CN117295824A

CN117295824A - 用于高风险脓毒症患者的预后通路

Info

Publication number: CN117295824A
Application number: CN202280034307.6A
Authority: CN
Inventors: W·H·鲍曼; A·范德斯托尔佩
Original assignee: Koninklijke Philips NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2021-03-11
Filing date: 2022-03-09
Publication date: 2023-12-26
Also published as: EP4305206A1; KR20230155549A; WO2022189530A1; JP2024514404A

Abstract

本发明涉及脓毒症，并且涉及可用于预防和治疗患有脓毒症或处于发生脓毒症风险的受试者的化合物。本发明特别涉及抑制AR细胞信号传导通路活性的化合物，或抑制TGFβ细胞信号传导通路活性的化合物。本发明还涉及测量处于发生脓毒症风险或患有脓毒症的受试者的血液样品中AR和/或TGFβ通路活性的方法，以及当AR和/或TGFβ通路活性超过特定阈值时施用AR和/或TGFβ通路抑制剂。

Description

用于高风险脓毒症患者的预后通路

发明领域

本发明涉及脓毒症，并且涉及用于预防和治疗患有脓毒症或处于发生脓毒症风险的受试者、或预防免疫系统的免疫抑制状态的化合物。本发明特别涉及抑制AR细胞信号传导通路活性的化合物和/或抑制TGFβ细胞信号传导通路活性的化合物。本发明还涉及测量处于发生脓毒症风险或患有脓毒症的受试者的血液样品中AR和/或TGFβ通路活性的方法，以及当AR和/或TGFβ通路活性超过一定阈值时施用AR和/或TGFβ通路抑制剂。

发明背景

脓毒症最近被重新定义为：伴有器官功能障碍的感染(10)。脓毒症是对感染的免疫应答失调。脓毒症通常是重度细菌感染的并发症，其中细菌在血流中扩增。这种疾病的特征在于全身炎症反应，其通过尚不完全清楚的机制可导致脓毒性休克，伴有输液难治的低血压和高乳酸血症，进行性器官衰竭，最终死亡。重度脓毒症的死亡率为25％至30％，脓毒性休克的死亡率为40％至70％。脓毒症的临床表现根据病因(即基础疾病或病症)而变化很大。最常见的细菌感染来源是呼吸系统、泌尿生殖系统、胃肠系统以及皮肤和软组织。尽管临床表现各不相同，但发烧伴极度寒颤和心动过速往往是脓毒症的首发临床表现，而肺炎和泌尿生殖系统感染是导致脓毒症的最常见原因。具体治疗主要包括给予抗生素治疗感染，以及维持血液循环和防止缺氧的标准措施。然而，感染的细菌因素通常是未知的，因此适当的抗生素治疗是一种有根据的猜测，直到从血培养中获得有关致病细菌及其对抗生素的敏感性/耐药性模式的信息。如果在细菌种类对所施用的抗生素具有抗药性的情况中，则该信息使得可以调整治疗。然而，血培养需要长时间(24至48小时)并且大约30％的感染患者的血培养结果呈阳性，而对于细菌性脓毒症患者，每延迟一小时使用有效抗生素就会增加相对死亡风险。

由于这些原因，许多患者进展为脓毒性休克，导致这种疾病的死亡率非常高。除抗生素外，脓毒性休克受试者的治疗通常包括静脉输液和血管加压药治疗。人们尝试了许多其他治疗来逆转炎症性脓毒性休克状态，例如皮质类固醇，但尚未证明它们具有临床益处，尽管不能排除它们可能使迄今为止尚未确定的一小部分患者受益(10)。

原因之一是尚不清楚哪种细胞机制导致脓毒性休克和器官损伤的转变。对脓毒症病理生理学的了解有望为以合理方式预防和治疗脓毒症提供新的药物靶点。

除了抗生素和维持内脏血液循环的支持措施外，没有任何治疗被证明是有效的，尽管不能排除某些治疗可能使迄今为止无法确定的一小部分患者受益[10]。未能开发出有效治疗的原因之一是脓毒症患者之间的异质性，即基础医疗状况和药物使用的差异，以及影响个体患者免疫应答的遗传变异。

未能开发出适用于所有人的有效药物的原因之一可能是患者之间的异质性，这是由于可导致脓毒症的原因和条件数量众多，以及影响其进展的已知和未知因素的数量更多，而所有这些共同决定对药物的反应或耐药性(例如细菌种类、遗传学、共存的其他疾病等)。

对脓毒症患者功能性免疫应答的详细评估可能会带来新的通用和个性化治疗方法并提高治疗效果。免疫功能的诊断性评估目前仅限于常规血液测量，例如免疫细胞数量和炎症标志物(例如C反应蛋白)，但无法提供造成脓毒症患者的异常免疫应答的各种类型免疫细胞的功能活动状态信息。

对微生物的炎症反应的连续体目前被分类为感染、脓毒症和脓毒性休克，取代了旧的顺序：脓毒症、重度脓毒症和脓毒性休克。此外，全身炎症反应综合征(SIRS)是一种被定义为在没有(已证实的)感染的情况下，满足四个标准中的两个的病症：发热、心动过速、呼吸急促和白细胞增多或白细胞减少；最近，由于缺乏敏感性和特异性，这种诊断已被放弃。

用于鉴定医院内脓毒症患者的脓毒症相关死亡高风险的临床标准是(1)精神状态改变；(2)收缩压<100mmHg，呼吸频率超过22次/分钟。使用这些标准可以改进对高风险患者的鉴定，但无法鉴定低风险患者。

从理性上讲，减少脓毒症死亡的最佳方法是尽可能早识别发展脓毒症风险的患者。随后可以对此类高危患者进行分层以进行更严格的监测(例如在ICU)、鉴别和消除感染灶(例如留置导管)、进行更频繁的细菌培养、施用预防性抗生素以及消除免疫抑制因素。

导尿管、开放性伤口或带有引流管、血管内导管等的伤口几乎总是与一定程度的细菌定植相关，因此可能会给易感患者带来脓毒症风险。这些病症存在于大部分住院患者中，因此这些住院患者代表了通过早期评估脓毒症风险和脓毒性休克可以改善临床结果的患者群体。患者遗传学和免疫系统的功能状态可能是决定风险的相关因素。

感染患者发生脓毒症并进展为脓毒性休克的易感性部分取决于患者针对感染性病原体产生的免疫应答。

免疫应答的功能(免疫活跃与免疫抑制、炎症型免疫应答与适应性T细胞介导的应答)由多种内源性因素决定，例如年龄、遗传变异、合并症(例如糖尿病等慢性疾病)、过去的治疗(如化疗、骨髓移植、皮质类固醇)，和外源性因素，如当前的免疫抑制治疗。

所有这些因素对个体患者免疫系统功能的影响尚无法评估。这使得目前很难预测(1)哪位感染患者将有发生脓毒症的风险，(2)该风险有多大，(3)进展为脓毒性休克并最终死亡的风险是什么。认识到免疫应答的状态是发生脓毒症风险的重要决定因素，也可能有助于为感染或脓毒症患者开发基于改善失败的免疫功能的新疗法(即免疫疗法)。

然而，由于患者之间存在很大的异质性，包括影响免疫应答和发生脓毒症易感性的基因变异，因此脓毒症中免疫应答功能失调的分子因素因人而异。这意味着需要根据决定个体患者功能性免疫状态的细胞机制的特征，采取个性化治疗方法，以选择最有效且最小副作用(例如细胞因子风暴)的免疫靶向药物。基于患者基因谱的个性化治疗尚未被证明有效。

显然，与脓毒症易感性相关的免疫功能失调表型不仅取决于遗传谱，而且在很大程度上取决于患者的许多环境因素(例如细菌种类、荷载、合并症、药物等)。这意味着个体功能性免疫状态应该在表型水平上进行表征，即控制免疫功能的细胞机制的活性。

免疫细胞功能是通过信号传导通路如TGFbeta、PI3K、MAPK、JAK-STAT和AR通路之间高度受控的相互作用来协调的。最近开发了新的测定方法以基于靶基因mRNA测量结果来测量细胞或组织样品包括血液样品中信号转导通路的活性，所述靶基因mRNA测量结果由贝叶斯计算模型解释并转化为通路活性评分(2)、(3)、(4)。测量这些通路的活性使得可以表征所有类型免疫细胞的功能状态(5)。

脓毒症诊断部分基于主观临床标准，因此不是很敏感，也不特异，主要是由于患者多种多样(1)。当根据临床标准怀疑脓毒症时，快速确认诊断仍然很重要，以制定患者护理和治疗计划。通过例如血培养进行确认是一个耗时的过程，可能需要几天，而且不能等待。

需要更快的确认诊断检验，以及预测哪些感染患者(主要是住院患者)有患脓毒症风险的检验，预测发生脓毒性休克的风险以及预测死亡风险的检验。基于这样的检验可以采取的临床行动可以是例如对受试者是进入重症监护病房(ICU)还是留在普通病房进行分层，对高风险患者进行手术搜索和去除感染源进行分层，以及对进行特定治疗分层，例如靶向免疫治疗。

总而言之，非常需要能够快速进行的另外的检验，这些检验可用于(1)预测受感染的住院(或居家)患者的脓毒症风险，(2)早期诊断脓毒症，以及(3)预测进展为脓毒性休克和死亡的风险；和(4)预测对治疗的反应，例如针对个体患者的(靶向)治疗或免疫治疗(个性化治疗)。另外，迫切需要(5)其他治疗或预防脓毒症的方法。

发明概述

根据本发明的第一方面，上述问题通过用于预防或治疗受试者脓毒症的AR细胞信号传导通路抑制剂来解决。

根据本发明的第二方面，上述问题通过用于预防或治疗受试者脓毒症的TGFβ通路抑制剂来解决。

实施方案详述

免疫细胞的功能状态由少数所谓的细胞信号转导通路(STP)决定([20]、[21]、[22]、[23]、[24]；每篇文章均通过引用全文并入)。最近，已经开发出新的测定方法来定量测量细胞和组织样品包括血液样品中的STP活性([25]、[26]、[27]、[28]；每篇文章均通过引用全文并入)。测量血细胞中这些STP的综合活性有望能够定量评估个体的先天性和适应性免疫应答。

对来自多个临床脓毒症研究的公开可得的基因表达数据进行STP分析([30]，通过引用全文并入)。本文描述的研究表明，与健康对照相比，脓毒症患者的AR和TGFβ活性增加，表明这些通路代表了治疗或预防脓毒症的新药物靶点。

使用通路抑制剂、特别是AR或TGFβ通路抑制剂或其组合进行治疗可能对于患有脓毒症或处于发生脓毒症危险中的受试者是有益的。之前曾在小鼠模型中尝试过用AR抑制剂治疗脓毒症，但没有成功。这可能部分是由于雄激素和/或睾酮水平的性别差异以及随之的AR通路的活性所致。从这项研究得出的结论是，用AR抑制剂治疗脓毒症是不可行的。现在本公开证明，首先可以根据AR通路活性对所有患者进行分层，从而使得可以仅治疗那些具有强烈增加的AR通路活性的患者。更重要的是，有发生脓毒症风险且相关血细胞中AR通路活性高的感染患者可以受益于AR抑制剂的预防性治疗。据本发明人所知，还没有提出用AR抑制剂进行这样的预防性治疗。这背后的基本原理是活性AR通路会导致免疫抑制，见例如Gubbels Bupp and Jorgensen 2018[5]所述，所述文章通过引用全文并入。

研究发现，AR蛋白在多种先天性和适应性免疫细胞中表达，包括中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、巨核细胞、B细胞和T细胞，表明AR通路可能确实是配体诱导的，本发明人在此确认了单核细胞是导致脓毒症症状的主要细胞类型。有趣的是，AR蛋白也在造血干细胞以及淋巴和骨髓祖细胞中表达。来自不同研究的证据表明，雄激素在不同免疫细胞类型中的免疫抑制作用主要是通过改变促炎和抗炎介质的表达来实现的，这对于适当的免疫应答很重要。

与脓毒症中的促炎症反应同时，有证据表明许多免疫抑制事件发生，其中免疫抑制细胞因子例如IL-10、TGF-β和IL6发挥作用。根据一项临床观察队列研究，脓毒症患者可发展为慢性危重疾病，6个月生存率为63％，并继续表现出慢性炎症的细胞因子谱，以及持续免疫抑制特有的生物标志物谱[31]。在Hiraki等人的研究中[32]，利用小鼠腹部脓毒症模型，其中施用TGF-β耗竭抗体，导致小鼠的存活率提高。这表明TGFβ通路在脓毒症中具有因果作用。迄今为止，尚未建议使用TGFβ抑制剂进行治疗或预防。

本发明进一步基于本发明人的创新，即信号转导通路活性的分析可用于表征血液样品，例如由至少一种免疫细胞类型或混合的免疫细胞类型集合组成的血液样品，基于确定例如AR信号传导通路的活性及任选地确定另外或替代通路的活性，例如TGFβ通路、MAPK-AP1通路和JAK-STAT3通路。本发明人证实，仅基于AR通路活性，当在血液样品例如全血样品上测定时，它可以用作在具有提示脓毒症临床标准的患者中建立或确认脓毒症诊断的检验。当发现AR通路活性低时，脓毒症可能仍然存在，但患者很可能是幸存者。此外，AR通路活性水平可用于区分低死亡风险和高死亡风险，这意味着基于从患有脓毒症的受试者获得的血液样品，基于AR通路活性可以区分得自具有高死亡风险的受试者的样品和得自具有低死亡风险的受试者的样品。最后，发现通路活性与脓毒症受试者相对于对照受试者或低死亡风险相对于高死亡风险之间的相关性对于这四种通路是特异性的，没有发现全血液样品中其他信号传导通路与脓毒症的存在或不存在或脓毒症的严重程度(包括死亡风险)相关(数据未显示)。

AR通路和TGFβ通路是在脓毒症中升高且高度指示不良预后的两个关键通路。这些通路还表明脓毒症前状态下的活性水平增加。因此，本发明人接下来研究了这些通路是否是致病因素，并因此可用于通过干扰AR和/或TGFβ通路活性来预防或治疗患者的脓毒症。

鉴于脓毒症患者之间的临床异质性，如前所述，个性化治疗可能会提供额外的优势。到目前为止，还无法对可以从AR或TGFβ通路抑制剂预防或治疗脓毒症中受益的患者进行分层。本文描述的方法现在使得可以准确评估血液样品中的AR或TGFβ通路活性。这使得可以区分具有低和高AR和/或TGFβ通路活性的患者，并对具有高AR和/或TGFβ通路活性的患者施用AR和/或TGFβ抑制剂以使通路活性正常化。

因此，本发明人推测，基于下述发现，用通路抑制剂、特别是AR和/或TGFβ通路抑制剂治疗可能对患有脓毒症或处于发生脓毒症危险的受试者是有益的。之前已经描述过用AR抑制剂治疗脓毒症小鼠，并取得了不同程度的成功[16]。结果发现，患有脓毒症的雄性小鼠受益于AR抑制剂的治疗，但对患有脓毒症的雌性小鼠却没有效果。然而，应该指出的是，对脓毒症的反应存在强烈的性别差异(雄性小鼠的死亡率要高得多)，因此尚不清楚这些结果在多大程度上可以外推至人类。

根据我们的结果，对AR和/或TGFβ抑制剂治疗反应的任何差异都可以通过以下事实来解释：并非所有脓毒症患者都表现出高AR和/或TGFβ通路活性，因此只有那些AR和/或TGFβ通路活性显著增加的患者将受益于AR和/或TGFβ通路抑制剂的治疗。更重要的是，有感染风险并表现出高AR和/或TGFβ通路活性的感染患者可能会从AR和/或TGFβ抑制剂的预防性治疗中获益最多。这一假设背后的基本原理是，活性AR和/或TGFβ通路会导致免疫抑制，见例如Gubbels Bupp and Jorgensen,Androgen-Induced Immunosuppression,FrontImmunol.2018；9:794[11]，通过引用将其全文并入。

研究发现，AR在多种先天性和适应性免疫细胞中表达，包括中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、巨核细胞、B细胞和T细胞。有趣的是，AR也在造血干细胞以及淋巴和骨髓祖细胞中表达[13]。来自不同研究的证据表明，雄激素和TGFβ在不同免疫细胞类型中具有相当大的免疫抑制作用，主要是通过减少和/或促进促炎和抗炎介质的表达而实现。

迄今为止，还不可能对将从AR和/或TGFβ通路抑制剂预防或治疗脓毒症中受益的患者进行分层，然而本文描述的方法使得准确评估血液样品中的AR和TGFβ通路活性。这使得可以简单地区分具有低和高AR和/或TGFβ通路活性的患者，并对具有高AR和/或TGFβ通路活性的患者施用AR和/或TGFβ抑制剂。

为了验证这一假设，设计了一项体外实验，其中用LPS刺激单核细胞，然后用各种AR和/或TGFβ通路抑制剂进行处理。选择单核细胞是因为它们已被描述为在脓毒症中发挥主要作用，见例如Sukhacheva,The role of monocytes in the progression of sepsis,Clinical Laboratory Int.26August 2020[14]或Haverman et al.,The central roleof monocytes in the pathogenesis of sepsis:consequences for immunomonitoringand treatment,The Netherlands Journal of Medicine,Volume 55,Issue 3,September1999,Pages 132-141[15]，两者均通过引用全文并入。本发明人能够证明(细菌)LPS能够刺激单核细胞中的AR和TGFβ信号传导通路，并且可以通过在刺激后将单核细胞与AR和/或TGFβ通路抑制剂一起温育来很大程度上抵消这种作用。

由于已知单核细胞是在脓毒症中发挥作用的关键细胞类型之一，AR信号传导活性增加，这种活性可以在单核细胞中测量，并且已知AR和TGFβ信号传导具有免疫抑制作用以及炎症作用，因此治疗具有高AR和/或TGFβ通路活性的患者完全有可能预防或成功治疗脓毒症，或至少减轻症状。实施例10通过使用THP-1细胞模型提供了AR通路抑制剂可用于治疗或预防脓毒症的第一个概念证明。数据表明，LPS在THP-1单核细胞中诱导AR和TGFβ通路活性，并且通过加入AR通路抑制剂，几乎可以将AR通路活性水平恢复到基线水平。

实施例11提供数据进一步支持AR抑制剂和TGFβ抑制剂可用于预防和治疗脓毒症。为了支持这一点，设计了预防和治疗模型来测试AR和TGFβ抑制剂。在这些模型中，使用单核细胞系(THP-1)，因为单核细胞被认为是脓毒症反应中的相关细胞之一，并且已被证明可以上调脓毒症患者中的AR和TGFβ通路活性(参见先前实施例)。

在预防模型中，将细胞与通路抑制剂或阴性对照(DMSO)预温育24小时，然后与LPS(或作为阳性对照的二氢睾酮(DHT))温育24小时。然后从细胞中提取RNA并通过本文描述的方法测定通路活性。这些数据在表7、8和10中描述。

在治疗模型中，同时加入通路抑制剂和LPS并将THP-1细胞温育24小时，然后分离RNA并测定通路活性。这些数据在表9A和11中描述。

为了证明LPS诱导的AR和TGFβ通路活性增加的效果是细胞类型特异性的，在单核细胞(THP-1)和淋巴样细胞系(MOLT-4)之间进行了比较。这些数据可见于表9A和9B，并且证明LPS引起THP-1细胞中AR和TGFβ通路活性的活化，但MOLT-4在通路活化中不显示任何变化。在THP-1细胞中，加入比卡鲁胺(bicalutamide)或恩杂鲁胺(enzalutamide)可能会稍微降低活性，但值得注意的是，所使用的LPS浓度极高，这解释了这些通路抑制剂在这个特定实验中仅有的轻微影响。

接下来审查了是否也可以观察到对健康受试者的PBMC的影响。由于PBMC仅含有5-10％单核细胞，因此预计影响很小。事实上，表12A和12B中的数据证明LPS没有显著上调得自健康志愿者的PBMC中的AR或TGFβ通路活性，这可能是由于预期有作用的单核细胞百分比较低所致。尽管如此，当LPS与(R)-比卡鲁胺联合使用时，观察到AR和TGFβ通路活性略有降低，并且通过包括Vactosertib也可以显著增加这种效果。

尽管如此，我们还是获得并分析了未治疗和用不同通路抑制剂治疗的脓毒症患者的PBMC。发现AR和TGFβ通路活性通常在脓毒症患者中升高，并且通过将所述PBMC与AR和/或TGFβ通路抑制剂一起温育24小时，可以令人惊讶地降低AR和TGFβ通路活性，提供了AR和TGFβ细胞信号传导通路抑制剂可用于治疗脓毒症的进一步证据。

总而言之，实施例1-9提供证据表明，在患有脓毒症的患者或处于发生脓毒症风险的患者中，若干通路被上调，此外，所述通路分析使得可以对患者进行分层，例如用于选择那些处于致命结果风险最高的患者。

因此，在第一方面，本发明涉及用于预防或治疗受试者脓毒症的AR细胞信号传导通路抑制剂。或者，本发明涉及在有需要的受试者中预防或治疗脓毒症的方法，包括向受试者施用AR细胞信号传导通路抑制剂。

当在本文中使用时，通过通路抑制剂预防或治疗脓毒症是指向有需要的受试者施用通路抑制剂，所述受试者是指患有脓毒症或处于发生脓毒症风险的受试者。施用途径通常是技术人员已知的并且取决于化合物。因此，本文描述的方法和用途不限于特定的施用途径并且可以例如指肠内、肠胃外或局部施用。可以使用的肠内施用途径的实例包括口服、经直肠、舌下、唇下或颊粘膜施用，其中优选口服施用。肠胃外施用可包括经硬膜外、脑室内、皮下、舌下或颊粘膜、舌下、鼻、动脉内、关节内、心内、海绵窦内、病灶内、肌内、眼内、骨内、腹膜内、鞘内、阴道内、静脉内、膀胱内、玻璃体腔内、皮下、经皮、血管周围或经粘膜施用，例如通过注射针施用。优选的肠胃外途径是皮下或肌内施用。

当在本文中使用时，预防是指受试者被认为没有患有脓毒症但处于发生脓毒症的高风险的情况，其中预防被认为是指减少所述受试者发生脓毒症的机会。当在本文中使用时，治疗是指受试者患有脓毒症的情况，并且其中与受试者未接受相应治疗的情况相比，所述治疗可以指减轻症状、缩短受试者脓毒症的时间、降低死亡率的变化或治愈受试者。治疗还可以指减轻受试者的免疫抑制状态。

受试者可以是人类或非人类哺乳动物。优选地，受试者是人。在一个实施方案中，受试者具有升高的AR细胞信号传导通路活性或其中AR细胞信号传导通路活性超过阈值。或者，本发明涉及预防或治疗脓毒症的方法，包括向具有升高的AR细胞信号传导通路活性的受试者或具有超过阈值的AR细胞信号传导通路活性的受试者施用AR细胞信号传导通路抑制剂。

当本文使用时，当指的是通路活性时，升高应当解释为意指与基线或对照水平相比更高或增加。例如，可以对一组健康个体的血液样品测定诸如AR或TGFβ通路活性的通路活性，以建立平均通路活性值作为基线或对照水平。然后可以将受试者血液样品中测量的通路活性与该平均值进行简单比较。因为在健康群体中观察到的通路活性存在自然变化，所以可以设定一个阈值，高于该阈值则称通路活性增加或升高。类似地，可以设定阈值，低于该阈值则称通路活性降低或更低。例如，当使用从一组健康受试者获得的通路活性时，可以使用平均通路活性加上或减去一倍标准差来设置阈值。可以通过将阈值设为从健康群体的血液样品获得的通路活性的平均值加或减两倍、三倍甚至四倍标准差来设置更严格的阈值。

在一个实施方案中，在从受试者获得的血液样品中测定AR细胞信号传导通路。可以对全血或分离的血细胞例如但不限于PBMC、单核细胞或中性粒细胞测定通路活性。或者，本发明涉及预防或治疗脓毒症的方法，包括向具有升高的AR细胞信号传导通路活性的受试者或具有超过阈值的AR细胞信号传导通路活性的受试者施用AR细胞信号传导通路抑制剂，其中在从受试者获得的血液样品中确定AR细胞信号传导通路。

在一个实施方案中，如果发现在受试者的血液样品中测定的AR细胞信号传导通路活性升高或超过某个阈值，则施用AR细胞信号传导通路抑制剂。所述阈值可以是预定的。技术人员将意识到获得的并代表通路活性的数值取决于所使用的方法。因此，理想地使用相同的方法来确定受试者的血液样品和例如健康受试者的参考血液样品中的通路活性，例如AR通路活性。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于预防或治疗脓毒症的AR细胞信号传导通路抑制剂，所述用途包括：

-测定受试者血液样品中的AR细胞信号传导通路活性；和

-如果发现受试者血液样品中的AR细胞信号传导通路活性升高或超过特定阈值，则向患者施用AR细胞信号传导通路抑制剂。

技术人员知道有多种方法可用于确定AR细胞信号传导通路活性。例如，在本文所述的用途和方法中，AR通路活性可以通过报告基因分析、受体转录复合物的核染色、基于磷酸化的测定、ELISA或基于如本文所述的标记或靶基因来测定。然而，技术人员知道可以使用其他方法，因此该列表不应被解释为限制性的。因此，本文描述的方法和用途不限于确定通路活性的特定方法。例如，可以使用下文描述的方法。因此，在一个实施方案中，确定AR细胞信号传导通路包括：测定或接收受试者血液样品中AR信号传导通路的3个或更多个靶基因的表达水平；测定样品中AR细胞信号传导通路相关转录因子(TF)元件的活性水平，所述TF元件控制所述3个或更多个靶基因的转录，所述测定基于评估使所述3个或更多个靶基因的表达水平与AR细胞信号传导通路的活性水平相关联的经校准的数学通路模型，并基于测定的AR细胞信号传导通路相关TF元件的活性水平来推断来自受试者的血液样品中的AR细胞信号传导通路的活性。下面提供了基于测定TF元件的活性水平来推断通路活性的方法的详细描述。

