CN1993134A - 用于抑制骨吸收含有二膦酸（阿仑膦酸）和维生素d（胆钙化固醇）的组合物 - Google Patents

Abstract

公开了在哺乳动物中用于预防、抑制、减少和治疗与异常骨吸收有关的情况和疾病，包括例如骨质疏松的组合物和方法。本发明的组合物的实施方案包括适于每周一次给药的药学上有效量的阿仑膦酸和维生素D₃。本发明的组合物和方法在二膦酸治疗的期间提供维生素D营养以便于正常的骨形成和矿化，而将与维生素D不足有关的并发症，如低钙血症和骨软化的发生或可能降到最低。也公开了用于制造本发明组合物、用于测量那些组合物的稳定性和降解，以及用于测量维生素D的血浆水平的方法。

Description

用于抑制骨吸收含有二膦酸（阿仑膦酸）和维生素D（胆钙化固醇）的组合物

发明背景

发明领域

本发明涉及包含二膦酸化合物和维生素D化合物的组合物。本发明也涉及使用这种组合物例如，用于在哺乳动物中治疗、减少、抑制或预防异常骨吸收的方法。本发明进一步涉及制备二膦酸和维生素D组合物的方法。

相关技术

人类和其它哺乳动物的各种障碍涉及或与异常骨吸收有关。在这些障碍中最常见的是骨质疏松，其是一种以低骨量和骨组织的微结构变性，随后骨脆性增加和易骨折为特征的全身性骨骼疾病。骨质疏松正在成为全世界流行病，其发生显著增加与全世界寿命的增加相一致。

负责骨吸收的主要的细胞类型是称作破骨细胞的多核细胞。二膦酸是公知的破骨细胞骨吸收的选择性抑制剂。认为二膦酸结合骨中的羟磷灰石并且通过它们的细胞内作用抑制破骨细胞的骨吸收活性。见，例如，H.Fleisch，Bisphosphonates In Bone Diseas，From TheLaboratory To The Patient，4th Edition，Academic Press(2000)。也已经报道了二膦酸结合骨并且然后在吸收期间被释放到吸收腔隙。这之后，它们被破骨细胞摄取并随后抑制法尼基二磷酸合酶。这种细胞内作用反过来阻止附着到膜小泡的信号蛋白质GTP酶的异戊二烯化(法尼基化和忙牛儿基忙牛儿基化)。忙牛儿基忙牛儿基化的小GTP酶的家族包括指导皱褶缘-活跃的骨吸收的细胞器形成的那些。见，A.A.Reszka和G.A.Rodan，“Bisphosphonate Mechanism ofAction，”Curr Rheumatol Rep.5(1)：65-74(2月，2003)。

认为二膦酸可用于防止与许多情况有关的骨质丢失。例如，已知二膦酸可用于防止骨质丢失和治疗疾病如，但不限于，骨质疏松、骨质稀少、转移性骨病、多发性骨髓瘤、牙周病、牙齿丧失、甲状旁腺机能亢进、类风湿性关节炎、Paget病、骨坏死、骨关节炎、假体周围骨质丢失或骨质溶解，以及恶性肿瘤的高钙血症。所有这些情况都以骨质丢失为特征，由于骨吸收-即分解-和骨形成之间的不平衡所致。

阿仑膦酸钠(Alendronate sodium)是当前可获得的最有效的二膦酸之一，并且在最大抑制骨吸收的剂量时不损害骨矿化。也已经发现给予阿仑膦酸所观察到的骨矿物密度增加是与脊椎骨和非脊椎骨(包括髋部)的骨折降低、脊柱变形降低和身高的保持正相关。这表明当施用相当长的时间，阿仑膦酸确实降低骨更新作用以产生强化的骨。阿仑膦酸钠在超过90个国家中被批准用于治疗绝经后妇女的骨质疏松。阿仑膦酸钠也被批准用于治疗男性骨质疏松、糖皮质激素诱导的骨质疏松以及骨的Paget病。证据提示其它二膦酸如伊本膦酸(ibandronate)、米诺膦酸(minodronate)、帕米膦酸(pamidronate)、利塞膦酸(risedronate)、替鲁膦酸(tiludronate)和唑来膦酸(zoledronate)，与阿仑膦酸具有许多相同的特性，包括作为破骨细胞的骨吸收抑制剂的高效能。

尽管它们的治疗益处，但是二膦酸从胃肠道吸收不良(约1％左右)。见，例如，B.J.Gertz等，Clinical Pharmacology ofAlendronate Sodium，Osteoporosis Int.，Suppl.3：S 13-16(1993)和B.J.Gertz等，Studies of the oral bioavailability ofalendronate，Clinical Pharmacology & Therapeutics，vol.58，number 3，pp.288-298(September 1995)。已知食物，以及可能伴随地被摄取的许多其它物质(包括饮料如矿泉水，甚至用于配制剂量载体的一些赋形剂)可能不利地影响二膦酸吸收。一直使用静脉内施用以确保整个剂量到达循环。然而，静脉内施用昂贵并且不方便，尤其是当必需反复给予受试者持续静脉内输注几个小时时。不象口服施用，如果施用太快，二膦酸的静脉内施用将与急性肾损害有关。

如果，代替静脉内施用，期望二膦酸的口服施用，可施用更高的剂量以补偿胃肠道的低生物利用率。为了抵消这种低生物利用率，通常建议受试者空腹服用二膦酸并在其后禁食至少30分钟。然而，许多受试者发现这种每日禁食不方便。

二膦酸治疗一直与低钙血症有关。在用二膦酸治疗期间，骨吸收的早期抑制可诱导血清钙降低，其发生在治疗开始的几个小时、几天或几周内。血清钙降低可在治疗开始后持续许多周到几个月并且可能在患维生素D缺乏的患者中很显著。对二膦酸治疗的低钙血症反应可能有时很严重以至于出现症状并且批准进行临床干预，特别是在患有甲状旁腺机能减退的病人中(见，例如，Vasikaran，S.D.，编，Bisphosphonates：An Overview with Special Reference toAlendronate，Ann.Clin.Biochem.(2001)38：608-623)。由于骨外没有钙的大量体内贮备，因此用阿仑膦酸的治疗开始后，新骨形成所需的钙必需从饮食-从食物或钙补充剂中吸收。维生素D是正常钙吸收所必需的。因此，适当的维生素D和钙摄取量是使用二膦酸患者期望的。当在有效的骨质疏松治疗期间由于二膦酸治疗发生钙净流入骨而提高钙需要时，适当的维生素D水平甚至更重要。结果，适当的维生素D和钙摄入量是使用二膦酸患者期望的。

维生素D化合物包括一组几乎不在食物中天然存在的脂溶性secosteriods，它们通过太阳紫外线辐射的作用在脊椎动物的皮肤中光合形成。虽然维生素D可有几种类型，但是生理上最相关的类型是维生素D₃(胆钙化固醇)和维生素D₂(麦角钙化固醇)。当酵母和植物甾醇—麦角固醇暴露于UV辐射时形成后者，而前者来自7-脱氢胆固醇并且在皮肤中合成。维生素D₃和维生素D₂的代谢途径相似，并且在人类中它们的生物学效能相似，它们的主要功能是维持血清钙和磷浓度在正常范围内。维生素D₃是激素钙三醇(也称作1，25-二羟胆钙化固醇或1，25-二羟维生素D₃)的专性前体，其主要作用是提高小肠吸收钙的能力，并且保留饮食的磷酸根。麦角钙化醇的激素样代谢产物是1，25-二羟麦角钙化醇(1，25-二羟维生素D₂)。当饮食钙摄入量不足以满足身体的需要时，甲状旁腺素(PTH)，连同维生素D₃的激素代谢产物钙三醇，动员骨髓中的单核细胞干细胞成为成熟的破骨细胞。这些破骨细胞通过各种细胞因子和其它因子进行自我刺激以提高骨的钙贮备的动员。

胆钙化固醇和麦角钙化醇的天然存在的类型是维生素D的羟化的有生物活性的代谢产物之无生物活性的前体。因为维生素D是脂溶的，因此其可被贮藏在体内的脂肪组织中或被代谢成主要的贮藏代谢产物25-羟基维生素D并贮藏在其它器官中。25-羟基维生素D在血浆中运输并当需要时被身体代谢。特别是，如图1中的胆钙化固醇的实例所示，一旦暴露于阳光，皮肤中的7-脱氢胆固醇转变成前-维生素D₃(维生素D₃的异构体，图1中没有显示)，然后转变成D₃(胆钙化固醇)。胆钙化固醇然后在肝脏代谢形成25-羟胆钙化固醇，也称作25-羟维生素D₃，这进一步在肾脏代谢成激素型1，25-二羟胆钙化固醇，也称作钙三醇。尽管没有在图1中描述，但是维生素D(D₂或D₃)的其它代谢产物包括1α-羟基维生素D、24，25二羟基维生素D和1α，24，25-三羟基维生素D。仅钙三醇完全具有生物活性；胆钙化固醇和上述所鉴别的代谢产物显示小的或者无生物活性。

维生素D(D₂和D₃两者)的主要生物功能是通过提高肠在吸收饮食钙中的效率，帮助维持钙稳态。其帮助以确保所吸收的钙量足够将血钙维持在正常范围并且足够维持骨骼的矿化。适当的维生素D摄入量便于钙的肠内吸收，并且在调控钙代谢和在骨骼的矿化中起重要的作用。

公认维生素D不足和缺乏是成人中代谢性骨病的原因。维生素D不足的特征是钙和磷酸盐吸收削弱但正常的骨矿化没有削弱，并且通常与血清25-羟基维生素D水平在约≤9-约30ng/mL之间有关。维生素D缺乏的特征是严重削弱的钙吸收、继发的甲状旁腺机能亢进、低磷酸盐血症、低或低正常血钙，以及削弱的骨矿化。血清25-羟维生素D水平通常约＜9ng/mL。维生素D不足和缺乏导致增加的甲状旁腺激素(PTH)，其反过来导致增加的破骨细胞活性、尿磷酸盐丢失和骨的钙动员。这反过来加重骨质疏松，尤其是在年老成人中，由于削弱的骨矿化导致骨强度独立的和额外的降低。认为持续的维生素D不足是逐渐骨丢失的重要原因。视维生素D和钙缺乏的程度，组织学照片可能呈骨软化、骨质疏松之一或是两者的组合。

维生素D不足和缺乏的流行在易于或患如骨质疏松或骨质减少情况的患者群中以及在经历这些情况的二膦酸治疗的受试者中产生额外维生素D摄入量的需要。在经历二膦酸治疗的受试者中，特别是饮食钙摄入量不充分或者不充分钙吸收的那些受试者，当将维生素D不足的可能或发生降到最低时，需要足够的维生素D以便于骨形成和矿化。增加维生素D摄入量的一些方式通常用于骨吸收化合物的临床试验并且在产品标签上和在产品包装纸上推荐。然而，例如，在美国大约30％骨质疏松的患者具有某种程度的维生素D不足并且随着年龄流行增加。

当前，建议采用口服二膦酸并需要维生素D的受试者在两个不同时间服用两种单独的产品。维生素D制剂是最常见的每日服用，而二膦酸可以每日、每周一次、每月一次或者在更长的时间间隔施用。结果，尽管建议这样做，但是许多在骨质疏松或骨质减少治疗的患者没能服用维生素D。一般地，维生素D不能与二膦酸同时服用，仅仅由于如下事实：二膦酸吸收不良，以至于绝大多数二膦酸口服剂量方案需要在二膦酸和其它物质(包括，但不限于维生素D)的摄取之间间隔30分钟。结果，患者遵守剂量方案，需要在二膦酸施用不高之前或之后的某个时间间隔单独服用维生素D化合物。(一些二膦酸化合物需要在食物摄取之前施用，因此任何维生素D施用将必需发生在二膦酸施用后的某个时间间隔)。尽管患者可在服用他们的二膦酸剂量之前或之后服用维生素D，然而有证据表明许多患者没有这么做。1998年销售研究显示，尽管75-85％开了阿仑膦酸的医生也建议补充维生素D，但是仅57％的骨质疏松患者实际上遵守了。

尽管也可以多种维生素的形式施用维生素D，但是在美国，例如，许多直接销售的口服维生素D制剂不以通常低于每日服用所需的剂量单位出售。而且，如果患者自己将维生素D和它们的二膦酸剂量同时服用，那么可能所服用种类的维生素D将干扰并且进一步降低二膦酸吸收，因为为骨质疏松患者配制的许多维生素D化合物含有降低二膦酸吸收的钙。

专利文献包括公开维生素D₃或维生素D₂或它们的代谢产物或者与二膦酸结合的类似物的专利和公开的专利申请。见，例如，美国专利Nos.4,230,700、4,330,537和4,812,304；欧洲专利Nos.EP 0 381296和EP 0 162 510；国际专利公开Nos.WO90/01321、WO92/21355、WO01/28564、WO01/97788和WO03/086415；欧洲专利公开No.EP 1051976；日本专利公开Nos.7-330613和11-60489；美国专利申请Nos.US 2003/0139378 A1，和US 2003/0225039 A1。然而，这些专利和公开没有公开或授予包含二膦酸化合物和维生素D化合物的组合物、产品或制剂(以及，最具体地，片剂)，其可用于在频率小于每日一次和高于六个月或更长的时间间隔连续口服施用，如每周一次。这些专利和公开也没有公开或授予通过在频率小于每日一次和高于六个月的时间间隔施用如二膦酸/维生素D组合物，治疗、抑制、减少或预防骨质疏松和与异常骨吸收有关的其它情况。

