）細胞系をＬＰＳ、ＤＨＴ又はＤＭＳＯで５時間刺激した後、ビカルタミド又はエンザルタミドで阻害した。正規化。ＡＲ及びＴＧＦベータＳＴＰ活性を正規化されたスコアで示した。
薬物探索：
ＴＨＰ－１敗血症モデル（防止及び処置）においてＬＰＳにより誘導されるＡＲ及びＴＧＦベータＳＴＰを阻害する薬物
上記のデータに基づいて、ＡＲ及び／又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を阻害する薬物を投与することによって敗血症を防止及び処置できるとの仮説が立てられた。
敗血症の防止
単球細胞を、最初に２５μＭのビカルタミド又はＤＭＳＯと共に２４時間培養した後、ＬＰＳ、ＤＨＴ又はＰＢＳと共に培養した。実験を３回反復で実施し、２回繰り返して、ロバストな結果を得た。
表１０に示されるように、ビカルタミドのみによる予備処置は、ＤＭＳＯと比較していずれかの経路の増加をもたらさなかった。ＬＰＳとＤＨＴとは両方とも、単球においてＡＲ細胞シグナリング経路活性を増加させ、ＬＰＳはＴＧＦベータも活性化する。ビカルタミドの予備処置、次いで、ＬＰＳ又はＤＨＴ刺激により、予備処置を用いない場合のＬＰＳと比較して、ＬＰＳによるＡＲ経路活性の有意に低い活性化が得られた（ビカルタミドＡＲ；ｐ＝０．０４、ＤＨＴ ＡＲ；ｐ＝０．０００３、ｎ＝９）。興味深いことに、ビカルタミドは、ＬＰＳにより誘導されるＴＧＦベータ活性の低減並びにＡＲ活性の低減を示し、それが二重ＡＲ／ＴＧＦベータ阻害剤として機能することを示唆している。
Figure 2024514404000011
敗血症の防止のためのＴＧＦベータ阻害剤
ＡＲ阻害剤に関する同様のアプローチの使用（最初の２４ｈの阻害剤、次いで、２４ｈのＬＰＳにより刺激）
表１０Ｂ示されるように、バクトセルチブのみによる予備処置は、ＤＭＳＯと比較していずれかの経路の増加をもたらさなかった。ＬＰＳは、ＡＲとＴＧＦベータとの両方を増加させた。バクトセルチブの予備処置、次いで、ＬＰＳ刺激により、予備処置を用いない場合と比較して、ＴＧＦベータ経路活性の有意に低い活性化が得られた（ｐ＝１．３Ｅ－０５片側ｔ検定）。バクトセルチブの効果は、ＡＲシグナリング経路上で見られなかった。
これらの結果は、ＬＰＳにより誘導されるＡＲ及びＴＧＦベータシグナリング経路活性の増加を、単球を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ実験によって示されるように、ＡＲ経路阻害剤によって軽減できることを示す。ＴＧＦベータシグナリング経路活性を、ＴＧＦベータ経路阻害剤を使用して軽減できる。これは、ＡＲ及びＴＧＦベータＳＴＰを阻害する薬物／化合物を使用して、敗血症を発症するリスクが高い患者において敗血症を防止できる可能性が高いことを示す。
敗血症の処置
２つの濃度、０．５及び５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを、実験において使用し、さらに、ＴＨＰ－１細胞系については、より多い継代回数（ｐｘ－５３～５５）及びより少ない継代回数（ｐｘ－１３～１５）を使用した（表１１）。より少ない継代回数のＴＨＰ－１細胞系は、より多い継代回数と比較してＬＰＳ活性化に向かってより反応性であった（データは示さない）。
ＴＨＰ－１単球敗血症モデル：
ＡＲシグナリング経路について、以下の化合物；別々の（Ｒ）－ビカルタミド、ケトダロルタミド、Ｄ４－アビラテロン、エタネルセプト、レサトルビド、バクトセルチブ、Ｎ－デスメチル－アパルタミド及びＮ－デスメチルエンザルタミドがＡＲ ＰＡＳを低減でき、（Ｒ）－ビカルタミド＋エタネルセプト及び（Ｒ）－ビカルタミド＋フィルゴチニブの組合せは、ＴＨＰ－１単球において経路活性スコアを低下させることができた（表１１）。
ＴＧＦベータシグナリング経路については、（Ｒ）－ビカルタミド、Ｄ４－アビラテロン、エタネルセプト、フィルゴチニブ、レサトルビド及びバクトセルチブが、ＰＡＳを低下させることができた（表１１）。
ＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路を、エタネルセプト、レサトルビド及び（Ｒ）－ビカルタミド＋エタネルセプトによって低下させることができた（表１１）。
Figure 2024514404000012
Figure 2024514404000013
健康なボランティアのＰＢＭＣ：
健康なボランティアのＰＢＭＣを、（Ｒ）－ビカルタミド及び（Ｒ）－ビカルタミド＋バクトセルチブと組み合わせて、５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで２４時間刺激した（実験１）。実験２において、（Ｒ）－ビカルタミド及びエタネルセプトを、０．５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで試験した（実験１については表１２Ａ及び実験２については表１２Ｂ）。０．５及び５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳは、ＡＲ及びＴＧＦベータＰＡＳを有意に増加させなかったが、これはＴＨＰ－１敗血症モデルにおいて示された。
したがって、ＬＰＳにより刺激されるＰＢＭＣモデルは、敗血症のための良好なモデルではないと考えられた。完全を期すために、薬物を用いた処置に関する結果を追加した。
