JP5739903B2 - 複合試料中のステロイド化合物の質量分析 - Google Patents
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Description
本発明は、質量分析によるステロイド化合物の定量的測定に関する。特定の態様において、本発明は、質量分析による複数の試料からのステロイド化合物の定量的測定の方法に関する。
ステロイド化合物は、4つの環に配置された17個の炭素原子を基本として有し、ステロール及び胆汁酸、副腎及び性ホルモン、ジギタリス化合物などの特定の天然薬物、並びに特定のビタミン及び関連化合物(ビタミンD、ビタミンD類似体及びビタミンD代謝物など)を含む多数の天然に存在する又は合成脂溶性有機化合物のいずれかである。
本発明は、単一の質量分析により複数の試験試料のそれぞれにおけるステロイド化合物の量を検出する方法を提供する。該方法は、各試験試料を別々に処理して複数の処理済み試料を調製するステップであって、処理の結果として、各処理済み試料中のステロイド化合物が他の処理済み試料中のステロイド化合物と質量分析により区別できる、ステップと;処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと;質量分析により検出できる1つ又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合試料をイオン化源にさらすステップであって、各処理済み試料からのステロイド化合物から発生する1つ又は複数のイオンが他の処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと;質量分析により各処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンの量を検出するステップと;各処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンの量を各試験試料中のステロイド化合物の量と関連づけるステップとを含む。
試料中のビタミンD及びビタミンD関連化合物などのステロイド化合物を測定する方法を述べる。より具体的には、単一の質量分析アッセイで複数の試験試料中のステロイド化合物を検出し、定量する方法を述べる。該方法は、誘導体化ステロイド化合物を得るためのPTADなどのクックソン型試薬を質量分析(MS)と併用し、それにより、複数の試験試料中のステロイド化合物を検出し、定量するための高処理アッセイシステムを提供することができる。好ましい実施形態は、大規模臨床施設における自動ステロイド化合物定量への適用に特に十分に適している。
質量分析の準備において、例えば、液体クロマトグラフィー、ろ過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー(TLC)、キャピラリー電気泳動を含む電気泳動、イムノアフィニティー分離を含むアフィニティー分離、酢酸エチル若しくはメタノール抽出を含む抽出法及びカオトロピック剤の使用又は上記のもののいずれかの組合せなどを含む当技術分野で公知の様々な方法により、1つ又は複数のステロイド化合物を試料中の1つ又は複数の他の化合物(例えば、タンパク質)と比較して濃縮することができる。これらの濃縮ステップは、処理前の個々の試験試料、誘導体化後の個々の処理済み試料、又は処理済み試料を混合した後の複合試料に適用することができる。
様々な実施形態において、誘導体化ステロイド化合物は、当業者に公知のいずれかの方法によりイオン化させることができる。質量分析は、分別試料をイオン化し、さらなる分析のための荷電分子を生成するためのイオン源を含む質量分析計を用いて実施される。例えば、試料のイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、光子イオン化、大気圧化学イオン化(APCI)、光イオン化、大気圧光イオン化(APPI)、高速原子衝撃(FAB)、液体二次イオン化(LSI)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー/プラズマスプレーイオン化、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化(SELDI)、誘導結合プラズマ(ICP)、粒子ビームイオン化及びLDTDにより行うことができる。当業者は、イオン化法の選択は、測定する分析物、試料の種類、検出器の種類、ポジティブモード対ネガティブモードの選択等に基づいて決定することができる。
上に略述した処置の後に、各患者試料を別々に処理する場合、複数の患者試料を複合とすることができる(すなわち、混合し、一緒に分析することができる)。「別々に処理する」という語句は、複合試料に含める各患者試料を、最初は質量分析により区別できない2つ又はそれ以上の患者試料中のステロイド化合物が処理の後に区別できるようになるような方法で処理することを意味する。これは、ステロイド化合物を誘導体化する異なる作用剤を用いて各患者試料を処理することにより達成することができる。使用するために選択される誘導体化剤は、質量分析により区別できる誘導体化ステロイド化合物を生成しなければならない。質量分析により誘導体化ステロイド化合物を区別するための基礎となるものは、誘導体化ステロイド化合物のイオンの質量の差である。質量の差は、PTAD及びDMEQTADなどの2つ又はそれ以上の異なる誘導体化剤を用いることにより生じ得る。質量の差は、PTAD及び13C6−PTADなどの同じ誘導体化剤の2つ又はそれ以上の同位体バリアントを用いることによっても生じ得る。これらの2つのアプローチは、相互に排他的でなく、分析する複数の患者試料中の各患者試料中のステロイド化合物を一意的に標識するために異なる誘導体化剤と同じ誘導体化剤の同位体バリアントの任意の組合せを用いることができる。場合によって、複数の患者試料の1つの試料は、誘導体化剤を用いずに処理してもよい。
実施例
以下の自動化ハイブリッドタンパク質沈澱/液−液抽出法は、患者血清試料において実施した。ゲルバリア血清(すなわち、血清分離管に採取された血清)並びにEDTA血漿及びヘパリン血漿もこのアッセイに許容できるものと立証された。
試料の注入は、Aria OS V1.5.1又はより新しいソフトウエアを用いたCohesive Technologies Aria TX−4 TFLCシステムにより行った。
MS/MSは、Finningan TSQ Quantum Ultra MS/MSシステム(Thermo Electron Corporation)を用いて実施した。すべてがThermo Electronから入手した以下のソフトウエアプログラムを本明細書で述べる実施例に用いた:Quantum Tune Master V1.5又はより新しいもの、Xcalibur V2.07又はより新しいもの、LCQuan V2.56(Thermo Finnigan)又はより新しいもの及びARIA OS v1.5.1(Cohesive Technologies)又はより新しいもの。分析カラムから出た液体溶媒/分析物をMS/MS分析計の噴霧器インターフェースに流した。溶媒/分析物混合物がインターフェースのチューブ中で蒸気に変換された。霧化溶媒中の分析物をESIによりイオン化した。
LLOQは、測定が定量的に意味があるようになる点である。このLLOQにおける分析物の応答は、特定可能であり、個別的であり、20%より大きい精度(すなわち、変動係数(CV))及び80%〜120%の正確度で再現性がある。LLOQは、予測されたLLOQに近いレベルのPTAD−25OHD2及びPTAD−25OHD3をスパイクした5種のヒト血清試料を分析し、再現性を評価することにより決定した。収集データの解析から、約4ng/mLの濃度を有する試料が約20%のCVをもたらしたことがわかる。PTAD−25OHD2及びPTAD−25OHD3に関するこの分析のLLOQは、約4ng/mLと確定された。両分析物についてのCV対濃度のグラフ表示を図3A〜Bに示す(図3Aは広範な濃度範囲にわたるプロットを示すが、図3BはLOQ近くの拡大した同じプロットを示す)。