当在本文使用时，术语AR细胞信号传导通路抑制剂与术语AR通路抑制剂可互换使用，并且用于描述通过活化的雄激素受体复合物抑制、降低或减少靶基因转录的化合物或生物制品。AR通路抑制剂可以是直接抑制剂或间接抑制剂，这意味着它可以直接干扰AR细胞信号传导的信号传导级联，或者通过干扰更下游调节AR细胞信号传导通路的通路来间接干扰。例如，所述抑制剂可以通过使AR通路的配体例如睾酮不可用、干扰睾酮至DHT的代谢步骤的减少、干扰活化的AR易位至细胞核或通过干扰AR转录复合物的转录起始、或通过减少AR表达例如通过AR降解来发挥作用。例如，依那西普(也称为Enbrel)被认为主要是一种干扰肿瘤坏死因子(TNF)的化合物，但在我们的数据中，我们观察到当该化合物用于相关模型系统时，AR和TGFβ通路信号传导显著减少，因此出于本发明的目的，依那西普被认为是AR通路抑制剂以及TGFβ通路抑制剂。例如，瑞沙托维(也称为TAK-242)被认为主要是Toll样受体4(TLR4)的拮抗剂，但在我们的数据中，我们观察到当该化合物用于相关模型系统时，AR和TGFβ通路信号传导显著减少，因此出于本发明的目的，瑞沙托维被认为是AR通路抑制剂以及TGFβ通路抑制剂。例如，非戈替尼(也称为Jyseleca)主要被称为JAK1抑制剂，但在我们的数据中，我们观察到当该化合物用于相关模型系统时，AR和TGFβ通路信号传导显著减少，因此出于本发明的目的，非戈替尼被认为是AR通路抑制剂以及TGFβ通路抑制剂。因此，当本文使用时，AR抑制剂是能够抑制相关模型系统例如但不限于THP-1细胞中AR通路活性的任何化合物或生物制品，其中通过本文所述的模型推断AR通路活性。AR通路抑制剂的次要作用可能是改变其他信号传导通路活性，例如通过中间蛋白的产生，或各种信号传导通路的转录因子之间的相互作用。

因此，在一个实施方案中，AR细胞信号传导通路抑制剂选自类固醇抗雄激素、非类固醇抗雄激素、雄激素合成抑制剂、CYP17A1抑制剂、CYP11A1(P450scc)抑制剂、5α-还原酶抑制剂和抗促性腺激素或其组合。或者，AR细胞信号传导通路抑制剂选自比卡鲁胺、(R)-比卡鲁胺(HY-14249)、恩杂鲁胺(MDV3100)、N-去甲基恩杂鲁胺、普克鲁胺(Proxalutamide，GT0918)、阿帕鲁胺(Apalutamide，ARN-509)、N-去甲基阿帕鲁胺、达洛鲁胺(Darolutamide，ODM-201；BAY-1841788)、酮基达洛鲁胺(Ketodarolutamide，ORM-15341)、Galeterone(TOK-001)、D4-阿比特龙(abiraterone)、A-485、地塞米松、米非司酮(Mifepristone，RU486)、醋酸环丙孕酮(Cyproterone acetate)、醋酸氯地孕酮(Chlormadinone acetate)、醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮(Megestrol acetate)、醋酸奥沙特隆(Osaterone acetate)、醋酸诺美孕酮(Nomegestrol acetate)、地诺孕素(Dienogest)、奥生多龙(Oxendolone)、屈螺酮(Drospirenone)、螺内酯(Spironolactone)、美屈孕酮(Medrogestone)、比卡鲁胺、氟他胺(Flutamide)、尼鲁米特(Nilutamide)、阿帕鲁胺、西咪替丁(Cimetidine)、托匹芦胺(Topilutamide)、醋酸阿比特龙、酮康唑(Ketoconazole)、Seviteronel、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、度他雄胺(Dutasteride)、阿法雌二醇(Alfatradiol)、度他雄胺、爱普列特(Epristeride)、非那雄胺(Finasteride)、A-485、ARCC-4、ARD-266、沙巴棕提取物、亮丙瑞林(Leuprorelin)、雌激素(例如雌二醇(及其酯)、炔雌醇(ethinylestradiol)、缀合雌激素、己烯雌酚(diethylstilbestrol))、GnRH类似物、GnRH激动剂(例如，戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林)、GnRH拮抗剂(例如，西曲瑞克(cetrorelix))，和孕激素(例如，醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕诺酮(gestonorone caproate)、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮)、依那西普(etanercept)、瑞沙托维(resatorvid)、非戈替尼(filgotinib)或其组合。在一个更优选的实施方案中，AR细胞信号传导通路抑制剂选自比卡鲁胺、(R)-比卡鲁胺(HY-14249)、恩杂鲁胺(MDV3100)、N-去甲基恩杂鲁胺、普克鲁胺(GT0918)、阿帕鲁胺(ARN-509)、N-去甲基-阿帕鲁胺、达洛鲁胺(ODM-201；BAY-1841788)、酮基-达洛鲁胺(ORM-15341)、Galeterone(TOK-001)、D4-阿比特龙、A-485、地塞米松、米非司酮(RU486)、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合。

在一个实施方案中，本发明涉及用于预防或治疗受试者脓毒症的AR细胞信号传导通路抑制剂，如本文所述，其中所述用途是用于预防处于发生脓毒症风险的受试者中的脓毒症。

在一个实施方案中，本发明涉及用于预防或治疗受试者脓毒症的AR细胞信号传导通路抑制剂，如本文所述，其中所述用途是用于治疗患有脓毒症的受试者中的脓毒症。

将AR抑制剂与TGFβ抑制剂组合以预防或治疗受试者的脓毒症可能是特别有利的。因此，在一个实施方案中，AR细胞信号传导通路抑制剂与TGFβ细胞信号传导通路抑制剂一起施用，其中AR细胞信号传导通路抑制剂和TGFβ细胞信号传导通路抑制剂是相同的化合物或不同的化合物。

AR和TGFβ抑制剂可以组合在单一治疗剂中或者可以单独施用。因此，在一个实施方案中，AR细胞信号传导通路抑制剂在TGFβ细胞信号传导通路抑制剂之前施用，或者其中AR细胞信号传导通路抑制剂与TGFβ细胞信号传导通路抑制剂同时施用，或者其中AR细胞信号传导通路抑制剂在TGFβ细胞信号传导通路抑制剂之后施用。

脓毒症和有发生脓毒症风险的受试者中AR和TGFβ细胞信号传导通路的激活各不相同。因此，一些受试者可能从AR和/或TGFβ细胞信号传导通路抑制剂中获益更多。因此，在治疗前测定受试者血液样品中的AR和/或TGFβ通路活性可能是有益的。因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于预防或治疗受试者脓毒症的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中所述用途包括：

-测定受试者血液样品中的AR细胞信号传导通路活性和TGFβ细胞信号传导通路活性；和

-当发现AR细胞信号传导通路活性升高或超过特定阈值时，给患者施用AR通路抑制剂；及

-当发现TGFβ细胞信号传导通路活性升高或超过特定阈值时，给患者施用TGFβ通路抑制剂。

例如，当在受试者的血液样品中测量到高AR通路活性和低TGFβ通路活性时，可以施用AR通路抑制剂，或者当在受试者的血液样品中测量到高AR通路活性和高TGFβ通路活性时，可以施用AR和TGFβ通路抑制剂二者。或者，当在受试者的血液样品中测量到低AR通路活性和高TGFβ通路活性时，可以施用TGFβ通路抑制剂。

因此，在一个实施方案中，TGFβ细胞信号传导通路抑制剂选自小分子激酶抑制剂、抗TGF-β配体抗体、抗TβR受体抗体或反义寡核苷酸或其组合，或

其中TGFβ细胞信号传导通路抑制剂选自Vactosertib(EW-7197)、Galunisertib(LY2157299)、LY3200882、(E)-SIS3、非苏木单抗、XPA681、XPA089、LY2382770、LY3022859、ISTH0036、ISTH0047、吡咯-咪唑聚酰胺、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合；

优选选自Vactosertib(EW-7197)、Galunisertib(LY2157299)、LY3200882、(E)-SIS3、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合。

在一个实施方案中，所述用途是用于预防脓毒症并且所述AR抑制剂是比卡鲁胺和/或TGFβ抑制剂是vactosertib。

在一个实施方案中，所述用途是用于治疗脓毒症并且所述AR抑制剂是比卡鲁胺、(R)-比卡鲁胺、酮基-达洛鲁胺(ORM-15341)、D4-阿比特龙、依那西普、瑞沙托维、N-去甲基恩杂鲁胺、N-去甲基-阿帕鲁胺或非戈替尼或其组合，和/或TGFβ抑制剂是vactosertib、依那西普、瑞沙托维或非戈替尼或其组合。

在一个实施方案中，所述AR抑制剂是(R)-比卡鲁胺并且TGFβ抑制剂是依那西普，或者AR抑制剂是(R)-比卡鲁胺并且TGFβ抑制剂是非戈替尼。优选地，所述用途是用于治疗脓毒症并且所述AR抑制剂是(R)-比卡鲁胺并且TGFβ抑制剂是依那西普，或者AR抑制剂是(R)-比卡鲁胺并且TGFβ抑制剂是非戈替尼。或者，所述用途用于治疗脓毒症并且所述AR抑制剂与依那西普或非戈替尼组合，优选其中AR抑制剂是(R)-比卡鲁胺。

在一个实施方案中，本发明涉及用于预防或治疗脓毒症的化合物。或者，本发明涉及预防受试者脓毒症或治疗患有脓毒症的受试者的方法，包括向受试者施用化合物。所述化合物优选选自比卡鲁胺、(R)-比卡鲁胺(HY-14249)、恩杂鲁胺(MDV3100)、N-去甲基恩杂鲁胺、普克鲁胺(GT0918)、阿帕鲁胺(ARN-509)、N-去甲基-阿帕鲁胺、达洛鲁胺(ODM-201；BAY-1841788)、酮基-达洛鲁胺(ORM-15341)、Galeterone(TOK-001)、D4-阿比特龙、A-485、地塞米松、米非司酮(RU486)、醋酸环丙孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸奥沙特隆、醋酸诺美孕酮、地诺孕素、奥生多龙、屈螺酮、螺内酯、甲孕酮、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、阿帕鲁胺、西咪替丁、托匹芦胺、醋酸阿比特龙、酮康唑、Seviteronel、氨鲁米特、度他雄胺、阿法雌二醇、度他雄胺、爱普列特、非那雄胺、A-485、ARCC-4、ARD-266、沙巴棕提取物、亮丙瑞林、雌激素(例如雌二醇(及其酯)、炔雌醇、缀合雌激素、己烯雌酚)、GnRH类似物、GnRH激动剂(例如，戈舍瑞林、亮丙瑞林)、GnRH拮抗剂(例如西曲瑞克)、孕激素(例如醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮)、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼、Vactosertib(EW-7197)、Galunisertib(LY2157299)、LY3200882、(E)-SIS3、非苏木单抗、XPA681、XPA089、LY2382770、LY3022859、ISTH0036、ISTH0047、吡咯-咪唑聚酰胺或其组合。

在第二方面，本发明涉及用于预防或治疗受试者脓毒症的TGFβ通路抑制剂。或者，本发明涉及在有需要的受试者中预防或治疗脓毒症的方法，包括为受试者施用TGFβ细胞信号传导通路抑制剂。在一个实施方案中，受试者具有升高的TGFβ细胞信号传导通路活性或其中TGFβ细胞信号传导通路活性超过阈值。或者，本发明涉及预防或治疗脓毒症的方法，包括为具有升高的TGFβ细胞信号传导通路活性的受试者或具有超过阈值的TGFβ细胞信号传导通路活性的受试者施用TGFβ细胞信号传导通路抑制剂。

在一个实施方案中，在从受试者获得的血液样品中测定TGFβ细胞信号传导通路。可以对全血或分离的血细胞例如但不限于PBMC、单核细胞或中性粒细胞测定通路活性。或者，本发明涉及预防或治疗脓毒症的方法，包括为具有升高的TGFβ细胞信号传导通路活性的受试者或具有超过阈值的TGFβ细胞信号传导通路活性的受试者施用TGFβ细胞信号传导通路抑制剂，其中在从受试者获得的血液样品中确定TGFβ细胞信号传导通路。

在一个实施方案中，如果发现受试者的血液样品中测定的TGFβ细胞信号传导通路活性升高或超过某个阈值，则施用TGFβ细胞信号传导通路抑制剂。阈值可以是预定的。技术人员将意识到获得的并代表通路活性的数值取决于所使用的方法。因此，理想地使用相同的方法来测定受试者的血液样品和例如健康受试者的参考血液样品中的通路活性，例如TGFβ通路活性。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于预防或治疗脓毒症的TGFβ细胞信号传导通路抑制剂，所述用途包括：

-测定受试者血液样品中的TGFβ细胞信号传导通路活性；和

-如果发现受试者血液样品中的TGFβ细胞信号传导通路活性升高或超过特定阈值，则为患者施用TGFβ细胞信号传导通路抑制剂。

技术人员知道有多种方法可用于测定TGFβ细胞信号传导通路活性。例如，在本文所述的用途和方法中，TGFβ通路活性可以通过报告基因分析、受体转录复合物的核染色、基于磷酸化的测定、ELISA来测定。然而，技术人员知道可以使用其他方法，因此该列表不应被解释为限制性的。因此，本文描述的方法和用途不限于确定通路活性的特定方法。例如，可以使用下文描述的方法。因此，在一个实施方案中，确定TGFβ细胞信号传导通路的方法包括：测定或接收受试者血液样品中TGFβ信号传导通路的3个或更多个靶基因的表达水平；确定样品中TGFβ细胞信号传导通路相关转录因子(TF)元件的活性水平，所述TF元件控制所述3个或更多个靶基因的转录，所述确定基于评估使所述3个或更多个靶基因的表达水平与TGFβ细胞信号传导通路的活性水平相关联的经校准的数学通路模型，并基于所确定的TGFβ细胞信号传导通路相关TF元件的活性水平来推断来自受试者的血液样品中TGFβ细胞信号传导通路的活性。下面提供了基于确定TF元件的活性水平来推断通路活性的方法的详细描述。

当本文使用时，术语TGFβ细胞信号传导通路抑制剂与术语TGFβ通路抑制剂可互换使用，并且用于描述通过活化的SMAD蛋白复合物抑制、减少或降低靶基因转录的化合物或生物制品。TGFβ通路抑制剂可以是直接抑制剂或间接抑制剂，这意味着它可以直接作用于TGFβ细胞信号传导的信号传导级联，或者通过干扰更下游调节TGFβ细胞信号传导通路的通路来间接进行。例如，所述抑制剂可以通过使TGFβ通路的配体例如TGFβ不可用或防止其与TGFβ受体结合、干扰导致SMAD蛋白磷酸化的下游信号传导级联、干扰活化的SMAD蛋白复合物的易位至细胞核或通过干扰SMAD转录复合物的转录起始来发挥作用。例如，依那西普(也称为Enbrel)被认为主要是一种干扰肿瘤坏死因子(TNF)的化合物，但在我们的数据中，我们观察到当该化合物用于相关模型系统时，AR和TGFβ通路信号传导显著减少，因此出于本发明的目的，依那西普被认为是AR通路抑制剂以及TGFβ通路抑制剂。例如，瑞沙托维(也称为TAK-242)主要被称为Toll样受体4(TLR4)的拮抗剂，但在我们的数据中，我们观察到当该化合物用于相关模型系统时，AR和TGFβ通路信号传导显著减少，因此出于本发明的目的，瑞沙托维被认为是AR通路抑制剂以及TGFβ通路抑制剂。例如，非戈替尼(也称为Jyseleca)主要被称为JAK1抑制剂，但在我们的数据中，我们观察到当该化合物与(R)-比卡鲁胺组合用于相关模型系统中时，AR和TGβ通路信号传导显著减少，因此出于本发明的目的，非戈替尼被认为是AR通路抑制剂以及TGFβ通路抑制剂。因此，当在本文使用时，TGFβ抑制剂是能够抑制相关模型系统例如但不限于THP-1细胞中TGFβ通路活性的任何化合物或生物制品，其中通过本文所述模型推断TGFβ通路活性。

因此，在一个实施方案中，TGFβ细胞信号传导通路抑制剂选自小分子激酶抑制剂、抗TGF-β配体抗体、抗TβR受体抗体或反义寡核苷酸或其组合。或者，TGFβ信号传导通路抑制剂选自：Vactosertib(EW-7197)，Galunisertib(LY2157299)，LY3200882，(E)-SIS3，非苏木单抗，XPA681，XPA089，LY2382770，LY3022859，ISTH0036，ISTH0047，吡咯-咪唑聚酰胺，依那西普，瑞沙托维，非戈替尼或其组合。在一个优选的实施方案中，TGFβ细胞信号传导通路抑制剂选自Vactosertib(EW-7197)、Galunisertib(LY2157299)、LY3200882、(E)-SIS3、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合。

在一个实施方案中，本发明涉及用于预防或治疗受试者脓毒症的TGFβ细胞信号传导通路抑制剂，如本文所述，其中所述用途是用于预防处于发生脓毒症风险的受试者中的脓毒症。

在一个实施方案中，本发明涉及用于预防或治疗受试者脓毒症的TGFβ细胞信号传导通路抑制剂，如本文所述，其中所述用途是用于治疗患有脓毒症的受试者中的脓毒症。

将AR抑制剂与TGFβ抑制剂组合以预防或治疗受试者脓毒症可能是特别有利的。因此，在一个实施方案中，TGFβ通路抑制剂与AR通路抑制剂一起施用，其中TGFβ通路抑制剂和AR通路抑制剂是相同的化合物或不同的化合物。AR和TGFβ抑制剂可以组合在单一治疗剂中或者可以单独施用。因此，在一个实施方案中，AR细胞信号传导通路抑制剂在TGFβ细胞信号传导通路抑制剂之前施用，或者其中AR细胞信号传导通路抑制剂与TGFβ细胞信号传导通路抑制剂同时施用，或者其中AR细胞信号传导通路抑制剂是在TGFβ细胞信号传导通路抑制剂之后施用。在一个实施方案中，本发明涉及用于预防或治疗受试者脓毒症的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中所述用途包括：

在一个实施方案中，AR细胞信号传导通路抑制剂选自类固醇抗雄激素、非类固醇抗雄激素、雄激素合成抑制剂、CYP17A1抑制剂、CYP11A1(P450scc)抑制剂、5α-还原酶抑制剂和抗促性腺激素或其组合。或者，AR细胞信号传导通路抑制剂选自比卡鲁胺、(R)-比卡鲁胺(HY-14249)、恩杂鲁胺(MDV3100)、N-去甲基恩杂鲁胺、普克鲁胺(GT0918)、阿帕鲁胺(ARN-509)、N-去甲基阿帕鲁胺、达洛鲁胺(ODM-201；BAY-1841788)、酮基-达洛鲁胺(ORM-15341)、Galeterone(TOK-001)、D4-阿比特龙、A-485、地塞米松、米非司酮(RU486)、醋酸环丙孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸奥沙酮、醋酸诺美地孕酮、地诺孕素、氧生多龙、屈螺酮、螺内酯、甲孕酮、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、阿帕鲁胺、西咪替丁、托匹芦胺、醋酸阿比特龙、酮康唑、Seviteronel、氨鲁米特、度他雄胺、阿法雌二醇、度他雄胺、爱普列特、非那雄胺、A-485、ARCC-4、ARD-266、沙巴棕提取物、亮丙瑞林、雌激素(例如雌二醇(及其酯)、炔雌醇、缀合雌激素、己烯雌酚)、GnRH类似物、GnRH激动剂(例如，戈舍瑞林、亮丙瑞林)、GnRH拮抗剂(例如，西曲瑞克)、孕激素(例如，醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮)、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合。在一个更优选的实施方案中，AR细胞信号传导通路抑制剂选自比卡鲁胺、(R)-比卡鲁胺(HY-14249)、恩杂鲁胺(MDV3100)、N-去甲基恩杂鲁胺、普克鲁胺(GT0918)、阿帕鲁胺(ARN-509)、N-去甲基-阿帕鲁胺、达洛鲁胺(ODM-201；BAY-1841788)、酮基-达洛鲁胺(ORM-15341)、Galeterone(TOK-001)、D4-阿比特龙、A-485、地塞米松、米非司酮(RU486)、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及AR和/或TGFβ通路抑制剂，其用于预防患有感染的受试者中的脓毒症，优选其中受试者具有升高的AR和/或TGFβ细胞信号传导通路活性，如在从受试者获得的血液样品中测定的。

任选地，在从受试者获得的血液样品上测定AR和/或TGFβ细胞信号传导通路活性，并且如果发现AR和/或TGFβ细胞信号传导通路活性升高或超过特定阈值，则施用AR和/或TGFβ通路抑制剂。AR和/或TGFβ细胞信号传导通路可以使用本文描述的方法、特别是本发明第一方面中描述的方法来确定。

目前预防脓毒症的方法旨在减少潜在的感染，例如施用抗生素。使用本文描述的方法，现在首次可以鉴别和治疗有发生脓毒症风险的感染患者。通过测定血液样品中受试者的AR和/或TGFβ活性，现在可以容易地鉴定出AR和/或TGFβ通路抑制剂治疗的候选者。发现AR和/或TGFβ通路活性的增加与感染引起的脓毒症的发生存在强相关性。这可能是由例如单核细胞中的AR和/或TGFβ通路活性的免疫抑制作用引起的。单核细胞在先天免疫反应中具有很强的炎症作用，全身炎症是脓毒症的标志。因此，AR和/或TGFβ通路活性可能是致病原因，因此抑制AR和/或TGFβ活性将增加预防或减轻脓毒症的机会。代替确定AR和/或TGFβ通路活性，施用AR和/或TGFβ通路抑制剂的决定还可以基于确定3个或更多个例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个选自组1的AR靶基因的表达水平，其中组1由以下基因组成：ABCC4，APP，AR，CDKN1A，CREB3L4，DHCR24，EAF2，ELL2，FGF8，FKBP5，GUCY1A3，IGF1，KLK2，KLK3，LCP1，LRIG1，NDRG1，NKX3_1，NTS，PLAU，PMEPA1，PPAP2A，PRKACB，PTPN1，SGK1，TACC2，TMPRSS2和UGT2B15，优选AR、CREB3L4、DHCR24、EAF2、ELL2、FKBP5、GUCY1A3、IGF1、KLK3、LCP1、LRIG1、NDRG1、NKX3_1、PMEPA1、PRKACB、TMPRSS2，更优选AR、CREB3L4、DHCR24、EAF2、ELL2、FKBP5、LCP1、LRIG1、NDRG1、PMEPA1、PRKACB、TMPRSS2，甚至更优选DHCR24、EAF2、ELL2、FKBP5、LCP1、LRIG1、PMEPA1、PRKACB，和/或基于确定3个或更多个例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个选自组2的TGFβ靶基因的表达水平，其中组2由以下基因组成：ANGPTL4，CDC42EP3，CDKN1A，CDKN2B，CTGF，GADD45A，GADD45B，HMGA2，ID1，IL11，INPP5D，JUNB，MMP2，MMP9，NKX2_5，OVOL1，PDGFB，PTHLH，SERPINE1，SGK1，SKIL，SMAD4，SMAD5，SMAD6，SMAD7，SNAI1，SNAI2，TIMP1和VEGFA，优选CDC42EP3、GADD45A、GADD45B、HMGA2、ID1、IL11、INPP5D、JUNB、MMP2、MMP9、NKX2_5、OVOL1、PDGFB、PTHLH、SGK1、SKIL、SMAD4、SMAD5、SMAD6、TIMP1、VEGFA，更优选CDC42EP3、GADD45A、GADD45B、ID1、JUNB、MMP9、PDGFB、SGK1、SKIL、SMAD5、SMAD6、TIMP1、VEGFA，甚至更优选CDC42EP3、GADD45A、GADD45B、ID1、JUNB、MMP9、PDGFB、SGK1、SMAD5、TIMP1、VEGFA。

本发明进一步涉及AR和/或TGFβ通路抑制剂，其用于治疗或缓解患有脓毒症的受试者，其中所述受试者具有升高的AR和/或TGFβ细胞信号传导通路活性或者AR和/或TGFβ细胞信号传导通路活性超过特定阈值，如在从受试者获得的血液样品中测定的。

任选地，在从受试者获得的血液样品上测定AR和/或TGFβ细胞信号传导通路活性，并且如果发现AR和/或TGFβ细胞信号传导通路活性升高或超过特定阈值，则施用AR和/或TGFβ通路抑制剂。在一个实施方案中，AR和/或TGFβ通路活性通过本文描述的方法测定。由于发现脓毒症患者中TGFβ通路活性也升高，因此推测抑制TGFβ通路活性和AR通路活性可能有益。这可以通过将AR抑制剂和TGFβ抑制剂作为两种不同的化合物施用来实现，或者可以使用抑制AR和TGFβ两者的单一化合物。例如，发现化合物A-458可以特异性抑制AR和TGFβ通路，并且可以有益地用于这个目的。因此，在根据本发明的用途的实施方案中，进一步测定TGFβ通路活性。在一个实施方案中，TGFβ通路活性通过本文描述的方法测定。