ＰＢＭＣ試料中で、単球は細胞のわずか５～１０％であり、ＰＢＭＣ中の多くの細胞はＴ細胞であり、４０～６０％である。おそらく、ＬＰＳにより増加したＰＡＳの明確な全体効果を見るためには、単球はＰＢＭＣ試料中で過剰に希薄化されている。以下の化合物の効果は、単球の表示又はＴ細胞の組合せ効果であってよい。
（Ｒ）－ビカルタミド＋バクトセルチブは、ＬＰＳにより刺激されたＰＢＭＣと比較して、有意に低い（対応のあるｔ検定）ＡＲ（ｐ＝１Ｅ－０５）及びＴＧＦベータ（ｐ＝５Ｅ－０４）ＰＡＳを示した。（Ｒ）－ビカルタミドは、実験１における６人の健康なボランティアのうちの３人及び実験２（実験２：ビカルタミド＋ＬＰＳ：ＡＲ ｐ＝５Ｅ－０２）における４人のうちの３人においてＡＲ及びＴＧＦベータの低下を示した。エタネルセプトは、４人の健康なボランティアのうちの２人においてＡＲ ＰＡＳを、４人のうちの３人においてＴＧＦベータＰＡＳを低下させた（有意ではない）。
Figure 2024514404000014
ＰＢＭＣ敗血症患者：
ＡＲ及びＴＧＦベータ経路活性に対するＬＰＳの刺激効果を中和するのにＴＨＰ－１敗血症モデルにおいて有効であった選択された薬物の効果を精査するために、続いて、実際の敗血症患者のＰＢＭＣを、これらの薬物及び薬物の組合せを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで処理した。
健康なボランティアのＬＰＳにより刺激されたＰＢＭＣは、敗血症のための良好な実験室モデル系ではないと考えられたが、以下の理由から、本発明者らは、敗血症を有する実際の患者に由来するＰＢＭＣに対する効果を精査することを決定した。ＬＰＳは、敗血症患者の血液中に存在する唯一の異常因子ではない；例えば、ペプチドグリカン（ＰｅｐＧ）及びリポタイコ酸（ＬＴＡ）などの他の細菌由来分子又はＬＰＳにより誘導される二次分子は、単球性細胞に加えてリンパ球免疫細胞中でのＳＴＰ活性に影響する可能性が高い。また、敗血症を発症する細菌感染を有する患者の少なくともサブセットは、免疫抑制された免疫系を有する可能性が高いと以前に仮説が立てられた［４１］、［２３］。少なくとも一部のリンパ球は、免疫抑制時にＴＧＦベータ経路活性及び潜在的にはＡＲ経路活性の増加を示す［２３］、［２４］。
実験あたり６個の患者試料について、合計で、１８個のＰＢＭＣ敗血症試料を、選択された阻害剤（及び組合せ）で２４時間処理した。
実験１（表１３：Ａ、Ｂ）：バクトセルチブ、バクトセルチブ＋Ｒ－ビカルタミド、エタネルセプト（１０μｇ／ｍｌ）及びＲ－ビカルタミド。
実験２（表１３：Ｃ、Ｄ）：レサトルビド、Ｄ４－アビラテロン、Ａ－４８５及びガルニセルチブ。
実験３（表１３：Ｅ、Ｆ）：Ｄ４－アビラテロン＋バクトセルチブ、Ｒ－ビカルタミド＋エタネルセプト（１０μｇ／ｍｌ）、バクトセルチブ＋エタネルセプト（１０μｇ／ｍｌ）及びＤ４－アビラテロン＋ガルニセルチブ。
不幸なことに、敗血症患者の不十分な試料品質のため、経路活性を全ての患者について測定できなかった。これはまた、実験あたりの低い試料サイズに関する統計値も限定した。
ＴＧＦベータ経路について、以下の化合物が経路活性における有意な低下を示した：バクトセルチブ（ｐ＝０．００７９）、バクトセルチブ＋Ｒ－ビカルタミド（ｐ＝０．０００４）、Ｄ４－アビラテロン（ｐ＝０．０５２７）、ガルニセルチブ（ｐ＝０．００１３）、Ｄ４－アビラテロン＋バクトセルチブ（ｐ＝０．００４０）、バクトセルチブ＋エタネルセプト（１０μｇ／ｍｌ）（ｐ＝０．０２７０）及びＤ４－アビラテロン＋ガルニセルチブ（ｐ＝０．００７５）。
ＡＲとＴＧＦベータとの両方の経路の経路活性スコアは、ガルニセルチブに関して有意に低かった（ＡＲ ｐ＝０．０３０２）。
以下の化合物は、ＡＲ経路の低減を示したが、その低減は有意ではなかった；２／３の患者におけるバクトセルチブ、３／３の患者におけるバクトセルチブ＋Ｒ－ビカルタミド及び４／５の患者におけるバクトセルチブ＋エタネルセプト（１０μｇ／ｍｌ）。
上記のように、敗血症患者においては、ＬＰＳ以外の他の因子も、適応免疫系（リンパ球）の機能の低減に反映される、免疫抑制状態の低減及び先天性、炎症性免疫（単球系列）系の活性の増加のように、症候において役割を果たしている。
ＴＧＦベータは単球の炎症状態及びリンパ球の免疫抑制状態を誘導することが知られている［２３］。本明細書に記載される薬物（及び組合せ）を使用して、単球の炎症表現型及びリンパ球の免疫抑制表現型を低減させることができる。免疫抑制状態は敗血症を発症させやすくし、敗血症の臨床転帰を悪化しやすくすると考えられるため、適応免疫応答及び先天性免疫応答の機能を回復させることによって、細菌感染を有する患者における敗血症の発症を防止するためと、敗血症の臨床転帰を改善するためとの両方のために、有効な薬物及び薬物の組合せが有効である可能性が高い［４］。この状態の防止によって、両方の敗血症を、長期の免疫抑制効果として防止できる。
Figure 2024514404000015
Figure 2024514404000016
Figure 2024514404000017

Claims (20)

  1. 対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤。
  2. 対象が上昇したＡＲ細胞シグナリング経路活性を有するか、又はＡＲ細胞シグナリング経路活性が閾値を超えている、請求項１に記載のＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤。
  3. ＡＲ細胞シグナリング経路が、対象から得られた血液試料中で決定される、請求項２に記載のＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤。