结果，需要包含二膦酸化合物和维生素D化合物的组合物产品，包括通过帮助以确保充分的维生素D摄入量以便于钙吸收，提高二膦酸治疗的全部效能。也需要维生素D和二膦酸产品以便于正常的骨形成和矿化，而减少或将与维生素D不足有关的并发症，如低钙血症和骨软化症的可能或发生降到最低。需要二膦酸和维生素D产品以提供营养量的维生素D以便于经历二膦酸治疗的受试者中正常的骨形成和矿化。也需要根据连续的给药时间表，在小于每日服药的时间间隔和高于在6个月或更长的时间间隔的服药间隔口服施用的二膦酸和维生素D组合。需要适于每周一次给药的包含维生素D和二膦酸的一种产品，以提高维生素D摄入量的便利并且在二膦酸治疗期间提高患者遵守所推荐的维生素D营养。此外，需要制备和施用这种维生素D/二膦酸组合物的方法。

发明概述

本发明提供包含二膦酸化合物和维生素D化合物的药物组合物。本发明的实施方案，例如，包括包含二膦酸、或二膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物，以及维生素D化合物，如药学级维生素D化合物的药物组合物。在实施方案中，维生素D化合物包括胆钙化固醇。在实施方案中，二膦酸包括，例如，阿仑膦酸、阿仑膦酸的药学上可接受的盐(例如，钠、钾、钙、镁，或铵，或者那些盐中任何一种的水合物)，如阿仑膦酸一钠、阿仑膦酸一钠一水合物，或者阿仑膦酸一钠三水合物。在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含胆钙化固醇和阿仑膦酸一钠三水合物。(见图2)本发明的组合物可以是压缩的、包被的或未包被的片剂、胶囊、酏剂、乳剂或其它可接受的剂型的形式。

在本发明组合物的实施方案中，二膦酸(或其药学上有效的盐、衍生物或水合物，或其混合物)以药学上有效的量存在，例如约0.05mg-约1120mg。在本发明组合物的相同的或其它实施方案中，维生素D化合物以药学上有效的量存在，例如约100IU-约60,000IU的维生素D化合物(40IU维生素D具有大约1微克的质量)。在其它实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，包含约100IU-36,000IU维生素D化合物，以及根据二膦酸活性，约5mg-约560mg二膦酸、其药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物。在其它实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，包含约100IU-28,000IU维生素D化合物，以及根据二膦酸活性，约5mg-约280mg二膦酸、其药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物。在其它实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，包括约100IU-8,400IU维生素D化合物，以及根据二膦酸活性，约5mg-约280mg二膦酸、其药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物。在其它实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，包含约100IU-5,600IU维生素D化合物，以及根据二膦酸活性，约5mg-约280mg二膦酸、其药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物。在其它实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，包含约100IU-4,200IU维生素D化合物，以及根据二膦酸活性，约5mg-约280mg二膦酸、其药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物。本发明的一个实施方案是一种药物组合物，包括约2,800IU维生素D和根据二膦酸活性，约70mg二膦酸或二膦酸盐的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物。本发明的一个实施方案是一种药物组合物，包括约2,800IU胆钙化固醇和根据二膦酸活性，约70mg阿仑膦酸或阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物。在另一个实施方案中，胆钙化固醇是药学级的。

本发明组合物的一个实例是包含阿仑膦酸钠、胆钙化固醇或含有适当等量胆钙化固醇的胆钙化固醇颗粒以及另外的赋形剂，如适当的填充剂、稀释剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂等的片剂。本发明组合物的另一个实例是包含阿仑膦酸钠、胆钙化固醇或含有适当等量胆钙化固醇的胆钙化固醇颗粒、乳糖、无水乳糖、微晶纤维素、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁的片剂。可配制本发明的组合物以满足各种纯度和稳定性标准，例如，在约＜30℃和在约＜30％相对湿度贮藏24个月后包含胆钙化醇的每种异构体按重量计算小于1％(相对于总胆钙化固醇)。也可配制本发明的组合物以在约＜30℃和在约＜30％相对湿度贮藏24个月后包含胆钙化固醇的总降解物小于约5％。为了贮藏目的，可通过使用适当的包装，如铝箔泡眼包装或具有干燥剂的HDPE瓶消除环境湿度可能对组合物的纯度和稳定性的影响。

另外，本发明包括制造本说明书中所公开的组合物和剂型的方法，以及根据那些方法所制备的产品。这种方法的一个实施方案包括制备包含二膦酸，如阿仑膦酸的粉剂混合物、将该粉剂混合物压紧以形成混合物、碾磨并将混合物与维生素D化合物混合以形成最后的颗粒混合物，以及压缩最后的颗粒混合物，例如，形成片剂。在另一个实施方案中，在压缩前可润滑最后的颗粒混合物。在一个实施方案中，粉末混合物包含阿仑膦酸、胶体二氧化硅、无水乳糖、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁。在另一个实施方案中，粉剂混合物的滚筒压紧形成压紧的带状物，其可被碾磨、与胆钙化固醇颗粒混合、润滑以及被压缩成固体剂型。本发明制造方法的优点包括提高二膦酸/维生素D组合物中维生素D化合物的稳定性，以及提高本发明组合物中所用单个化合物的颗粒大小的一致性。

另外，阿仑膦酸粉剂混合物可首先与赋形剂中的一种或多种预混合，与剩余的赋形剂混合，以及然后滚筒压紧。

制造二膦酸颗粒，如，例如阿仑膦酸颗粒的其它方法包括但不限于，预压片法(slugging)，以及湿法制粒法。如果使用预压片法制造二膦酸颗粒，接着可将二膦酸(如阿仑膦酸)粉剂混合物压缩成紧密的非带状物以及然后碾磨成颗粒，其可能然后与维生素D化合物混合以形成颗粒混合物，其可能然后被压缩成固体剂型(例如，片剂)。可选择地，二膦酸和所有赋形剂可用成粒液(例如，水)湿法制粒，然后干燥、碾磨、与维生素D化合物混合，并加工成最终的剂型(例如，片剂)。

除了上述方法，也可使用直接的混合方法，通过将二膦酸、所有赋形剂、和维生素D化合物一同混合以及然后压缩成片剂或装入胶囊形成胶囊剂或其它固体剂型。在美国专利5,358,941；美国专利5,882,656和PCT公开WO 95/29679中描述了可能用于制造二膦酸颗粒方法的另外描述。

也可如上述制造二膦酸/维生素D组合以及然后为了降低组合物的含水量水平进行干燥步骤。另外，为了减少含水量水平可将组合物与干燥剂一起包装。

本发明也包括预防、减少、抑制或治疗代谢性骨病的方法。代谢性骨病包括，但不限于，骨质疏松、绝经后骨质疏松、类固醇诱导的骨质疏松、男性骨质疏松、其它疾病诱导的骨质疏松、原发性骨质疏松以及糖皮质激素诱导的骨质疏松。本发明也包括预防、减少、抑制或治疗骨质疏松、与骨质疏松有关的情况，以及与异常骨吸收有关的其它疾病和情况的方法。这种其它疾病和情况可包括，如更多的实例，代谢性骨病、恶性肿瘤的高钙血症、假体周围的骨质溶解、炎性关节炎，以及这里在人或其它哺乳动物中鉴定的其它疾病和情况。另外，本发明涉及在哺乳动物中引起修改对关节炎病症影响的疾病的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的维生素D/二膦酸组合物。本发明也涉及在哺乳动物中引起修改对软骨下骨硬化影响的疾病、预防骨赘形成或进展以及预防关节破坏的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的维生素D/二膦酸组合物。本发明也包括降低哺乳动物骨折风险的方法，其包括施用单位剂量的维生素D/二膦酸组合物。

这种方法的实施方案包括向哺乳动物，包括人施用本发明的组合物。这种组合物可以每周一次、每两周一次、每月一次、每月两次以及每两月一次的时间间隔施用。在这种方法中，在二膦酸治疗期间通过本发明的组合物提供维生素D，将与维生素D不足有关的并发症的发生或可能降到最低。因此，本发明的组合物和方法可用于被鉴定为具有或易受维生素D不足或缺乏影响，或期望足够维生素D量的哺乳动物。在一个实施方案中，在连续时间表中维持每周一次的剂量，以治疗骨质疏松或者与异常骨吸收有关的其它疾病或情况以及将维生素D不足的风险或并发症降到最低，直到达到期望的治疗效果。本发明方法的一个实施方案包括向患骨质疏松的哺乳动物每周施用一次包括约2,800IU胆钙化固醇和约70mg阿仑膦酸或阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物的片剂。在实施方案中，每周施用一次本发明组合物的维生素D化合物的治疗效果基本上与所推荐的维生素D的每日剂量，例如，每日400IU、600IU或800IU维生素D的治疗效果类似。

本发明另外包括用于测量包含胆钙化固醇和二膦酸的药物组合物中胆钙化固醇(例如，稳定性)的方法。这种方法的一个实施方案包括从这种组合物中提取胆钙化固醇到第一溶液中以形成第二溶液，从第二溶液中分离含有胆钙化固醇的样本，以及检测样本中胆钙化固醇的量，例如，使用反相高效液相层析。这种方法的实施方案提供提高的测量灵敏度以及可有利地用本发明的组合物用于区别胆钙化固醇和前胆钙化固醇，或胆钙化固醇的异构体和前胆钙化固醇，或者用于检测胆钙化固醇或前胆钙化固醇酯加合物。

本发明进一步包括施用本发明的二膦酸/胆钙化固醇组合物后测量血浆中胆钙化固醇的方法。这种方法的实施方案包括向哺乳动物施用包括阿仑膦酸和胆钙化固醇的组合物、从哺乳动物中获得血浆样本、从血浆样本中提取胆钙化固醇以形成第一溶液、将第一反应溶液中的胆钙化固醇与亲双烯体反应以形成一个或多个胆钙化固醇的狄耳斯-阿德耳加成产物、使用高效液相层析(HPLC)分离法分离钙化固醇的狄耳斯-阿德耳加成产物，以及使用质谱分析检测样本中胆钙化固醇的量。这种方法的实施方案提供提高的测量灵敏度并且可有利地用本发明的组合物用于，例如，测量施用本发明组合物的药代动力学效应。

本发明也提供测量随施用本发明组合物的时间的药代动力学效应的方法，包括，例如，如通过总尿排泄、血清浓度对时间曲线下的面积(AUC)、稳态最大血清浓度(C_max)、C_max的时间(T_max)，以及包括约70mg阿仑膦酸和约2,800IU胆钙化固醇的片剂的血浆浓度中位表观半衰期(t_1/2)反映。

本发明可包括、由或者基本上由必需的以及这里所描述的或所要求的可选择的成分、组分、步骤和方法构成。本发明的另外特征、优点和实施方案、其性质和各种优点将从下列详细描述和从本发明的实践中变得更显而易见。

附图简述

图1描述维生素D₃的代谢。

图2描述胆钙化固醇和阿仑膦酸一钠三水合物的化学结构。

图3描述维生素D₂和维生素D₃的化学结构。

图4显示总结制备本发明组合物方法的实施方案的示意图。

图5描述维生素D₃的热和光化学异构化以及酯基转移。

图6显示维生素D₃降解的放射性标记研究的结果。

发明详述

术语“异常骨吸收”，如这里所使用的，意思是超过骨形成程度的骨吸收的程度，局部地，或者在骨骼中作为整体，或者可选择地，可能与具有异常结构的骨的形成有关。

“关节炎病症”或“关节炎病状”指一种疾病其中损害(其中的一些是炎性的)限于关节或关节的任何炎性情况，最显著地是类风湿性关节炎。(Academic Press Dictionary of Science Technology；Academic Press；1st edition，January 15，1992)。关节炎病症可由炎症、创伤或感染所致。本发明的组合物也可，单独的或联合的，用于治疗或预防关节炎病症或涉及关节炎的症状/疾病，如淀粉样变性；关节强直性脊椎炎；细菌性关节炎；碱性磷酸钙晶体沉积病；Behcet病；滑囊炎和腱炎；CPPD沉积病；钙化腱炎；腕管综合征；Ehlers-Danlos综合征；肠炎性(enteropathic)关节炎；Felty综合征；纤维肌痛；痛风；真菌性关节炎；血红蛋白病；血友病性关节病；肥大性骨关节病；传染性关节炎；炎性肠病；幼年关节炎；幼年类风湿性关节炎；红斑狼疮；lyme病；marfan综合征；混合性结缔组织病；多中心性网状组织细胞瘤病，肌病；肌炎；骨关节炎；骨坏死；骨坏死软骨营养障碍；多动脉炎；多肌痛风湿病；银屑病性关节炎；Raynaud现象；反射交感神经营养障碍综合征；Reiter综合征；复发性多软骨炎；类风湿性关节炎；风湿热；结节病；脓毒性关节炎；硬皮病；Sjogren综合征；脊柱骨骺发育不良；系统性红斑狼疮；以及病毒性关节炎。不像类风湿性关节炎，骨关节炎是结缔组织病，具有由机械损伤诱导的关节软骨变性、软骨下骨重建和有限的滑膜炎症反应引起的病理。这些活动的净结果是继发于关节软骨侵蚀的关节变性、关节周围软骨内骨化/骨赘病、软骨下的骨硬化和囊肿形成。见，Oettmeier，R.，和K.Abendroth，1989，″Osteoarthritis and bone：osteologic types of osteoarthritis of the hip，″Skeletal Radiol.18：165-74；Cutolo M，Seriolo B，Villaggio B，Pizzorni C，Craviotto C，Sulli A.Ann.N.Y.Acad.Sci.2002 Jun；966：131-42；Cutolo，M.Rheum Dis Clin North Am2000 Nov；26(4)：881-95；Bijlsma JW，Van den Brink HR.Am J Reprod Immunol 1992Oct-Dec；28(3-4)：231-4；Jansson L，Holmdahl R.；Arthritis Rheum2001 Sep；44(9)：2168-75；和Purdie DW.Br Med Bull 2000；56(3)：809-23；也见Merck Manual，17th edition，pp.449-451。本发明的实施方案包括关节炎病症的治疗、减少、抑制或预防，其包括施用治疗有效量的本发明的组合物。另一个实施方案是骨关节炎的治疗、减少、抑制或预防，其包括施用治疗有效量的本发明的组合物。