分析における誘導体化ビタミンD代謝物の検出の線型性は、4つのプール血清を高内在性濃度の25OHD2又は25OHD3で希釈し、未希釈検体及び1:2、1:4及び1:8の希釈検体を4回ずつ分析することにより判断した。データの二次回帰を行ったところ、R2=0.97の試験した濃度範囲にわたる相関係数が得られた。これらの試験により、平均回収率が101%で、約4〜約512ng/mLの報告できる範囲を可能にする、1:4で希釈することができることが示された。検体希釈レベルのそれぞれについての平均測定値及び線形回帰分析からの相関値を下の表4Aに示す。検体希釈レベルのそれぞれについての回収率を下の表4Bに示す。
類似分析物に対する分析の特異性は、分析において25OHD3と同様に挙動する3−エピ−25OHD3を除いて、試験したいずれのビタミンD代謝物についても交差反応性を有さないと判断された。25OHD2及び25OHD3の側鎖標識安定同位体もイオン源において起こる水素交換による交差反応性を示した。したがって、25OHD2及び25OHD3の側鎖標識安定同位体は、内部標準として用いるべきでない。下の表5に試験した化合物及び交差反応性試験の結果を示す。
各分析物ごとの5、15、30、60、90及び120ng/mLの6つの標準を定量の再現性の手段としてすべてのアッセイにおいて測定した。日間再現性は、19回のアッセイからの較正曲線を用いて決定した。これらの19回のアッセイからの結果を表6A(25OHD2について)及び表6B(25OHD3について)に示す。
アッセイ内変動は、単一アッセイ内の試料についての結果の再現性と定義される。アッセイ内変動を評価するために、各分析物ごとの任意の超低、低、中及び高濃度の25OHD2及び25OHD3を含むプールした血清からのアッセイの報告できる範囲にわたる4つの品質管理(QC)プールのそれぞれ20個の複製品を調製し、測定した。変動係数(CV)の許容できるレベルは、3つの高濃度については15%未満であり、最低濃度(アッセイのLOQ又はそれに近い)については20%未満である。
2つの回収試験を実施した。第1のものは、それぞれ2種の濃度の25OHD2及び25OHD3をスパイクした6つの検体を用いて実施した。これらのスパイクした検体を、実施例1で述べたハイブリッドタンパク質沈澱/液液抽出処置にかけた。次いで、スパイク検体の抽出物の分割検体を、上述の手順に従って通常のPTADにより誘導体化し、4回ずつ分析した。スパイク濃度は、アッセイの実行できる範囲内にあった。6つのプールは、約44ng/mLより大きいスパイクレベルで約89%、約73ng/mLより大きいスパイクレベルで約92%の平均正確度を示した。24実験的回収率のうちの2つのみが85%未満であり、残りの22アッセイが85〜115%の許容できる正確度範囲内にあった。スパイク検体回収試験の結果を下の表9に示す。
PTAD誘導体化後のビタミンD代謝物を検出する方法を、分析の前にビタミンD代謝物を誘導体化しない質量分析法と比較した。そのような方法は、公開米国特許出願第2006/0228808号(Caulfieldら)に記載されている。8つの検体を分割し、両方法により分析した。2つの方法の間の相関は、完全なデータセット(較正試料、QCプール及び未知など)並びに未知のみについて線形回帰、デミング回帰及びブランド−アルトマン分析により評価した。
アッセイに対する溶血、脂血症及び黄疸の影響も検討した。
試料間のキャリーオーバーを評価するために高濃度の25OHD2及び25OHD3を含む検体の直後にブランクマトリックスを測定した。これらの試験により、分析物又は内部標準の保持時間における応答は、アッセイの完全性を損なうのに十分に大きくなかったことがわかった。これらの試験のデータを下の表11に示す。
種々の検体の種類についてアッセイを行った。ヒト血清及びゲルバリア血清(すなわち、血清分離管からの血清)並びにEDTA血漿及びヘパリンは、許容できる試料の種類と確認された。これらの試験において、同じ患者から同時に採取したヒト血清(血清)、ゲルバリア血清(SST)、EDTA血漿(EDTA)及びヘパリン(Na Hep)の組を25OHD2(40検体の組)及び25OHD3(6検体の組)について試験した。既存の自動ピペッティングシステムの凝血検出/検知に関する制限のため、自動化された処置について血漿を試験しなかった。
異なる誘導体化剤による誘導体化の後の患者試料の複合化を以下のクロスオーバー実験で示した。
非誘導体化及びPTAD誘導体化25−ヒドロキシビタミンD2及び25−ヒドロキシビタミンD3をLDTD−MS/MSにより分析した。これらの分析の結果を下に示す。
1α,25−ジヒドロキシビタミンD2及び1α,25−ジヒドロキシビタミンD3のPTAD誘導体は、各分析物の保存溶液の分割試料をアセトニトリル中でPTADにより処理することにより調製した。誘導体化反応は、約1時間進行させ、反応混合物に水を加えることにより停止させた。次いで、上に略述したLDTD−MS/MSの手順に従って誘導体化分析物を分析した。
ビタミンD2及びビタミンD3のPTAD誘導体は、各分析物の保存溶液の分割試料をアセトニトリル中でPTADにより処理することにより調製した。誘導体化反応は、約1時間進行させ、反応混合物に水を加えることにより停止させた。次いで、誘導体化分析物をMS/MSにより分析した。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
[1] 処理前のステロイド化合物が各試験試料中で同じである、複数の試験試料のそれぞれにおけるステロイド化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
各試験試料を別々に処理して複数の処理済み試料を調製するステップであって、前記処理の結果として、各処理済み試料中のステロイド化合物が他の処理済み試料中のステロイド化合物と質量分析により区別できる、ステップと、
処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる1つ又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合試料をイオン化源にさらすステップであって、各処理済み試料からのステロイド化合物から発生する1つ又は複数のイオンが他の処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
質量分析により各処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンの量を検出するステップと、
各処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンの量を各試験試料中のステロイド化合物の量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。
[2] 前記複数の処理済み試料が非誘導体化ステロイド化合物を含む1つの処理済み試料を含む、上記[1]に記載の方法。
[3] 前記処理が、各試験試料を、誘導体化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異なる誘導体化剤にさらすステップを含む、上記[1]に記載の方法。
[4] 前記異なる誘導体化剤が互いの同位体バリアントである、上記[3]に記載の方法。