  4. 対象の前記血液試料中で決定されたＡＲ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合に、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤が投与される、請求項３に記載のＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤。
  5. 使用が、
    対象の血液試料中のＡＲ細胞シグナリング経路活性を決定すること、及び
    対象の前記血液試料中のＡＲ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合に、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤を患者に投与すること
    を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤。
  6. ＡＲ細胞シグナリング経路の決定が、
    対象の血液試料中のＡＲシグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定する、又は受け取ること、
    試料中のＡＲ細胞シグナリング経路関連転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルを決定することであって、ＴＦエレメントが、３個以上の標的遺伝子の転写を制御し、決定が、３個以上の標的遺伝子の発現レベルと、ＡＲ細胞シグナリング経路の活性レベルとを関連付ける較正された数学的経路モデルを評価することに基づくものである、決定すること、及び
    ＡＲ細胞シグナリング経路関連ＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づいて、対象に由来する血液試料中のＡＲ細胞シグナリング経路の活性を推測すること
    を含む、請求項５に記載のＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤。
  7. ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤が、ステロイド性抗アンドロゲン剤、非ステロイド性抗アンドロゲン剤、アンドロゲン合成阻害剤、ＣＹＰ１７Ａ１阻害剤、ＣＹＰ１１Ａ１（Ｐ４５０ｓｃｃ）阻害剤、５α－リダクターゼ阻害剤及び抗性腺刺激ホルモン若しくはその組合せからなる群から選択されるか、又は
    ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤が、ビカルタミド、（Ｒ）－ビカルタミド（ＨＹ－１４２４９）、エンザルタミド（ＭＤＶ３１００）、Ｎ－デスメチルエンザルタミド、プロキサルタミド（ＧＴ０９１８）、アパルタミド（ＡＲＮ－５０９）、Ｎ－デスメチル－アパルタミド、ダロルタミド（ＯＤＭ－２０１；ＢＡＹ－１８４１７８８）、ケトダロルタミド（ＯＲＭ－１５３４１）、ガレテロン（ＴＯＫ－００１）、Ｄ４－アビラテロン、Ａ－４８５、デキサメタゾン、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）、酢酸シプロテロン、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、酢酸メゲストロール、酢酸オサテロン、酢酸ノメゲストロール、ジエノゲスト、オキセンドロン、ドロスピレノン、スピロノラクトン、メドロゲストン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、アパルタミド、シメチジン、トピルタミド、酢酸アビラテロン、ケトコナゾール、セビテロネル、アミノグルテチミド、デュタステリド、アルファトラジオール、デュタステリド、エピステリド、フィナステリド、Ａ－４８５、ＡＲＣＣ－４、ＡＲＤ－２６６、ノコギリヤシ抽出物、ロイプロレリン、エストロゲン（例えば、エストラジオール（及びそのエステル）、エチニルエストラジオール、コンジュゲート化エストロゲン、ジエチルスチルベストロール）、ＧｎＲＨアナログ、ＧｎＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、ロイプロレリン）、ＧｎＲＨアンタゴニスト（例えば、セトロレリクス）、及びプロゲストゲン（例えば、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、カプロン酸ゲストノロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール）、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ又はそれらの組合せからなる群から選択され、
    好ましくは、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤が、ビカルタミド、（Ｒ）－ビカルタミド（ＨＹ－１４２４９）、エンザルタミド（ＭＤＶ３１００）、Ｎ－デスメチルエンザルタミド、プロキサルタミド（ＧＴ０９１８）、アパルタミド（ＡＲＮ－５０９）、Ｎ－デスメチル－アパルタミド、ダロルタミド（ＯＤＭ－２０１；ＢＡＹ－１８４１７８８）、ケトダロルタミド（ＯＲＭ－１５３４１）、ガレテロン（ＴＯＫ－００１）、Ｄ４－アビラテロン、Ａ－４８５、デキサメタゾン、及びミフェプリストン（ＲＵ４８６）、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤。