术语“二膦酸”，如这里所使用的，相当于化学式：

其中R₁独立地选自H、OH和Cl，R₂独立地选自CH₃、Cl、CH₂CH₂NH₂、(CH₂)₃NH₂、CH₂-3-吡啶基、CH₂-S-苯基-Cl、CH₂CH₂N(CH₃)(戊基)、CH₂-咪唑、CH₂-2-咪唑并-吡啶基、N-(环庚基)、CH₂CH(CH₃)₂、(CH₂)₅NH₂、和CH₂-1-吡咯烷基，及其组合。在本发明的实施方案中，R₁是OH和R₂是3-氨丙基部分，因此所得的化合物是4-氨基-1-羟基丁烯基-1，1-二膦酸，即，阿仑膦酸。

本发明的化合物和方法也包括二膦酸的药学上可接受的盐、衍生物，和水合物。盐的非限制性的实例包括选自碱金属、碱性金属、铵和单、二、三、或四-C₁-C₃₀-烷基取代的铵的那些，包括钠、钾、钙、镁和铵盐。衍生物的非限制性的实例包括选自酯和酰胺的那些。在本发明的范围内也包括的是二膦酸的各种水合物和其它溶剂化合物，以及它们的药学上可接受的盐。在本发明的范围内也包括的是阿仑膦酸的水合物，包括但不限于，水含量在约1-12％之间的水合物，以及它们的晶体型。阿仑膦酸和其它二膦酸的水合物的非限制性的实例包括一水合物、二水合物、三水合物、半水合物、1/4水合物、1/3水合物、2/3水合物、3/4水合物、5/4水合物、4/3水合物和3/2水合物。

在本发明中有用的二膦酸的非限制性的实例包括下列：

阿仑膦酸(酸式)，4-氨基-1-羟基丁烯基-1，1-二膦酸。

阿仑膦酸钠(也称作阿仑膦酸钠或阿仑膦酸一钠三水合物，或者由商标FOSAMAX^_表示)，4-氨基-1-羟基丁烯基-1，1-二膦酸一钠三水合物。(阿仑膦酸和阿仑膦酸钠描述于，例如，1990年5月1日授予Kieczykowski等的美国专利4,922,007，和1991年5月28日授予Kieczykowski的美国专利5,019,651)。

环庚氨基亚甲基-1，1-二膦酸，YM175，Yamanouchi(因卡膦酸钠(incadronate)或英卡膦酸钠(cimadronate))，如描述于，例如，1990年11月13日授予Isomura等的美国专利4,970,335。

1，1-二氯亚甲基-1，1-二膦酸(氯屈膦酸(clodronic acid))，和二钠盐(氯屈膦酸二钠，Procter和Gamble)，描述于，例如，比利时专利672,205(1966)和J.Org.Chem 32，4111(1967)。

1-羟基-3-(1-吡咯烷基)-亚丙基-1，1-二膦酸(EB-1053)。

1-羟基乙烷-1，1-二膦酸(羟乙二膦酸)。

1-羟基-3-(N-甲基-N-戊基氨基)亚丙基-1，1-二膦酸，也称作BM-210955，Boehringer-Mannheim(伊本膦酸钠(ibandronate))，描述于，例如，1990年5月22日授予的美国专利No.4,927,814。

[1-羟基-2-咪唑吡啶基-(1，2-a)-3-亚乙基]-二膦酸盐(米诺膦酸钠)。

6-氨基-1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(neridronate)。

3-(二甲氨基)-1-羟基亚丙基-1，1-二膦酸(奥帕磷酸钠(olpadronate))。

3-氨基-1-羟基亚丙基-1，1-二膦酸(帕米膦酸(pamidronate))

[2-(2-吡啶基)亚乙基]-1，1-二膦酸(piridronate)描述于，例如，美国专利No.4,761,406。

1-羟基-2-(3-吡啶基)-亚乙基-1，1-二膦酸(利塞膦酸钠(risedronate))

(4-氯苯基)硫甲烷-1，1-二膦酸(替鲁膦酸钠(tiludronate))描述于，例如，1989年10月24日授予Breliere等的美国专利4,876,248。

1-羟基-2-(1氢-咪唑-1-基)亚乙基-1，1-二膦酸(唑来膦酸(zoledronate))。

在本发明的实施方案中，二膦酸选自阿仑膦酸、其药学上可接受的盐、衍生物和水合物，以及它们的混合物。阿仑膦酸的药学上可接受的盐可选自阿仑膦酸的钠、钾、钙、镁和铵盐，并且可以是阿仑膦酸一钠或其水合物，包括例如阿仑膦酸钠一水合物或阿仑膦酸钠三水合物。

在一个实施方案中，本发明的组合物包括阿仑膦酸钠(4-氨基-1-羟基亚丁基-1，1-二膦酸的一钠盐)，其是含氮二膦酸类药物的一员。

应当注意到，术语“二膦酸”和“二膦酸类”，如这里所使用的在提及本发明的治疗剂时，意思是也包括二膦酸酯、二膦酸(酸式)、和双膦酸(酸式)，以及这些材料的盐、衍生物和水合物。在提及二膦酸或二膦酸类时特殊命名法的使用不意味着限制本发明的范围，除非有特殊说明。由于本领域普通技术人员当前使用混合命名法，因此提及本发明二膦酸化合物的特定重量或百分率是根据酸活性重量，除非这里有其它说明。二膦酸在本发明的剂量范围内所包括的它们的盐、衍生物或水合物型的基础上根据它们的二膦酸酸式活性重量计算。另外，阿仑膦酸的所有水合物型的剂量根据阿仑膦酸酸式活性重量计算。例如，阿仑膦酸和其盐的一水合物、三水合物、半水合物以及所有其它水合物型的剂量，根据它们的阿仑膦酸酸式活性重量计算。如另一个实例，短语“约70mg抑制骨吸收的二膦酸选自阿仑膦酸、其药学上可接受的盐、衍生物和水合物，以及它们的混合物，根据阿仑膦酸活性重量”意思是根据70mg阿仑膦酸酸式计算所选的二膦酸化合物的量。

如整个本说明书和权利要求书中所使用的，术语“二膦酸酸式”和“阿仑膦酸酸式”包括相关的二膦酸型、药学上可接受的盐形式和平衡混合物。该术语包括阿仑膦酸酸式和其药学上可接受的盐的结晶的、水合结晶的以及无定形型。术语“阿仑膦酸酸式”特别包括，但不限于，无水阿仑膦酸一钠、阿仑膦酸一钠半水合物、阿仑膦酸一钠一水合物、阿仑膦酸一钠三水合物、无水阿仑膦酸二钾，以及阿仑膦酸二钾五水合物。美国专利No.6,281,381中公开了阿仑膦酸一钠一水合物和阿仑膦酸钠的其它结晶型。国际专利公开WO 99/20635中公开了阿仑膦酸的钾盐及其水合物。

虽然便于根据二膦酸活性重量给药和计算二膦酸的剂量，但是可根据其它盐或水合物型计算并施用二膦酸剂量。例如，可根据无水利塞膦酸钠(risedronate)盐的重量计算二膦酸利塞膦酸钠(risedronate)的剂量。根据Physician′s Desk Reference(第55版，2664页，(2001))，例如，每个利塞膦酸钠(risedronate)片剂含有5mg或30mg无水利塞膦酸(risedronate)钠，以具有少量一水合物的半五水合物的形式。

如这里所使用的术语“胆钙化固醇颗粒”指含有胆钙化固醇的颗粒并也可含有前维生素D₃、维生素D₃的异构体、转酯化的维生素D₃或其异构体和/或另外的赋形剂。

术语“连续的时间表”或“连续的给药时间表”，如这里所使用的，意思是重复给药方案直到达到期望的治疗效应。连续的时间表或连续的给药时间表不同于周期性的或间歇性的施用。

术语“Dry维生素D₃100颗粒”，如这里所使用的，指由BASF在商业上销售的，明胶包被的，药物级颗粒的Dry维生素D₃100。

术语“普遍地骨丢失”，如这里所使用的，意思是在多个骨骼部位或整个骨骼系统中的骨丢失。术语“局限化的骨丢失”，意思是在一个或多个特定的、明确的骨骼部位的骨丢失。

术语“需要治疗的人”，“需要预防的人”，“需要其的人”，和“有其风险的人”，如这里所使用的，指由临床医生或研究者所决定的需要治疗疾病情况，需要预防、减轻、抑制或减少疾病情况，或者有发展疾病情况的风险的人。

术语“IU”，如这里所使用的，意思是国际单位。当叙述维生素D的效能和剂量时习惯使用国际单位(IU)。将一个国际单位(IU)定义为0.025μg晶状国际标准或纯的维生素D的特定的生物活性。以另一种方式叙述，1毫克维生素D是大约40国际单位。

术语“需要治疗的哺乳动物”、“需要预防的哺乳动物”、“需要其的哺乳动物”、和“有其风险的哺乳动物”，如这里所使用的，指由临床医生或研究者所决定的需要治疗疾病情况，需要预防、减轻、抑制或减少疾病情况，或者有发展疾病情况的风险的哺乳动物。

“每周一次剂量”，如这里所使用的，意思是单位剂量，例如一周施用一次单位剂量的二膦酸和维生素D化合物，即，在7天周期中施用一次，优选地在每周的同一天。在每周一次的剂量方案中，通常约每7天施用单位剂量。每周一次剂量方案的非限制性的实例将需要每个星期日施用单位剂量的二膦酸和维生素D化合物。习惯上建议不连续几天施用每周一次施用的单位剂量，但每周一次的剂量方案可包括在两个不同的每周一次周期内的连续两天施用单位剂量的剂量方案。

如这里所使用的“骨赘”指位于关节边缘的新形成的骨结构，它们的发生与骨关节炎进展的晚期非常有关。当前的假说是骨赘起源于导致产生新软骨的活化的骨膜，最后通过软骨内骨形成的过程变成骨。

如这里所使用的，对于二膦酸(如阿仑膦酸)的盐、酯、水合物和衍生物，“药学上可接受的”意思是二膦酸的盐、衍生物或水合物具有与从其衍生的游离酸形式相同的一般药学特性并且从毒性观点上是可接受的。

术语“药学上有效的量”，如这里所使用的，意思是当根据治疗方案施用时将引起期望的治疗效应或反应的化合物，例如二膦酸化合物或维生素D化合物的量。二膦酸的药学上有效的量，例如，是根据治疗方案所施用的足以引起例如，异常骨吸收的预防、减少、抑制或治疗的量。

术语“药物级”，如这里所使用的，意思是足够的品质和效能以至于符合生效的美国药典(USP)和欧洲药典(Ph.Eur.)大纲级的要求。尽管现在没有配制的维生素D₃产品的USP专论，但是已经公开了生性的欧洲药典专论。“药学级”胆钙化固醇，例如，通常是优于常用于营养补充物的维生素D的等级。

术语“预防、抑制、减少或治疗”，如这里所使用的，包括通过破骨细胞形成或活性的直接或间接改变解决异常骨吸收(和产生的生理情况，例如骨质疏松)，以及包括骨丢失的预防、抑制、减少或治疗，尤其是通过破骨细胞形成或活性的直接的或间接的改变，抑制从矿化阶段和/或有机基质阶段除去存在的骨质。这些术语也意味着以这种方式解决其它疾病状态或情况以至于促进疾病或情况的缓解。

术语“直到达到期望的治疗效果”，如这里所使用的，意思是根据所选的给药时间表施用组合物，例如，二膦酸和胆钙化固醇组合物，或者随后的治疗过程，直到临床医生或研究者观察到疾病或情况所寻找的临床或医学效应的时候。对于本发明的治疗方法，可以连续地施用二膦酸化合物直到观察到骨量或结构的期望的改变。在这种情况中，达到骨量增加、预防骨量进一步减少或者用更多的正常的骨结构取代异常的骨结构是期望的目标之一。对于本发明的方法，可连续施用必要长时间的二膦酸化合物以预防不期望的情况。在这种情况中，骨量密度的维持常常是目的。施用周期的非限制性的实例可从约2周到哺乳动物的剩余寿命。对于人，施用周期可从约2周到人的剩余寿命，优选地从约2周到约40年，更优选地从约1个月到约35年，更优选地从约6个月到约30年，最优选地从约1年到约20年。

术语“维生素D”，如这里所使用的，意思是具有图3所示化学结构的维生素D₂和维生素D₃。短语“维生素D的代谢产物”和“维生素D的衍生物”，如这里所使用的，意思是维生素D₂和维生素D₃的代谢产物和衍生物。术语“维生素D化合物”，如这里所使用的，意思是维生素D₂(麦角钙化固醇)和维生素D₃(胆钙化固醇)、7-脱氢胆固醇和前维生素的D₂和前维生素D₃，以及7-脱氢胆固醇、维生素D₂、维生素D₃、前维生素D₂、或前维生素D₃中任何一种的异构体或酯，或者它们的混合物。在相应的生理温度时，维生素D₂和维生素D₃与它们各自的前维生素异构体处于平衡，尽管改变该平衡有利于维生素D₂和维生素D₃。在本发明中，术语“维生素D化合物”不包括维生素D的代谢产物，如，例如，25-羟胆钙化固醇或钙三醇或它们的类似物，该术语也不包括活性激素钙三醇或其类似物。术语维生素D₃和胆钙化固醇，这里可交换地使用，除非有其它清楚地说明。