[5] 前記異なる誘導体化剤がクックソン型誘導体化剤である、上記[3]に記載の方法。
[6] 前記クックソン型誘導体化剤が、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)、4−メチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(MTAD)、4−[2−(6,7−ジメトキシ−4−メチル−3−オキソ−3,4−ジヒドロキノキサリル)エチル]−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(DMEQTAD)、4−(4−ニトロフェニル)−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(NPTAD)、4−フェロセニルメチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(FMTAD)及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択される、上記[5]に記載の方法。
[7] 前記クックソン型誘導体化剤が4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の同位体バリアントである、上記[5]に記載の方法。
[8] 複数の試料が2つの試料を含み、第1の誘導化試薬が4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)であり、第2の誘導化試薬が 13 C 6 −4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン( 13 C 6 −PTAD)である、上記[3]から[7]のいずれか一項に記載の方法。
[9] 前記ステロイド化合物がビタミンD又はビタミンD関連化合物である、上記[1]から[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10] 前記ステロイド化合物が、ビタミンD 2 、ビタミンD 3 、25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )、25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )、1α,25−ジヒドロキシビタミンD 2 (1α,25OHD 2 )及び1α,25−ジヒドロキシビタミンD 3 (1α,25OHD 3 )からなる群から選択される、上記[1]から[9]のいずれか一項に記載の方法。
[11] 前記ステロイド化合物が、25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )又は25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )である、上記[10]に記載の方法。
[12] 複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさらに含む、上記[1]から[11]のいずれか一項に記載の方法。
[13] 抽出カラムが固相抽出(SPE)カラムである、上記[12]に記載の方法。
[14] 抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、上記[12]に記載の方法。
[15] 分析カラムが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、上記[12]から[14]のいずれか一項に記載の方法。
[16] 質量分析がタンデム質量分析である、上記[1]から[15]のいずれか一項に記載の方法。
[17] 前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンとして実施される、上記[16]に記載の方法。
[18] 抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、上記[12]から[17]のいずれか一項に記載の方法。
[19] 前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離(LDTD)を含む、上記[1]から[18]のいずれか一項に記載の方法。
[20] 前記イオン化源が、エレクトロスプレーイオン化源(ESI)又は大気圧化学イオン化源(APCI)を含む、上記[1]から[19]のいずれか一項に記載の方法。
[21] 前記試験試料が生物学的試料を含む、上記[1]から[20]のいずれか一項に記載の方法。
[22] 前記試験試料が血漿又は血清を含む、上記[21]に記載の方法。
[23] 複数の試験試料のそれぞれにおける2つ又はそれ以上のステロイド化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
各試験試料を別々に処理して、複数の処理済み試料を調製するステップであって、前記処理の結果として、各処理済み試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が他の処理済み試料中の同じ2つ又はそれ以上のステロイド化合物と質量分析により区別できる、ステップと、
処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる1つ又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合試料をイオン化源にさらすステップであって、各処理済み試料からのステロイド化合物のそれぞれについて発生する1つ又は複数のイオンが他の処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
質量分析により各処理済み試料からの2つ又はそれ以上のステロイド化合物のそれぞれからの1つ又は複数のイオンの量を検出するステップと、
各処理済み試料からの2つ又はそれ以上のステロイド化合物のそれぞれからの1つ又は複数のイオンの量を各試験試料中のステロイド化合物のそれぞれの量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。
[24] 前記複数の処理済み試料が非誘導体化ステロイド化合物を含む1つの処理済み試料を含む、上記[23]に記載の方法。
[25] 前記処理が、各試験試料を、誘導体化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異なる誘導体化剤にさらすステップを含む、上記[23]に記載の方法。
[26] 前記異なる誘導体化剤が互いの同位体バリアントである、上記[25]に記載の方法。
[27] 前記異なる誘導体化剤がクックソン型誘導体化剤である、上記[25]に記載の方法。
[28] 前記クックソン型誘導体化剤が、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)、4−メチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(MTAD)、4−[2−(6,7−ジメトキシ−4−メチル−3−オキソ−3,4−ジヒドロキノキサリル)エチル]−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(DMEQTAD)、4−(4−ニトロフェニル)−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(NPTAD)、4−フェロセニルメチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(FMTAD)及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択される、上記[27]に記載の方法。