代替确定TGFβ通路活性，决定施用TGFβ通路抑制剂还可以基于确定选自组2的3个或更多个例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个基因的表达水平，其中组2由以下基因组成：ANGPTL4，CDC42EP3，CDKN1A，CDKN2B，CTGF，GADD45A，GADD45B，HMGA2，ID1，IL11，INPP5D，JUNB，MMP2，MMP9，NKX2_5，OVOL1，PDGFB，PTHLH，SERPINE1，SGK1，SKIL，SMAD4，SMAD5，SMAD6，SMAD7，SNAI1，SNAI2，TIMP1和VEGFA，优选CDC42EP3，GADD45A，GADD45B，HMGA2，ID1，IL11，INPP5D，JUNB，MMP2，MMP9，NKX2_5，OVOL1，PDGFB，PTHLH，SGK1，SKIL，SMAD4，SMAD5，SMAD6，TIMP1，VEGFA，更优选CDC42EP3，GADD45A，GADD45B，ID1，JUNB，MMP9，PDGFB，SGK1，SKIL，SMAD5，SMAD6，TIMP1，VEGFA，甚至更优选CDC42EP3，GADD45A，GADD45B，ID1，JUNB，MMP9，PDGFB，SGK1，SMAD5，TIMP1，VEGFA。

在一个优选实施方案中，AR通路抑制剂与TGFβ通路抑制剂一起施用，其中AR通路抑制剂和TGFβ通路抑制剂是相同的化合物或不同的化合物。

所述AR通路抑制剂可以是类固醇抗雄激素、非类固醇抗雄激素、雄激素合成抑制剂、CYP17A1抑制剂、CYP11A1(P450scc)抑制剂、5α-还原酶抑制剂和抗促性腺激素。非限制性实例是醋酸环丙孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸奥沙特隆、醋酸诺美孕酮、地诺孕素、奥生多龙、屈螺酮、螺内酯、甲孕酮、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、阿帕鲁胺、达洛鲁胺、恩杂鲁胺、普克鲁胺、西咪替丁、托匹芦胺、醋酸阿比特龙、酮康唑、Seviteronel、氨鲁米特、度他雄胺、阿法雌二醇、度他雄胺、爱普列特德、非那雄胺、A-485、ARCC-4、ARD-266、沙巴棕提取物、亮丙瑞林、雌激素(例如雌二醇(及其酯)、炔雌醇、缀合雌激素、己烯雌酚)、GnRH类似物、GnRH激动剂(例如，戈舍瑞林、亮丙瑞林)、GnRH拮抗剂(例如，西曲瑞克)，孕激素(例如，醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕诺酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮)、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合。

因此，在一个实施方案中，AR抑制剂选自：醋酸环丙孕酮，醋酸氯地孕酮，醋酸环丙孕酮，醋酸甲地孕酮，醋酸奥沙特隆，醋酸诺美孕酮，地诺孕素，奥生多龙，屈螺酮，螺内酯，美屈孕酮，比卡鲁胺，氟他胺，尼鲁米特，阿帕鲁胺，达洛鲁胺，恩杂鲁胺，普克鲁胺，西咪替丁，托匹芦胺，醋酸阿比特龙，酮康唑，Seviteronel，氨鲁米特，度他雄胺，阿法雌二醇，度他雄胺，爱普列特，非那雄胺，A-485，ARCC-4，ARD-266，沙巴棕提取物，亮丙瑞林，雌激素(例如雌二醇(及其酯)、炔雌醇、缀合雌激素、己烯雌酚)，GnRH类似物，GnRH激动剂(例如，戈舍瑞林、亮丙瑞林)，GnRH拮抗剂(例如，西曲瑞克)，孕激素(例如，醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕诺酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮)、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合，优选其中所述AR抑制剂选自A-485、ARCC-4、ARD-266、比卡鲁胺、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合，更优选其中AR抑制剂是A-485。

TGFβ通路抑制剂可以是小分子激酶抑制剂、抗TGF-β配体抗体、抗TβR受体抗体或反义寡核苷酸。非限制性实例是TEW-7197、Galunisertib、LY2157299、非苏木单抗(Fresolimumab)、XPA681、XPA089、LY2382770、LY3022859、ISTH0036、ISTH0047、吡咯-咪唑聚酰胺、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合。

因此，在一个实施方案中，TGFβ抑制剂选自包含TEW-7197、Galunisertib、LY2157299、非苏木单抗、XPA681、XPA089、LY2382770、LY3022859、ISTH0036、ISTH0047、吡咯-咪唑聚酰胺、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合的列表。

对于本发明重要的是AR、TGFβ、MAPK-AP1和JAK-STAT3通路的活性与免疫抑制相关。这些通路尤其是AR通路在脓毒症患者中平均异常激活的发现很重要，因为它表明该通路的正常活性可能与正常的免疫功能相关。本发明人的发现似乎证实了这一点，即与没有感染的对照受试者相似，具有正常AR通路活性的少数患者是脓毒症幸存者。这似乎表明从脓毒症中存活需要正常的免疫功能。总体而言，很明显，良好的免疫应答对于预防感染和脓毒症的发生以及预防脓毒症相关死亡至关重要。再次强调，令人惊讶的是，这可以根据在全血中测量的信号传导通路活性来确定。

对血液样品或全血样品中特定细胞子集的通路活性的测量可以提供有关感染患者免疫状态的信息。可以推断，如果免疫应答受到抑制，患有感染例如与膀胱导管相关的泌尿生殖道感染的患者患脓毒症的风险会更高。测量感染患者血液样品中AR通路以及TGFβ、MAPK-AP1和JAK-STAT3通路的活性将提供有关发生脓毒症的风险的信息，当这些通路、尤其是AR通路的活性增加时，发生脓毒症的风险则高。这将有助于及时预测感染尤其是细菌感染患者的脓毒症风险。

本发明人首次证明通路活性的测定可用于诊断患者的脓毒症并对从受试者获得的血液样品进行分层，例如区分脓毒症和脓毒性休克。然而，更令人惊讶的是发现可以对血液样品例如全血样品进行这种分析。

本发明是通过深入研究得自健康对照受试者、康复的脓毒症受试者和因脓毒性休克而死亡的脓毒症受试者的血液样品中数种信号传导通路例如AR信号传导通路、TGFβ通路、MAPK-AP1通路和JAK-STAT3信号传导通路的活性而实现的。

接下来评估鉴定的相关通路的靶基因是否可以用作进行预测的基础(例如，受试者是否患有脓毒症)。使用一个简单模型，其中基于仅校正其相关性(上调或下调)的基因表达水平，发现从AR细胞信号传导通路靶基因、TGFβ细胞信号传导通路靶基因或合并的AR和TGFβ细胞信号传导通路靶基因中选择3个基因，足以做出具有非常高特异性和良好灵敏度的预测。可以通过增加测定中使用的基因的量或通过更有选择性地选择基因(如实施例9中所示)、或通过在本文所述的通路活性模型中使用3个(或更多个)基因来增加预测的灵敏度。

实施例9中呈现的数据表明，本文描述的预测(例如，诊断患有脓毒症的受试者、预测高或低死亡率机会、预测患有细菌感染的受试者发生脓毒症的风险)可以基于来自本文描述的列表的3个或更多个基因的表达水平进行。因此，可以使用下面更详细描述的通路模型，但这不是必需的。

本发明设想的3个或更多个基因可以如下使用：3个或更多个基因的表达水平基于样品(例如从受试者获得的血液样品)中的mRNA水平来确定。使用一个或多个参考基因例如管家基因将所述3个或更多个基因的表达水平标准化。所述3个或更多个基因的标准化表达水平乘以“1”或“-1”，具体取决于它们与通路活性的相关性(如果基因表达随着通路活性的增加而增加，则为+1；当基因表达随着通路活性的增加而降低时，则为-1，每个基因的相关性也在实施例9中指出)。接下来，将已针对表达相关性进行校正的标准化表达水平相加或相乘。现在可以将所获得的3个或更多个表达水平的值与得自参考样品(例如患有脓毒症的受试者或健康受试者)的3个或更多个基因的表达水平的值进行比较，或者可以将其与多个参考进行比较。或者，可以将所获得的3个或更多个表达水平的值与一个或多个设定值进行比较。例如，基于得自健康受试者和脓毒症受试者的参考样品，可以确定截止值，其定义了非脓毒症受试者的上限和脓毒症受试者的下限。作为非限制性示例：基于3个基因的表达水平，在3个健康受试者中计算为以下值：5、8、4；在3个脓毒症受试者中，计算为以下值：43、30、24。根据这些结果，计算出的阈值为19。对于现在的受试者，使用相同的3个基因来计算分数，如果分数低于19，则该受试者被认为是非脓毒症，如果分数高于19，则该受试者被认为是脓毒症。

因此，当血液样品的AR和/或TGFβ通路活性或功能状态用于如本文所述方法、预测或诊断时，血液样品的AR和/或TGFβ通路活性或功能状态可以简单地基于对选自AR和/或TGFβ通路靶基因的3个或更多个基因的方法、预测或诊断而替代。

同样的原理也适用于感染患者，特别是细菌感染患者，其中AR(和TGFβ)信号传导通路活性的增加与患脓毒症的机会增加相关。因此，选自如本文所述的AR和TGFβ细胞信号传导通路的靶基因的3个或更多个基因可以用于预测或计算患有感染(例如细菌感染)的患者发生脓毒症的风险。

在实施例9中，不同基因表达水平和通路活性之间的相关性已进一步用于为更具选择性的基因列表提供截止值。这些用T值表示，其中T＝0表示未选择(使用所有靶基因)，T＝0.3表示相关性的截止值为0.3。已经针对AR和TGFβ细胞信号传导通路确定了每个T值(T＝0、T＝0.3、T＝0.4、T＝0.5)的相应基因列表并且列于实施例9中。所述实施方案中列出的基因和组1和组2的优选实施方案分别对应于AR和TGFβ通路的选定靶基因并代表不同的T值列表。

由于多种原因，需要可靠地确定从受试者或个体获得的血液样品是否得自患有或未患有脓毒症的受试者或个体的能力。目前，脓毒症诊断最初基于如呼吸频率、心率和血压等临床参数，辅以简单且非特定的临床化学实验室测量例如乳酸、CRP、电解质、尿素、肌酐进行。这不是一种非常准确的诊断(不够敏感且不特异)，因此当怀疑受试者患有脓毒症时，需要通过血液病原体培养来确认诊断，以检测致病病原体并分析其抗生素耐药性，这是一个耗时过程，可能需要几天才能完成。相比之下，通过基于提取的mRNA确定一个或多个通路活性来确定血液样品的功能状态只需2-3小时即可实现。

一旦通过本文描述的方法或通过其他方式做出脓毒症诊断，有利于确定受试者进展为脓毒性休克的风险是高还是低，以及患者的死亡率风险是高还是低。目前，脓毒症患者、尤其是脓毒性休克患者，一般在重症监护室或急诊室接受治疗，费用昂贵。考虑到本文定义的血液样品的功能状态可用于确定进展为脓毒性休克的风险和受试者的死亡风险，这可能并不总是必要的。因此，一旦诊断出脓毒症，就可以基于血液样品的功能状态如基于测定的AR通路活性进行风险评估，以确定受试者进展为脓毒性休克的风险是高还是低或死亡风险是高还是低。如果受试者的脓毒性休克的风险低或死亡风险低，则后续治疗可能不一定需要在ICU中进行，从而节省大量费用。此外，当确定受试者处于高风险时，ICU中的治疗是有益的，并且可能需要额外的监测或治疗以进一步减轻风险，例如可以加强对致病病原体的搜查，并根除来源。

由于上述原因，血液样品的功能状态是一个有用的工具。当在本文中使用时，“血液样品的功能状态”被定义为已经测定活性的一个或多个通路的确定的活性的组合信息。通常，可以确定通路的活性是有活性的还是无活性的，或者可以参考对照样品来确定活性。对照样品可以是从健康受试者获得的血液样品，但其也可以指用于校准用于确定通路活性的模型的样品或数据。因此，对照样品不一定是血液样品，还可以是具有已知的通路功能状态(即活性或非活性)的不同样品。通过将所述活性与参考如对照样品进行比较，所述活性可以表示为二元值(即所述通路是活性的或非活性的)，或者可以表示为由数字表示的相对值。因此，例如，当仅确定血液样品上的AR通路时，相对于对照样品，所述血液样品的功能状态可以被限定为是活性的AR活性或非活性的AR活性。或者，如果所述通路活性的相对值由数字表示，非活性对照样品被定义为具有值0并且活性对照样品被定义为具有值1，则在得自所述受试者的血液样品中确定的通路活性可例如是0.81，表示所述通路活性更接近于活性而不是非活性。

因此，基于确定的基因表达水平的通路活性优选以数值表示。使用如下所述的模型，通路的基因表达水平可用于参照所述通路基因的经校准的表达水平和/或参照对照样品(例如得自健康受试者的血液样品)来量化所述通路活性。这种量化可以是一个简单的二元模型(例如，值为0表示通路无活性，值1表示通路有活性)，或者可以更复杂地通过量化已确定表达水平的每个基因的贡献任选乘以权重因子来进行量化。因此，本文描述的“血液样品的状态”是确定的通路活性的数值，或者如果确定了多个通路活性，则其组合数值用于确定的通路。

因此，优选地，从受试者获得的血液样品的状态包括信号传导通路的一种或多种活性，所述信号传导通路活性优选为：AR信号传导通路活性，AR和TGFβ信号传导通路活性，AR和MAPK-AP1信号传导通路活性，AR和JAK-STAT3信号传导通路活性，AR、TGFβ和MAPK-AP1信号传导通路活性，AR、TGFβ和JAK-STAT3信号传导通路活性，AR、MAPK-AP1和JAK-STAT3信号传导活性和/或AR、TGFβ、MAPK-AP1和JAK-STAT3信号传导活性，其中所述信号传导活性基于各自通路的3个或更多个靶基因的测定的表达水平。

据此，本发明的一个实施方案是血液样品的功能状态的确定进一步基于相应参考信号传导通路活性或信号传导通路的参考活性的组合。类似地，诊断或死亡风险的确定可以进一步基于相应信号传导通路的参考活性。参考活性反映了从健康受试者获得的血液样品和从具有已知临床结果(例如脓毒性休克康复、脓毒性休克死亡)的脓毒症患者获得的血液样品中发现的相应信号传导通路的活性。

出于本发明的目的，基于提取的RNA确定基因或靶基因的表达水平可以是所述方法的一部分，这意味着所述方法包括使用本领域技术人员已知的或本文描述的方法确定从得自患者的血液样品提取的RNA中所述基因或靶基因的表达水平的步骤。所述方法还可以包括从患者获取血液样品以提取RNA的步骤。或者，可以单独测定表达水平并且(靶基因的表达水平的)测定步骤不是本发明方法中的主动步骤。在这种情况下，表达水平作为输入值提供，例如相对于一个或多个对照基因表达水平的相对表达水平。

通过将待诊断受试者中的3个或更多个基因表达水平中的每一个与3个或更多个参考表达水平进行比较，可以做出关于受试者状态的预测(例如患有脓毒症或非脓毒症、发生脓毒症的可能性、因脓毒症死亡的可能性)。或者，通过将每个参考通路活性与待诊断受试者中的每个相应通路活性进行比较，可以确定包含每个相应通路活性的血液样品的状态。

当在本文中使用时，“表达水平”是指量化从基因转录的mRNA拷贝数。通常，这个数字不是绝对值而是相对值，因此优选例如针对一或多个管家基因的表达进行标准化。管家基因是假定具有独立于细胞类型和/或细胞功能状态(即来自患病或健康受试者)的恒定表达水平的基因，因此可用于标准化实验确定的相对表达水平。管家基因通常是技术人员已知的，可用于标准化的管家基因的非限制性实例是β-肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和转录因子IID TATA结合蛋白(TBP)。

已经鉴定了优选分析其表达水平的细胞信号传导通路靶基因集合，或者本文描述了用于鉴定合适靶基因的方法。对于例如通过数学模型用于确定通路活性，可以分析来自每个评估的细胞信号传导通路的3或更多个例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因，以确定通路活性。

从受试者获得的血液样品可以是任何类型的血液样品，即可以例如使用插管抽取血液并且可以是全血或确定的血液部分，例如分离的PBMC、分离的CD4+细胞、混合的CD8+和T细胞、分离的中性粒细胞或分离的单核细胞。优选地，所述样品是全血。本发明基于令人惊讶的发现，即全血液尽管其中包含细胞的多功能性，仍可用于通路分析以确定所述血液样品的功能状态，并且其中所述血液样品的所述功能状态可用于例如对以从中获得血液样品的患有脓毒症或疑似患有脓毒症的受试者进行诊断和预后。

因此，一个或多个信号传导通路的活性可以用作表征血液样品的功能状态的生物标志物，这将有助于早期预测感染患者中脓毒症的发生、受试者脓毒症的诊断、脓毒症受试者进展为脓毒性休克和死亡风险的预测，以及脓毒症受试者的治疗选择。

在一个实施方案中，使用qPCR、多重qPCR、多重qPCR、ddPCR、RNAseq、RNA表达阵列或质谱法进行信号传导通路测量。例如，可以使用基因表达微阵列数据，如Affymetrix微阵列，或RNA测序方法，如Illumina测序仪。

如本文所用，术语“受试者”是指任何生物。在一些实施方案中，所述受试者是动物，优选哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者是人，例如医学受试者。尽管本发明不一定限于特定的受试者组，但显然患有脓毒症的受试者或疑似患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症风险的受试者最受益于本文所述的发明。因此，优选地，已从中获得血液样品的受试者是患有脓毒症的受试者，在这种情况中脓毒症已经通过其它方式(例如血培养或通过所要求保护的方法)被确认，或者是怀疑患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症风险中的受试者。怀疑患有脓毒症的受试者可以是满足定义SIRS或脓毒症的一项或多项标准的受试者，例如存在发热、心动过速、呼吸急促和/或白细胞增多或白细胞减少。或者，怀疑患有脓毒症的受试者可以是处于患有或发生脓毒症风险的受试者，例如具有可导致脓毒症的感染的受试者、或患有癌症、糖尿病、免疫力降低的受试者、在长时间处于重症监护病房的受试者、早产的受试者、具有低AGPAR评分的受试者等。所述受试者还可以是处于发生脓毒症风险的受试者，当如本文所用时，“处于发生脓毒症风险的受试者”是指当前未患有脓毒症但具有可能导致受试者发生脓毒症的一种或多种风险因素增加的受试者，例如存在导尿管、开放性伤口或带有引流管、血管内管线等的伤口。

当本文使用时，术语“临床参数”是指呼吸频率、心率、血压。术语“临床参数”还可以指选自以下的症状：发热、寒战、极低体温、排尿比平时少、恶心、呕吐、腹泻、疲劳、虚弱、皮肤出现斑点或变色、出汗、皮肤湿冷或严重疼痛。

根据本发明使用的血液样品可以是提取的样品，即已经从受试者中提取的样品。样品的实例包括但不限于全血样品、分离的PBMC、分离的CD4+细胞、混合的CD8+和T细胞、分离的中性粒细胞或分离的单核细胞。分离的PBMC、分离的CD4+细胞、混合的CD8+和T细胞、分离的中性粒细胞或分离的单核细胞通常通过技术人员已知的方法从全血样品获得。此外，本领域技术人员熟知如何使用常规抽血方法从受试者获得全血样品。如本文所用的术语“样品”还涵盖例如以下情况：其中例如细胞、组织和/或体液已从受试者中取出，并且例如已放在显微镜载玻片或固定剂上，并且其中为了执行所要求保护的方法，提取这个样品的一部分，例如通过激光捕获显微切割(LCM)、或通过打孔、或从载玻片上刮下感兴趣的细胞、或通过荧光激活细胞分选技术进行。另外，如本文所用，术语“样品”还涵盖这样的情况，其中例如细胞、组织和/或体液已从受试者中取出并置于显微镜载玻片上，并且在载玻片上进行所要求保护的方法。优选地，所述样品是体液，特别是全血，或从全血样品分离的一种或多种细胞类型。

术语“通路”、“信号转导通路”、“信号传导通路”和“细胞信号传导通路”在本文中可互换使用。

“信号传导通路的活性”可以指样品中信号传导通路相关转录因子(TF)元件的活性，所述TF元件控制靶基因的转录，驱动靶基因表达，即靶基因被转录的速度，例如在高活性(即高速)或低活性(即低速)或其他维度如与这种活性(例如速度)相关的水平、值等。因此，出于本发明的目的，如本文所用的术语“活性”还意指可以在如本文所述的“通路分析”期间作为中间结果而获得的活性水平。

如本文所用，术语“转录因子元件”(TF元件)优选是指活性转录因子的中间体或前体蛋白或蛋白质复合物，或者控制特定靶基因表达的活性转录因子蛋白或蛋白质复合物。例如，所述蛋白质复合物可以含有至少相应信号传导通路蛋白质之一的胞内结构域，以及一种或多种辅因子，从而控制靶基因的转录。优选地，该术语指由相应信号传导通路蛋白之一的裂解产生细胞内结构域而引发的蛋白质或蛋白复合物转录因子。

如本文所用，术语“靶基因”是指其转录直接或间接受相应转录因子元件控制的基因。“靶基因”可以是“直接靶基因”和/或“间接靶基因”(如本文所述)。

通路分析使得能够定量测量血细胞中的信号转导通路活性，其基于通过测量与相应信号转导通路相关的转录因子的经过充分验证的直接靶基因的mRNA水平来推断信号转导通路的活性(见例如W Verhaegh et al.,2014,如前；W Verhaegh,Avan de Stolpe,Oncotarget,2014,5(14):5196)。

据此，本发明的一个实施方案是血液样品的功能状态的确定和/或其随后如诊断患者或预测死亡风险的用途进一步基于信号传导通路的参考活性的相应组合。类似地，信号传导通路异常因素的确定还可以基于相应信号传导通路的参考活性。参考活性反映了健康受试者血液样品中发现的相应信号传导通路的活性。

通过将每个参考通路活性与待诊断受试者中每个相应通路活性进行比较，可以确定包含每个相应通路的血液样品的功能状态。血液样品的功能状态指示相应通路的活性是否偏离(异常于)相应通路的参考活性。然后，血液样品的功能状态可以转化为诊断或死亡风险。血液样品的功能状态也可以直接根据通路活性的组合来计算。血液样品的功能状态可以被认为是多通路评分MPS并且表示受试者患有脓毒症的可能性，或因脓毒症而死亡的风险。因此，“血液样品的功能状态”是指一个维度，例如将通路活性的组合与受试者患有脓毒症的可能性或因脓毒症导致死亡的风险相关的水平或值。

如本文所用，术语“脓毒症”是指当机体对感染的反应导致其组织和器官损伤时出现的状况。脓毒症是由感染引发的炎症免疫应答。细菌感染是最常见的原因，但真菌、病毒和原生动物感染也可导致脓毒症。原发感染的常见部位包括肺、脑、尿道、皮肤和腹部器官。

血液样品的功能状态基于单一细胞信号传导通路活性或“细胞信号传导通路活性组合”。这意味着血液样品的功能状态受到一个或多个细胞信号传导通路的活性的影响。所述一个或多个细胞信号传导通路的活性可以通过本文所述的数学模型来推断和/或组合。在一个优选实施方案中，血液样品的功能状态基于信号传导通路活性的组合，包括超过2个细胞信号传导通路的活性。信号传导通路活性的这种组合可以包括3或4个、或甚至超过4个例如5、6、7或8或甚至更多个不同信号传导通路的活性。

一般而言，可以设计许多不同的公式来确定血液样品的功能状态，其基于受试者中两个或更多个细胞信号传导通路的活性的组合，即：

MPS＝F(Pi)+X，其中i＝1...N，

其中MPS表示血液样品的功能状态和/或风险评分(术语“MPS”在本文中用作“多通路评分”的缩写，以表示血液样品的功能状态可以受到两个或更多个细胞信号传导通路的活性的影响)，Pi表示细胞信号传导通路i的活性，N表示用于计算血液样品功能状态的细胞信号传导通路的总数，X是可能进入该等式的可能的其他因素和/或参数的占位符。更具体地，这样的公式可以是给定变量的一定程度的多项式，或者变量的线性组合。这种多项式中的加权系数和幂可以基于专业知识来设置，但是通常使用具有已知基本事实的训练数据集(例如生存数据)来获得对上述公式的加权系数和幂的估计。这些活性可以使用上述公式进行组合，随后生成MPS。接下来，可以优化评分函数的加权系数和幂，使得高MPS与患者患有脓毒症和/或具有高死亡风险的较高概率相关，反之亦然。优化评分函数与已知数据的相关性可以使用多种分析技术完成，例如Cox比例风险回归检验(如本文优选使用的)、对数秩检验、Kaplan-Meier估计量结合标准优化技术如梯度下降或者手动修改等等。

当在本文中使用时，术语“风险评分”或“风险因素”一般是指基于血液样品的功能状态对受试者的预测、风险评估或诊断。例如，风险评分可以是受试者患有脓毒症的诊断(受试者患有脓毒症的风险)、脓毒症受试者的死亡风险、和/或非脓毒症受试者发生脓毒症的风险、先前被诊断患有脓毒症的受试者的复发风险。