本发明提供包括二膦酸，或者二膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物，以及维生素D化合物的组合物。在示例性的实施方案中，二膦酸化合物选自阿仑膦酸钠、阿仑膦酸钠一水合物或阿仑膦酸钠三水合物，以及维生素D化合物是胆钙化固醇。

二膦酸和维生素D化合物的精确剂量将随给药时间表、所选的特定二膦酸的口服效能、哺乳动物或人的年龄、大小、性别和情况、将要治疗的障碍的性质和严重性，以及其它相关的医学和身体因素而变化。因此，不能预先指定精确的药学上有效的量，但是可很容易地由照顾人(caregiver)或医生确定。可通过动物模型和人类临床研究的常规实验确定适当的量。通常，根据连续的给药时间表选择药学上有效量的二膦酸，直到达到期望的治疗效果。对于人，二膦酸的有效的口服剂量对于75公斤受试者一般地约0.0001mg/kg-约100mg/kg体重，优选地约0.0005-约20mg/kg体重。

在本发明的实施方案中，选自适当量的维生素D化合物以便在给药间隔期间提供足够的维生素D营养而不干扰二膦酸获得骨吸收抑制效应的能力。对于包括阿仑膦酸，阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或它们的混合物，以及维生素D化合物的本发明的口服组合物，维生素D化合物的量包括约100IU-约60,000IU。本发明的实施方案中的维生素D化合物的口服量的非限制性实例包括，但不限于，700、1,400IU、2,800IU、4,200IU、5600IU、7,000IU、8,400IU、14,000IU、28,000IU、36,000IU和60,000IU剂量的维生素D化合物。

对于包括维生素D化合物和药学上有效量的阿仑膦酸，或者阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或它们的混合物的口服组合物，阿仑膦酸的口服的药学上有效的量一般地包括根据阿仑膦酸重量的约0.05mg-约1120mg阿仑膦酸化合物。本发明实施方案中的口服的药学上有效量的阿仑膦酸的非限制性的实例包括，但不限于，约2.5mg、5mg、8.75mg、10mg、17.5mg、35mg、40mg、70mg、140mg、280mg、560，和1120mg剂量的阿仑膦酸，每一剂量都是根据阿仑膦酸重量。

一般地以具有根据口服施用的剂型适当地选择的，合适的药学稀释剂、赋形剂或载体的混合物施用本发明的二膦酸和维生素D组合物。口服剂型的实例包括片剂(包括压缩的、包被的或未包被的)、胶囊(其中的每一个包括持续释放或定时释放制剂)、硬的或软的明胶胶囊、丸、丸剂、粉剂、颗粒、酏剂、酊剂、浆液、泡腾剂组合物、软片、无菌溶液或悬浮液、糖浆和乳剂等等。同样地，也可以以药学领域普通技术人员公知的所有使用静脉内(推注或输注)、腹膜内、局部(例如，眼泪)、鼻内、吸入、皮下、肌肉内或经皮(例如，膜片)形式，计量气雾剂或液体喷雾、滴剂、安瓿、自动注射器装置或栓剂的形式施用。可使用有效的但无毒量的期望的组合物。组合物打算用于口服、肠胃外、鼻内、舌下或直肠施用，或者用于通过吸入或吹入施用。可方便地通过本领域的已知方法，例如，如在 Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，1995中所描述的方法影响根据本发明的组合物制剂。

例如，对于以片剂、胶囊、丸或粉剂形式的口服施用，可将活性成分结合口服的，无毒的，药学上可接受的惰性载体如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇、交联羧甲基纤维素钠，等等；对于以液体形式的口服施用，例如，酏剂、糖浆、浆液、乳剂、悬液、溶液和泡腾剂组合物，可将口服药物成分结合任何口服的，无毒的，药学上可接受的惰性载体如，乙醇、甘油、水，等等。此外，当期望或必要时，也可掺入适当的粘合剂、填充物、润滑剂、压缩助剂、崩解剂、缓冲液、包衣，以及着色剂。适当的粘合剂可包括但不限于淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β乳糖，以及玉米增甜剂、天然的和合成的树胶，如阿拉伯树胶、西黄蓍糖或藻酸钠、羟甲基纤维素、聚乙二醇、蜡，等等。用于这些剂型中的润滑剂可包括，但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠，等等。适当的崩解剂可以是几种修饰的淀粉或修饰的纤维素聚合物之一，包括交联羧甲基纤维素钠。稀释剂，其可用作压缩助剂，包括，但不限于，乳糖、磷酸二钙、纤维素、微晶纤维素，等等。本发明中也可利用改善粉剂混合物的流动特性的助流剂(glidant)。助流剂的实例包括，但不限于，胶体二氧化硅、滑石粉，等等。也可将本发明中所使用的组合物与作为可定向的药物载体的可溶性聚合物偶联。这种聚合物可包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、多羟基丙基甲基丙烯酰胺，等等。也可利用另外的赋形剂，如在美国专利5,358,941；美国专利5,882,656和PCT公开WO 95/29679中所描述的那些。

本发明的实施方案，例如，是80mg-1500mg片剂，包括约0.5％-约90％重量的阿仑膦酸钠、约1％-约70％重量的胆钙化固醇颗粒(等于约0.0005％-约20％重量的胆钙化固醇)、约10％-约80％重量的无水乳糖、约5％-约50％重量的微晶纤维素、约0.1％-约5％重量的胶体二氧化硅、约0.5％-约10％重量的交联羧甲基纤维素钠，以及约0.5％-约5％重量的硬脂酸镁。

Dry维生素D₃100颗粒的重量范围是确保每个片剂中2800IU效能，因为该颗粒含有每克100,000IU-110,000IU维生素D₃的效能范围。为了维持最终片剂的重量为325mg，根据添加到片剂中的Dry维生素D₃100颗粒的量调整无水乳糖的量。这里，包括在下面实例中描述本发明的包括二膦酸化合物，如阿仑膦酸和维生素D化合物的口服组合物的其它非限制的实例。Dry维生素D₃100颗粒每克颗粒含有重量约100,000IU维生素D₃。因此，28mg Dry维生素D₃100颗粒含有约2800IU维生素D₃，其等于约70μg维生素D₃。

本发明，包括这里所描述的实施方案的二膦酸/维生素D组合物，可在每周一次、每两周一次、每月一次、每月两次，以及每两月一次的间隔施用。对于每周一次服用的本发明的组合物，阿仑膦酸的口服的药学上有效的量包括约0.05mg-约1120mg阿仑膦酸化合物，根据阿仑膦酸的重量。提供每周一次口服的药学上有效量的阿仑膦酸的本发明的实施方案包括，但不限于，用于预防骨质疏松的单位剂量，包括维生素D化合物和约35mg-约70mg阿仑膦酸化合物；用于治疗骨质疏松的单位剂量，包括维生素D化合物和约70mg阿仑膦酸化合物；用于治疗Paget病的单位剂量，包括维生素D化合物和约280mg阿仑膦酸化合物；以及用于治疗转移性骨病的单位剂量，包括维生素D化合物和约280mg阿仑膦酸化合物。

对于每周一次给药，本发明的二膦酸/维生素D组合物中药学上有效量的维生素D化合物包括约100IU-约60,000IU维生素D。因此，在本发明的一个实施方案中，组合物包括约100IU-约5,600IU维生素D化合物，以及药学上有效量的阿仑膦酸，阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物。在另一个实施方案中，阿仑膦酸的药学上可接受的量包括约0.05mg-约1120mg的阿仑膦酸，根据阿仑膦酸活性，阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物。

对于每两周一次或每两月一次给药，本发明的二膦酸/维生素D组合物中药学上有效量的维生素D化合物包括约100IU-约60,000IU维生素D。在本发明的一个实施方案中，组合物包括约100IU-约8,400IU维生素D化合物，以及药学上有效量的阿仑膦酸，阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物。在另一个实施方案中，阿仑膦酸的药学上可接受的量包括约0.05mg-约1120mg的阿仑膦酸，根据阿仑膦酸活性，阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物。

对于每月一次给药，本发明的二膦酸/维生素D组合物中药学上有效量的维生素D化合物包括约100IU-约36,000IU维生素D。在本发明的一个实施方案中，组合物包括约100IU-约11,200IU维生素D化合物，以及药学上有效量的阿仑膦酸，阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物。在另一个实施方案中，阿仑膦酸的药学上可接受的量包括约0.05mg-约1120mg的阿仑膦酸钠，根据阿仑膦酸活性，阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或者它们的混合物。

本发明也包括预防、减少、抑制和治疗与异常骨吸收有关的疾病和情况的方法，如骨质疏松。患骨质疏松的患者，即，具有低于绝经前妇女标准的至少约2个或2.5个标准差的骨矿物密度(BMD)，将是根据本发明方法施用本发明组合物的候选者。已发现以每周一次剂量到高于每日剂量的7倍或更多倍剂量施用的维生素D₃，可同时与二膦酸，如阿仑膦酸共同施用，不相反地影响二膦酸的生物利用率。见，例如，实施例7。本发明的方法没有当前在二膦酸治疗期间需要笨重的、无规律的，或复杂的给药方案以提供充分的维生素D的治疗方法的缺点。

结果，本发明的组合物，如包含二膦酸化合物(例如，阿仑膦酸钠)和维生素D化合物的组合物将对所有对包括阿仑膦酸或其它二膦酸而无维生素D化合物的组合物有效的适应征有效。本发明的方法和组合物可用于减少或抑制骨吸收，以及用于治疗、减少、抑制或预防异常骨吸收，和与其有关的情况。本发明的组合物可因此用于人类和其它动物以提高骨量以及预防、抑制、减少和治疗下列情况和疾病状态：骨丢失；骨质疏松，包括但不限于，绝经后的骨质疏松、类固醇诱导的骨质疏松、男性骨质疏松、疾病诱导的骨质疏松、原发性骨质疏松，以及糖皮质激素诱导的骨质疏松；骨坏死、Paget病；骨关节炎；类风湿性关节炎、其它关节炎病症、异常增加的骨更新；与假体周围骨质丢失或骨质溶解有关的局部骨丢失；骨折；转移性骨病；Gaucher病；无血管的坏死；多骨纤维性结构不良；Charcot关节；寄生物障碍；成骨不全；高胱氨酸尿；赖氨酸尿性蛋白不耐受症；Turner综合征；固定术；进行性骨化性纤维性结构不良；骨不完全性纤维发生；牙周病；牙齿丢失；恶性肿瘤的高钙血症；多发性骨髓瘤；骨质减少，包括但不限于，固定术诱导的骨质减少和由于骨转移瘤引起的骨质减少；以及可能与异常骨吸收有关的其它骨病和情况。

本发明涉及本发明的组合物用于制备可用于治疗、减少、抑制或预防关节炎病症的药物的用途。本发明也涉及本发明的组合物和选自雄激素受体调节剂；破骨细胞质子ATP酶的抑制剂；HMG-CoA还原酶的抑制剂；破骨细胞合成代谢剂；降钙素；维生素K₂或药学上可接受的盐和它们的组合的试剂用于制备可用于治疗关节炎病症的药物的用途。

在本发明的实施方案中，关节炎病症是淀粉样变性；强直性脊柱炎；细菌性关节炎；碱性钙磷晶体沉积病；Behcet病；滑囊炎和腱炎；CPPD沉积病；钙化腱炎；腕管综合征；Ehlers-Danlos综合征；肠炎性(enteropathic)关节炎；Felty综合征；纤维肌痛；痛风；真菌性关节炎；血红蛋白病；血友病性关节病；肥大性骨关节病；传染性关节炎；炎性肠病；幼年关节炎；幼年类风湿性关节炎；红斑狼疮；lyme病；marfan综合征；混合性结缔组织病；多中心性网状组织细胞瘤病，肌病；肌炎；骨关节炎；骨坏死；骨坏死软骨营养障碍；多动脉炎；多肌痛风湿病；银屑病性关节炎；Raynaud现象；反射交感神经营养障碍综合征；Reiter综合征；复发性多软骨炎；类风湿性关节炎；风湿热；结节病；脓毒性关节炎；硬皮病；Sjogren综合征；脊柱骨骺发育不良；系统性红斑狼疮；以及病毒性关节炎。

本发明的一个实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗、减少、抑制或预防骨关节炎进展的方法，包括向哺乳动物施用治疗有效量的本发明的组合物。在文献中已知骨关节炎伴随关节的明确改变，包括关节软骨表面的腐蚀、关节周围软骨内骨化/骨赘病，以及软骨下的骨硬化和囊肿形成。见Oettmeier R，Abendroth，K，“Osteoarthritis andbone：osteologic types of osteoarthritis of the hip，”SkeletalRadiol.1989；18：165-74。最近，已提出软骨下骨硬化对骨关节炎的引起和发展的潜在作用。作为对重复冲击负荷的关节反应的变硬的软骨下骨，较少能减弱和分配通过关节的压力，使穿过关节软骨表面的机械压力更大。这反过来加速软骨磨损和形成原纤维。见Radin，EL和Rose RM，“Role of subchondral bone in the initiation andprogression of cartilage damage，”Clin.Orthop.1986；213：34-40。通过本发明组合物抑制过度的关节下骨的吸收可导致抑制软骨下骨更新，并且因此可对骨关节炎进展产生有利的影响。

本发明的另一个实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗、减少、抑制或预防类风湿性关节炎病症的方法，包括向哺乳动物施用治疗有效量的本发明的组合物。在文献中已知关节周围骨的进行性破坏是患类风湿性关节炎患者关节机能障碍和残疾的主要原因。见Goldring SR，“Pathogenesis of bone erosions in rheumatoid arthritis”Curr.Opin.Rheumatol.2002；14：406-10。另外，普遍地骨丢失是与严重的类风湿性关节炎有关的病态(morbility)的主要原因。在患慢性类风湿性关节炎的患者中髋部和脊椎骨折的频率基本上增加。见Gould A，Sambrook，P，Devlin J等，“Osteoclastic activationis the principal mechanism leading to secondary osteoporosisin rheumatoid arthritis，”J.Rheumatol.1998；25：1282-9。在关节下骨的吸收和普遍骨丢失的治疗或预防中使用抗吸收剂，代表对类风湿性关节炎进展的合理的药理学干预的方法。因此，可使用包括二膦酸化合物和维生素D化合物的本发明的组合物用于治疗、减少、抑制或预防与类风湿性关节炎和其它骨关节炎病症有关的骨丢失。