[29] 前記クックソン型誘導体化剤が、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の同位体バリアントである、上記[27]に記載の方法。
[30] 複数の試料が2つの試料を含み、第1の誘導体化試薬が4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)であり、第2の誘導体化試薬が 13 C 6 −4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン( 13 C 6 −PTAD)である、上記[23]から[29]のいずれか一項に記載の方法。
[31] 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物がビタミンD又はビタミンD関連化合物である、上記[23]から[30]のいずれか一項に記載の方法。
[32] 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が、ビタミンD 2 、ビタミンD 3 、25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )、25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )、1α,25−ジヒドロキシビタミンD 2 (1α,25OHD 2 )及び1α,25−ジヒドロキシビタミンD 3 (1α,25OHD 3 )からなる群から選択される、上記[23]から[31]のいずれか一項に記載の方法。
[33] 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )及び25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )からなる群から選択される少なくとも1つのステロイド化合物を含む、上記[32]に記載の方法。
[34] 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が、25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )及び25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )である、上記[32]に記載の方法。
[35] 複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさらに含む、上記[23]から[34]のいずれか一項に記載の方法。
[36] 抽出カラムが固相抽出(SPE)カラムである、上記[35]に記載の方法。
[37] 抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、上記[35]に記載の方法。
[38] 分析カラムが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、上記[[35]から[37]のいずれか一項に記載の方法。
[39] 質量分析がタンデム質量分析である、上記[23]から[38]のいずれか一項に記載の方法。
[40] 前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンとして実施される、上記[39]に記載の方法。
[41] 抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、上記[23]から[40]のいずれか一項に記載の方法。
[42] 前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離(LDTD)を含む、上記[23]から41のいずれか一項に記載の方法。
[43] 前記イオン化源が、エレクトロスプレーイオン化源(ESI)又は大気圧化学イオン化源(APCI)を含む、上記[23]から[42]のいずれか一項に記載の方法。
[44] 前記試験試料が生物学的試料を含む、上記[23]から[44]のいずれか一項に記載の方法。
[45] 前記試験試料が血漿又は血清を含む、上記[44]に記載の方法。
[46] 処理前のビタミンD又はビタミンD関連化合物がすべての試験試料中で同じである、2つの試験試料のそれぞれにおけるビタミンD又はビタミンD関連化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
ビタミンD又はビタミンD関連誘導体を得るのに適する条件下で4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第1の同位体バリアントに第1の試験試料をさらすことによって第1の処理済み試料を調製するステップと、
ビタミンD又はビタミンD関連誘導体を得るのに適する条件下で4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第2の同位体バリアントに第2の試験試料をさらすことによって第2の処理済み試料を調製するステップであって、PTADの第1及び第2の同位体バリアントが質量分析により区別できる、ステップと、
第1の処理済み試料を第2の処理済み試料と合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる1つ又は複数のイオンを得るのに適する条件下で複合試料中の各処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体をイオン化源にさらすステップであって、第1の処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体からの1つ又は複数のイオンが第2の処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体からの1つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
各処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体からの1つ又は複数のイオンの量を質量分析により測定するステップと、
測定されたイオンの量を第1及び第2の試験試料中のビタミンD又はビタミンD関連化合物の量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。
[47] 4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第1の同位体バリアントが4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)であり、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第2の同位体バリアントが 13 C 6 −4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン( 13 C 6 −PTAD)である、上記[46]に記載の方法。
[48] ビタミンD又はビタミンD関連化合物が、25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )及び25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )からなる群から選択される、上記[46]又は[47]のいずれか一項に記載の方法。