优选地，测定信号传导通路的活性、多种通路活性的组合及其应用如以下文献中所述进行(为了测定相应信号传导通路的活性的目的，将每篇文献的全部内容并入本文)：已发表的国际专利申请WO2013011479(名称“ASSESSMENT OF CELLULAR SIGNALINGPATHWAY ACTIVITY USING PROBABILISTIC MODELING OF TARGET GENE EXPRESSION”)，WO2014102668(名称“ASSESSMENT OF CELLULAR SIGNALING PATHWAY ACTIVITY USINGLINEAR COMBINATION(S)OF TARGET GENE EXPRESSIONS”)，WO2015101635(名称“ASSESSMENT OF THE PI3KCELLULAR SIGNALING PATHWAY ACTIVITY USING MATHEMATICALMODELLING OF TARGET GENE EXPRESSION”)，WO2016062891(名称“ASSESSMENT OF TGF-βCELLULAR SIGNALING PATHWAY ACTIVITY USING MATHEMATICAL MODELLING OF TARGETGENE EXPRESSION”)，WO2017029215(名称“ASSESSMENT OF NFKB CELLULAR SIGNALINGPATHWAY ACTIVITY USING MATHEMATICAL MODELLING OF TARGET GENE EXPRESSION”)，WO2014174003(名称“MEDICAL PROGNOSIS AND PREDICTION OF TREATMENT RESPONSEUSING MULTIPLE CELLULAR SIGNALLING PATHWAY ACTIVITIES”)，WO2016062892(名称“MEDICAL PROGNOSIS AND PREDICTION OF TREATMENT RESPONSE USING MULTIPLECELLULAR SIGNALING PATHWAY ACTIVITIES”)，WO2016062893(名称“MEDICAL PROGNOSISAND PREDICTION OF TREATMENT RESPONSE USING MULTIPLE CELLULAR SIGNALINGPATHWAY ACTIVITIES”)，WO2018096076(名称"Method to distinguish tumorsuppressive FOXO activity from oxidative stress")，以及专利申请WO2018096076(名称“Method to distinguish tumor suppressive FOXO activity from oxidativestress”)，WO2019068585(名称“Assessment of Notch cellular signaling pathwayactivity using mathematical modelling of target gene expression”)，WO2019120658(名称“Assessment of MAPK-MAPK-AP1 cellular signaling pathwayactivity using mathematical modelling of target gene expression”)，WO2019068543(名称"Assessment of JAK-JAK-STAT3 cellular signaling pathwayactivity using mathematical modelling of target gene expression")，WO2019068562(名称"Assessment of JAK-STAT1/2cellular signaling pathwayactivity using mathematical modelling of target gene expression")和WO2019068623(名称"Determining functional status of immune cells types andimmune response")。

这些模型已在多种细胞类型上针对ER、AR、PI3K-FOXO、HH、Notch、TGF-β、Wnt、NFkB、JAK-STAT1/2、JAK-JAK-STAT3和MAPK-MAPK-AP1通路进行了生物学验证。

已经鉴定出独特的细胞信号传导通路靶基因集合，其表达水平被优选分析。为了用于数学模型中，可以分析来自每个评估的细胞信号传导通路的3个或更多个靶基因，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个靶基因，以确定通路活性。

用于确定本文所公开的不同信号传导通路的活性的通路分析方法的共同点是这样的观点，出于本发明的目的而优选应用于本文，其中细胞例如存在于血液样品中的细胞中的信号传导通路的活性可通过如下确定：接收信号传导通路的一个或多个、优选3个或更多个靶基因的表达水平，确定样品中信号传导通路相关转录因子(TF)元件的活性水平，所述TF元件控制所述3个或更多个靶基因的转录，所述确定基于评估使所述一个或多个、优选3个或更多个靶基因的表达水平与信号传导通路活性水平相关联的经校准的数学通路模型，以及任选基于测定的信号传导通路相关TF元件的活性水平推断血液样品中存在的细胞中的信号传导通路的活性。如本文所述，所述活性水平可以直接用作输入以确定血液样品的功能状态和/或诊断和/或风险评分，这也是本发明所预期的。

如本文所用，TF元件的术语“活性水平”表示TF元件关于其靶基因的转录的活性水平。

所述经校准的数学通路模型可以是基于使信号传导通路相关TF元件的活性水平和所述3个或更多个靶基因的表达水平相关的条件概率的概率模型，优选贝叶斯网络模型，或者所述经校准的数学通路模型可以基于所述3个或更多个靶基因的表达水平的一种或多种线性组合。出于本发明的目的，所述经校准的数学通路模型优选地是形心或线性模型，或者基于条件概率的贝叶斯网络模型。

特别地，可以进行表达水平的测定以及任选推断受试者中信号传导通路的活性，例如尤其通过(i)评估经校准的概率通路模型、优选贝叶斯网络模型的一部分，代表一组输入的细胞信号传导通路，包括在受试者的样品中测量的细胞信号传导通路的3个或更多个靶基因的表达水平，(ii)估计受试者中信号传导通路相关转录因子(TF)元件的活性水平，所述信号传导通路相关TF元件控制所述细胞信号传导通路的3个或更多个靶基因的转录，所述估计基于使信号传导通路相关TF元件的活性水平与在受试者的样品中测量的细胞信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的表达水平相关的条件概率，并且任选地(iii)基于估计的受试者的样品中信号传导通路相关TF元件的活性水平来推断所述细胞信号传导通路的活性。这在公开的国际专利申请WO 2013/011479 A2(“Assessment of cellularsignaling pathway activity using probabilistic modeling of target geneexpression”)中详细描述，所述专利全部并入本文。

在示例性替代方案中，受试者中细胞信号传导通路的表达水平的测定和任选推断细胞信号传导通路的活性可以尤其通过以下方式进行：(i)测定受试者样品中信号传导通路相关转录因子(TF)元件的活性水平，所述信号传导通路相关TF元件控制细胞信号传导通路的3个或更多个靶基因的转录，所述确定基于评估使细胞信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的表达水平与信号传导通路相关TF元件的活性水平相关联的经校准的数学通路模型，所述数学通路模型基于所述3个或更多个靶基因的表达水平的一种或多种线性组合，并且任选地(ii)基于测定的受试者样品中信号传导通路相关TF元件的活性水平来推断受试者中的细胞信号传导通路的活性。这在已公开的国际专利申请WO 2014/102668A2(“Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination(s)of target gene expressions”)中详细描述。

关于使用靶基因表达的数学模型推断细胞信号传导通路活性的进一步细节可见于如上述W Verhaegh et al.,2014。

为了便于快速鉴别参考文献，上述参考文献已被分配给本文感兴趣的每个信号传导通路，并且已指示了适合于确定信号传导通路活性的示例性相应靶基因。在这方面，还特别参考与上述参考文献一起提供的靶基因的序列表。

AR：KLK2，PMEPA1，TMPRSS2，NKX3 1，ABCC4，KLK3，FKBP5，ELL2，UGT2B15，DHCR24，PPAP2A，NDRG1，LRIG1，CREB3L4，LCP1，GUCY1A3，AR和EAF2(WO 2013/011479，WO 2014/102668)；KLK2，PMEPA1，TMPRSS2，NKX3 1，ABCC4，KLK3，FKBP5，ELL2，UGT2B15，DHCR24，PPAP2A，NDRG1，LRIG1，CREB3L4，LCP1，GUCY1A3，AR，和EAF2(WO 2014/174003)；TGF-β：ANGPTL4，CDC42EP3，CDKNIA，CDKN2B，CTGF，GADD45A，GADD45B，HMGA2，ID1，IL11，SERPINE1，INPP5D，JUNB，MMP2，MMP9，NKX2-5，OVOL1，PDGFB，PTHLH，SGK1，SKIL，SMAD4，SMAD5，SMAD6，SMAD7，SNAI1，SNAI2，TIMP1和VEGFA(WO 2016/062891，WO 2016/062893)；MAPK-AP-1：BCL2L11，CCND1，DDIT3，DNMT1，EGFR，ENPP2，EZR，FASLG，FIGF，GLRX，IL2，IVL，LOR，MMP1，MMP3，MMP9，SERPINE1，PLAU，PLAUR，PTGS2，SNCG，TIMP1，TP53和VIM(WO 2019/120658)；及JAK-JAK-STAT3：AKT1，BCL2，BCL2L1，BIRC5，CCND1，CD274，CDKN1A，CRP，FGF2，FOS，FSCN1，FSCN2，FSCN3，HIF1A，HSP90AA1，HSP90AB1，HSP90B1，HSPA1A，HSPA1B，ICAM1，IFNG，IL10，JunB，MCL1，MMP1，MMP3，MMP9，MUC1，MYC，NOS2，POU2F1，PTGS2，SAA1，STAT1，TIMP1，TNFRSF1B，TWIST1，VIM和ZEB1(WO 2019/068543)。

在一个实施方案中，使用qPCR、多重qPCR、多重复合qPCR、ddPCR、RNAseq、RNA表达阵列或质谱法进行信号传导通路测量。例如，可以使用基因表达微阵列数据，例如Affymetrix微阵列，或RNA测序方法，如Illumina测序仪。

经校准的数学通路模型优选为形心或线性模型，或基于条件概率的贝叶斯网络模型。例如，经校准的数学通路模型可以是基于使血液样品的功能状态和/或风险评分与信号传导通路的活性相关的条件概率的概率模型，优选贝叶斯网络模型，或者经校准的数学通路模型可以基于信号传导通路的活性的一种或多种线性组合。

已经鉴定出独特的细胞信号传导通路靶基因集合，其表达水平被优选分析。为了在数学模型中使用，可以分析来自每个评估的细胞信号传导通路的3个或更多个靶基因，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个靶基因，以确定通路活性。

作为非限制性实例，以下方法可用于生成确定信号传导通路活性的模型：在多个数据集中，在假定通路具有活性的样品和在假定通路没有活性的样品中测定不同基因的RNA表达水平。例如基于管家基因的表达水平对所述表达水平进行标准化。基于样品的标准化表达水平(其中所述通路假定为活性或假定为无活性)，可以确定阈值，其中如果样品中基因的标准化表达水平低于阈值，则该通路更可能是无活性的，如果所述表达水平高于该阈值，则该通路更可能是活性的。基于这个阈值，可以构建一个简单模型，其中将一个值指定为表达水平，如在脓毒症或疑似患有脓毒症的受试者的血液样品中确定的，并且通路活性被确定为测定表达水平的每个基因的这些值的总和。或者，可以将相应通路的每个基因获得的值与来自健康受试者(即未患脓毒症的受试者)的参考血液样品中所述基因获得的值进行比较。

根据本发明的一个实施方案，

所述测定AR信号传导通路、TGFβ信号传导通路、MAPK-AP1信号传导通路和/或JAK-STAT3信号传导通路的3个或更多个靶基因的表达水平包括：

测定AR信号传导通路的3个或更多个靶基因例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因的表达水平，所述靶基因选自由以下组成的列表：KLK2，PMEPA1，TMPRSS2，NKX31，ABCC4，KLK3，FKBP5，ELL2，UGT2B15，DHCR24，PPAP2A，NDRG1，LRIG1，CREB3L4，LCP1，GUCY1A3，AR和EAF2，优选其中AR通路的靶基因集合包含选自如下的3个或更多个例如3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个靶基因：ELL2，FKBP5，GUCY1A3，LRIG1，PLAU，PMEPA1，PRKACB，SGK1，NDRG1，CREB3L4，DHCR24或PTPN1；和/或

测定TGFβ信号传导通路的3个或更多个靶基因例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因的表达水平包括测定选自由以下组成的列表的3个或更多个靶基因的表达水平：ANGPTL4，CDC42EP3，CDKN1A，CTGF，GADD45A，GADD45B，HMGA2，ID1，IL11，JUNB，PDGFB，PTHLH，SERPINE1，SGK1，SKIL，SMAD4，SMAD5，SMAD6，SMAD7，SNAI2，VEGFA，优选其中TGFβ通路的靶基因集合包含选自如下的3个或更多个例如3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个靶基因：CDC42EP3，GADD45A，ID1，MMP9，SGK1，SMAD5，SMAD7，VEGFA，JUNB，TIMP1，SKIL和CCKN1A；和/或

测定MAPK-AP1信号传导通路的3个或更多个靶基因的表达水平包括测定选自由以下组成的列表的3个或更多个靶基因例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因的表达水平：BCL2L11，CCND1，DDIT3，DNMT1，EGFR，ENPP2，EZR，FASLG，FIGF，GLRX，IL2，IVL，LOR，MMP1，MMP3，MMP9，SERPINE1，PLAU，PLAUR，PTGS2，SNCG，TIMP1，TP53和VIM，优选其中MAPK-AP1通路的靶基因集合包含选自如下的3个或更多个例如3、4、5、6、7、8、9、10或11个靶基因：DNMT1，EGFR，ENPP2，GLRX，MMP9，PLAUR，TIMP1，LOR，EZR，DDIT3和TP53；和/或

测定JAK-STAT3信号传导通路的3个或更多个靶基因例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因的表达水平包括测定选自由以下组成的列表的3个或更多个靶基因的表达水平：AKT1，BCL2，BCL2L1，BIRC5，CCND1，CD274，CDKN1A，CRP，FGF2，FOS，FSCN1，FSCN2，FSCN3，HIF1A，HSP90AA1，HSP90AB1，HSP90B1，HSPA1A，HSPA1B，ICAM1，IFNG，IL10，JunB，MCL1，MMP1，MMP3，MMP9，MUC1，MYC，NOS2，POU2F1，PTGS2，SAA1，STAT1，TIMP1，TNFRSF1B，TWIST1，VIM和ZEB1，优选其中JAK-STAT3通路的靶基因集合包含选自如下的3个或更多个例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因：BCL2，BIRC5，CD274，FOS，HSPA1A，JUNB，MMP9，STAT1，TIMP1，BCL2L1，HSPA1B，HSP90AB1，HSP90B1，POU2F1和ICAM1。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的方法包括对已从中获得血液样品的受试者进行诊断的步骤，其中所述受试者被诊断为患有脓毒症或其中所述受试者被诊断为不患有脓毒症，所述诊断基于：

-临床参数，以及

-血液样品的功能状态，

所述方法还包括将受试者的血液样品的功能状态与得自健康或非脓毒症对照受试者的血液样品的至少一种功能状态进行比较。在一个优选实施方案中，如果血液样品的功能状态包含AR信号传导通路活性，其中AR信号传导通路活性被确定为高于在得自健康或非脓毒症对照的对照血液样品中测定的AR信号传导通路活性并且从中获得血液样品的受试者具有至少一种与脓毒症相关的临床参数，则所述受试者被诊断患有脓毒症。本发明人发现，对得自受试者的血液样品测定的通路活性可用于诊断所述受试者是否患有脓毒症。如实验数据中详述，确定AR信号传导通路足以区分得自患有脓毒症的受试者的血液样品和得自健康个体的血液样品。任选地，所述诊断中可以包括其他通路活性，例如TGFβ信号传导通路活性、MAPK-AP1信号传导通路活性和/或JAK-STAT3信号传导通路活性。因此，本文确定的血液样品的功能状态可以用作快速诊断受试者的诊断工具。

根据血液样品中来自AR通路的3个或更多个靶基因的表达水平，可以测定AR信号传导通路的活性，从而确定血液样品的功能状态。这个AR信号传导通路可以表示为定量值，并与得自健康受试者或已知脓毒症受试者的血液样品测定的AR信号传导通路活性进行比较。因此，诊断受试者的步骤优选进一步包括将受试者的血液样品的功能状态与得自已知脓毒症患者的血液样品的功能状态进行比较。因为所述诊断步骤基于血液样品的功能状态，因此这个步骤任选进一步使用确定的TGFβ、MAPK-AP1和/或JAK-STAT3信号传导通路活性(如果其被测定的话)。通过包括其它通路，可以进一步提高诊断的确定性。

血液样品的功能状态包括以数值表示的至少AR信号传导通路活性。因此，通过将来自受试者的血液样品的功能状态与得自健康受试者的对照血液样品的功能状态进行比较，基于至少通过AR信号传导通路活性表示的数值的差异或相似性来做出诊断。因此，所述比较优选使用参考血液样品的多种功能状态来进行，以提高准确性。更优选地，所述比较还包括与得自已知脓毒症受试者的血液样品的一种或多种、优选多种其它参考功能状态进行比较。

例如，当使用多个健康个体参考血液样品时，可以计算每个样品的AR信号传导通路活性，并可以确定平均值。待诊断的受试者的AR信号传导通路活性可以与平均参考AR信号传导通路活性相似(例如，在计算的平均活性的1或2个标准差内)，在这种情况下，所述受试者被诊断为没有患有脓毒症。或者，AR信号传导通路可以高于计算的平均AR信号传导通路活性(例如比平均值高至少1或2个标准差)，在这种情况下，所述受试者被诊断患有脓毒症。任选地，其他通路活性可以包括在这个比较中。无论用于计算信号传导通路活性的方法如何，只要对待诊断受试者的样品和参考样品使用相同的方法，都可以使用上述方法。

优选地，出于诊断患有脓毒症的受试者的目的，测定AR信号传导通路、TGFβ信号传导通路、MAPK-AP1信号传导通路和/或JAK-STAT3信号传导通路的3个或更多个靶基因的表达水平包括：

确定AR信号传导通路的3个或更多个靶基因例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因的表达水平，其中3个或更多个例如3、4或5个靶基因选自：FKBP5，LRIG1，PMEPA1，DHCR24和LCP1；和/或

测定TGFβ信号传导通路的3个或更多个靶基因例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因的表达水平，其中3个或更多个例如3、4或5靶基因选自：MMP9，GADD45A，CDC42EP3，TIMP1和SMAD5；和/或

测定MAPK-AP1信号传导通路的3个或更多个靶基因的表达水平包括确定MAPK-AP1通路的3个或更多个靶基因例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因的表达水平，其中3个或更多个例如3、4或5个靶基因选自：MMP9，TIMP1，DNMT1，FASLG和PLAUR；和/或

测定JAK-STAT3信号传导通路的3个或更多个靶基因例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因的表达水平，其中3个或更多个例如3、4或5个靶基因选自：MMP9，BCL2，TIMP2，HSPA1A和HSPA1AB。

因此，本发明还涉及一种基于从得自受试者的血液样品中提取的RNA来诊断受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

-测定或接收AR通路的3个或更多个靶基因的表达水平的测定结果；

-基于测定的AR信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的表达水平来确定AR信号传导通路活性；

及任选地：

-测定或接收TGFβ通路的3个或更多个靶基因的表达水平的测定结果；

-基于测定的TGFβ信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的表达水平来确定TGFβ信号传导通路活性；

-测定或接收MAPK-AP1通路的3个或更多个靶基因的表达水平的测定结果；

-基于测定的MAPK-AP1信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的表达水平来确定MAPK-AP1信号传导通路活性；

-测定或接收JAK-STAT3通路的3个或更多个靶基因的表达水平的测定结果；

-基于测定的JAK-STAT3信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的表达水平来确定JAK-STAT3信号传导通路活性；

其中所述方法还包括诊断已从中获得血液样品的受试者的步骤，其中所述受试者被诊断患有脓毒症或其中所述受试者被诊断为不患有脓毒症，所述诊断基于：

-临床参数，以及

-血液样品中测定的信号传导通路的活性，

所述方法还包括将受试者的血液样品中测定的信号传导通路的活性与得自健康或非脓毒症对照受试者的至少一个血液样品中测定的信号传导通路的活性进行比较，

其中所述血液样品得自患有脓毒症的受试者或得自疑似患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症风险的受试者。在优选的实施方案中，如果AR信号传导通路活性被确定为高于得自健康或非脓毒症对照受试者的对照血液样品中测定的AR信号传导通路活性以及从中已获得血液样品的受试者具有至少一种与脓毒症相关的临床参数，则受试者被诊断患有脓毒症。

因此，在本发明的一个实施方案中，如果所述血液样品的功能状态包括AR信号传导通路活性，其中AR信号传导通路活性被确定为高于在得自健康受试者的参考血液样品中确定的AR信号传导通路活性，则所述受试者被诊断患有脓毒症。或者，诊断可以直接基于所述3个或更多个基因的表达水平。或者，所述比较还可以包括得自已知脓毒症受试者的参考血液样品。在这种情况下，可以将所述受试者血液样品的3个或更多个基因的表达水平或功能状态与健康个体的血液样品的3个或更多个基因的表达水平或功能状态及已知脓毒症受试者血液样品的3个或更多个基因的表达水平或功能状态进行比较。在这种情况下，可以比较指定AR信号传导通路活性(以及其他通路活性，如果测定的话)的数值。例如，当受试者具有接近已知脓毒症受试者的平均值的AR信号传导通路时，例如在1或2个标准差之内，则所述受试者被诊断患有脓毒症，或者当所述值接近健康受试者的平均值时，例如在1或2个标准差之内，则所述受试者被诊断为非脓毒症。或者，可以使用统计方法来确定受试者是否更可能属于非脓毒症组或脓毒症组(这意味着指定AR信号传导通路的数值更接近正常(健康)平均值或更接近脓毒症平均值)。其他信号传导通路活性可以任选地包括在这个计算中。当使用多个信号传导通路活性进行诊断步骤时，例如AR信号传导通路活性和TGFβ信号传导通路活性二者，可以采用聚类方法，根据通路活性，对健康对照受试者、已知脓毒症受试者和待诊断受试者进行聚类，以确定待诊断受试者属于健康组还是脓毒症组。当在本文中使用时，来自已知脓毒症受试者的参考血液样品是得自随后例如通过血培养证实脓毒症诊断的受试者的血液样品。

在根据本发明的方法的一个实施方案中，所述3个或更多个基因的表达水平用于预测从中已获得血液样品的受试者的死亡风险，

其中所述预测基于受试者的所述3个或更多个基因的表达水平与得自参考受试者的3个或更多个基因的多个参考表达水平的比较，其中得自参考受试者的所述3个或更多个基因的所述多个参考表达水平包括得自脓毒症非幸存者的受试者的所述3个或更多个基因的表达水平和得自脓毒症幸存者的受试者的所述3个或更多个基因的表达水平，并且任选还包括得自健康或非脓毒症对照受试者的所述3个或更多个基因的表达水平，

其中从中获得血液样品的受试者被证实患有脓毒症，并且

其中当得自患有脓毒症的受试者的所述3个或更多个基因的表达水平与得自脓毒症幸存者的参考受试者的所述3个或更多个基因的表达水平相似时，或者当得自患有脓毒症的受试者的所述3个或更多个基因的表达水平与得自至少一名健康或非脓毒症对照受试者的所述3个或更多个基因的表达水平相似时，预测低死亡风险，及

其中当得自患有脓毒症的受试者的所述3个或更多个基因的表达水平与得自脓毒症非幸存者的参考受试者的所述3个或更多个基因的表达水平相似时，预测高死亡风险。

在本发明的另一个实施方案中，所述血液样品的功能状态用于预测已从中获得血液样品的受试者的死亡风险，

其中所述预测基于受试者的血液样品的功能状态与得自参考受试者的血液样品的多个参考功能状态的比较，其中所述得自参考受试者的血液样品的所述多个参考功能状态包括得自脓毒症非幸存者的受试者的血液样品的至少一种功能状态和得自脓毒症幸存者的受试者的血液样品的至少一种功能状态，以及任选进一步包括得自健康或非脓毒症对照受试者的血液样品的至少一种功能状态，

其中从中获得血液样品的受试者被证实患有脓毒症，并且

其中当得自患有脓毒症的受试者的血液样品的功能状态与得自脓毒症幸存者的参考受试者的血液样品的至少一种功能状态相似时，或者当得自患有脓毒症的受试者的血液样品的功能状态与得自至少一名健康或非脓毒症对照受试者的血液样品的至少一种功能状态相似时，预测低死亡风险，及

其中当得自患有脓毒症的受试者的血液样品的功能状态与得自脓毒症非幸存者的参考受试者的血液样品的至少一种功能状态相似时，预测高死亡风险。

在一个实施方案中，使用确定的通路活性的聚类、优选通过层次聚类法，进行得自受试者的血液样品的所述3个或更多个基因或功能状态与得自对照受试者的血液样品的多个功能状态的所述比较。

本发明人发现，可以基于得自受试者的血液样品的所述3个或更多个靶基因或功能状态来做出关于死亡风险的预测。通过将得自受试者的血液样品的所述3个或更多个靶基因的表达水平或功能状态与已死亡和已存活的脓毒症受试者的参考样品进行比较，可以计算所述受试者将死于脓毒症的可能性。这个预测可以通过使用表示不同的确定的信号传导通路活性的数值来完成，例如AR信号传导活性，或AR与TGFβ信号传导活性的组合，并将这些值与参考组获得的值进行比较。或者，这个预测可以直接基于所述3个或更多个基因的表达水平。这种比较可以使用统计学方法或例如通过使用聚类法来完成。当使用聚类法时，当受试者与已死亡的参考受试者聚类在一起时，预测所述受试者具有高死亡风险，或者当其与存活的参考受试者聚类在一起时，预测所述受试者具有低死亡风险。

优选地，在根据本发明的方法中进行预测，其中所述方法是对得自患有脓毒症的患者的血液样品进行。优选地，例如通过本文描述的方法对已经确定受试者患有脓毒症的受试者进行预测。

优选地，在根据本发明的方法中进行预测，其中所述将得自受试者的血液样品的所述3个或更多个基因的表达水平或功能状态与得自对照受试者的3个或更多个基因的多个表达水平的比较使用对确定的通路活性的聚类优选层次聚类进行。本发明人发现，通过基于对得自脓毒症患者的确定的信号传导活性样品的聚类可以鉴定因脓毒症的死亡。因此，通过将得自受试者的血液样品中确定的信号传导活性与已知参考患者进行比较，当相应信号传导活性与已死亡的患者聚类，可以预测死亡风险为高，或者当相应信号传导活性与已幸存的患者聚类时，可以预测风险为低。