更普遍地，认为可在同一制剂中与维生素D一起给予二膦酸，无不利地影响二膦酸的生物利用率。此外，认为可在同一制剂中与二膦酸一起给予更低剂量的维生素D和更高剂量的维生素D，不反向影响二膦酸的生物利用率。作为实例，认为当在本发明的组合物中与二膦酸联合施用时，每周一次2800IU剂量的维生素D是有效的。也已知可用维生素D₂替换维生素D₃，具有与维生素D₃类似的结果。因此，在同一制剂中与二膦酸化合物一起施用维生素D化合物将消除在二膦酸治疗期间单独服用维生素D的需要并且提供维生素D营养，不反向影响二膦酸的生物利用率和效能。

患者将从维生素D和二膦酸组合中受益，因为其提供额外的维生素D营养以便于正常的骨形成和矿化并且提高二膦酸治疗的效能。从患者生活方式和顺从观点看，本发明的方法也将比具有每日另外施用维生素D的二膦酸的每日或周期性给药方案更方便。由于本发明，患者可不再需要每日单独服用维生素D以从额外的维生素D营养中获益，因为本发明提供每周一次剂量的维生素D。患者将不必进行单独施用二膦酸和维生素D的复杂的给药方案。最后，患者将较少频繁地经历必需在空腹服用二膦酸化合物并且在服药前或后必需禁食至少30分钟的不便。本发明的方法因此可能具有提高更好的患者顺从，并且其反过来可转化成更好的治疗效能的优点。

也认为二膦酸/维生素D组合物也将较少刺激食管，以及胃肠系统。由于阿仑膦酸可潜在地穿透分层的鳞状上皮的基底层(例如，通过其自身的穿透或者通过穿透到由粗糙的食物或其它试剂所致的局部损伤的部位)，其可能导致角质形成细胞生长的抑制，如通过其在体外对角质形成细胞生长的影响所提示的。见，A.A.Reszka等，Mol.Pharmacol.，2001；59(2)：193-202。生长的抑制将减缓上皮修复的过程，因此导致局部刺激或溃疡。用放射性1，25(OH)₂维生素D₃喂养的大鼠的放射自显影图的确显示在食管的上皮中维生素D受体表达的证据。见Stumpf，WE，等，Histochemistry，1987；87(1)：53-8。水平低于在甲状旁腺中所见到的。

因此，认为活性维生素D₃代谢产物(例如，1，25(OH)₂-胆钙化固醇或钙三醇)与阿仑膦酸的共同施用可通过其对角质形成细胞的分化的影响加剧食管的刺激。已观察到钙三醇和25-OH-胆钙化固醇通过抑制生长和诱导分化，影响角质形成细胞。见K.Matsumoto等，Biochem.Biophys.Acta.，1991；1092(3)：311-8。角质形成细胞分化与细胞周期停滞(生长停滞)有关，因此阿仑膦酸与活性维生素D代谢产物的结合将对抑制基底层的生长具有协同效应。这可能反过来导致更大的刺激效应。因为口服维生素D₃(胆钙化固醇)需要在肝脏以及然后在肾脏中活化，因此认为其可能不引起与活性代谢产物相同的局部刺激效应。

另外，可能活性维生素D₃激素的正常生理水平可帮助身体力图修复由急性暴露于阿仑膦酸所诱导的局部刺激的部位。因为与阿仑膦酸联合施用口服的维生素D₃，以及因为老年人群的大部分是维生素D₃缺陷的，因此这可更好地使身体加速康复过程。

也认为维生素D/二膦酸组合物可用于摇摆的预防或治疗。另外，认为维生素D/二膦酸组合物可用于减少跌倒。认为维生素D/二膦酸组合物将在老年人中增加肌肉强度，改善神经肌肉功能，减少身体摇摆并改善身体机能。这将导致减少跌倒的风险并且因此有助于减少骨折的风险。流行病学研究证明在美国在老年人中维生素D缺乏非常普遍。见A.N.Exton-Smith等，Lancet 1966；2：999-1001；RP Heaney等，Osteoporos Int 2000；11：553-5；MJ McKenna，Am J Med1992；93：69-77；ST Haden等，Calcif Tissue Int 1999；64：275-9。有维生素D对骨骼外组织影响的证据。见Latham等，2003；51：1219-1226。另外，已经在肌肉组织鉴定了维生素D受体，肌肉虚弱、四肢疼痛和身体机能削弱是公认的严重的维生素D缺乏的表现。

许多预期的、随机的干预研究证明维生素D改善肌与骨骼的功能并减少跌倒风险的效能。已证明用维生素D，以及钙的治疗减少非椎骨骨折的发生率和减少姿式摇摆以及可能减少跌倒的发生率。见J.K.Dhesi等，Age and Aging 2002；31：267-271。另外，已经证明通过用阿法骨化醇(alfacalcidol)(1-α-羟基维生素D₃)，和最低的钙摄入量的治疗可显著减少住在老年社区患者的跌倒的次数。见L.Dukas等，JAGS 2004；52：230-236。

也认为维生素D/二膦酸组合物将提高钙的吸收。已经有在绝经后妇女中利用维生素D的活性代谢产物检查对部分钙吸收的阳性影响的研究。见M.L.Holzherr等，Osteoporosis Int 2000；11：43-51；J.C.Gallagher等，J.Clin.Endocrinol.Metab.，1980；51(5)：1359-64。也已经在大鼠模型中证明二膦酸提高肠的钙吸收。见P.Ammann等，J Bone Miner Res1993；8(12)：1491-8；H.FleischOsteoporos Int 1996；6：166-70；J-P Bonjour Endocrinol Metab1988；17：E260-E264。然而，认为维生素D化合物和二膦酸的组合物将提高钙的吸收，高于维生素D或二膦酸每种单独施用的相加效应。另外，认为胆钙化固醇和阿仑膦酸的组合物将比维生素D的活性型和不同二膦酸的组合更高地提高钙的吸收。钙吸收的这种提高将与骨折风险减少相关。

本发明也提供由维生素D化合物和二膦酸化合物组成的组合物用于制造在哺乳动物如人中治疗、减少、抑制或预防上面所鉴定的情况和疾病状态的药物的用途，其中二膦酸化合物包括药学上有效量的至少一种二膦酸，或者二膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物，以及一种或多种活性成分。

在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物也可包括组胺H2受体阻滞剂(即，拮抗剂)和/或质子泵抑制剂，其是公知的用于提高胃pH的治疗剂。见，例如，L.J.Hixson，等，Current Trends inthe Pharmacotherapy for Peptic Ulcer Disease，Arch.Intern.Med.，vol.152，pp.726-732(April 1992)。发现在本发明中按顺序口服组胺H2受体阻滞剂和/或质子泵抑制剂，随后口服二膦酸和维生素D组合物可帮助将不利的胃肠影响降到最低。在本发明的一个实施方案中，在施用二膦酸和维生素D组合物前约30分钟-约24小时，或者在约30分钟-约12小时前施用组胺H2受体阻滞剂和/或质子泵抑制剂。组胺H2受体阻滞剂和/或质子泵抑制剂的剂量将取决于所选的特定化合物和与将要治疗的哺乳动物有关的因素，即，大小、健康，等等。组胺H2受体阻滞剂和/或质子泵抑制剂的非限制性的实例包括选自西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁(famotidine)、尼扎替丁(nizatidine)、雷尼替丁(ranitidine)、奥美拉唑(omprazole)和兰索拉唑(lansoprazole)的那些。

本发明进一步包括制造本发明组合物的方法，包括例如包括二膦酸化合物和维生素D化合物的药物组合物。在一个实施方案中，制备阿仑膦酸钠-胆钙化固醇制剂的方法，包括：制备包括阿仑膦酸的粉剂混合物；压紧粉剂混合物以形成阿仑膦酸混合物；碾磨并将阿仑膦酸混合物与胆钙化固醇颗粒混合以形成混合物；以及润滑并压缩混合物。在另一个实施方案中，制备阿仑膦酸-胆钙化固醇固体剂型的方法包括：将阿仑膦酸、胶体二氧化硅、无水乳糖、微晶纤维和交联羧甲基纤维素钠混合以形成预混合物；将预混合物和硬脂酸镁混合以形成第一润滑的混合物；滚筒压紧第一润滑的混合物以形成压紧的带状物；碾磨压紧的带状物以形成润滑的混合物；将润滑的混合物与胆钙化固醇颗粒混合以形成第二润滑的混合物；以及压缩第二润滑的混合物形成固体剂型。

图4描述本发明的用于制造本发明二膦酸/维生素D组合物方法的实施方案的流程图。在该实施方案中，通过包括滚筒压紧阿仑膦酸钠制剂以形成带状物、碾磨从滚筒压紧步骤所产生的带状物以及然后与维生素D₃制剂的颗粒外(extragranular)添加剂混合的方法制备组合物。使用，例如，实施例1中所鉴定的活性成分和赋形剂，该制剂和方法导致满足产品释放以及阿仑膦酸和维生素D₃的稳定性的控制要求的产品。如在图4中所示，在该实施方案中，在步骤301中制备胶体二氧化硅、无水乳糖和阿仑膦酸钠的预混合物。如步骤302所描述的，然后将预混合物与微晶纤维素和交联羧甲基纤维素钠混合。在步骤303中，添加硬脂酸镁以形成润滑的混合物。将润滑的混合物通过滚筒压紧器(compactor)并且碾磨压紧的带状物，如在步骤304中所示。在图4所描述的实施方案中，然后在步骤305中添加含有约2800IU(或约70μg的等同物)维生素D₃的维生素D₃颗粒并与碾磨的颗粒混合，具有根据进入的颗粒分析和从滚筒压紧/碾磨步骤的产量所调整的维生素D₃颗粒电荷数量。然后在步骤306中压缩所得的混合物以形成片剂并将压缩的片剂除尘。可将所得的片剂包装在适当的包装中，包括例如防潮和避光泡眼包装或瓶。

维生素D₃(胆钙化固醇)和维生素D₂(麦角钙化固醇)是不溶于水、疏水的化合物，熔点分别是约84℃和约115℃。这些化合物也非常易于氧化并且不耐光，分解成各种降解产物。维生素D颗粒也易于分离。维生素D的稳定性因此受维生素D/二膦酸组合物的加工的程度和性质以及贮藏条件(例如，接触光、高温，以及高相对湿度)的影响。结果，渴望在本发明的组合物中包括维生素D，在涉及发展制造和贮藏含维生素D组合物的方法的范围提出了特殊的挑战。因此，在加工期间和在贮藏期间需要配制维生素D/二膦酸组合物以便减少维生素D的降解。也需要制造这些稳定组合物的方法。另外，需要发展检测或测量含维生素D的组合物，如本发明的那些中维生素D降解的方法。另外，因为特定维生素D降解物(degradant)的水平可能非常小(在纳克级)，所以需要发展测量或检测含维生素D的组合物，如本发明的那些中维生素D降解的方法，具有足以检测维生素D降解物量的定量限度(LOQ)。

因此，本发明也提供制造包括二膦酸化合物和维生素D化合物的组合物的方法，其将制造期间维生素D化合物的丢失降到最低。通过控制制造期间的湿度、维生素D形成期间存在的温度和光或者提供适当的成品剂型包装，可减少维生素D的丢失而充分维持其效能。在本发明的一个实施方案中，制造过程期间的温度小于或等于约35℃。在另一个实施方案中，温度在约20℃-约30℃之间。在一个实施方案中，制造过程期间的相对湿度小于或等于约60％RH。在另一个实施方案中，相对湿度是在约20％-约40％之间。另外，可能不仅控制制剂的维生素D成分的起始湿度水平，而且也控制可能存在的任何赋形剂的起始湿度水平。在另一个实施方案中，相对湿度是在约25％-约35％之间。

本发明也包括制造的方法，其包括另外的干燥步骤。因此，作为另一个实施方案，可在与上述不同的条件(温度和/或相对湿度)下制造本发明的组合物，可通过干燥组合物减少所制造的组合物的含水量。在一个实施方案中，干燥可包括在产生固体剂型后干燥(用，例如，热)本发明的组合物。在另一个实施方案中，干燥可包括本发明组合物的固体剂型(例如，片剂)的薄膜包被。在另一个实施方案中，干燥可包括用适当量的干燥剂或其它部分包装本发明的组合物以减少含水量。在另一个实施方案中，干燥可包括以减少湿度和/或光的贮藏形式(例如，铝泡眼包装、防潮瓶)储存本发明的组合物。

在本发明的实施方案中，用作起始材料的维生素D化合物可包括维生素D的自由流动的、稳定的颗粒。在实施方案中，在本发明的制造方法中用作起始材料的维生素D颗粒是由BASF销售的，明胶包被的，药物级的，Dry维生素D₃100。将维生素D的颗粒溶于包埋在明胶和蔗糖的淀粉包被的基质中的1-2μm液滴的中等链甘油三酯。然后可用叔丁基羟基甲苯(BHT)稳定溶解的维生素D。维生素D颗粒含有硅酸铝钠作为助流剂。本领域普通技术人员将懂得，可根据维生素D的来源和/或添加的维生素D的效能需要调节添加到组合物中的维生素D的量。例如，如果利用明胶包被的，药物级，Dry维生素D₃100(BASF)，那么普通技术人员将会理解，颗粒可具有不同的效能(例如，100,000IU/g或105,000IU/g或110,000IU/g)，为了达到组合物中2800IU或5600IU的维生素D，将需要调整添加到组合物中的颗粒的量。