[49] 試験試料が2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物をさらに含み、各試験試料中の2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物の量が測定される、上記[46]から[48]のいずれか一項に記載の方法。
[50] 2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物が25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )及び25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )を含む、上記[49]に記載の方法。
[51] 2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物が25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )及び25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )である、上記[49]に記載の方法。
[52] 複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさらに含む、上記[46]から[51]のいずれか一項に記載の方法。
[53] 抽出カラムが固相抽出(SPE)カラムである、上記[52]に記載の方法。
[54] 抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、上記[52]に記載の方法。
[55] 分析カラムが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、上記[52]から[54]のいずれか一項に記載の方法。
[56] 質量分析がタンデム質量分析である、上記[52]から[55]のいずれか一項に記載の方法。
[57] 前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンとして実施される、上記[56]に記載の方法。
[58] 抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、上記[52]から[57]のいずれか一項に記載の方法。
[59] 前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離(LDTD)を含む、上記[46]から[58]のいずれか一項に記載の方法。
[60] 前記イオン化源がエレクトロスプレーイオン化源(ESI)又は大気圧化学イオン化源(APCI)を含む、上記[46]から[59]のいずれか一項に記載の方法。
[61] 前記試験試料が生物学的試料を含む、上記[46]から[60]のいずれか一項に記載の方法。
[62] 前記試験試料が血漿又は血清を含む、上記[61]に記載の方法。
Claims (58)
- 処理前のステロイド化合物が各試験試料中で同じである、複数の試験試料のそれぞれにおけるステロイド化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
複数の試験試料を別々に処理して複数の処理済み試料を調製するステップであって、前記処理が各試験試料をクックソン型誘導体化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異なるクックソン型誘導体化剤にさらすことを含み、前記処理の結果として、各処理済み試料中のステロイド化合物が他の処理済み試料中のステロイド化合物と質量分析により区別できる、ステップと、
処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる1つ又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合試料をイオン化源にさらすステップであって、各処理済み試料からのステロイド化合物から発生する1つ又は複数のイオンが他の処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
質量分析により各処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンの量を検出するステップと、
各処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンの量を各試験試料中のステロイド化合物の量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。 - 前記複数の処理済み試料が非誘導体化ステロイド化合物を含む1つの処理済み試料を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記異なる誘導体化剤が互いの同位体バリアントである、請求項1に記載の方法。
- 前記クックソン型誘導体化剤が、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)、4−メチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(MTAD)、4−[2−(6,7−ジメトキシ−4−メチル−3−オキソ−3,4−ジヒドロキノキサリル)エチル]−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(DMEQTAD)、4−(4−ニトロフェニル)−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(NPTAD)、4−フェロセニルメチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(FMTAD)及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記クックソン型誘導体化剤が4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の同位体バリアントである、請求項1に記載の方法。
- 複数の試料が2つの試料を含み、第1の誘導化試薬が4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)であり、第2の誘導化試薬が13C6−4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(13C6−PTAD)である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステロイド化合物がビタミンD又はビタミンD関連化合物である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステロイド化合物が、ビタミンD2、ビタミンD3、25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)、25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)、1α,25−ジヒドロキシビタミンD2(1α,25OHD2)及び1α,25−ジヒドロキシビタミンD3(1α,25OHD3)からなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステロイド化合物が、25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)又は25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)である、請求項8に記載の方法。