优选地，为了预测脓毒症受试者的生存概率，测定AR信号传导通路、TGFβ信号传导通路、MAPK-AP1信号传导通路和/或JAK-STAT3信号传导通路的3个或更多个靶基因的表达水平包括：

测定AR信号传导通路的3个或更多个靶基因例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因的表达水平，其中3个或更多个例如3、4或5个靶基因选自：ELL2，FKBP5，EAF2，NDRG1和DHCR24；和/或

测定TGFβ信号传导通路的3个或更多个靶基因例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因的表达水平，其中3个或更多个例如3、4或5个靶基因选自：ID1，SKIL，GADD45A，HMGA2和SMAD4；和/或

测定MAPK-AP1信号传导通路的3个或更多个靶基因的表达水平包括测定MAPK-AP1通路的3个或更多个例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因的表达水平，其中3个或更多个例如3、4或5个靶基因选自：BCL2L11，EZR，ENPP2，MMP3和PLAUR；和/或

测定JAK-STAT3信号传导通路的3个或更多个靶基因例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因的表达水平，其中3个或更多个例如3、4或5个靶基因选自：BIRC5，HSP90B1，MMP3，IL10，HIF1A。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其中所述3个或更多个基因的表达水平用于预测从中获得血液样品的受试者的死亡风险，

其中所述预测基于所述受试者的所述3个或更多个基因的表达水平与得自参考受试者的3个或更多个基因的多个参考表达水平的比较，其中得自参考受试者的所述3个或更多个基因的所述多个参考表达水平包括得自脓毒症非幸存者的受试者的所述3个或更多个基因的表达水平和得自脓毒症幸存者的受试者的所述3个或更多个基因的表达水平，并且任选还包括得自健康或非脓毒症对照受试者的所述3个或更多个基因的表达水平，

其中从中获得血液样品的受试者被证实患有脓毒症，并且

其中当得自脓毒症受试者的所述3个或更多个基因的表达水平与从得自脓毒症幸存者的参考受试者的所述3个或更多个基因的表达水平相似时，或者当得自脓毒症受试者的所述3个或更多个基因的表达水平与得自至少一名健康或非脓毒症对照受试者的所述3个或更多个基因的表达水平相似时，则预测低死亡风险，并且

其中当得自脓毒症受试者的所述3个或更多个基因的表达水平与得自脓毒症非幸存者的参考受试者的所述3个或更多个基因的表达水平相似时，则预测高死亡风险。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种基于从受试者的血液样品中提取的RNA来确定受试者的死亡风险的方法，所述方法包括以下步骤：

-确定或接收AR通路的3个或更多个靶基因的表达水平的测定结果；

-基于确定的AR信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的表达水平来确定AR信号传导通路活性；

以及任选地：

-确定或接收TGFβ通路的3个或更多个靶基因的表达水平的测定结果；

-基于确定的TGFβ信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的表达水平来确定TGFβ信号传导通路活性；

-确定或接收MAPK-AP1通路的3个或更多个靶基因的表达水平的测定结果；

-基于确定的MAPK-AP1信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的表达水平来确定MAPK-AP1信号传导通路活性；

-确定或接收JAK-STAT3通路的3个或更多个靶基因的表达水平的测定结果；

-基于确定的JAK-STAT3信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的表达水平来确定JAK-STAT3信号传导通路活性；

其中血液样品中的信号传导通路活性用于预测从中获得血液样品的受试者的死亡风险，

其中所述预测基于所述受试者的血液样品中的信号传导通路活性与得自参考受试者的多个血液样品中的信号传导通路活性的比较，其中得自参考受试者的多个血液样品中的所述信号传导通路活性包含得自脓毒症非幸存者受试者的至少一种血液样品和得自脓毒症幸存者受试者的至少一种血液样品以及任选包含得自健康或非脓毒症对照受试者的至少一种血液样品，

其中从中获得血液样品的受试者被证实患有脓毒症，并且

其中当得自脓毒症受试者的血液样品中的信号传导通路活性与得自脓毒症幸存者的参考受试者的至少一种血液样品中的信号传导通路活性相似时，或者当得自脓毒症受试者的血液样品中的信号传导通路活性与得自健康或非脓毒症对照受试者的至少一种血液样品中的信号传导通路活性相似时，则预测低死亡风险，

其中当得自脓毒症受试者的血液样品中的信号传导通路活性与得自脓毒症非幸存者的参考受试者的至少一种血液样品中的信号传导通路活性相似时，则预测高死亡风险。

在一个实施方案中，所述将得自受试者的血液样品的所述3个或更多个基因的表达水平或信号传导通路活性与得自对照受试者的多个血液样品的所述3个或更多个基因的表达水平或信号传导通路活性的比较是使用确定的通路活性的聚类进行的，优选通过层次聚类进行。

在进一步的实施方案中，已从中获得血液样品的受试者没有脓毒症，并且其中所述3个或更多个基因的表达水平用于确定受试者将发生脓毒症的风险，

所述方法还包括将从中获得血液样品的受试者的所述3个或更多个基因的表达水平与得自健康或非脓毒症对照受试者的所述3个或更多个基因的表达水平进行比较。

在另一个实施方案中，从中已获得血液样品的受试者没有脓毒症，并且其中血液样品的功能状态用于确定受试者将发生脓毒症的风险，

所述方法还包括将从中已获得血液样品的受试者的血液样品的功能状态与得自健康或非脓毒症对照受试者的血液样品的至少一种功能状态进行比较，

优选地，其中如果所述血液样品的功能状态包含AR信号传导通路活性，其中AR信号传导通路活性被确定为高于在得自健康或非脓毒症对照受试者的对照血液样品中测定的AR信号传导通路活性，则预测从中获得血液样品的受试者有发生脓毒症的风险。在优选的实施方案中，预测未患有脓毒症的受试者发生脓毒症的风险进一步基于TGFβ信号传导通路活性，其中当TGFβ信号传导通路活性被确定为高于在得自健康或非脓毒症对照受试者的对照血液样品中测定的TGFβ信号传导通路活性时，则所述受试者处于发生脓毒症的风险中。在一个更优选的实施方案中，当确定AR和TGFβ信号传导通路活性均高于在得自健康或非脓毒症对照受试者的对照血液样品中确定的AR和TGFβ信号传导通路活性时，则确定从中获得血液样品的没有脓毒症的受试者处于发生脓毒症的风险中。优选地，未患有脓毒症的受试者是患有细菌感染的受试者。

本发明人发现，在没有患有脓毒症但处于发生脓毒症风险的患者中，例如患有细菌感染的患者，具有发生脓毒症高风险的患者可以被确定为与AR和任选TGFβ信号传导通路活性增加相关的高风险。

因此，本发明还涉及一种用于基于从受试者的血液样品中提取的RNA来确定非脓毒症受试者发生脓毒症的风险的方法，所述方法包括以下步骤：

及任选地：

-基于确定的TGFβ信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的表达水平来确定TGFβ信号传导通路活性；和/或

-基于确定的MAPK-AP1信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的表达水平来确定MAPK-AP1信号传导通路活性；和/或

其中所述血液样品中的信号传导通路活性用于确定受试者将发生脓毒症的风险，

其中从中已获得血液样品的受试者不具有脓毒症，

所述方法还包括将从中已获得血液样品的受试者的血液样品中的信号传导通路活性与得自健康或非脓毒症对照受试者的至少一种血液样品中的信号传导通路活性进行比较。

优选地，未患有脓毒症的受试者是患有细菌感染的受试者。

在一个实施方案中，如果确定AR信号传导通路活性高于得自健康人或非脓毒症对照受试者的对照血液样品中确定的AR信号传导通路活性，则预测从其获得血液样品的受试者处于发生脓毒症的风险。

在本发明的另一个实施方案中，已从中获得血液样品的受试者已从脓毒症康复，并且其中血液样品的所述3个或更多个基因的表达水平用于监测该受试者将发生脓毒症复发的风险，

所述方法还包括将从中已获得血液样品的受试者的所述3个或更多个基因的表达水平与从得自健康或非脓毒症对照受试者的所述3个或更多个基因的表达水平进行比较。

在另一个实施方案中，已从中获得血液样品的受试者已从脓毒症康复，并且其中血液样品的功能状态用于监测该受试者将发生脓毒症复发的风险，

所述方法还包括将从中获得血液样品的受试者的血液样品的功能状态与得自健康或非脓毒症对照受试者的血液样品的至少一种功能状态进行比较，

优选地，其中如果所述血液样品的功能状态包含AR信号传导通路活性，该AR信号传导通路活性被确定为高于在得自健康或非脓毒症对照受试者的对照血液样品中测定的AR信号传导通路活性，则预测从中获得血液样品的受试者处于发生脓毒症复发的风险。在优选的实施方案中，预测已从脓毒症康复的受试者发生脓毒症复发的风险进一步基于TGFβ信号传导通路活性，其中当确定TGFβ信号传导通路活性高于在得自健康或非脓毒症对照受试者的对照血液样品中测定的TGFβ信号传导通路活性时，则所述受试者处于发生脓毒症复发的风险中。在一个更优选的实施方案中，当确定AR和TGFβ信号传导通路活性均高于在得自健康或非脓毒症对照受试者的对照血液样品中测定的AR和TGFβ信号传导通路活性时，则确定已从脓毒症康复的受试者处于发生脓毒症复发的风险中。

研究发现，在自脓毒症康复后，患者在较长时间内仍容易出现脓毒症复发。本发明人证实了较高的复发风险与增加的AR和TGFβ信号传导通路活性相关，并且基于单独的AR信号传导通路活性或当与TGFβ信号传导通路活性组合时，可以鉴定具有发生脓毒症复发风险的受试者。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种基于从受试者的血液样品中提取的RNA来确定从脓毒症康复的受试者的复发风险的方法，所述方法包括以下步骤：

及任选地：

其中已从中获得血液样品的受试者已从脓毒症康复，并且其中所述血液样品中的信号传导通路活性用于监测该受试者将发生脓毒症复发的风险，

在一个实施方案中，如果确定AR信号传导通路活性高于在得自健康或非脓毒症对照受试者的对照血液样品中确定的AR信号传导通路活性，则预测从其获得血液样品的受试者处于发生脓毒症复发的风险。

根据本发明的优选实施方案，所述血液样品是全血样品、分离的外周血单个核细胞(PBMC)、分离的CD4+细胞、分离的CD8+细胞、调节性T细胞、混合的CD8+和T细胞、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)、树突状细胞、分离的中性粒细胞、分离的淋巴细胞或分离的单核细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述信号传导通路活性基于评估使基于从血液样品提取的RNA确定的所述通路的所述3个或更多个基因表达水平与所述信号传导通路的活性相关的经校准的数学模型而确定。

根据本发明的优选实施方案，基于评估使血液样品中信号传导通路的活性与数值相关的经校准的数学模型来确定血液样品的功能状态。这个模型可以被编程为解释通路活性的组合，从而确定待诊断受试者的血液样品的功能状态，并且任选进一步使用这个功能状态来提供诊断或死亡风险。具体地，血液样品的功能状态的确定包括(i)接收待诊断受试者的血液样品中相应信号传导通路的活性，(ii)确定所述受试者的血液样品的功能状态，所述确定基于评估使相应信号传导通路的活性与血液样品的功能状态相关联的经校准的数学模型。

经校准的数学通路模型优选为形心或线性模型，或基于条件概率的贝叶斯网络模型。例如，经校准的数学通路模型可以是基于与血液样品的功能状态和信号传导通路的活性相关的条件概率的概率模型，优选贝叶斯网络模型，或者经校准的数学通路模型可以基于信号传导通路的活性的一种或多种线性组合。

根据所述数学模型，信号传导通路的活性被解释为提供血液样品的功能状态，所述功能状态可以进一步被转化为诊断，或者被解释为直接提供诊断。血液样品的功能状态预测或提供了受试者患有脓毒症的概率，和/或患有脓毒症的受试者将由于脓毒性休克而死亡的概率。

因此，诊断的确定或死亡风险的确定可以包括基于血液样品中细胞信号传导通路的活性的组合来确定所述血液样品的功能状态，并将所述功能状态转化为诊断或死亡风险。根据本发明的优选实施方案，相应信号通路的活性通过本文所述的通路分析确定或可确定。

因此，在本发明的一个优选实施方案中，所述方法包括提供得自受试者的血液样品并从所述血液样品提取RNA的步骤。

在本发明的一个实施方案中，所述受试者是儿童受试者。

在第二方面，本发明涉及一种用于实施本发明第一方面的方法及其各种实施方案的计算机执行方法。

根据第三方面，本发明涉及一种用于确定血液样品的功能状态、和/或诊断脓毒症受试者、和/或预测受试者的死亡风险的装置，所述装置包括被配置为执行本发明第一方面的方法及其各种实施方案的数字处理器。在一个优选实施方案中，本发明涉及一种用于确定血液样品的功能状态的装置，所述装置包括被配置为执行根据前述权利要求中任一项所述的方法的数字处理器，包含适于接收指示AR信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的靶基因表达谱的数据、任选指示TGFβ信号传导通路和/或MAPK-AP1信号传导通路和/或JAK-STAT3信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的靶基因表达谱的数据的输入。

根据第四方面，本发明涉及一种用于确定血液样品的功能状态、和/或诊断脓毒症受试者、和/或预测受试者的死亡风险的非暂时性存储介质，所述非暂时性存储介质存储可由数字处理设备执行以实施本发明第一方面的方法及其各种实施方案的指令。在一个优选实施方案中，本发明涉及一种包含指令的计算机程序产品，当该程序由计算机执行时，所述指令使计算机执行一种方法，该方法包括：

-接收指示AR信号传导通路的3个或更多个靶基因的靶基因表达谱的数据，任选进一步接收指示TGFβ信号传导通路和/或MAPK-AP1信号传导通路和/或JAK-STAT3信号传导通路的3个或更多个靶基因的靶基因表达水平的数据，

-基于确定的AR信号传导通路及任选TGFβ信号传导通路和/或MAPK-AP1信号传导通路和/或JAK-STAT3信号传导通路的所述3个或更多个靶基因的表达水平，确定AR信号传导通路活性及任选确定TGFβ信号传导通路活性和/或MAPK-AP1信号传导通路活性和/或JAK-STAT3信号传导通路活性，

-基于确定的AR信号传导通路活性和任选TGFβ信号传导通路活性和/或MAPK-AP1信号传导通路活性和/或JAK-STAT3信号传导通路活性来确定血液样品的功能状态，其中所述血液样品的所述功能状态被确定为具有确定的AR信号传导通路活性和任选TGFβ信号传导通路活性和/或MAPK-AP1信号传导通路活性和/或JAK-STAT3信号传导通路活性，以及

-任选地，基于所述血液样品的功能状态提供诊断或预测。

所述非暂时性存储介质可以是计算机可读存储介质，例如硬盘驱动器或其他磁性存储介质、光盘或其他光存储介质、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、闪存或其他电子存储介质、网络服务器等。所述数字处理设备可以是手持设备(例如个人数据助理或智能手机)、笔记本电脑、台式计算机、平板计算机或设备、远程网络服务器等。

根据第五方面，本发明涉及一种用于确定血液样品的功能状态、和/或诊断脓毒症受试者、和/或预测受试者的死亡风险的计算机程序，该计算机程序包括程序代码模块，用于当所述计算机程序在数字处理装置上运行时使所述数字处理装置执行根据本发明第一方面的方法及其各种实施方案。所述计算机程序可以存储/分布在适当介质上，例如光存储介质或固态介质，与其他硬件一起提供或作为其他硬件的一部分提供，但也可以以其他形式分布，例如通过互联网或其他有线或无线电信系统。

在第六方面，本发明涉及多个部分，其包含引物和任选包含探针，用于测定3个或更多个例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个基因的表达水平，

其中所述3个或更多个例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个基因选自组1和组2，其中组1由以下基因组成：ABCC4，APP，AR，CDKN1A，CREB3L4，DHCR24，EAF2，ELL2，FGF8，FKBP5，GUCY1A3，IGF1，KLK2，KLK3，LCP1，LRIG1，NDRG1，NKX3_1，NTS，PLAU，PMEPA1，PPAP2A，PRKACB，PTPN1，SGK1，TACC2，TMPRSS2和UGT2B1 5，及

其中组2由以下基因组成：ANGPTL4，CDC42EP3，CDKN1A，CDKN2B，CTGF，GADD45A，GADD45B，HMGA2，ID1，IL11，INPP5D，JUNB，MMP2，MMP9，NKX2_5，OVOL1，PDGFB，PTHLH，SERPINE1，SGK1，SKIL，SMAD4，SMAD5，SMAD6，SMAD7，SNAI1，SNAI2，TIMP1和VEGFA。

设计引物和探针是基因检测和定量领域的常规技术。例如，引物可以通过如Primer3(https://primer3.ut.ee/)等在线程序来设计。qPCR探针通常被设计用于结合扩增产物并具有荧光部分和猝灭剂，从而可以区分结合状态和未结合状态。上述基因的基因组序列可以很容易地在基因组数据库中找到，例如UCSC Genome Browser、Ensembl GenomeBrowser或NCBI Genome Data Viewer。

在一个实施方案中，组1由以下基因组成：AR，CREB3L4，DHCR24，EAF2，ELL2，FKBP5，GUCY1A3，IGF1，KLK3，LCP1，LRIG1，NDRG1，NKX3_1，PMEPA1，PRKACB，TMPRSS2，优选AR，CREB3L4，DHCR24，EAF2，ELL2，FKBP5，LCP1，LRIG1，NDRG1，PMEPA1，PRKACB，TMPRSS2，更优选DHCR24，EAF2，ELL2，FKBP5，LCP1，LRIG1，PMEPA1，PRKACB，和/或组2由以下基因组成：CDC42EP3，GADD45A，GADD45B，HMGA2，ID1，IL11，INPP5D，JUNB，MMP2，MMP9，NKX2_5，OVOL1，PDGFB，PTHLH，SGK1，SKIL，SMAD4，SMAD5，SMAD6，TIMP1，VEGFA，优选CDC42EP3，GADD45A，GADD45B，ID1，JUNB，MMP9，PDGFB，SGK1，SKIL，SMAD5，SMAD6，TIMP1，VEGFA，更优选CDC42EP3，GADD45A，GADD45B，ID1，JUNB，MMP9，PDGFB，SGK1，SMAD5，TIMP1，VEGFA。在一个实施方案中，所述3个或更多个基因选自组1。

在另一个实施方案中，本发明进一步涉及一种试剂盒，其包含用于通过测定相应细胞信号传导通路的一或多个靶基因集合的表达水平来推断一个或多个细胞信号传导通路的活性的引物，其中所述细胞信号传导通路包含AR通路，并且任选进一步包含TGFβ通路、MAPK-AP1通路和JAK-STAT3通路中的一个或多个，

其中AR通路的靶基因集合包含3个或更多个靶基因，例如选自下组的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因：KLK2，PMEPA1，TMPRSS2，NKX3_1，ABCC4，KLK3，FKBP5，ELL2，UGT2B15，DHCR24，PPAP2A，NDRG1，LRIG1，CREB3L4，LCP1，GUCY1A3，AR和EAF2，优选地，其中AR通路的靶基因集合包含3个或更多个靶基因，例如选自以下的3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个靶基因：ELL2，FKBP5，GUCY1A3，LRIG1，PLAU，PMEPA1，PRKACB，SGK1，NDRG1，CREB3L4，DHCR24或PTPN1，及

其中TGFβ通路的靶基因集合包含3个或更多个靶基因，例如选自包含以下基因的组中的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因：ANGPTL4，CDC42EP3，CDKN1A，CTGF，GADD45A，GADD45B，HMGA2，ID1，IL11，JUNB，PDGFB，PTHLH，SERPINE1，SGK1，SKIL，SMAD4，SMAD5，SMAD6，SMAD7，SNAI2，VEGFA，优选地，其中TGFβ通路的靶基因集合包含3个或更多个靶基因，例如选自以下的3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个靶基因：CDC42EP3，GADD45A，ID1，MMP9，SGK1，SMAD5，SMAD7，VEGFA，JUNB，TIMP1，SKIL和CCKN1A，及

其中MAPK-AP1通路的靶基因集合包含3个或更多个靶基因，例如选自包含以下基因的组中的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因：BCL2L11，CCND1，DDIT3，DNMT1，EGFR，ENPP2，EZR，FASLG，FIGF，GLRX，IL2，IVL，LOR，MMP1，MMP3，MMP9，SERPINE1，PLAU，PLAUR，PTGS2，SNCG，TIMP1，TP53，和VIM，优选地，其中MAPK-AP1通路的靶基因集合包含3个或更多个靶基因，例如选自以下的3、4、5、6、7、8、9、10或11个靶基因：DNMT1，EGFR，ENPP2，GLRX，MMP9，PLAUR，TIMP1，LOR，EZR，DDIT3和TP53，以及

其中JAK-STAT3通路的靶基因集合包含3个或更多个靶基因，例如选自包含以下基因的组中的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因：AKT1，BCL2，BCL2L1，BIRC5，CCND1，CD274，CDKN1A，CRP，FGF2，FOS，FSCN1，FSCN2，FSCN3，HIF1A，HSP90AA1，HSP90AB1，HSP90B1，HSPA1A，HSPA1B，ICAM1，IFNG，IL10，JunB，MCL1，MMP1，MMP3，MMP9，MUC1，MYC，NOS2，POU2F1，PTGS2，SAA1，STAT1，TIMP1，TNFRSF1B，TWIST1，VIM和ZEB1，优选地，其中JAK-STAT3通路的靶基因集合包含3个或更多个靶基因，例如选自以下的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个靶基因：BCL2，BIRC5，CD274，FOS，HSPA1A，JUNB，MMP9，STAT1，TIMP1，BCL2L1，HSPA1B，HSP90AB1，HSP90B1，POU2F1和ICAM1。

在本发明的一个优选实施方案中，所述试剂盒还包含根据本发明第三方面的装置，和/或根据本发明第四方面的非暂时性存储产品和/或根据本发明第五方面的计算机程序。

在一个实施方案中，本发明涉及根据第六方面的试剂盒在根据第一方面的方法中的用途。

在第七方面，本发明涉及使用根据本发明第六方面的试剂盒在体外或离体诊断或预后受试者是否患有脓毒症、患有脓毒性休克或由于脓毒症而具有高死亡风险的方法。优选地，其中与脓毒症相关的以下基因表达增加：ABCC4，APP，FGF8，FKBP5，ELL2，DHCR24，NDRG1，LCP1，EAF2，PTPN1，CDC42EP3，CDKN2B，CTGF，GADD45A，GADD45B，HMGA2，ID1，IGF1，IL11，INPP5D，JUNB，MMP9，PTHLH，SERPINE1，SGK1，SKIL，SMAD4，SMAD6，SNAI2，TIMP1和VEGFA；或者以下基因表达降低：CDKN1A，KLK2，KLK3，PMEPA1，TMPRSS2，NKX2_5，NKX3_1，NTS，PLAU，UGT2B15，PPAP2A，LRIG1，TACC2，CREB3L4，GUCY1A3，AR，ANGPTL4，MMP2，OVOL1，PDGFB，PRKACB，SMAD5，SMAD7和SNAI1。

在另一个实施方案中，本发明涉及使用试剂盒在体外或离体诊断或预后受试者是否患有脓毒症、患有脓毒性休克或因脓毒症而具有高死亡风险的方法，所述试剂盒包含用于通过测定相应细胞信号传导通路的一或多个靶基因集合的表达水平来推断一个或多个细胞信号传导通路的活性的引物，其中所述细胞信号传导通路包含AR通路，并且任选进一步包含TGFβ通路、MAPK-AP1通路和JAK-STAT3通路中的一个或多个，

其中AR通路的靶基因集合包含选自下组的3个或更多个靶基因：KLK2，PMEPA1，TMPRSS2，NKX3_1，ABCC4，KLK3，FKBP5，ELL2，UGT2B15，DHCR24，PPAP2A，NDRG1，LRIG1，CREB3L4，LCP1，GUCY1A3，AR和EAF2，及

其中TGFβ通路的靶基因集合包含选自下组的3个或更多个靶基因：ANGPTL4，CDC42EP3，CDKN1A，CTGF，GADD45A，GADD45B，HMGA2，ID1，IL11，JUNB，PDGFB，PTHLH，SERPINE1，SGK1，SKIL，SMAD4，SMAD5，SMAD6，SMAD7，SNAI2，VEGFA，及

其中MAPK-AP1通路的靶基因集合包含选自下组的3个或更多个靶基因：BCL2L11，CCND1，DDIT3，DNMT1，EGFR，ENPP2，EZR，FASLG，FIGF，GLRX，IL2，IVL，LOR，MMP1，MMP3，MMP9，SERPINE1，PLAU，PLAUR，PTGS2，SNCG，TIMP1，TP53和VIM，以及

其中JAK-STAT3通路的靶基因集合包含选自下组的3个或更多个靶基因：AKT1，BCL2，BCL2L1，BIRC5，CCND1，CD274，CDKN1A，CRP，FGF2，FOS，FSCN1，FSCN2，FSCN3，HIF1A，HSP90AA1，HSP90AB1，HSP90B1，HSPA1A，HSPA1B，ICAM1，IFNG，IL10，JunB，MCL1，MMP1，MMP3，MMP9，MUC1，MYC，NOS2，POU2F1，PTGS2，SAA1，STAT1，TIMP1，TNFRSF1B，TWIST1，VIM和ZEB1。