本发明实施方案中所含有的维生素D符合欧洲药典(Ph.Eur.)胆钙化固醇浓度(粉剂)专论认可的标准。尽管直到这时没有配制的维生素D₃产品的USP专论，但是已经公开了生效的欧洲药典专论。在本发明组合物的实施方案中所使用的维生素D化合物的组合物中的非活性成分(例如，中等链甘油三酯、丁基化的羟基甲苯、蔗糖、明胶、改性淀粉以及硅酸铝钠)是大纲级(compendial)或食品级的材料。

在本发明的方法和组合物的实施方案中，用作起始材料的阿仑膦酸是购自Merck & Co.，Inc.的大纲级阿仑膦酸钠一水合物，或者大纲级阿仑膦酸钠三水合物。

另外，通过可商业途径获得的维生素D颗粒可用于本发明的组合物，如可从Roche、BASF或Solvay获得的那些。

在另一个实施方案中，本发明提供用于方便地和有效地进行本发明方法的试剂盒。这种试剂盒尤其适合给予固体口服剂型如片剂或胶囊并且在实施方案中包括许多具有朝向它们期望用途的剂量的单位剂量卡片。这种试剂盒的一个实例是“泡眼包装”。泡眼包装是包装工业中公知的并且广泛用于包装药物单位剂型。如果期望的话，可提供记辅助物，例如以数字、字母或其它标记的形式或者用日历插页，标明治疗时间表中的可施用剂量的时间。可选择地，可包括安慰剂剂量，或者钙或饮食补充物，以与二膦酸和维生素D单位剂量类似的或不同的形式，以提供每天服用剂量的试剂盒。在包括组胺H2受体和/或质子泵抑制剂的那些实施方案中，可包括这些试剂作为试剂盒的一部分。

本发明也提供为了测量本发明的维生素D₃化合物的降解产物而发展的检测方法。具体地，测量药物组合物的降解的方法可包括从组合物中提取胆钙化固醇到第一溶液中以形成第二溶液，从第二溶液中分离含有胆钙化固醇的样本，以及通过将样本进行反相HPLC分离检测样本中胆钙化固醇的量。进行本发明的检测方法以检测每个药物组合物中约2800IU-约5600IU胆钙化固醇。另外，检测方法具有小于约9ng/mL胆钙化固醇的胆钙化固醇的定量限度(LOQ)。

在一个实施方案中，该方法利用包括水、醇、乙腈或它们的混合物的第一溶液。在一个具体的实施方案中，第一溶液含有约5％水和约95％甲醇。可从每片含有2800IU维生素D的15个片剂中提取示例性的样本制剂到50mL约5％水和约95％甲醇中。也在一个实施方案中，可将所得的溶液搅拌约10分钟，超声处理约30分钟，然后再搅拌3小时。在一个实施方案中，可通过离心进行样本的分离，其可约5,000rpm-约15,000rpm。在一个实施方案中，柱是PhenomenexPhenosphere 80_ODS(1)柱(150×4.6mm，3μm)，注射体积是100μL。将样本沿柱洗脱并且然后检测。在该方法的一个实施方案中，可使用65分钟梯度。也可使用约260nm-约265nm的检测波长。在该方法的一个实施方案中，在约25℃的反相HPLC柱温度完成检测步骤。可使用约5℃的样本盘温度。在一个实施方案中，检测步骤包括反相HPLC分离，使用约99％乙腈和约1％的0.025％磷酸的洗脱液。

在一个实施方案中，可在本发明的方法中使用的反相HPLC柱包括仅部分末端加帽(endcapped)或没有末端加帽的柱。末端加帽过程减少固定相上的游离硅烷醇基，因此，其影响前维生素D和维生素D峰之间的分离。尝试使用末端加帽柱在提供对本发明的分析方法充分的峰分辨率中不成功，因为将不能分辨并定量两个活性分子之间的任何洗脱的降解物。的确，在用于本发明方法的鉴别柱中，观察到维生素D₃异构体(0.96RRT)作为在制剂中所发现的两个活性分子之间的洗脱。更多的使用其它末端加帽柱的方法发展都显示前维生素D₃和维生素D₃峰之间有限的分辨率。

柱碳负荷对四种维生素D₃酯加合物的洗脱有影响，其是前维生素D₃或维生素D₃和中等链甘油三酯(C₈和C₁₀脂肪酸酯存在于可在本发明的组合物和方法中使用的BASF维生素D颗粒)之间酯基转移的产物。这些酯可通过酯基转移机理与维生素D₃的羟基反应以形成C₈-D₃和C₁₀-D₃酯。由于长脂肪酸链，因此这些酯非常疏水并且与C₁₈固定相相互作用。具有更高碳负荷的柱具有更高的C₁₈固定相；因此，其与酯的相互作用更强并且将酯更长时间地保留在柱上。因此，在本发明方法的实施方案中，可使用具有小于约10％碳负荷的HPLC柱。使用具有更低碳负荷的柱降低固定相和酯之间的相互作用，导致这些峰的更早的洗脱。结果显示，例如，使用具有低碳负荷(5％)的Platinum EPSC₁₈柱，当使用含有95％乙腈/5％水的流动相时，所有酯都在10分钟前被洗脱。类似地，当使用另一个柱，Phenosphere ODS(1)柱(7％碳负荷)时，所有四种酯都在26分钟内被洗脱。

下面列出了可在本发明的方法中使用的示例性的层析条件：

流速	1.2mL/分钟
		柱温度	25℃
注入体积	100μL
		流动相	梯度，A＝0.025％磷酸，B＝99％乙腈/1％A
流动时间	65分钟
		柱	Phenosphere 80_，ODS(1)柱，150×4.6mm，3μm
样品盘温度	5℃
		检测器波长	265nm

梯度时间表：

T(分钟)	0	16	39	43	57	57.01	65
								％水性％混合物	51.548.5	1387	1090	0100	0100	51.548.5	51.548.5

使用本发明的检测方法，可定量前维生素D和维生素D峰以计算样本中维生素D的总量。特别是，本发明的方法足够灵敏和有选择性，以至于对约2800IU胆钙化固醇的样本可区别胆钙化固醇、前胆钙化固醇和它们的异构体，以及可检测一个或多个胆钙化固醇酯加合物，或者一个或多个前胆钙化固醇酯加合物。

已经在本发明的药物组合物的稳定性研究中观察到三种可能的维生素D₃降解产物，其在下面进行描述(包括在实施例6中)。在下述稳定性研究中，研究的片剂组合物包括约91.4mg阿仑膦酸钠、约26.7mg胆钙化固醇颗粒、约131.0mg微晶纤维素、约62.4mg无水乳糖、约9.7mg交联羧甲基纤维素钠、约0.8mg胶体二氧化硅以及约3.1mg硬脂酸镁。

如在图5中所描述的，维生素D₃的结构包括共轭三烯，其经历各种热和光化学异构化。已经在本发明的示例性的药物组合物中鉴定了五种维生素D₃异构体(在该实例中，使用维生素D₃(胆钙化固醇))：前维生素D₃、反式维生素D₃以及在0.78RRT、0.96RRT和1.09RRT的三种另外的异构体(其是如下所述通过高效液相层析的化合物的保留时间的测量值)。一些这些维生素D₃异构体的结构显示于图5。结构结论是基于UV、MS，以及在一些情况中是NMR光谱学。

已知维生素D和其异构体前维生素D通过δ1，7-氢迁移热互变。在体内，已经证明前维生素D是维生素D的直接前体，并且发现在生理温度下两种物质处于平衡浓度，尽管该平衡似乎主要有利于维生素D。因为认为维生素D和前维生素D起相同的生理功能，因此当常规报道时维生素D试验包括两种物质的总和。这与含有维生素D₃产品的USP和Ph.Eur.专论一致，例如。可获得的稳定性数据表明在适当的包装中在25℃/60％RH贮藏24个月，没有一种其它异构体将接近1.0％重量的ICH数量测定阈值。

在本发明组合物所用的维生素D₃颗粒中，最突出的降解产物似乎是通过维生素D₃与中等链甘油三酯(MCT)的酯基转移反应所形成的维生素D₃酯。一些这些维生素D₃酯加合物的结构也显示于图5。主要的物质对应于维生素D₃的n-辛酸酯(C₈)和n-癸酸(C₁₀)酯。可通过前维生素D₃与维生素D₃化合物中的甘油三酯的反应或者通过维生素D₃酯的热转变产生前维生素D₃酯加合物。可定量的降解产物中，在稳定性研究中仅C₈和C₁₀维生素D₃酯加合物似乎提高到任何可估计的程度。

可获得的稳定性数据表明在低于约30℃和小于约30％相对湿度(RH)贮藏24个月，这些种类不应当接近1.0％重量的ICH数量测定阈值并且在本发明的组合物和方法的实施方案中，预计它们不会在任何事件中引起安全考虑。研究进一步表明，当在低于约30℃和小于约30％RH贮藏24个月后，本发明组合物的总降解物小于约5％。

也应当理解，维生素D可通过自由基引发剂的诱导或者在固相或液相中自发地进行自动氧化以形成各种产物，已经鉴定了其中的一些。本发明组合物的实施方案中维生素D降解(以及，具体地，在本情况中维生素D₃)的典型特征证实维生素D₃的自动氧化的不稳定性，其中将维生素D₃转变成油或无定形固体并暴露于20-40℃的温度。在几个小时内，HPLC分析显示维生素D₃的广泛破坏和出现许多显示非常低的紫外线(UV)吸收的无法分辨的降解物。在更长的暴露时间，随着反应的进一步发生这些吸收继续降低。

使用自由基引发剂，偶氮二异丁腈(AIBN)进行维生素D₃自动氧化的更详细的分析。在该实验中，使用AIBN引起溶液中维生素D₃的自动氧化。通过使用UV的HPLC、质谱分析(MS)和蒸发光散射(ELS)检测表征所得产物的分布图。结果显示：(a)溶液相自动氧化也可导致多个降解产物，(b)自动氧化可导致UV发色团的逐渐破坏，导致表面材料丢失，而ELS检测，在另一方面，提供显著更好的质量恢复，以及(c)质谱m/z比和在一些情况中所观察到的UV/vis谱证实这些反应产物的氧化性质。

在表征本发明组合物的实施方案中所使用的包括约70mg阿仑膦酸和约2,800IU(70μg)维生素D₃的颗粒制剂中维生素D₃降解的尝试中，进行放射性标记研究。利用氚标记的维生素D₃作为跟踪降解的维生素D₃的工具，不依赖UV吸收特征的改变。将放射性标记的维生素D₃掺入到模拟在本发明组合物的实施方案中所用的维生素D颗粒的制剂中，然后分析稳定性。为了在合理的时间框内发生降解，模型制剂中的抗氧化剂水平处于对于商业制剂来说被认为是期望的抗氧化剂水平的降低的水平。在40℃/75％RH和70℃14周后使用液体闪烁计数器(LSC)和具有同时UV和在线放射检测的反相高效液相层析(RP-HPLC)分析样本。对于在40℃/75％RH条件贮藏的样本，观察到大约40％的维生素D3丢失，而低温控制显示良好的稳定性。这种分析的结果显示于图6的降解样本的放射性色谱图，其显示大片区域的无法分辨的降解产物，其中没有一个似乎是主要的产物。这些结果提供进一步的证据，当不完全稳定时，维生素D₃氧化降解成多个具有降低的UV吸收的产物并且这些产物可解释维生素D₃的丢失。基于这些稳定性分析，在本发明组合物的片剂实施方案中不期望单个自动氧化降解产物接近安全考虑的水平。

本发明也包括在施用本发明的组合物后测量哺乳动物中药代动力学参数的方法。可测量的药代动力学参数包括，例如，总尿排泄、尿排泄、血清浓度对时间曲线下的面积(AUC)、稳态的最大血浆浓度(C_max)、C_max的时间(T_max)，以及片剂的血清浓度中位表观半衰期(t_1/2)，如，例如，包括约70mg阿仑膦酸和约2,800IU胆钙化固醇的片剂。

这些测量值证实本发明的组合物和方法的实施方案在体内产生了阿仑膦酸和胆钙化固醇的药学上有效的水平(后者通过与本发明组合物和方法中维生素D化合物的推荐的每日量的比较证明)。