- 複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 抽出カラムが固相抽出(SPE)カラムである、請求項10に記載の方法。
- 抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、請求項10に記載の方法。
- 分析カラムが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、請求項10〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 質量分析がタンデム質量分析である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンとして実施される、請求項14に記載の方法。
- 抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、請求項10〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離(LDTD)を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イオン化源が、エレクトロスプレーイオン化源(ESI)又は大気圧化学イオン化源(APCI)を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験試料が生物学的試料を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験試料が血漿又は血清を含む、請求項19に記載の方法。
- 複数の試験試料のそれぞれにおける2つ又はそれ以上のステロイド化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
複数の試験試料を別々に処理して、複数の処理済み試料を調製するステップであって、前記処理が各試験試料をクックソン型誘導体化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異なるクックソン型誘導体化剤にさらすことを含み、前記処理の結果として、各処理済み試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が他の処理済み試料中の同じ2つ又はそれ以上のステロイド化合物と質量分析により区別できる、ステップと、
処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる1つ又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合試料をイオン化源にさらすステップであって、各処理済み試料からのステロイド化合物のそれぞれについて発生する1つ又は複数のイオンが他の処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
質量分析により各処理済み試料からの2つ又はそれ以上のステロイド化合物のそれぞれからの1つ又は複数のイオンの量を検出するステップと、
各処理済み試料からの2つ又はそれ以上のステロイド化合物のそれぞれからの1つ又は複数のイオンの量を各試験試料中のステロイド化合物のそれぞれの量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。 - 前記複数の処理済み試料が非誘導体化ステロイド化合物を含む1つの処理済み試料を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記異なる誘導体化剤が互いの同位体バリアントである、請求項21に記載の方法。
- 前記クックソン型誘導体化剤が、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)、4−メチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(MTAD)、4−[2−(6,7−ジメトキシ−4−メチル−3−オキソ−3,4−ジヒドロキノキサリル)エチル]−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(DMEQTAD)、4−(4−ニトロフェニル)−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(NPTAD)、4−フェロセニルメチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(FMTAD)及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- 前記クックソン型誘導体化剤が、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の同位体バリアントである、請求項21に記載の方法。
- 複数の試料が2つの試料を含み、第1の誘導体化試薬が4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)であり、第2の誘導体化試薬が13C6−4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(13C6−PTAD)である、請求項21〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物がビタミンD又はビタミンD関連化合物である、請求項21〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が、ビタミンD2、ビタミンD3、25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)、25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)、1α,25−ジヒドロキシビタミンD2(1α,25OHD2)及び1α,25−ジヒドロキシビタミンD3(1α,25OHD3)からなる群から選択される、請求項21〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)及び25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)からなる群から選択される少なくとも1つのステロイド化合物を含む、請求項28に記載の方法。
- 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が、25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)及び25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)である、請求項28に記載の方法。
- 複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさらに含む、請求項21〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 抽出カラムが固相抽出(SPE)カラムである、請求項31に記載の方法。
- 抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、請求項31に記載の方法。