本申请描述了一些优选实施方案。其他人在阅读和理解前面的详细描述后可能会作出修改和变更。本申请旨在被解释为包括所有这种修改和变更，只要其落入所附权利要求或其等同的范围内即可。

本领域技术人员在实践所要求保护的发明时，通过研究附图、公开内容和所附权利要求，可以理解并实现所公开的实施方案的其他变型。

应当理解，第一方面的方法、第二方面的计算机实现的发明、第三方面的装置、第四方面的非暂时性存储介质、第五方面的计算机程序、第六方面的试剂盒具有类似和/或相同的优选实施方案，特别是如从属权利要求中所限定。

在权利要求中，单词“包含”不排除其他元素或步骤，并且不定冠词“a”或“an”不排除复数。

单个单元或设备可以实现权利要求中列举的多个项目的功能。在相互不同的从属权利要求中叙述某些措施并不表明这些措施的组合不能被有利地使用这一事实。

由一个或多个单元或设备执行的诸如确定死亡风险之类的计算可以由任何其他数量的单元或设备执行。

计算机程序可以存储/分布在适当介质上，例如光存储介质或固态介质，与其他硬件一起提供或作为其他硬件的一部分提供，但也可以以其他形式分布，例如通过互联网或其他有线或无线电信系统。

应当理解，本发明的优选实施方案也可以是从属权利要求或上述实施方案与相应独立权利要求的任意组合。

参考下文描述的实施方案，本发明的这些和其他方面将变得明显并被阐明。

附图简述

一般：在描绘信号转导通路分析评分的所有图中，这些评分均以通路活性的log2几率(log2odds)分数给出，源自由贝叶斯通路模型分析提供的通路活性的概率分数。Log2几率分数以线性量度表示信号传导通路的活性水平。

分析的公共数据集用其GSE编号表示(原则上在每个图的底部)，各个样品用其GSM编号表示(原则上在聚类图的最右列)。

信号传导通路模型或免疫应答/系统模型的所有验证样品都是独立样品并且尚未用于校准待验证的相应模型。

图1显示了来自数据集GSE26440的脓毒性休克患者和健康对照受试者的AR信号传导通路活性(顶部)和TGFβ信号传导通路活性(底部)。数据得自脓毒性休克患者(幸存者)、脓毒性休克患者(非幸存者)、对照受试者(健康受试者)和对照受试者(非脓毒症幸存者)的全血样品。图表示出了相应信号传导通路活性的log2几率；统计差异显示在条形上方，其中“ns”(不显著)表示p值为5.00e^-02<p<＝1.00e+00，*表示p值为1.00e^-02<p<＝5.00e-02，**表示p值为1.00e^-03<p<＝1.00e-02，***表示p值为1.00e^-04<p<＝1.00e-03，****表示p值为p<＝1.00e-04。

图2显示了来自数据集GSE26440的脓毒性休克患者和健康对照受试者的MPK-AP1信号传导通路活性(顶部)和JAK-STAT3信号传导通路活性(底部)。数据得自脓毒性休克患者(幸存者)、脓毒性休克患者(非幸存者)、对照受试者(健康受试者)和对照受试者(非脓毒症幸存者)的全血样品。图表示出了相应信号传导通路活性的log2几率；统计差异显示在条形上方，其中“ns”(不显著)表示p值为5.00e^-02<p<＝1.00e+00，*表示p值为1.00e^-02<p<＝5.00e-02，**表示p值为1.00e^-03<p<＝1.00e-02，***表示p值为1.00e^-04<p<＝1.00e-03，****表示p值为p<＝1.00e-04。

图3显示了来自数据集GSE4607的脓毒性休克患者和健康对照受试者的AR信号传导通路活性(顶部)和TGFβ信号传导通路活性(底部)。数据得自对照受试者、脓毒性休克患者(非幸存者)和脓毒性休克患者(幸存者)的全血样品。图表示出了相应信号传导通路活性的log2几率；统计差异显示在条形上方，其中“ns”(不显著)表示p值为5.00e^-02<p<＝1.00e+00，*表示p值1.00e^-02<p<＝5.00e-02，**表示p值为1.00e^-03<p<＝1.00e-02，***表示p值为1.00e^-04<p<＝1.00e-03，****表示p值为p<＝1.00e-04。

图4显示了来自数据集GSE4607的脓毒性休克患者和健康对照受试者的MPK-AP1信号传导通路活性(顶部)和JAK-STAT3信号传导通路活性(底部)。数据得自对照受试者、脓毒性休克患者(非幸存者)和脓毒性休克患者(幸存者)的全血样品。图表示出了相应信号传导通路活性的log2几率；统计差异显示在条形上方，其中“ns”(不显著)表示p值为5.00e^-02<p<＝1.00e+00，*表示p值为1.00e^-02<p<＝5.00e-02，**表示p值为1.00e^-03<p<＝1.00e-02，***表示p值为1.00e^-04<p<＝1.00e-03，****表示p值为p<＝1.00e-04。

图5显示了来自数据集GSE66099的脓毒性休克患者和健康对照受试者的AR信号传导通路活性(顶部)和TGFβ信号传导通路活性(底部)。数据得自对照受试者、脓毒性休克患者(非幸存者)和脓毒性休克患者(幸存者)的全血样品。图表示出了相应信号传导通路活性的log2几率；统计差异显示在条形上方，其中“ns”(不显著)表示p值为5.00e^-02<p<＝1.00e+00，*表示p值为1.00e^-02<p<＝5.00e-02，**表示p值为1.00e^-03<p<＝1.00e-02，***表示p值为1.00e^-04<p<＝1.00e-03，****表示p值为p<＝1.00e-04。

图6显示了来自数据集GSE66099的脓毒性休克患者和健康对照受试者的MPK-AP1信号传导通路活性(顶部)和JAK-STAT3信号传导通路活性(底部)。数据得自对照受试者、脓毒性休克患者(非幸存者)和脓毒性休克患者(幸存者)的全血样品。图表示出了相应信号传导通路活性的log2几率；统计差异显示在条形上方，其中“ns”(不显著)表示p值为5.00e^-02<p<＝1.00e+00，*表示p值为1.00e^-02<p<＝5.00e-02，**表示p值为1.00e^-03<p<＝1.00e-02，***表示p值为1.00e^-04<p<＝1.00e-03，****表示p值为p<＝1.00e-04。

图7显示了来自数据集GSE95233的脓毒性休克患者和健康对照受试者的AR信号传导通路活性(顶部)和TGFβ信号传导通路活性(底部)。数据来自对照受试者(CS＝健康对照受试者；PC＝非脓毒症患者对照)、脓毒性休克患者(NS＝非幸存者)和脓毒性休克患者(SV＝幸存者)的全血样品。图表示出了相应信号传导通路活性的log2几率；统计差异显示在条形上方，其中“ns”(不显著)表示p值为5.00e^-02<p<＝1.00e+00，*表示p值为1.00e^-02<p<＝5.00e-02，**表示p值为1.00e^-03<p<＝1.00e-02，***表示p值为1.00e^-04<p<＝1.00e-03，****表示p值为p<＝1.00e-04。

图8显示了来自数据集GSE95233的脓毒性休克患者和健康对照受试者的MPK-AP1信号传导通路活性(顶部)和JAK-STAT3信号传导通路活性(底部)。数据来自对照受试者(CS＝健康对照受试者；PC＝非脓毒症患者对照)、脓毒性休克患者(NS＝非幸存者)和脓毒性休克患者(SV＝幸存者)的全血样品。图表示出了相应信号传导通路活性的log2几率；统计差异显示在条形上方，其中“ns”(不显著)表示p值为5.00e^-02<p<＝1.00e+00，*表示p值为1.00e^-02<p<＝5.00e-02，**表示p值为1.00e^-03<p<＝1.00e-02，***表示p值为1.00e^-04<p<＝1.00e-03，****表示p值为p<＝1.00e-04。

图9显示了数据集GSE26440中各个样品基于AR和TGFβ信号传导通路的聚类图。灰度编码代表各个通路分数的对数刻度。使用了层次聚类法。左侧的颜色编码描绘了：黑色＝脓毒性休克患者(幸存者)；浅灰色＝脓毒性休克患者(非幸存者)；中灰色＝正常对照；深灰色＝对照幸存者。

图10显示了数据集GSE26440中各个样品基于AR、TGFβ和MAPK-AP1信号传导通路的聚类图。灰度编码代表各个通路分数的对数刻度。使用了层次聚类法。左侧的颜色编码描绘了：黑色＝脓毒性休克患者(幸存者)；浅灰色＝脓毒性休克患者(非幸存者)；中灰色＝正常对照；深灰色＝对照幸存者。

图11显示了数据集GSE26440中各个样品基于AR、TGFβ、MAPK-AP1和JAK-STAT3信号传导通路的聚类图。灰度编码代表各个通路分数的对数刻度。使用了层次聚类法。左侧的颜色编码描绘了：黑色＝脓毒性休克患者(幸存者)；浅灰色＝脓毒性休克患者(非幸存者)；中灰色＝正常对照；深灰色＝对照幸存者。

图12显示了数据集GSE4607中各个样品基于AR和TGFβ信号传导通路的聚类图。灰度编码代表各个通路分数的对数刻度。使用了层次聚类法。左侧的颜色编码描绘了：黑色＝对照；浅灰色＝脓毒性休克患者(非幸存者)；深灰色＝脓毒性休克患者(幸存者)。

图13显示了数据集GSE4607中各个样品基于AR、TGFβ和MAPK-AP1信号传导通路的聚类图。灰度编码代表各个通路分数的对数刻度。使用了层次聚类法。左侧的颜色编码描绘了：黑色＝对照；浅灰色＝脓毒性休克患者(非幸存者)；深灰色＝脓毒性休克患者(幸存者)。

图14显示了数据集GSE4607中各个样品基于AR、TGFβ、MAPK-AP1和JAK-STAT3信号传导通路的聚类图。灰度编码代表各个通路分数的对数刻度。使用了层次聚类法。左侧的颜色编码描绘了：黑色＝对照；浅灰色＝脓毒性休克患者(非幸存者)；深灰色＝脓毒性休克患者(幸存者)。

图15显示了数据集GSE66099中各个样品基于AR和TGFβ信号传导通路的聚类图。灰度编码代表各个通路分数的对数刻度。使用了层次聚类法。左侧的颜色编码描绘了：黑色＝脓毒性休克患者；浅灰色＝脓毒症患者；深灰色＝对照受试者。

图16显示了数据集GSE66099中各个样品基于AR、TGFβ和MAPK-AP1信号传导通路的聚类图。灰度编码代表各个通路分数的对数刻度。使用了层次聚类法。左侧的颜色编码描绘了：黑色＝脓毒性休克患者；浅灰色＝脓毒症患者；深灰色＝对照受试者。

图17显示了数据集GSE66099中各个样品基于AR、TGFβ、MAPK-AP1和JAK-STAT3信号传导通路的聚类图。灰度编码代表各个通路分数的对数刻度。使用了层次聚类法。左侧的颜色编码描绘了：黑色＝脓毒性休克患者；浅灰色＝脓毒症患者；深灰色＝对照受试者。

图18显示了数据集GSE95233中各个样品基于AR和TGFβ信号传导通路的聚类图。灰度编码代表各个通路分数的对数刻度。使用了层次聚类法。左侧的颜色编码描绘了：黑色＝脓毒性休克患者；浅灰色＝脓毒症患者；深灰色＝对照受试者。

图19显示了数据集GSE95233中各个样品基于AR、TGFβ和MAPK-AP1信号传导通路的聚类图。灰度编码代表各个通路分数的对数刻度。使用了层次聚类法。左侧的颜色编码描绘了：黑色＝脓毒性休克患者；浅灰色＝脓毒症患者；深灰色＝对照受试者。

图20显示了数据集GSE95233中各个样品基于AR、TGFβ、MAPK-AP1和JAK-STAT3信号传导通路的聚类图。灰度编码代表各个通路分数的对数刻度。使用了层次聚类法。左侧的颜色编码描绘了：黑色＝血液对照；浅灰色＝对照幸存者；中灰色＝非幸存者第1天；深灰色＝幸存者第1天。

图21描绘了从分离的THP-1细胞获得的通路活性。将THP-1细胞与幽门螺杆菌(H.pylori)上清液一起温育，直接与幽门螺杆菌细菌一起温育并与对照THP-1细胞进行比较。测定AR、ER、FOXO Hedgehog和TGFβ通路的活性并绘制相对值图。

图22描绘了从分离的THP-1细胞获得的通路活性。将THP-1细胞与不同浓度的细菌产物脂多糖(LPS)一起温育，并与对照THP-1细胞进行比较。测定AR、ER、FOXO Hedgehog和TGFβ通路的活性并绘制相对值图。

图23至图34：箱形图显示了基因子集的预测能力。

每张图均描绘了针对AR细胞信号传导通路(图23至26)、TGFβ细胞信号传导通路(图27至30)、或AR和TGFβ细胞信号传导通路的组合的靶基因(图31至34)的不同子集的N＝1、2、3、4、5或6的N个基因的随机选择。使用整个靶基因集合(T＝0，图23、27和31)或基于其对通路活性评分的贡献使用截止值来选择靶基因的子集(T＝0.3、0.4或0.5，图24-26、28-30、32-34)。从每个选择的基因集合中，随机选择N个基因1000次，并使用相应基因选择来确定是否可以将脓毒症患者与健康受试者区分开(至少2个SD差异)。结果以箱形图的形式绘制，其中集合1代表组合数据集GSE26440、GSE4607和GSE66099，集合2代表数据集GSE95233，集合3代表数据集GSE57065。中位数由方框中的粗线表示，第25百分位数由方框的下界表示，第10百分位数由虚线表示。

图35：AR抑制剂实验的示意图。描述了确定AR抑制剂是否可用于减轻LPS对单核细胞(THP-1细胞)影响的实验设置。简而言之，将单核细胞(THP-1)在有或没有LPS的条件下培养24小时，然后更换培养基，随后在有或没有DHT的这两种条件下培养。LPS和DHT都有望激活AR细胞信号传导通路。在平行实验中，首先将THP-1细胞与LPS一起培养24小时，然后更换培养基并将细胞与ARCC-4、ARD-266、A-458和比卡鲁胺之一培养。

图36至39：在AR抑制剂实验中确定的通路活性。图36至39描述了在图35中概述的不同条件下测量的细胞信号传导通路活性的实验结果。图中描绘了分别在不同实验组中测定的AR、ER、HH(Hedgehog)和TGFβ细胞信号传导通路活性。实验一式三份进行，测量的活性的标准偏差显示在图表中。

实施方案详述

以下实施例仅示例说明特别优选的方法和与其相关的选定方面。本文提供的教导可用于构建多种测试和/或试剂盒，例如以检测、预测和/或诊断一种或多种血液样品的功能状态。此外，在使用本文描述的方法时，可以有利地指导药物处方，可以进行药物反应预测和药物功效(和/或副作用)的监测。以下实施例不应被解释为限制本发明的范围。

实施例1：方法和样品描述

使用来自临床和临床前研究样品的Gene Expression Omnibus(GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)Affymetrix HG-U133Plus2.0数据，所述研究中使用全血样品(GSE26440、GSE4607、GSE66099、GSE95233，有关样品类型和制备的更多信息见表1)。我们使用通路分析来确定信号转导通路活性(AR、ER、PR、GR、HH、Notch、TGFbeta、WNT、JAK-STAT1/2、JAK-STAT3、NFkB、PI3K、MAPK)。对于层次聚类，我们使用聚类工具Seabornclustermap。

为了进行分析，使用了来自GEO数据库的公共Affymetrix U133P2.0数据(GSE26440、GSE4607、GSE66099、GSE95233，有关样品类型和制备的更多信息见表1)。对数据集GSE26440、GSE4607、GSE66099和GSE95233的通路分析显示，使用Mann-Whitney-Wilcoxon双侧检验，在正常(健康)对照受试者和脓毒性休克受试者之间的多个通路包括AR和TGFβ通路活性中存在显著差异(通路和p值见图1-8)。

使用重要通路的组合，我们可以从对照中识别/诊断脓毒症受试者。此外，基于AR和/或TGFβ通路活性，建立了计算模型来计算关于脓毒症死亡风险和存活的风险评分。通过层次聚类，我们确定了聚类在对照/健康人群附近的样品，其更有可能存活。

表1：每个数据集的样品类型和制备信息

实施例2：计算风险评分的计算模型

此外，我们能够根据脓毒症死亡的风险对低、中和高风险脓毒症受试者进行分类。我们使用基于计算模型的多个信号传导通路活性评分的解释来对低、中和高风险脓毒症受试者进行分类。

为了构建解释通路活性评分的线性模型，我们通过计算具有1和2个标准差(SD)的平均通路活性来评估健康人群的通路活性。当通路活性超出正常健康人的2SD边界时，我们认为这是异常活性通路，这在模型中意味着为1分。任选可以使用另一个阈值，例如均值的3SD。将分数相加产生累积异常通路活性分数，其直接决定风险的可能性。

计算风险评分的其他计算模型可以是贝叶斯模型、基于形心的模型等。

实施例3：使用校准和验证集的线性模型

为此，我们使用数据集GSE26440作为训练集模型并使用数据集GSE4607验证所述模型。对于AR和TGFβ通路，高于在健康对照人群中测量的平均通路活性分数的2SD用于分类模型，然后将这个相同值应用于独立验证数据集GSE4607。当AR和TGFβ均高于对照样品2SD时，所述脓毒症受试者被归类为高风险(2分)。当AR或TGFβ任一均比对照高2SD时，受试者被分类为中风险(1分)，小于2SD差异被分类为低风险(0分)。有关通路的确定平均值、标准差和2SD上界见表2。

对于预后模型，确定低、中和高风险组以对受试者分层。在中风险组中，所述通路之一被上调，而在高风险组中两条通路均被上调。

表3显示了预后模型的性能。对于GSE 26440数据集(n＝76，非幸存者10％(n＝8)，幸存者68％(n＝51)，对照22％(n＝17))，我们可以将非幸存者组分类，3为高风险，5为中风险，0为低风险。对于验证集GSE 4607(n＝83，非幸存者17％(n＝14)，幸存者65％(n＝54)及对照18％(n＝15))，我们可以使用上述模型将非幸存者组分类，10为高风险，2为中风险，2为低风险。

此外，AR和TGFβ的组合通路总分也可用作预后标志物，其中由于组合的AR和TGFβ通路评分比对照样品高2SD，因此被分类为高风险(1分)。当组合的AR和TGFβ评分与对照相比小于2SD差异时，所述样品被归类为低风险(0分)(数据未显示)。

对于其他数据集(GSE66099、GSE95233和GSE57064)，我们还看到低AR和/或TGFβ通路活性的样品。然而，我们缺乏生存数据来证明这些受试者从脓毒症生存的更高的变化。

表2：基于GSE26440的AR、TGFβ及组合的活性的平均值、标准差和2SD上界。

表3：可能死亡的低、中和高风险脓毒症受试者的分类模型。(n＝样品数)。SD基于使用对照组的上界。AR或TGFβ的评分<2SD提示低风险，仅AR或TGFβ的评分>2SD提示中风险，AR和TGFβ的评分>2SD提示高风险。

实施例4：线性模型2-使用每个数据集上界

由于检验和采样之间的差异，确定每个数据集的上界可能更具体。表4列出了GSE26440和GSE4607的AR活性的平均值、标准差和SD上界。在表5中，使用了上述线性模型，但在这个实施例中，基于每个单独的数据集使用2SD上界。所有非幸存者均被归入中风险组和高风险组。对照样品仅位于低风险组，可用作诊断标志物。

表4：GSE26440和GSE4607的AR活性的平均值、标准差和SD上界

数据集	平均值	标准差	1SD上界	2SD上界	3SD上界
						GSE26440	18.0	2.6	20.6	23.3	25.9
GSE4607	17.8	1.8	19.6	21.4	23.3

表5：基于AR+TGFβ对可能死亡的低风险、中风险和高风险脓毒症受试者进行分类的模型。SD基于使用对照组的上界。AR或TGFβ的评分<2SD提示低风险，仅AR或TGFβ的评分>2SD提示中风险，AR和TGFβ的评分>2SD提示高风险。n＝样品数。

实施例5：线性模型3-使用仅AR通路和每个数据集上界

本实施例使用与上述相同的原理，仅使用2SD上界，并且模型仅基于AR通路。在这种情况下，风险组处于死于脓毒症的低风险或高风险。所述模型的性能可见于表6。对照样品仅位于低风险组，可以用作诊断标志物。

表6：对可能死亡和存活的低风险和高风险脓毒症受试者进行分类的预后模型。(n＝样品数)。SD基于使用对照组的上界。AR评分<2SD提示低风险组，AR评分>2SD提示高风险组。

实施例6：聚类方法

我们使用层次聚类(seaborn clustermap)来确定是否可以根据受试者的通路活性对受试者进行分类。我们选择了对照组和脓毒症组之间AR、TGFβ、JAK-STAT3和MAPK-AP1通路的显著模型。

对于数据集GSE4607，多个脓毒症样品聚类在对照组(橙色)附近。这些受试者可能有更高的生存机会。在上述基于AR和TGFβ的模型中，这些样品也聚类在低风险组中。然而，没有显示脓毒性休克幸存者和非幸存者之间的明显区别。

实施例7：用幽门螺杆菌(H.Pylori)进行细胞刺激

为了研究细菌或细菌产物是否可以诱导与在脓毒症患者中观察到的相同通路活性，进行了体外实验，其中将细菌或细菌产物LPS加入来自细胞系的单核细胞中，如血液单核细胞的模型系统。

使用脱水HBI(Oxoid，CM1032)按照制造商说明在厌氧培养罩中培养牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，ATCC，33277)细菌。

将THP-1细胞以4×10⁵个细胞/孔的密度在6孔板中培养48小时。细胞接种48小时后，细胞用PBS洗涤并直接用1:100MOI的细菌或使用细菌培养物的20％“上清液”在37℃、5％ CO₂处理4小时。将细胞暴露于MOI为1:100的细菌，通过过滤过夜细菌培养物制备20％“上清液”，融合0.2uM过滤器以去除整个细菌，然后在细胞培养基中稀释至20％浓度。细胞接种48小时后，细胞用PBS洗涤并直接用1:100MOI的细菌或使用细菌培养物的20％“上清液”在37℃、5％ CO₂处理4小时。此后，将细胞用PBS洗涤并在RNeasy微型试剂盒裂解缓冲液(Qiagen，目录号/ID：74104)中裂解并储存在-80℃直至进一步处理。使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，74104)提取RNA。使用Philips Research OncoSignal平台进行qPCR。

为了确定螺杆菌对THP-1细胞的通路活性是否具有细菌特异性作用，进行qRT-PCR。将细胞直接用细菌或细菌培养物的生长培养基处理。如图21所示，AR、FOXO、TGFβ和WNT通路的通路活性增加。然而，在脓毒症样品中，我们没有检测到FOXO和WNT通路的显著差异，这可能是由于单核细胞仅占血液成分的4-8％，而其他血细胞类型也发挥着重要作用。

实施例8：用LPS进行细胞刺激

为了研究炎症过程，我们使用源自大肠杆菌的3种不同浓度的LPS(0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml)在THP-1的培养基(DMEM，补充有10％ FBS、1％glutamax和1％青链霉素(pen strep)，在37℃、5％ CO₂)中刺激单核THP-1细胞(TIB-202^TM)24小时。刺激后收获细胞并使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，74104)提取RNA。使用Philips ResearchOncoSignal平台进行qPCR。如图22所示，在LPS刺激的细胞中，通路AR、FOXO、TGFβ和WNT的通路活性增加。在脓毒症样品中也发现了AR和TGFβ通路的激活，证实了这些通路在炎症中的作用。然而，在脓毒症样品中，我们没有检测到FOXO和WNT通路的显著差异，这可能是由于单核细胞仅占血液成分的4-8％，而其他血细胞类型也发挥着重要作用。

实施例9：靶基因子集的验证

为了验证通路靶基因的子集(例如从总数中选择的3个靶基因)是否仍然具有预测性，对AR和TGFβ细胞信号传导通路靶基因随机选择N个基因以评估从总列表中随机选择的N个基因具有预测性的机会。为了做到这一点，对AR和TGFβ细胞信号传导通路的各个靶基因基于其对如下所述通路评分(T)的相对贡献进行排序。对于不同的T阈值(其中T＝0对应于整个基因集，随后较高的T值对应于更严格的选择)，随机选择1000次N个基因并如下所示使用非常简单的线性模型计算分数。对数据集GSE26440、GSE4607与GSE66099组合(集合1)、或GSE95233(集合2)或GSE57065(集合3)计算从1至6范围的N值。此外，还对AR靶基因、TGFβ靶基因以及合并的AR和TGFβ靶基因进行计算。

如下进行所述方案：

1.获取对应于感兴趣的通路的基因列表，并获取其探针集。

2.对于每个基因，采用与其所贡献的通路评分具有最大绝对相关性的探针组(基于所有脓毒症和对照样品；一个基因可能参与多个通路)。

3.通过选取其绝对探针组-通路相关性高于阈值T的所有基因来选择候选基因列表。

4.重复(1000次)，从候选基因列表中选择N个基因的随机子列表。

5.根据探针组-通路相关性的迹象，通过为其分配权重+1或-1，从而制作这些N个基因的简单线性分类器。

6.对所有样品应用该线性分类器以计算分数。

7.对于每个测试集，GSE26440、GSE4607和GSE66099组合，或者GSE95233或GSE57065：

a确定正常样品分数的平均值和标准差，

b.通过取平均值加上两倍标准差来计算阈值，

c.确定高于阈值的脓毒症样品分数、高于阈值的脓毒症非幸存者(如果给定)分数，并检查高于阈值的正常样品分数。

8.绘制1000次随机抽取中确定的分数的箱形图分布。

例如，我们考虑AR和TGFB通路，相关性阈值T＝0.4，通过手动选择的基因(图33)和N＝3基因的随机集合进行增广，组合测试集合GSE26440、GSE4607和GSE66099的结果示出：