在一个实施方案中，本发明包括施用包含阿仑膦酸和胆钙化固醇的药物组合物后测量人血清中胆钙化固醇的方法，该方法包括：(1)向人施用包括阿仑膦酸和胆钙化固醇的组合物；(2)从人中获得血浆样本；(3)从血浆样本中提取胆钙化固醇以形成第一溶液；(4)将第一溶液中的胆钙化固醇与亲双烯体反应以形成胆钙化固醇的一个或多个狄耳斯-阿德耳加成产物；(5)使用高效液相层析(HPLC)层析分离法分离胆钙化固醇的狄耳斯-阿德耳加成产物；和(6)使用质谱检测样本中胆钙化固醇的量。在该方法的实施方案中，亲双烯体包括4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(P-TADO或PTAD)。同样地，可使用热的喷雾器探测器在阳性电离模型中进行检测步骤，并可进一步包括向每个人类血浆样本中添加氘化的内标准胆钙化固醇，以及提取、反应、分离和沿着样本胆钙化固醇检测氘化的内标准胆钙化固醇。当测量1mL血浆时，该方法具有小于约0.5ng/mL胆钙化固醇的胆钙化固醇的定量限度(LOQ)。本发明的一个实施方案是维生素D/二膦酸组合物，其中施用组合物后120小时哺乳动物的血清浓度的图产生至少下列之一：胆钙化固醇的最小平方(LS)均值AUC(_0-120小时)约296.4ng.h/mL，其中不考虑基线胆钙化固醇血清浓度测量药代动力学参数；最小平方(LS)均值AUC(_0-120小时)约297.5ng.h/mL，其中通过考虑基线胆钙化固醇血清浓度测量药代动力学参数，使用服药前0小时血清胆钙化固醇浓度作为协变量(covariate)；以及最小平方(LS)均值AUC(_0-120小时)约143.1ng.h/mL，其中通过考虑基线胆钙化固醇血清浓度测量药代动力学参数，使用120小时期间估计的基线胆钙化固醇的减法。在另一个实施方案中，组合物包括二膦酸和胆钙化固醇，其中施用组合物后120小时哺乳动物血浆浓度的图产生下列之一：120小时的稳态最大血浆浓度(C_max)的最小平方(LS)均值约5.9ng/mL，其中不考虑基线胆钙化固醇血清浓度测量药代动力学参数；120小时的稳态最大血浆浓度(C_max)的最小平方(LS)均值约5.9ng/mL，其中通过考虑基线胆钙化固醇血清浓度测量药代动力学参数，使用服药前0小时血清胆钙化固醇血清浓度作为协变量；以及稳态最大血浆浓度(C_max)的最小平方(LS)均值约4.0ng/mL，其中通过考虑基线胆钙化固醇血清浓度测量药代动力学参数，使用120小时期间估计的基线胆钙化固醇的减法。

本发明也包括一种组合物，其中施用组合物后120小时哺乳动物的胆钙化固醇的血浆浓度的图产生：在约12小时发生C_max的算术均值时间(T_max)时胆钙化固醇的稳态最大血浆浓度(C_max)，其中不考虑基线胆钙化固醇血清浓度测量药代动力学参数。在另一个实施方案中，组合物具有在哺乳动物中为约23.8小时的组合物的胆钙化固醇的血浆浓度中间表观半衰期(t_1/2)，并且通过考虑基线胆钙化固醇血清浓度测量药代动力学参数，使用估计的基线胆钙化固醇步骤的减法。

为了测定本发明组合物的药代动力学特征，在236名年龄在18-65岁的健康非怀孕妇女和男性中进行公开标记、随机的、2部分的、2期交叉研究的抽样研究。在该研究中，在下面的实施例7中详细描述，研究以70-mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂施用的维生素D₃相对于2800IU维生素D₃片剂的药代动力学参数(AUC_0-120小时、C_max、T_max、和血清浓度中位表观半衰期(t_1/2))。另外，研究组合片剂中阿仑膦酸的尿排泄与FOSAMAX^_的每周一次70mg片剂的关系。概括起来，(1)证明根据本发明的70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂在阿仑膦酸生物利用率方面与70mg阿仑膦酸片剂生物等效；(2)证明70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂和含有2800IU维生素D₃的片剂(无阿仑膦酸)中维生素D₃的生物利用率相似，以及(3)证明根据本发明的70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂普遍很好地耐受。因此，预计，例如，用本发明的二膦酸/维生素D化合物的每周一次给药将在与二膦酸/维生素D化合物的每周一次给药相同的时期，提供与推荐的每日剂量的维生素D，如每日400IU维生素D的维生素D血液水平和/或治疗效应相当的维生素D₃血液水平和/或治疗效应。

在下列非限制性的实例中进一步解释本发明的这些和其它实施方案。

                       实施例

下列实施例进一步描述和举例说明本发明范围内的实施方案。由于其许多变化可能不偏离本发明的精神和范围，因此给出的实施例仅用于举例说明的目的，不应当被解释为本发明的限制。

实施例1

二膦酸和维生素D片剂

成品药物产物是含有阿仑膦酸钠(约70mg无水游离酸等同物)和维生素D₃(约2800I.U.(约70μg))的组合片剂，具有在表1-1中所确定的成分。所有赋形剂都是大纲级并选择用于达到最大物理和化学稳定性。

表1-1

片剂组合物

成分	阿仑膦酸钠70mg/维生素D32800I.U.片剂
			mg/片	重量％
	阿仑膦酸钠	91.37			28.1％
Dry维生素D3100颗粒			26.67	8.2％
	微晶纤维素NF	131.0			40.3％
无水乳糖NF			62.35	19.2％
	交联羧甲基纤维素钠NF	9.740			3.0％
胶体二氧化硅NF			0.8120	0.25％
	硬脂酸镁NF	3.0870			0.95％
总计			325	100％

使用所得的片剂根据本发明的方法用于预防、抑制、减少或治疗例如骨质疏松。类似地，根据阿仑膦酸活性，制备包括其它相应重量的阿仑膦酸的片剂，包括，但不限于，每个片剂约2.5mg、5mg、8.75mg、17.5mg、70mg、140mg、280mg、560mg或1120mg。类似地，制备包括每单位剂量其它相应重量的维生素D₃的片剂，包括，但不限于，每个片剂约1,400、2,800、5,600、7,000IU、8,400IU、14,000IU、28,000或36,000IU。可在从每周一次到每两月一次的时间间隔施用这种片剂。

实施例2

二膦酸和维生素D组合物

可使用如本说明书中所述的混合和制剂技术制备包括二膦酸和维生素D的组合物。可使用下列相应重量的成分制备含有根据阿仑膦酸活性，约35mg阿仑膦酸，和约5,600IU维生素D₃的组合物。

成分	每片
		阿仑膦酸一钠三水合物	45.68mg
Dry维生素D3100颗粒	56mg*
		无水乳糖，NF	71.32mg
微晶纤维素，NF	80.0mg
		硬脂酸镁，NF	1.0mg
交联羧甲基纤维素，NF	2.0mg

*每克颗粒含有大约100000IU；因此56mg颗粒等于约5600IU。

使用所得的剂型根据本发明的方法用于预防、抑制、减少或治疗例如，骨质疏松。类似地，根据阿仑膦酸活性，制备包括其它相应重量的阿仑膦酸的剂型，包括，但不限于，每片约2.5mg、5mg、8.75mg、17.5mg、70mg、140mg、280mg、560mg或1120mg。类似地，制备包括每单位剂量其它相应重量的维生素D₃的剂型，包括，但不限于，每单位剂型约1,400、2,800、5,600、7,000IU、8,400IU、14,000IU、28,000或36,000IU。可在从每周一次到每两月一次范围的时间间隔施用这种剂型。这些剂型可以是，例如，片剂或胶囊。

实施例3

阿仑膦酸和维生素D片剂

使用这里所公开的方法，使用下列成分的相应重量，制备含有根据阿仑膦酸活性，70mg阿仑膦酸，和2800IU维生素D₃的片剂。

表3-1

组合物(每片)阿仑膦酸钠二氧化硅，胶体的，CAB-O-SIL PDry维生素D3100颗粒_纤维素微晶NF Avicel PH-102乳糖NF无水交联羧甲基纤维素钠硬脂酸镁NF(非-牛)	91.37m_0.81mg26.67mg*131mg63.35mg9.74mg3.09mg
		_等于70.0mg游离酸_Dry维生素D3100颗粒也含有中等链甘油三酯、明胶、蔗糖、丁基化羟基甲苯、淀粉和硅酸铝钠。*26.67克Dry维生素D3100颗粒含有105,000IU/g维生素D3

使用所得的片剂根据本发明的方法用于预防、抑制、减少或治疗例如骨质疏松。类似地，根据阿仑膦酸活性，制备包括其它相应重量的阿仑膦酸的片剂，包括，但不限于每片约2.5mg、5mg、8.75mg、17.5mg、70mg、140mg、280mg、560mg或1120mg。

类似地，制备包括每单位剂量其它相应重量的维生素D₃片剂，包括，但不限于每片约1,400、2,800、5,600、7,000IU、8,400IU、14,000IU、28,000或36,000IU。可在每周一次到每两月一次的时间间隔施用这种片剂。

实施例4

维生素D₃(粉剂)对阿仑膦酸吸收的影响

为了检查当以单剂量施用时粉剂的维生素D₃(胆钙化固醇)对阿仑膦酸的相互作用，在14名年龄在18-85岁健康的，非怀孕的妇女和男性中进行两期、交叉研究。受试者在每个时期接受一片阿仑膦酸70-mg片剂。根据计算机所产生的患者分配表，在两个时期之一将单剂量的维生素D₃5600IU与阿仑膦酸片剂共同服用。当维生素D₃与阿仑膦酸共同施用时，将维生素D₃粉剂在60mL普通自来水中重构并与阿仑膦酸片剂一起施用给受试者(治疗A)。清洗维生素D₃瓶并用60mL普通自来水填满3次，然后每次施用给受试者。因此，将240mL总体积的普通自来水与维生素D₃一同施用。当单独施用阿仑膦酸时，将240mL体积的普通自来水与该剂量一同施用(治疗B)。每个时期至少间隔14天冲失。治疗示意图和分配在表4-1。

表4-1

治疗示意图和分配

组	1期	2期
			1(N＝7)ANs 0002，0004，0005，0008，0009，0011，00132(N＝7)ANs 0001，0003，0006，0007，0010，0012，0014	AB	BA
治疗A＝70mg阿仑膦酸片剂和维生素D35600IU治疗B＝70mg阿仑膦酸

在每个治疗前夜将受试者在研究单位隔离。过夜禁食(除了水)后，受试者施用各自的治疗。受试者在药物服用后继续禁食直到服药后2小时食用成分明确的饭。

临床供应信息在表4-2。在该研究中所用的阿仑膦酸片剂和维生素D₃的组合物和分析结果列于表4-3和4-4。

                表4-2

              临床供应

药物	效能	剂型
			阿仑膦酸维生素D3	70mg5600IU	片剂颗粒

                 表4-3

            阿仑膦酸片剂特征

组合物(每片)阿仑膦酸钠无水乳糖NF纤维素微晶NF Avicel 102硬脂酸镁细微粉末NF交联羧甲基纤维素钠NF A型	91.37mg_113.38mg140.00mg1.75mg3.50mg
		_等同于70.0mg游离酸

              表4-4

        维生素D₃颗粒粉剂特征

组合物(每瓶)Dry维生素D3型100CWS/HP	51.96mg_
		_等同于5600IU

过夜禁食(除了水)后施用所有剂量。受试者服用一片阿仑膦酸70-mg片剂和240mL普通自来水。当受试者将5600IU的维生素D₃剂量与阿仑膦酸一起服用时，要求受试者重悬(resuspend)并将阿仑膦酸70-mg片剂和维生素D₃剂量(以颗粒型提供并在研究地点在水中重构)共同服用。与每个阿仑膦酸剂量一起服用的液体的总体积是240mL。在研究药物施用后受试者再保持禁食状态2小时，随后食用成分确定的饭。在药物施用和成分确定饭之间受试者保持直立2小时。通过至少14天的时间间隔隔离每个剂量周期。

在下列时间间隔收集用于阿仑膦酸分析的尿样本，用于药代动力学分析：服药前2-0小时、服药后0-8小时、服药后8-24小时以及服药后24-36小时。恰在研究药物施用前2小时期间所获得的尿收集提供基线阿仑膦酸测定。将所有尿样本收集到预先称重的聚丙烯容器中。对于服药后0-到8-、8-到24-、和24-到36小时尿收集，向容器中添加12.5克硼酸作为定时时间间隔开始时的防腐剂。在每个定时收集时间间隔的终点，称量整个尿收集，测量比重以及测定净体积。在原位将尿样本酸化。每200mL尿添加5mL 6.0N盐酸(HCl)以使尿样本pH≤2.0。酸化后，搅拌尿样本并将样本等分到聚丙烯容器内冷冻贮藏(-20℃)直到完成高效液相层析(HPLC)分析。使用每个时期的总的尿体积，包括硼酸和HCl的体积，测定特定时间间隔的阿仑膦酸的尿排泄。

测定人尿中阿仑膦酸的分析方法包括3个不同的操作：(1)从尿中分离分析物和内标准(帕米膦酸钠(pamidronate))，(2)强荧光衍生物的形成，和(3)所得衍生物的HPLC分离和荧光检测。通过添加氯化钙和氢氧化钠，尿中的阿仑膦酸和内标准与天然存在的磷酸盐共沉淀。将通过离心分离的沉淀在1M盐酸中重构并应用到在pH 4的乙酸缓冲的溶液中的阴离子交换二乙胺(DEA)柱体。通过0.20M柠檬酸钠和0.20M二元磷酸钠的溶液(调整到pH 9)从DEA柱体中洗脱阿仑膦酸。在室温在存在N-乙酰-D-青霉胺时，用2，3-萘二羧基醛衍生阿仑膦酸。然后将衍生物应用到由苯乙烯和二乙烯苯的共聚物所组成的非二氧化硅基础的聚合柱。流动相最初由85％ 0.025M柠檬酸钠、0.025M二元磷酸钠(pH 6.95)和15％乙腈组成，流速为1mL/分钟。通过将乙腈提高到50％除去后来洗脱的尿的内源性成分。试验在5ng/mL和125ng/mL之间的人类尿液中得到证实，变异系数低于10％。需要5-mL尿样本以获得1-ng/mL的检测限度。

通过将所分析等分试样中的阿仑膦酸的浓度乘以时间间隔的总的尿体积(包括硼酸和盐酸)，测定特定时间间隔(-2-0、0-8、8-24、24-36小时)的阿仑膦酸的总的尿排泄。

使用适于2期、交叉设计的方差(ANOVA)模型的分析，进行70-mg阿仑膦酸片剂加5600IU维生素D₃与单独70-mg阿仑膦酸片剂的总尿排泄的比较。ANOVA模型含有顺序、受试者(顺序)、时期和治疗的因素。将总尿排泄进行log转换。用于正态性的Shapiro-Wilk检验的结果，连同模型的剩余的图，不提示ANOVA模型的假设的任何偏离。为了估计70-mg阿仑膦酸片剂加维生素D₃对单独70-mg阿仑膦酸片剂的相对生物利用率，根据总尿排泄的GMR的t分布，计算95％CI。另外，也计算真GMR高于临床上重要的0.50边界的后验概率。