  8. 使用が、敗血症を発症するリスクがある対象における敗血症の防止のためのものである、請求項１から７のいずれか一項に記載のＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤。
  9. 使用が、敗血症に罹患している対象における敗血症の処置のためのものである、請求項１から７のいずれか一項に記載のＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤。
  10. ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤が、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤と一緒に投与され、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤と、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤とが、同じ化合物であるか、又は異なる化合物である、請求項１から９のいずれか一項に記載のＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤。
  11. ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤が、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤の前に投与されるか、又はＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤が、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤と同時に投与されるか、又はＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤が、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤の後に投与される、請求項１０に記載のＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤。
  12. 使用が、
    対象の血液試料中のＡＲ細胞シグナリング経路活性及びＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を決定すること、
    ＡＲ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合、ＡＲ経路阻害剤を患者に投与すること、並びに
    ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合、ＴＧＦベータ経路阻害剤を患者に投与すること
    を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤。
  13. ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤が、低分子キナーゼ阻害剤、抗ＴＧＦ－βリガンド抗体、抗ＴβＲ受容体抗体又はアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはそれらの組合せからなる群から選択されるか、又は
    ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤が、バクトセルチブ（ＥＷ－７１９７）、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ３２００８８２、（Ｅ）－ＳＩＳ３、フレソリムマブ、ＸＰＡ６８１、ＸＰＡ０８９、ＬＹ２３８２７７０、ＬＹ３０２２８５９、ＩＳＴＨ００３６、ＩＳＴＨ００４７、ピロール－イミダゾールポリアミド、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ若しくはそれらの組合せからなる群から選択され；
    好ましくは、バクトセルチブ（ＥＷ－７１９７）、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ３２００８８２、（Ｅ）－ＳＩＳ３、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ若しくはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤。
  14. 対象における敗血症の防止又は処置における使用のためのＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤。
  15. 対象が上昇したＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を有するか、又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が閾値を超えている、請求項１４に記載のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤。
  16. 使用が、