-检测到的脓毒症样品的中值分数(方框中的粗线)约为0.60，这意味着一半的随机列表的灵敏度为60％或更高，

-检测到的脓毒症样品的第25百分位数(方框的下界)约为0.32，这意味着四分之三的随机列表的灵敏度为32％或更高，

-检测到的脓毒症样品的第10百分位数(小点状水平线)约为0.12，这意味着90％的随机列表的灵敏度为12％或更高，

-通过选择阈值(平均值+2个标准差)，特异性约为97.5％，并且通过正常样品观察到的低分数证实了这一点。

由这些子集产生的箱形图如图23至34所示。从这些数据集可以得出结论，根据所使用的数据集和靶基因的选择标准，少至1个靶基因可足以区分从脓毒症和非脓毒症受试者获得的血液样品，但在所有情况下，随机选择至少3个基因会获得具有高特异性和理想灵敏度的基因集合。因此得出结论，AR细胞信号传导通路、TGFβ细胞信号传导通路、或来自AR和TGFβ细胞信号传导通路(如本文所定义)的合并的靶基因的最少3个靶基因足以诊断患有脓毒症的受试者。

从这些数据可以得出结论，基于选自在此呈现的各种基因集合的3个基因表达水平可以可靠地做出脓毒症诊断。尽管使用通路模型成功地鉴定了相应的基因集合，但是这个实施例表明在诊断中没有必要使用通路模型，并且可以仅根据表达水平来进行诊断。

所述分析中使用的基因集合如下(基因名称前面的符号表示正相关或负相关)：

AR--T＝0

AR：+ABCC4，+APP，-AR，-CDKN1A，-CREB3L4，+DHCR24，+EAF2，+ELL2，+FGF8，+FKBP5，-GUCY1A3，+IGF1，-KLK2，-KLK3，+LCP1，-LRIG1，+NDRG1，-NKX3_1，-NTS，-PLAU，-PMEPA1，-PPAP2A，-PRKACB，+PTPN1，+SGK1，-TACC2，-TMPRSS2，-UGT2B15

AR--T＝0.3

AR：-AR，-CREB3L4，+DHCR24，+EAF2，+ELL2，+FKBP5，-GUCY1A3，+IGF1，-KLK3，+LCP1，-LRIG1，+NDRG1，-NKX3_1，-PMEPA1，-PRKACB，-TMPRSS2

AR--T＝0.4

AR：-AR，-CREB3L4，+DHCR24，+EAF2，+ELL2，+FKBP5，+LCP1，-LRIG1,+NDRG1，-PMEPA1，-PRKACB，-TMPRSS2

AR--T＝0.5

AR：+DHCR24，+EAF2，+ELL2，+FKBP5，+LCP1，-PMEPA1，-PRKACB

TGFB--T＝0

TGFB：-ANGPTL4，+CDC42EP3，-CDKN1A，+CDKN2B，+CTGF，+GADD45A，+GADD45B，+HMGA2，+ID1，+IL11，+INPP5D，+JUNB，-MMP2，+MMP9，-NKX2_5，-OVOL1，-PDGFB，+PTHLH，+SERPINE1，+SGK1，+SKIL，+SMAD4，-SMAD5，+SMAD6，-SMAD7，-SNAI1，+SNAI2，+TIMP1和+VEGFA

TGFB--T＝0.3

TGFB：+CDC42EP3，+GADD45A，+GADD45B，+HMGA2，+ID1，+IL11，+INPP5D，+JUNB，-MMP2，+MMP9，-NKX2_5，-OVOL1，-PDGFB，+PTHLH，+SGK1，+SKIL，+SMAD4，-SMAD5，+SMAD6，+TIMP1，+VEGFA

TGFB--T＝0.4

TGFB：+CDC42EP3，+GADD45A，+GADD45B，+ID1，+JUNB，+MMP9，-PDGFB，+SGK1，+SKIL，-SMAD5，+SMAD6，+TIMP1，+VEGFA

TGFB--T＝0.5

TGFB：+CDC42EP3，+GADD45A，+GADD45B，+ID1，+JUNB，+MMP9，-PDGFB，-+SGK1，-SMAD5，+TIMP1，+VEGFA

AR；TGFB--T＝0

AR；TGFB--T＝0.3

AR：-AR，-CREB3L4，+DHCR24，+EAF2，+ELL2，+FKBP5，-GUCY1A3，+IGF1，-KLK3，+LCP1，-LRIG1，+NDRG1，-NKX3_1，-PMEPA1，-PRKACB，+SGK1，-TMPRSS2

AR；TGFB--T＝0.4

AR：-AR，-CREB3L4，+DHCR24，+EAF2，+ELL2，+FKBP5，+LCP1，-LRIG1，+NDRG1，-PMEPA1，-PRKACB，+SGK1，-TMPRSS2

AR；TGFB--T＝0.5

AR：+DHCR24，+EAF2，+ELL2，+FKBP5，+LCP1，-LRIG1，-PMEPA1，-PRKACB，+SGK1

TGFB：+CDC42EP3，+GADD45A，+GADD45B，+ID1，+JUNB，+MMP9，-PDGFB，+SGK1，-SMAD5，+TIMP1，+VEGFA

实施例10：AR抑制剂作为脓毒症治疗选项的验证

基于上述数据，推测脓毒症可以通过施用AR细胞信号传导通路抑制剂来治疗或者至少可以减轻其症状。从实施例7和实施例8以及图21和22可以推断出，在用幽门螺杆菌上清液或LPS在单核细胞(THP-1细胞)中刺激后，AR和TGFβ细胞信号传导通路活性增加。为了证实这一假设，本申请人使用这个模型系统来预测AR通路抑制剂用于治疗脓毒症的医学结果。

图35描述了所使用的实验设置。简而言之，将单核细胞(THP-1)在有或没有LPS的条件下培养24小时，然后更换培养基，随后在有或没有DHT的这两种条件下培养。LPS和DHT都有望激活AR细胞信号传导通路。在平行实验中，首先将THP-1细胞与LPS一起培养24小时，然后更换培养基并将细胞与ARCC-4、ARD-266、A-458和比卡鲁胺之一培养。

对所有实验条件均进行细胞信号传导通路分析。测量的ER、AR、HH和TGFβ细胞信号传导通路活性分别在图36至39示出。图36证明LPS或DHT增加单核细胞中的AR细胞信号传导通路活性，并且这似乎是小的叠加效应。此外，图36表明，通过加入AR通路抑制剂，由LPS诱导的AR活性可以至少部分回归至基线水平。

图37和38证明ER和HH细胞信号传导通路活性基本上不受LPS、DHT或AR通路抑制剂的影响，因此证明图36中所示的作用是特异性的。

图39示出LPS还增加TGFβ信号传导，这与本文显示的其他数据一致，其中证明脓毒症影响AR和TGFβ通路。正如预期的那样，DHT不增加TGFβ活性。令人感兴趣的是，A-458示出LPS诱导的TGFβ活性降低以及AR活性降低，表明它具有AR/TGFβ双重抑制剂的功能。正如预期的那样，其余的AR抑制剂无法减轻LPS对TGFβ细胞信号传导通路活性的作用。

从这些数据可以得出结论，脓毒症会提高血细胞中AR和TGFβ细胞信号传导通路活性，这可以在患者的血液样品中检测并用于快速诊断脓毒症或预测患者发生脓毒症的风险。此外，这些数据表明，升高的AR和TGFβ至少可以部分归因于单核细胞，并且可以通过在培养的单核细胞中加入LPS来重现该作用。此外，这些数据表明，如使用单核细胞的体外实验所证明的，AR通路抑制剂可以减轻LPS诱导的增加的AR信号传导通路活性。这表明AR抑制剂可能可用于治疗或至少减轻(缓解)脓毒症受试者的症状，前提条件是患者具有增加的AR通路活性或脓毒症相关基因的异常表达。这进一步强调了需要进行伴随检验来识别处于发生脓毒症风险的患者或可从AR抑制剂治疗中受益的脓毒症患者。

实施例11：在脓毒症THP-1模型中筛选用于预防或治疗脓毒症的通路抑制剂。

引言

脓毒症是一种危及生命的感染，其中免疫应答失调导致多器官功能障碍或衰竭[17]。脓毒症通常是严重细菌感染的并发症，其特征是导致脓毒性休克的全身炎症反应。脓毒症的死亡率为25％至30％，脓毒性休克的死亡率为40％至70％[4]、[18]、[19]。

除了抗生素和维持内脏血液循环的支持措施外，没有任何治疗被证明是有效的，尽管不能排除某些治疗可能使迄今为止无法确定的一小部分患者受益[17]。未能开发出有效治疗的原因之一是脓毒症患者之间的异质性，即基础医学状况和药物使用的差异，以及影响各个患者的免疫应答的遗传变异。

对脓毒症患者的功能性免疫应答的详细评估可以实现个性化治疗方法并改善治疗效果。免疫功能的诊断性评估目前仅限于常规血液测量，例如免疫细胞数量和炎症标志物(例如C反应蛋白)，但无法提供在脓毒症患者造成异常免疫应答的各种类型免疫细胞的功能活性状态信息。

免疫细胞的功能状态由少数所谓的细胞信号转导通路(STP)决定[20]、[21]、[22]、[23]、[24]。最近，已经开发出新的测定方法来定量测量细胞和组织样品(包括血液样品)中STP的活性[25]、[26]、[27]、[28]。测量血细胞中这些STP的综合活性预期能够定量评估个体患者的先天性和适应性免疫应答[23]、[29]。

对来自多个临床脓毒症研究的可公开获得的基因表达数据进行STP分析[30]。研究表明，与健康对照相比，脓毒症患者的AR和TGFβ活性增加，表明这些通路代表了治疗或预防脓毒症的新药物靶点。

用通路抑制剂、特别是AR和TGFβ通路抑制剂治疗可能对患有脓毒症或处于发生脓毒症危险的受试者有益。以前曾尝试用AR抑制剂治疗脓毒症患者，但没有成功。根据我们的结果，这可以解释为并非所有脓毒症患者都表现出高AR通路活性，因此只有那些AR通路活性明显增加的患者可能会受益于AR通路抑制剂的治疗。更重要的是，处于发生脓毒症风险中且相关血细胞中AR通路活性高的感染患者可能会受益于AR抑制剂的预防性治疗。这一假设背后的基本原理是，活性AR通路会导致免疫抑制，见例如Gubbels Bupp和Jorgensen所述[5]，通过引用将其全部内容并入本文。

研究发现，AR蛋白在多种先天性和适应性免疫细胞中表达，包括中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、巨核细胞、B细胞和T细胞，表明AR通路可能确实是配体诱导的。有趣的是，AR蛋白也在造血干细胞以及淋巴和骨髓祖细胞中表达。来自不同研究的证据表明，雄激素在不同免疫细胞类型中的免疫抑制作用主要是通过改变对于适当的免疫应答重要的促炎和抗炎介质的表达来实现的。

与脓毒症中的促炎反应同时，有证据表明许多免疫抑制事件发生，其中免疫抑制细胞因子例如IL-10、TGF-β和IL6发挥作用。根据一项临床观察队列研究，脓毒症患者可发展为慢性危重疾病，6个月存活率为63％，并继续表现出慢性炎症的细胞因子谱，以及持续免疫抑制的生物标志物谱[31]。在Hiraki等人的研究[32]中，利用小鼠腹部脓毒症模型，其中施用耗竭TGF-β的抗体，导致小鼠的存活率提高。这表明TGFβ通路在脓毒症中具有因果作用。总之，AR和TGFβ通路可能通过修改免疫抑制和促炎状态的免疫应答而在脓毒症中发挥因果作用。

鉴于脓毒症患者之间的临床异质性，如前所述，个性化治疗可能是获得临床益处所必需的。

迄今为止，还不可能对将从AR或TGFβ通路抑制剂预防或治疗脓毒症中受益的患者进行分层，然而本文描述的方法使得可以准确评估血液样品中的AR和TGFβ通路活性。这使得可以区分具有低和高AR和/或TGFβ通路活性的患者并对具有高AR和/或TGFβ通路活性的患者施用抑制AR和/TGFβ的抑制剂以使通路活性正常化。

脓毒症的药物再利用筛选

为了开发新的合理疗法以个性化方式预防和治疗脓毒症，研究了脓毒症中异常免疫细胞(单核细胞)功能的几种实验室模型：

-用脂多糖(LPS)刺激的单核细胞系(THP-1)

-用LPS刺激的原代血液来源的单核细胞

-用LPS刺激的健康志愿者来源的PBMC

-脓毒症患者来源的PBMC

将LPS在实验室脓毒症模型中对STP活性的影响与之前描述的脓毒症患者血细胞(全血样品)中的STP活性进行比较。这个分析证实，LPS以剂量依赖性方式激活脓毒症THP-1和原代单核细胞模型中的AR和TGFβSTP(表7-10)。AR和TGFβ通路活性仅在单核细胞中由LPS诱导，而在淋巴样细胞系中则否(MOLT-4，见表10)。正如预测的那样，LPS对PBMC中这些STP的活性没有影响，因为单核细胞仅占PBMC样品中细胞的5-10％，其他细胞是淋巴细胞(70-90％)，导致对单核细胞的影响过多稀释[33]。单核细胞和PBMC之间结果的差异也强调了所测量的STP活性差异的特异性。

将AR和TGFβSTP的原始配体加入单核细胞模型中也证实了AR和TGFβ通路确实可以在单核细胞中被正确激活，因此在这种细胞类型中是功能性STP。基于这些结果，我们确认AR和TGFβSTP是脓毒症中单核细胞的潜在药物靶点。

随后，我们继续筛选可以单独或组合纠正这些实验室脓毒症模型中异常AR和TGFβSTP活性的药物。我们研究了它们在两种临床应用中的潜在用途：

1.预防脓毒症；

2.治疗已确诊的脓毒症。

对于第一种应用，将THP-1细胞与所选药物预温育24小时，随后加入LPS温育24小时。对于治疗应用，将所述药物和LPS同时加入细胞中24小时。重要的是：有些药物需要在体内进行处理才能发挥作用，例如比卡鲁胺等一些雄激素受体(AR)通路抑制剂。在这种情况下，我们还测试了所述药物的活性变体(就比卡鲁胺而言：(R-)比卡鲁胺)。

通过降低LPS诱导的AR和/或TGFβSTP活性，在THP-1单核细胞脓毒症模型中测试了以下药物(或药物组合)：

在脓毒症预防模型中：测试了比卡鲁胺和vactosertib(表10)。

在脓毒症治疗模型中：测试了(R)-比卡鲁胺、酮基-达洛鲁胺(ORM-15341)、D4-阿比特龙、依那西普、瑞沙托维、Vactosertib、N-去甲基恩杂鲁胺、N-去甲基-阿帕鲁胺、R-比卡鲁胺+依那西普和R-比卡鲁胺+非戈替尼(表11)。

药物对脓毒症患者PBMC样品的作用

在PBMC中测试了以下药物(或药物组合)并显示AR和/或TGFβSTP降低。对于TGFβ通路，使用配对单侧t检验显示以下化合物示出显著降低：Vactosertib(p＝0.0079)，Vactosertib+R-比卡鲁胺(p＝0.0004)，D4-阿比特龙(p＝0.0527)，Galunisertib(p＝0.0013)，D4-阿比特龙+Vactosertib(p＝0.0040)，Vactosertib+依那西普(10ug/ml)(p＝0.0270)和D4-阿比特龙+Galunisertib(p＝0.0075)。(表13)Galunisertib组的AR和TGFβ通路均显著降低(AR p＝0.0302)。以下化合物显示AR通路降低，但并不显著；Vactosertib，2/3患者；Vactosertib+R-比卡鲁胺，3/3患者；Vactosertib+依那西普(10ug/ml)，4/5患者。(表13)

在脓毒症患者中，除了LPS之外，其他因素也在症状学中发挥作用，例如免疫抑制状态降低，反映在适应性免疫系统(淋巴细胞)功能降低和先天炎症免疫(单核细胞谱系)系统活性增加。

众所周知，TGFβ诱导单核细胞的炎症状态和淋巴细胞的免疫抑制状态([41]，[23])。使用本文描述的药物(和组合)，我们可以减少单核细胞的炎症表型和淋巴细胞的免疫抑制表型。设想使用这些药物来预防和治疗脓毒症：需要考虑的重要一点是，对于病情严重的脓毒症患者，鉴于无法口服药物和胃肠道药物吸收不足，口服药物可能是不可行的或不是优选的。对于处于脓毒症风险的患者，可以口服给药。因此，口服有效的药物有可能用于预防感染患者的脓毒症。为了治疗患有脓毒症或脓毒性休克的患者，所述制剂可能需要优选改为静脉内药物，或者可以是皮下或肌内制剂。

因此，虽然这些药物均可口服施用并且可以再利用于预防脓毒症和治疗早期脓毒症，但开发另一种制剂(静脉内、皮下、肌内)是治疗重症脓毒症患者的优选。最有效的剂量，无论是口服施用还是静脉内/皮下/肌内施用，都可以在常规剂量效应研究中确定。

方法

THP-1脓毒症模型

LPS被认为是脓毒症症状的主要介质。我们设计了一项体外实验，其中用LPS刺激单核细胞，然后用各种抑制剂进行处理。选择单核细胞是因为它们已被描述在脓毒症中发挥主要作用，见例如Sukhacheva,[34],Clinical Laboratory Int.26August 2020或Haverman et al.[15],The central role of monocytes in the pathogenesis ofsepsis:consequences for immunomonitoring and treatment,The NetherlandsJournal of Medicine,Volume 55,Issue 3,September 1999,Pages 132-141。为了研究炎症过程，我们使用DMSO或LPS(0.5或5ng/ml，源自大肠杆菌)或与药物组合的LPS在培养基(DMEM，补充有10％ FBS、1％glutamax和1％青链霉素，在37℃、5％ CO₂)中刺激单核THP-1细胞(TIB-202^TM)。

脓毒症预防模型：将THP-1细胞与所选药物或DMSO一起预温育24小时，随后与LPS或PBS一起培养24小时。化合物和浓度描述于表9中。

脓毒症治疗模型：对于治疗应用，将药物和LPS同时加入细胞中24小时。表11和表12描述了针对健康志愿者PBMC的化合物和浓度。

MOLT-4细胞系

将MOLT-4(ATCC CRL-1582)在补充有10％ FBS、1％glutamax和1％青链霉素的RPMI1640培养基中在37℃、5％ CO₂培养。

RNA提取和STP活性评分

刺激后收获细胞并使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen,74104)提取RNA。如本文所述，使用Philips Research OncoSignal平台(www.philips.com/oncosignal)计算基于qPCR的STP活性分数。

基于Affymetrix微阵列数据测量细胞样品中的信号转导通路活性

通路活性评分(PAS)根据源自GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)的Affymetrix表达微阵列数据计算[35]。对于每个信号传导通路，将标准化的PAS以log2几率分值表示。通路活性的log2几率分值衍生自通过计算模型计算的通路相关转录因子活性的概率得分，如[36]、[37]、[38]所述。

微阵列数据质量控制

如前所述[38]，对每个单独样品的Affymetrix数据进行质量控制(QC)。总之，QC参数包括：所有探针强度的平均值，阴性或极高(>16-bit)强度值的存在，poly-A RNA(样品制备spike-ins)和标记的cRNA(杂交spike ins)对照，GAPDH，和ACTB 3’/5’比率，由R中的affyQCReport软件包确定强度中心以及阳性和阴性边界对照值，以及由R中Affymetrix软件包的AffyRNAdeg函数确定的RNA降解值[39]、[40]。在数据分析之前删除未通过QC的样品数据。

源自健康人和脓毒症患者的PBMC

通过组织溶液获得健康志愿者和脓毒症患者的PBMC样品。简而言之，首先将冷冻保存的PBMC用洗涤缓冲液(PBS/1％ BSA/2mM EDTA)洗涤，离心并将沉淀重悬于培养基(不含酚红的RPMI1640+8.5％活性炭处理的FBS+1％ Glx+1％p/s)。将0.5×10⁵至1×10⁶个细胞接种到24孔板中的每孔中，并在治疗实验前静置1小时。来自健康捐献者的10个PBMC样品用于：(1)测量基线通路水平，(2)用LPS激活。

脓毒症治疗模型：将源自脓毒症患者(n＝20)的PBMC用化合物、DMSO或化合物的组合处理24小时。(来自健康人和脓毒症患者的PBMC来自同一医院，以最小化样品制备中的偏差)。刺激后，收获细胞并使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，74104)提取RNA。使用PhilipsResearch OncoSignal平台进行qPCR。

结果

单核细胞中的功能性AR和TGFβSTP

AR和TGFβ通路在单核细胞中发挥作用(表7)。在THP-1细胞中睾酮诱导AR通路的活性，该活性可被比卡鲁胺抑制。TGFβ诱导TGFβ通路活性，该活性被特定的已知TGFβ通路抑制剂抑制。总之，这两个通路均示出在单核细胞中发挥作用。

表7：AR(A)和TGFβ(B)STP在THP-1细胞中发挥作用。STP分数是标准化的分数。将THP-1细胞用DMSO或LPS刺激24小时，然后用DMSO或DHT刺激。

	A	B
			组	AR	TGFβ
24hrs DMSO+24hrs DMSO	1.4	8.3
			24hrs DMSO+24hrs DMSO	1.2	8.6
24hrs DMSO+24hrs DHT(25nM)	9.9	8.5
			24hrs DMSO+24hrs DHT(25nM)	9.8	8.5
24hrs LPS(50ng/ml)+24hrs DMSO	18.1	20.4
			24hrs LPS(50ng/ml)+24hrs DMSO	19.4	21.4
24hrs LPS(50ng/ml)+24hrs DHT(25nM)	21.2	20.2
			24hrs LPS(50ng/ml)+24hrs DHT(25nM)	21.6	19.8

单核细胞的/基于单核细胞的脓毒症模型

LPS增加单核细胞的/基于单核细胞脓毒症模型中的AR和TGFβSTP活性

在THP-1单核细胞中，使用5和0.5ng/ml LPS刺激的细胞中的AR和TGFβ通路的STP活性以剂量依赖性方式增加(表8A)。在源自人志愿者的原代单核细胞中，类似地发现用10ng/ml LPS刺激所述细胞6小时，LPS导致AR、TGFβSTP活性的增加(GEO数据库数据集GSE84161)(表8B)。AR和TGFβ通路活性仅在单核细胞中被LPS诱导，而在淋巴样细胞(MOLT-4)中则否(表9)。

表8：LPS以剂量依赖性方式增加AR和TGFβSTP活性分数。A)THP-1细胞。DMSO，5和0.5ng/ml LPS刺激。STP分数是标准化的分数。B)未经处理的及用LPS(10ng/ml)处理6小时的原代单核细胞(GEO数据集GSE84161)。STP分数是log2几率。

A

B

组	AR	TGFβ
			LPS 1	-10.80	6.66
LPS 2	-10.03	9.79
			LPS 3	-9.56	10.25
LPS 4	-10.38	7.46
			LPS 5	-9.14	4.76
未处理1	-12.44	-1.91
			未处理2	-12.29	-3.52
未处理3	-10.69	-0.81
			未处理4	-11.11	-3.81
未处理5	-11.86	-3.69

表9：AR和TGFβ通路活性仅在单核细胞(THP-1)中由LPS诱导而在淋巴样细胞(MOLT-4)中则不是。

将THP1(A)和MOLT-4(B)细胞系用LPS、DHT或DMSO刺激5小时，随后用比卡鲁胺或恩杂鲁胺抑制。标准化的AR和TGFβSTP活性以标准化的分数示出。

A

B

药物发现

在THP-1脓毒症模型中抑制LPS诱导的AR和TGFβSTP的药物(预防和治疗)

基于上述数据，假设可以通过施用抑制AR和/或TGFβ细胞信号传导通路活性的药物来预防和治疗脓毒症。

脓毒症的预防

首先将单核细胞与25uM比卡鲁胺或DMSO一起培养24小时，随后与LPS、DHT或PBS一起培养。该实验一式三份进行并重复两次以获得稳健的结果。

如表10所示，与DMSO相比，单独的比卡鲁胺预处理不会导致任何通路活性的增加。LPS和DHT均增加单核细胞中AR细胞信号传导通路活性，LPS还激活TGFβ。与未经预处理的LPS处理相比，比卡鲁胺预处理后用LPS或DHT刺激导致LPS对AR通路活性的激活显著降低(比卡鲁胺AR，p＝0.04；DHT AR；p＝0.0003，n＝9)。有趣的是，比卡鲁胺显示LPS诱导的TGFβ活性降低以及AR活性降低，表明它具有AR/TGFβ双重抑制剂的作用。

表10：药物对THP-1脓毒症预防模型的作用。

A：比卡鲁胺；B：Vactosertib。STP分数是标准化的分数。

A

	平均值		STDEV
					组	AR	TGFβ	AR	TGFβ
24hrs Bical+24hrs DHT	3.17	1.04	1.62	0.48
					24hrs Bical+24hrs LPS	12.93	9.78	1.97	2.54
24hrs Bical+24hrs PBS	2.63	1.25	1.08	0.48
					24hrs DMSO+24hrs DHT	6.13	1.27	1.64	0.59
24hrs DMSO+24hrs LPS	14.50	11.83	1.64	3.53
					24hrs DMSO+24hrs PBS	1.62	1.16	0.46	0.42