- 分析カラムが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、請求項31〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 質量分析がタンデム質量分析である、請求項21〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンとして実施される、請求項35に記載の方法。
- 抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、請求項21〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離(LDTD)を含む、請求項21〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イオン化源が、エレクトロスプレーイオン化源(ESI)又は大気圧化学イオン化源(APCI)を含む、請求項21〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験試料が生物学的試料を含む、請求項21〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験試料が血漿又は血清を含む、請求項40に記載の方法。
- 処理前のビタミンD又はビタミンD関連化合物がすべての試験試料中で同じである、2つの試験試料のそれぞれにおけるビタミンD又はビタミンD関連化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
ビタミンD又はビタミンD関連誘導体を得るのに適する条件下で4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第1の同位体バリアントに第1の試験試料をさらすことによって第1の処理済み試料を調製するステップと、
ビタミンD又はビタミンD関連誘導体を得るのに適する条件下で4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第2の同位体バリアントに第2の試験試料をさらすことによって第2の処理済み試料を調製するステップであって、PTADの第1及び第2の同位体バリアントが質量分析により区別できる、ステップと、
第1の処理済み試料を第2の処理済み試料と合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる1つ又は複数のイオンを得るのに適する条件下で複合試料中の各処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体をイオン化源にさらすステップであって、第1の処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体からの1つ又は複数のイオンが第2の処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体からの1つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
各処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体からの1つ又は複数のイオンの量を質量分析により測定するステップと、
測定されたイオンの量を第1及び第2の試験試料中のビタミンD又はビタミンD関連化合物の量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。 - 4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第1の同位体バリアントが4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)であり、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第2の同位体バリアントが13C6−4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(13C6−PTAD)である、請求項42に記載の方法。
- ビタミンD又はビタミンD関連化合物が、25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)及び25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)からなる群から選択される、請求項42又は43のいずれか一項に記載の方法。
- 試験試料が2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物をさらに含み、各試験試料中の2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物の量が測定される、請求項42〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物が25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)及び25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)を含む、請求項45に記載の方法。
- 2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物が25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)及び25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)である、請求項45に記載の方法。
- 複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさらに含む、請求項42〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 抽出カラムが固相抽出(SPE)カラムである、請求項48に記載の方法。
- 抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、請求項48に記載の方法。
- 分析カラムが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、請求項48〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 質量分析がタンデム質量分析である、請求項48〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンとして実施される、請求項52に記載の方法。
- 抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、請求項48〜53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離(LDTD)を含む、請求項42〜54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イオン化源がエレクトロスプレーイオン化源(ESI)又は大気圧化学イオン化源(APCI)を含む、請求項42〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験試料が生物学的試料を含む、請求項42〜56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験試料が血漿又は血清を含む、請求項57に記載の方法。
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