    対象の血液試料中のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性を決定すること、及び
    対象の血液試料中のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路活性が上昇しているか、又はある特定の閾値を超えていると認められる場合に、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤を患者に投与すること
    を含む、請求項１４又は１５に記載のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤。
  17. ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路の決定が、
    対象の血液試料中のＴＧＦベータシグナリング経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定する、又は受け取ること、
    試料中のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路関連転写因子（ＴＦ）エレメントの活性レベルを決定することであって、ＴＦエレメントが、３個以上の標的遺伝子の転写を制御し、決定が、３個以上の標的遺伝子の発現レベルと、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路の活性レベルとを関連付ける較正された数学的経路モデルを評価することに基づくものである、決定すること、及び
    ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路関連ＴＦエレメントの決定された活性レベルに基づいて、対象に由来する血液試料中のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路の活性を推測すること
    を含む、請求項１６に記載のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤。
  18. ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤が、低分子キナーゼ阻害剤、抗ＴＧＦ－βリガンド抗体、抗ＴβＲ受容体抗体又はアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはそれらの組合せからなる群から選択されるか、又は
    ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤が、バクトセルチブ（ＥＷ－７１９７）、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ３２００８８２、（Ｅ）－ＳＩＳ３、フレソリムマブ、ＸＰＡ６８１、ＸＰＡ０８９、ＬＹ２３８２７７０、ＬＹ３０２２８５９、ＩＳＴＨ００３６、ＩＳＴＨ００４７、ピロール－イミダゾールポリアミド、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ若しくはそれらの組合せからなる群から選択され；
    より好ましくは、バクトセルチブ（ＥＷ－７１９７）、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ３２００８８２、（Ｅ）－ＳＩＳ３、エタネルセプト、レサトルビド、フィルゴチニブ若しくはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４から１７のいずれか一項に記載のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤。
  19. ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤が、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤と一緒に投与され、ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤と、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤とが、同じ化合物であるか、又は異なる化合物である、請求項１４から１８のいずれか一項に記載のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤。
  20. ＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤が、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤の前に投与されるか、又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤が、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤と同時に投与されるか、又はＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤が、ＡＲ細胞シグナリング経路阻害剤の後に投与される、請求項１９に記載のＴＧＦベータ細胞シグナリング経路阻害剤。
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