B

预防脓毒症的TGFβ抑制剂

使用与AR抑制剂类似的方法(先使用24小时抑制剂，然后24小时LPS刺激)。

如表10B所示，与DMSO相比，单独Vactosertib预处理不会导致任何通路的活性增加。LPS增加AR和TGFβ活性。与未经预处理的情况相比，Vactosertib预处理后进行LPS刺激导致显著更低的TGFβ通路活性激活(p＝1.3E-05，单侧t检验)。Vactosertib对AR信号传导通路没有作用。

结果表明，AR通路抑制剂可以减轻LPS诱导的增加的AR和TGFβ信号传导通路活性，正如使用单核细胞的体外实验所证明的那样。使用TGFβ通路抑制剂可以减轻TGFβ信号传导通路活性。这表明抑制AR和TGFβSTP的药物/化合物很可能可以用于预防处于发生脓毒症高风险中的患者的脓毒症。

脓毒症的治疗

实验中使用了两种浓度的LPS，即0.5和5ng/ml，此外，对于THP-1细胞系，使用了较高传代数(px-53-55)和较低传代数(px-13-15)(表11)。与较高传代数相比，具有较低传代数的THP-1细胞系对LPS激活的反应性更强(数据未显示)。

THP-1单核细胞脓毒症模型

对于AR信号传导通路，以下化合物可以降低AR PAS；单独(R)-比卡鲁胺、酮基达洛鲁胺、D4-阿比特龙、依那西普、瑞沙托维、Vactosertib、N-去甲基阿帕鲁胺和N-去甲基恩杂鲁胺及组合(R)-比卡鲁胺+依那西普和(R)-比卡鲁胺+非戈替尼可降低THP-1单核细胞中的通路活性分数(表11)。

对于TGFβ信号传导通路；(R)-比卡鲁胺、D4-阿比特龙、依那西普、非戈替尼、瑞沙托维和vactosertib可以降低PAS(表11)。

AR和TGFβ通路均可通过以下药物降低：依那西普、瑞沙托维和(R)-比卡鲁胺+依那西普(表11)。

表11：用DMSO(载体对照)、LPS或LPPS与化合物组合刺激的THP-1细胞。示出了AR和TGFβSTP活性分数以及STP分数的STDEV。每个区块代表一个实验；区块由空行分隔。STP分数是标准化的分数。

PBMC健康志愿者

使用5ng/ml LPS组合(R)-比卡鲁胺和(R)-比卡鲁胺+Vactosertib刺激健康志愿者的PBMC进行24小时(实验1)。在实验2中，用0.5ng/ml LPS测试(R)-比卡鲁胺和依那西普(针对实验1的表12A和针对实验2的表12B)。0.5ng/ml和5ng/ml LPS不显著增加AR和TGFβPAS，这在THP-1脓毒症模型中显示。

因此，LPS刺激的PBMC模型被认为不是脓毒症的良好模型。为了完整起见，我们添加了药物治疗的结果。

在PBMC样品中，单核细胞仅占细胞的5-10％，PBMC中大多数细胞是T细胞，占40-60％。PBMC样品中的单核细胞可能被过度稀释，以至于无法看到LPS增加的PAS的明显总体效果。以下化合物的作用可以是单核细胞的代表或是T细胞的组合作用。

与LPS刺激的PBMC相比，(R)-比卡鲁胺+Vactosertib显示显著较低的(配对t检验)AR(p＝1E-05)和TGFβ(p＝5E-04)的PAS。(R)-比卡鲁胺在实验1中6名健康志愿者中的3名和实验2中4名健康志愿者中的3名示出AR和TGFβ降低(实验2：比卡鲁胺+LPS：AR p＝5E-02)。依那西普降低(不显著)4名健康志愿者中2名的AR PAS和4名健康志愿者中3名的TGFβPAS。

表12：A)，使用DMSO、5ng/ml LPS刺激24小时或与(R)-比卡鲁胺或(R)-比卡鲁胺+Vactosertib组合刺激的健康志愿者的PBMC的PAS。B)，依那西普或比卡鲁胺。

A

B

PBMC脓毒症患者

为了研究在THP-1脓毒症模型中有效的选择的药物抵消LPS对AR和TGFβ通路活性的刺激作用的效果，随后用这些药物和药物组合在体外治疗真实脓毒症患者的PBMC。

尽管LPS刺激的健康志愿者的PBMC被认为不是脓毒症的良好实验室模型系统，但出于以下原因，我们决定研究对实际脓毒症患者的PBMC的作用。LPS并不是脓毒症患者血液中存在的唯一异常因子；例如，除了单核细胞外，其他细菌衍生的分子如肽聚糖(PepG)和脂磷壁酸(LTA)或LPS诱导的次级分子，也可能影响淋巴细胞免疫细胞中的STP活性。我们之前还假设，至少有一部分发生脓毒症的细菌感染患者可能具有免疫抑制的免疫系统[41]、[23]。至少一些淋巴细胞在免疫抑制时表现出增加的TGFβ通路活性和潜在的AR通路活性[23]、[24]。

使用选择的抑制剂(和组合)对总共18个PBMC脓毒症样品进行24小时处理，每个实验6个患者样品。

实验1(表13：A，B)：Vactosertib、Vactosertib+R-比卡鲁胺、依那西普(10ug/ml)和R-比卡鲁胺。

实验2(表13：C，D)：瑞沙托维、D4-阿比特龙、A-485和Galunisertib。

实验3(表13：E，F)：D4-阿比特龙+Vactosertib、R-比卡鲁胺+依那西普(10ug/ml)、Vactosertib+依那西普(10ug/ml)和D4-阿比特龙+Galunisertib。

不幸的是，由于脓毒症患者的样品质量差，无法测量所有患者的通路活性。这也限制了每次实验的样品量较小的统计数据。

对于TGFβ通路，以下化合物显示通路活性显著降低：Vactosertib(p＝0.0079)、Vactosertib+R-比卡鲁胺(p＝0.0004)、D4-阿比特龙(p＝0.0527)、Galunisertib(p＝0.0013)、D4-阿比特龙+Vactosertib(p＝0.0040)、Vactosertib+依那西普(10ug/ml)(p＝0.0270)和D4-阿比特龙+Galunisertib(p＝0.0075)。

使用Galunisertib的AR和TGFβ通路的通路活性分数均显著降低(AR p＝0.0302)。

以下化合物显示AR通路降低，但降低并不显著；Vactosertib，2/3名患者，Vactosertib+R-比卡鲁胺，3/3名患者以及Vactosertib+依那西普(10ug/ml)，4/5名患者。

如上所述，在脓毒症患者中，除了LPS之外，其他因素也在症状学中发挥作用，例如免疫抑制状态降低，反映在适应性免疫系统(淋巴细胞)功能降低和先天性、炎症性、免疫(单核细胞谱系)活性增加。

已知TGFβ诱导单核细胞的炎症状态和淋巴细胞的免疫抑制状态[23]。使用本文描述的药物(和组合)，我们可以减少单核细胞的炎症表型和淋巴细胞的免疫抑制表型。由于我们认为免疫抑制状态容易发生脓毒症以及更糟糕的脓毒症临床结果，因此有效的药物和药物组合可能既能有效预防细菌感染的患者发生脓毒症，又能改善脓毒症的临床结果，通过恢复适应性免疫应答和先天免疫应答的功能而实现[4]。通过预防这种状态，可以预防脓毒症和长期免疫抑制作用。

表13：来自脓毒症患者的PBMC的PAS，用DMSO刺激24小时，或用DMSO作为载体对照与以下组合刺激：A、B)：Vactosertib、Vactosertib+R-比卡鲁胺、依那西普(10ug/ml)和R-比卡鲁胺；C、D)：瑞沙托维、D4-阿比特龙、A-485和Galunisertib；E、F)：D4-阿比特龙+Vactosertib、R-比卡鲁胺+依那西普(10ug/ml)、Vactosertib+依那西普(10ug/ml)和D4-阿比特龙+Galunisertib。灰色区域表示与载体DMSO对照相比PAS降低(2分)。STP分数是标准化的分数。

A

B

C

D

/>

E

F

参考文献

[1]N.L.Stanski and H.R.Wong,“Prognostic and predictive enrichment insepsis,”Nature Reviews Nephrology.Nature Publishing Group,01-Jan-2019.

[2]“Recommendations|Sepsis:recognition,diagnosis and early management|Guidance|NICE.”

[3]N.K.Patil,J.K.Bohannon,and E.R.Sherwood,“Immunotherapy:A promisingapproach to reverse sepsis-induced immunosuppression.,”Pharmacol.Res.,vol.111,pp.688–702,2016.

[4]R.S.Hotchkiss,G.Monneret,and D.Payen,“Sepsis-inducedimmunosuppression:from cellular dysfunctions to immunotherapy.,”Nat.Rev.Immunol.,vol.13,no.12,pp.862–74,Dec.2013.

[5]M.R.Gubbels Bupp and T.N.Jorgensen,“Androgen-InducedImmunosuppression,”Front.Immunol.,vol.9,p.794,Apr.2018.

[6]A.Trigunaite and J.Dimo,“Suppressive effects of androgens on theimmune system,”Cell.Immunol.,vol.294,no.2,pp.87–94,Apr.2015.

[7]von Dipl Biochem Daniela“Androgen-regulation of sepsisresponse:Beneficial role of androgen receptor antagonists.”

[8]F.Fattahi and P.A.Ward,“Understanding Immunosuppression afterSepsis,”Nat.Rev.Mol.Cell Biol,vol.42,pp.51–65,2017.

[9]A.Roquilly et al.,“Local Modulation of Antigen-Presenting CellDevelopment after Resolution of Pneumonia Induces Long-Term Susceptibility toSecondary Infections,”Immunity,vol.47,no.1,pp.135-147.e5,Jul.2017.

[10]M.Cecconi et al.,“Sepsis and septic shock”,Lancet 2018；392:75–87.

[11]Gubbels Bupp and Jorgensen,Androgen-Induced Immunosuppression,Front Immunol.2018；9:794.

[12]Malinen et al.,Crosstalk between androgen and pro-inflammatorysignaling remodels androgen receptor and NF-κB cistrome to reprogram theprostate cancer cell transcriptome,Nucleic Acids Res.2017 Jan 25；45(2):619–630.

[13]Ben-Batalla et al.,Influence of Androgens on Immunity to Self andForeign:Effects on Immunity and Cancer,Front.Immunol.,02 July 2020|https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01184.

[14]Sukhacheva,The role of monocytes in the progression of sepsis,Clinical Laboratory Int.26 August 2020.

[15]Haverman et al.,The central role of monocytes in the pathogenesisof sepsis:consequences for immunomonitoring and treatment,The NetherlandsJournal of Medicine,Volume 55,Issue 3,September 1999,Pages 132-141.

[16]Angele et al.,Gender differences in sepsis,Virulence,5:1,12-19,DOI:10.4161/viru.26982

[17].Cecconi M,Evans L,Levy M,Rhodes A.Sepsis and septic shock.TheLancet.2018 Jul 7；392(10141):75–87.

[18].Lever A,Mackenzie I.Sepsis:definition,epidemiology,anddiagnosis.BMJ.2007 Oct 27；335(7625):879–83.

[19].Singer M,Deutschman CS,Seymour CW,Shankar-Hari M,Annane D,BauerM,et al.The Third International Consensus Definitions for Sepsis and SepticShock(Sepsis-3).JAMA.2016 Feb 23；315(8):801–10.

[20].Newton K,Dixit VM.Signaling in innate immunity andinflammation.Cold Spring Harb Perspect Biol.2012 Mar 1；4(3).

[21].Cantrell D.Signaling in lymphocyte activation.Cold Spring HarbPerspect Biol.2015 Jun 1；7(6).

[22].Cantley editor of compilation.)Lewis C,Hunter editor ofcompilation.)Tony,Sever editor of compilation.)Richar,Thorner editor ofcompilation.)Jeremy W.Signal transduction:principles,pathways,and processes[Internet].Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press；2014[cited 2018 Dec 2].Available from:https://trove.nla.gov.au/version/203634108

[23].Wesseling-Rozendaal Y,van Doorn A,Willard-Gallo K,van de StolpeA.Characterization of immunoactive and immunotolerant CD4+T cells in breastcancer by measuring activity of signaling pathways that determine immune cellfunction[Internet].Cancer Biology；2020 Oct[cited 2021 Feb 24].Available from:http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/2020.10.08.292557

[24].Bouwman W,Verhaegh W,Holtzer L,van de Stolpe A.Measurement ofCellular Immune Response to Viral Infection and Vaccination.FrontImmunol.2020；11:575074.

[25].Verhaegh W,Ooijen H van,Inda MA,Hatzis P,Versteeg R,Smid M,etal.Selection of Personalized Patient Therapy through the Use of Knowledge-Based Computational Models That Identify Tumor-Driving Signal TransductionPathways.Cancer Res.2014 Jun 1；74(11):2936–45.

[26].van de Stolpe A,Holtzer L,van Ooijen H,Inda MA de,VerhaeghW.Enabling precision medicine by unravelling disease pathophysiology:quantifying signal transduction pathway activity across cell and tissuetypes.Scientific Reports.2019 Feb 7；9(1):1603.

[27].van Ooijen H,Hornsveld M,Dam-de Veen C,Velter R,Dou M,VerhaeghW,et al.Assessment of Functional Phosphatidylinositol 3-Kinase PathwayActivity in Cancer Tissue Using Forkhead Box-O Target Gene Expression in aKnowledge-Based Computational Model.The American Journal of Pathology.2018Sep 1；188(9):1956–72.

[28].Canté-Barrett K,Holtzer L,van Ooijen H,Hagelaar R,Cordo’V,Verhaegh W,et al.A Molecular Test for Quantifying Functional Notch SignalingPathway Activity in Human Cancer.Cancers(Basel).2020 Oct 27；12(11).

[29].Frontiers|Measurement of Cellular Immune Response to ViralInfection and Vaccination|Immunology[Internet].[cited 2021 Feb 24].Availablefrom:https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.575074/full

[30].Bouwman W,Verhaegh W,Stolpe A van de.Androgen Receptor PathwayActivity Assay for Sepsis Diagnosis and Prediction of FavorablePrognosis.Frontiers inMedicine.2021；8:2352.

[31].Bergmann CB,Beckmann N,Salyer CE,Hanschen M,Crisologo PA,Caldwell CC.Potential Targets to Mitigate Trauma-or Sepsis-Induced ImmuneSuppression.Front Immunol.2021 Feb 25；12:622601.

[32].Hiraki S,Ono S,Tsujimoto H,Kinoshita M,Takahata R,Miyazaki H,etal.Neutralization of interleukin-10 or transforming growth factor-βdecreasesthe percentages of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in septic mice,therebyleading to an improvedsurvival.Surgery.2012 Feb 1；151(2):313–22.

[33].Peripheral Blood|Whole blood|Handbook|Miltenyi Biotec|Nederland[Internet].[cited 2022 Feb 23].Available from:https://www.miltenyibiotec.com/NL-en/resources/macs-handbook/human-cells-and-organs/human-cell-sources/blood-human.html#gref

[20].The role of monocytes in the progression of sepsis-ClinicalLaboratory int.[Internet].[cited 2021 Feb 24].Available from:https://clinlabint.com/the-role-of-monocytes-in-the-progression-of-sepsis/

[34].Home-GEO DataSets-NCBI[Internet].[cited 2021 Feb 24].Availablefrom:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/

[35].Verhaegh W,van Ooijen H,Inda MA,Hatzis P,Versteeg R,Smid M,etal.Selection of personalized patient therapy through the use of knowledge-based computational models that identify tumor-driving signal transductionpathways.Cancer Res.2014 Jun 1；74(11):2936–45.

[36].van Ooijen H,Hornsveld M,Dam-de Veen C,Velter R,Dou M,VerhaeghW,et al.Assessment of Functional Phosphatidylinositol 3-Kinase PathwayActivity in Cancer Tissue Using Forkhead Box-O Target Gene Expression in aKnowledge-Based Computational Model.Am J Pathol.2018 Sep；188(9):1956–72.

[37].Stolpe A van de,Holtzer L,van Ooijen H,de Inda MA,VerhaeghW.Enabling precision medicine by unravelling disease pathophysiology:quantifying signal transduction pathway activity across cell and tissuetypes.Sci Rep.2019 Feb 7；9(1):1603.

[38].Parman C,Halling C,Gentleman R.Parman C,Halling C,GentlemanR.AffyQCReport:QC report generation for affyBatch objects.R package version1.58.0.2018.

[39].Gautier L,Cope L,Bolstad BM,Irizarry RA.affy--analysis ofAffymetrix GeneChip data at the probe level.Bioinformatics.2004 Feb 12；20(3):307–15.

[40].Bicalutamide(ICI-176334)|≥99％(HPLC)|Selleck|Androgen Receptorantagonist[Internet].selleckchem.com.[cited 2022 Jan 6].Available from:https://www.selleckchem.com/products/Bicalutamide(Casodex).html

[41].Bouwman W,Verhaegh W,Doorn A van,Stolpe A van de.Measuring hostimmune response status by simultaneous quantitative measurement of activityof signal transduction pathways that coordinate functional activity of immunecells from innate and adaptive immune system[Internet].bioRxiv；2021[cited2022 Mar 7].p.2021.10.06.463309.Available from:https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.10.06.463309v1。

Claims

1.一种用于预防或治疗受试者脓毒症的用途的AR细胞信号传导通路抑制剂。

2.根据权利要求1所述的用于所述用途的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中受试者具有升高的AR细胞信号传导通路活性或者其中所述AR细胞信号传导通路活性超过阈值。

3.根据权利要求2所述的用于所述用途的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中在得自所述受试者的血液样品中测定所述AR细胞信号传导通路。

4.根据权利要求3所述的用于所述用途的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中，如果发现所述受试者的血液样品中测定的AR细胞信号传导通路活性升高或者超过特定阈值，则施用所述AR细胞信号传导通路抑制剂。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用于所述用途的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中，所述用途包括：

-测定所述受试者的血液样品中的AR细胞信号传导通路活性；和

-如果发现所述受试者的血液样品中的AR细胞信号传导通路活性升高或超过特定阈值，则向患者施用AR细胞信号传导通路抑制剂。

6.根据权利要求5所述的用于所述用途的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中测定AR细胞信号传导通路包括：

-测定或接收所述受试者的血液样品中AR信号传导通路的3个或更多个靶基因的表达水平；

-测定所述样品中AR细胞信号传导通路相关转录因子(TF)元件的活性水平，所述TF元件控制所述3个或更多个靶基因的转录，所述测定基于评估使所述3个或更多个靶基因的表达水平与AR细胞信号传导通路的活性水平相关联的经校准的数学通路模型，以及

-基于测定的所述AR细胞信号传导通路相关TF元件的活性水平，推断来自所述受试者的血液样品中的AR细胞信号传导通路的活性。

7.根据权利要求1-6任一项所述的用于所述用途的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中所述AR细胞信号传导通路抑制剂选自类固醇抗雄激素、非类固醇抗雄激素、雄激素合成抑制剂、CYP17A1抑制剂、CYP11A1(P450scc)抑制剂、5α-还原酶抑制剂和抗促性腺激素或其组合，或者

其中所述AR细胞信号传导通路抑制剂选自比卡鲁胺、(R)-比卡鲁胺(HY-14249)、恩杂鲁胺(MDV3100)、N-去甲基恩杂鲁胺、普克鲁胺(GT0918)、阿帕鲁胺(ARN-509)、N-去甲基阿帕鲁胺、达洛鲁胺(ODM-201；BAY-1841788)、酮基达洛鲁胺(ORM-15341)、Galeterone(TOK-001)、D4-阿比特龙、A-485、地塞米松、米非司酮(RU486)、醋酸环丙孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸奥沙特隆、醋酸诺美孕酮、地诺孕素、奥生多龙、屈螺酮、螺内酯、美屈孕酮、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、阿帕鲁胺、西咪替丁、托匹芦胺、醋酸阿比特龙、酮康唑、Seviteronel、氨鲁米特、度他雄胺、阿法雌二醇、度他雄胺、爱普列特、非那雄胺、A-485、ARCC-4、ARD-266、沙巴棕提取物、亮丙瑞林、雌激素(例如雌二醇(及其酯)、炔雌醇、缀合雌激素、己烯雌酚)、GnRH类似物、GnRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林)、GnRH拮抗剂(例如西曲瑞克)，和孕激素(例如醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕诺酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮)、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合；

优选地，所述AR细胞信号传导通路抑制剂选自比卡鲁胺、(R)-比卡鲁胺(HY-14249)、恩杂鲁胺(MDV3100)、N-去甲基恩杂鲁胺、普克鲁胺(GT0918)、阿帕鲁胺(ARN-509)、N-去甲基阿帕鲁胺、达洛鲁胺(ODM-201；BAY-1841788)、酮基达洛鲁胺(ORM-15341)、Galeterone(TOK-001)、D4-阿比特龙、A-485、地塞米松、米非司酮(RU486)、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合。

8.根据权利要求1-7任一项所述的用于所述用途的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中所述用途用于预防处于发生脓毒症风险的受试者的脓毒症。

9.根据权利要求1-7任一项所述的用于所述用途的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中所述用途用于治疗患有脓毒症的受试者的脓毒症。

10.根据权利要求1-9任一项所述的用于所述用途的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中所述AR细胞信号传导通路抑制剂与TGFβ细胞信号传导通路抑制剂一起施用，其中所述AR细胞信号传导通路抑制剂和所述TGFβ细胞信号传导通路抑制剂是相同的化合物或不同的化合物。

11.根据权利要求1-10任一项所述的用于所述用途的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中所述AR细胞信号传导通路抑制剂在所述TGFβ细胞信号传导通路抑制剂之前施用，或者其中所述AR细胞信号传导通路抑制剂与所述TGFβ细胞信号传导通路抑制剂同时施用，或者其中所述AR细胞信号传导通路抑制剂在所述TGFβ细胞信号传导通路抑制剂之后施用。

12.根据权利要求1-11任一项所述的用于所述用途的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中所述用途包括：

-测定所述受试者的血液样品中的AR细胞信号传导通路活性和TGFβ细胞信号传导通路活性；和

13.根据权利要求10-12任一项所述的用于所述用途的AR细胞信号传导通路抑制剂，其中所述TGFβ细胞信号传导通路抑制剂选自小分子激酶抑制剂、抗TGF-β配体抗体、抗TβR受体抗体或反义寡核苷酸或其组合，或

其中所述TGFβ细胞信号传导通路抑制剂选自Vactosertib(EW-7197)、Galunisertib(LY2157299)、LY3200882、(E)-SIS3、非苏木单抗、XPA681、XPA089、LY2382770、LY3022859、ISTH0036、ISTH0047、吡咯-咪唑聚酰胺、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合；

14.一种用于预防或治疗受试者脓毒症的用途的TGFβ细胞信号传导通路抑制剂。

15.根据权利要求14所述的用于所述用途的TGFβ细胞信号传导通路抑制剂，其中所述受试者具有升高的TGFβ细胞信号传导通路活性或其中所述TGFβ细胞信号传导通路活性超过阈值。

16.根据权利要求14或15所述的用于所述用途的TGFβ细胞信号传导通路抑制剂，其中所述用途包括：

-测定所述受试者的血液样品中的TGFβ细胞信号传导通路活性；和

-如果发现所述受试者的血液样品中的TGFβ细胞信号传导通路活性升高或超过特定阈值，则向患者施用TGFβ细胞信号传导通路抑制剂。

17.根据权利要求16所述的用于所述用途的TGFβ细胞信号传导通路抑制剂，其中测定TGFβ细胞信号传导通路活性包括：

-测定或接收所述受试者的血液样品中的TGFβ信号传导通路的3个或更多个靶基因的表达水平；

-测定所述样品中的TGFβ细胞信号传导通路相关转录因子(TF)元件的活性水平，所述TF元件控制所述3个或更多个靶基因的转录，所述测定基于评估使所述3个或更多个靶基因的表达水平与TGFβ细胞信号传导通路的活性水平相关联的经校准的数学通路模型，以及

-基于测定的TGFβ细胞信号传导通路相关TF元件的活性水平，推断来自所述受试者的血液样品中的TGFβ细胞信号传导通路的活性。

18.根据权利要求14-17任一项所述的用于所述用途的TGFβ细胞信号传导通路抑制剂，其中所述TGFβ细胞信号传导通路抑制剂选自小分子激酶抑制剂、抗TGF-β配体抗体、抗TβR受体抗体或反义寡核苷酸或其组合，或

更优选选自Vactosertib(EW-7197)、Galunisertib(LY2157299)、LY3200882、(E)-SIS3、依那西普、瑞沙托维、非戈替尼或其组合。

19.根据权利要求14-18任一项所述的用于所述用途的TGFβ细胞信号传导通路抑制剂，其中所述TGFβ细胞信号传导通路抑制剂与AR细胞信号传导通路抑制剂一起施用，其中所述TGFβ细胞信号传导通路抑制剂和所述AR细胞信号传导通路抑制剂是相同的化合物或不同的化合物。

20.根据权利要求19所述的用于所述用途的TGFβ细胞信号传导通路抑制剂，其中所述TGFβ细胞信号传导通路抑制剂在所述AR细胞信号传导通路抑制剂之前施用，或者其中所述TGFβ细胞信号传导通路抑制剂与所述AR细胞信号传导通路抑制剂同时施用，或者其中所述TGFβ细胞信号传导通路抑制剂在所述AR细胞信号传导通路抑制剂之后施用。