从上述分析中去掉一个受试者，因为该特殊受试者所有3个收集间隔(0-8、8-24和24-36小时)的尿阿仑膦酸浓度均低于两种治疗的定量限度。由于治疗程序次序的轻微不平衡，报告总的尿排泄的最小平方均数。从分析中除去该受试者的数据。

通过ANOVA模型的后转化获得最小平方均数。所有p值在报告前四舍五入到3位小数。认为报告p≤0.050的结果有显著意义。

表4-5显示每名受试者的70-mg阿仑膦酸片剂加维生素D₃和70-mg阿仑膦酸片剂的阿仑膦酸钠的总尿排泄。在表4-6中是阿仑膦酸的总尿排泄的总结性统计数值和GMR，具有其对应的95％CI。

70-mg阿仑膦酸片剂加5600IU维生素D₃的总尿排泄的最小平方几何均值是183.61，单独的70-mg阿仑膦酸片剂是157.97μg。相对于单独的阿仑膦酸，70-mg阿仑膦酸+维生素D₃的GMR和其对应的95％CI是1.16(0.74，1.83)。GMR可能高于临床上重要的0.50边界的后验概率是0.999。

                表4-5

  施用单剂量70mg阿仑膦酸片剂加5600IU

维生素D₃和单独施用的70mg阿仑膦酸后36小时，

       个人阿仑膦酸的总的尿排泄(μg)

	70mg阿仑膦酸加5600IU维生素D3	70mg阿仑膦酸
			194.22311.32367.40291.47181.42127.41494.92＜LOQ_21.75185.46101.5197.86248.71464.51	68.02111.11290.62310.48113.4068.64169.86＜LOQ_61.29257.7568.73259.69341.90519.58
	算术均值标准差	237.54143.63			203.16140.51
_低于1ng/ml的定量的限度

                                    表4-6

                   施用70mg阿仑膦酸加维生素D₃和单独的70mg

                    阿仑膦酸的单剂量后36小时的阿仑膦酸的

                       总尿排泄(μg)的总结性统计数值和

                         具有相应的95％CI的几何均值比

治疗	N	LS_均值	中位数	最小	最大	SD_	GMR§	GMR的95％CI‖
									阿仑膦酸+维生素D3阿仑膦酸	1313	183.61157.97	194.22169.86	21.7561.29	494.92519.58	260.40177.07	1.16	(0.74，1.83)
ANOVA模型的log范围内的均方根误(RMSE)＝0.522(ln μg)_LS均值＝最小平方均值(log数值的后面-转换)_SD＝后转换的受试者间标准差§GMR＝最小平方均值比(阿仑膦酸+维生素D3/阿仑膦酸)‖CI＝置信区间

实施例5

维生素D₃(阿仑膦酸/维生素D片剂中所含有的)对阿仑膦酸吸收的影响

为了检查阿仑膦酸和口服施用的维生素D₃之间相互作用的可能性，14名健康的成年受试者(6男，8女，年龄在33-61岁)服用一片无维生素D₃的70-mg阿仑膦酸，以及连同悬于240mL水中的维生素D₃粉剂(5600IU)。该研究是开放的，随机的，交叉的双向设计。该研究的目的是获得与维生素D₃一同服用70-mg片剂后，相对于不与维生素D₃一同服用的阿仑膦酸，阿仑膦酸的相对生物利用率的初步估计。

在两个时期的每一时期中，口服施用70-mg片剂阿仑膦酸。在一个时期中，将片剂与在普通自来水中重构的维生素D₃粉剂一同施用，在另一个时期中将片剂连同普通自来水一起服用。收集阿仑膦酸的每个剂量前2小时和后36小时的尿液用于所排泄的阿仑膦酸的分析测定。根据服药后36小时的阿仑膦酸的总的尿回收，估计相对的生物利用率。

无维生素D₃的70-mg阿仑膦酸的剂量后，阿仑膦酸的尿回收是202μg，具有90％CI(126μg，279μg)，连同维生素D₃一起施用70-mg剂量后，回收平均为238μg，具有90％CI(159μg，316μg)。估计几何均值比(90％CI)为1.18(0.80，1.74)。该研究显示，口服维生素D₃连同口服剂量的阿仑膦酸对不影响阿仑膦酸的生物利用率最小。

实施例6

维生素D₃和阿仑膦酸的稳定研究

已研究了含有阿仑膦酸钠(70mg无水游离酸等同物)和维生素D₃(2800I.U./70μg)的组合片剂形式的本发明组合物的稳定性。

表6-1含有阿仑膦酸/维生素D组合片剂的实施方案的片剂组合物。所有赋形剂是大纲级并且选择用以达到最大的物理和化学稳定性。

                      表6-1

                     片剂组合物

成分	阿仑膦酸70mg/维生素D32800I.U.片剂
			mg/片	重量％
	阿仑膦酸钠	91.37			28.1％
Dry维生素D3100颗粒			26.67*	8.2％
	微晶纤维素NF	131.0			40.3％
无水乳糖NF			62.35	19.2％
	交联羧甲基纤维素钠NF	9.740			3.0％
胶体二氧化硅NF			0.8120	0.25％
	硬脂酸镁NF(颗粒内)	2.275			0.7％
硬脂酸镁NF(颗粒外)			0.8120	0.25％
	总计	325			100％

^*26.67克Dry维生素D₃100颗粒含有105,000IU/g维生素D₃

阿仑膦酸试验和溶解方法可使用具有前柱9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)衍生化的反相HPLC，与已报道的FOSAMAX^_片剂的方法类似。维生素D₃试验和降解法也可以是能分辨并定量维生素D₃以及维生素D₃的多个可能的降解产物的反相梯度HPLC法(RP-HPLC)。维生素D₃含量均匀性和溶解试验也使用反相HPLC。由于维生素D₃的不良的水溶解度，溶解方法可使用表面活性剂介质(1％SDS)。由于组合片剂的低维生素D₃效能(70μg)，可在500mL基质中使用三片以获得适当的信号。

下面提供在30℃/65％RH和40℃/75％RH贮藏的一批组合物片剂的52周的试验和降解产物数据(见表6-2和6-3)。尽管产生的数据的确表明维生素D₃有轻微降解，但是这些数据证明本发明组合物的实施方案的可接受的稳定性。在更高的温度时在铝泡眼和无干燥剂的HDPE瓶中发现更多的降解。

                                     表6-2

                           维生素D3稳定性试验结果的总结：

                      阿仑膦酸钠70mg/维生素D₃2800I.U.组合片剂

贮藏条件	周_	维生素D3(％标签要求)75ml HDPE瓶w/箔感应密封，1克干燥剂，每瓶4片			维生素D3(％标签要求)箔对箔铝泡眼
										Lot 001	Lot 002	Lot 003	Lot 001	Lot 002	Lot 003
最初的	0	98.6	97.3	99.2	98.6	97.3	99.2
								25℃/60％RH	13	NT	97.3	99.5	99.2	97.7	NT
26	99.9	98.0	NT	100.8	NT	99.6
							39		99.0	NT	98.1	NT	93.8	97.1
44	99.1	97.1	99.6	97.9	95.4	99.1
							52		98.2	96.4	99.3	98.8	94.9	99.3
30℃/65％RH	13	100.1	96.8	NT	99.3	NT									99.1
							26	99.7	NT	99.5	NT	96.7	99.8
	39	NT	94.4	97.1	97.6	94.3								NT
							44	97.3	95.7	97.6	97.9	96.1	98.0
	52	97.5	95.4	97.5	97.7	94.1								97.1
							40℃/75％RH	13	99.3	96.0	99.0	97.1	96.1		97.8
26	97.1	94.5	96.9	96.8	94.7	97.6
								_表示周中的理论时间点NT＝没有检验

                             表6-3

维生素D₃降解稳定性结果的总结：阿仑膦酸钠70mg/维生素D3 2800I.U.组合片

                         剂，箔对箔铝泡眼

降解物	贮藏条件	周_	％标签要求(相对于维生素D的wt％)
									Lot 001	Lot 002	Lot 003
0.74RRT(反式-维生素D3)	最初的	0	0.4	0.3	0.3
						25℃/60％RH	13	0.2	0.3	NT
	26	0.2	NT	0.2
					39		NT	0.3	0.2
	44	0.2	0.3	0.2
					52		0.2	0.3	0.2
	30℃/65％RH	13	0.2	NT						0.3
					26	NT	0.3	0.2
		39	0.2	0.3					NT
					44	0.2	0.3	0.2
		52	0.2	0.3					0.2
					40℃/75％RH	13	0.2	0.3		0.2
	26	0.1	0.2	0.1
						0.78RRT(维生素D3异构体)	最初的	0	0.0_	0.0_	0.0_
25℃/60％RH	13	0.0_	0.1	NT
					26		0.1	NT	0.1
	39	NT	0.1	0.1
					44		0.1	0.1	0.1
	52	0.1	0.1	0.1
					30℃/65％RH		13	0.1	NT	0.1
26	NT	0.1	0.1
				39			0.2	0.2	NT
44	0.2	0.2	0.2
				52			0.2	0.2	0.2
40℃/75％RH	13	0.2	0.2							0.2
				26	0.3		0.3	0.3
	0.96RRT(维生素D3异构体)	最初的	0						0.2	0.3	0.2
25℃/60％RH				13	0.2	0.2	NT
		26	0.2					NT	0.1
				39	NT	0.2	0.1
		44	0.1					0.2	0.1
				52	0.1	0.2	0.1
		30℃/65％RH	13					0.2	NT	0.2
26				NT	0.2	0.1
			39				0.1	0.2	NT
44				0.1	0.2	0.1
			52				0.1	0.2	0.1
40℃/75％RH				13	0.1	0.2				0.1
		26	0.0_				0.0_	0.0_
				1.09RRT(维生素D3降解物)	最初的	0			NR	NR	NR
25℃/60％RH	13	0.0_	0.0_				NT
					26	0.0_		NT	0.0_
	39	NT	0.0_				0.0_
					44	0.0_		0.0_	0.0_

降解物	贮藏条件	周_	％标签要求(相对于维生素D的wt％)
									Lot 00l	Lot 002	Lot 003
		52	0.0_	0.0_	0.0_
						30℃/65％RH	13	0.0_	NT	0.0_
	26	NT	0.0_	0.0_
					39		0.0_	0.0_	NT
	44	0.0_	0.1	0.0_
					52		0.1	0.1	0.1
	40℃/75％RH	13	0.0_	0.0_						0.0_
					26	0.2	0.2	0.1
		1.39RRT(C8维生素D3酯)	最初的	0					0.1	0.1	0.1
25℃/60％RH	13				0.2	0.1	NT
			26	0.2				NT	0.2
	39				NT	0.2	0.2
			44	0.3				0.2	0.3
	52				0.3	0.3	0.3
			30℃/65％RH	13				0.2	NT	0.2
26	NT				0.2	0.3
				39			0.4	0.3	NT
44	0.4				0.4	0.4
				52			0.5	0.4	0.5
40℃/75％RH	13				0.3	0.3				0.3
			26	0.6			0.5	0.6
	1.52RRT(C10维生素D3酯)				最初的	0			0.0_	0.0_	0.0_
25℃/60％RH		13	0.0_	0.0_			NT
					26	0.1		NT	0.1
		39	NT	0.1			0.1
					44	0.2		0.1	0.2
		52	0.2	0.2			0.2
					30℃/65％RH	13		0.0_	NT	0.1
26		NT	0.1	0.2
						39	0.2	0.2	NT
44		0.2	0.2	0.2
						52	0.3	0.2	0.3
40℃/75％RH		13	0.2	0.2						0.2
					26	0.4	0.3	0.4
		总的降解物	最初的	0					0.7	0.7	0.6
25℃/60％RH	13				0.6	0.8	NT
			26	0.8				NT	0.8
	39				NT	1.0	0.9
			44	0.9				1.0	0.9
	52				1.0	1.1	1.0
			30℃/65％RH	13				0.7	NT	0.8
26	NT				1.0	0.9
				39			1.0	1.1	NT
44	1.1				1.3	1.1
				52			1.3	1.4	1.4
40℃/75％RH	13				0.9	1.1				0.9
			26	1.6			1.6	1.5

降解物	贮藏条件	W周_	％标签要求(相对于维生素D的wt％)
									Lot 001	Lot 002	Lot 003
_表示周中的理论的时间点_0.0代表结果＜0.1％或没有检测NT＝没有检测NR＝没有报告

维生素D₃降解稳定性结果的总结：阿仑膦酸钠70mg/维生素D₃2800I.U.组合片剂，75cc HDPE瓶，每瓶4片，和一个1克干燥剂

降解物	贮藏条件	周_	％标签要求(相对于维生素D的wt％)
									Lot 001	Lot 002	Lot 003
0.74RRT(反式维生素D3)	最初的	0	0.4	0.3	0.3
						25℃/60％RH	13	NT	0.4	0.3
	26	0.2	0.3	NT
					39		0.2	NT	0.2
	44	0.2	0.3	0.2
					52		0.2	0.3	0.2
	30℃/65％RH	13	0.2	0.3						NT
					26	0.2	NT	0.2
		39	NT	0.3					0.2
					44	0.2	0.3	0.2
		52	0.2	0.3					0.2
					40℃/75％RH	13	0.2	0.3		0.2
	26	0.2	0.2	0.2
						0.78RRT(维生素D3异构体)	最初的	0	0.1	0.0_	0.0_
25℃/60％RH	13	NT	0.0_	0.0_
					26		0.1	0.1	NT
	39	0.1	NT	0.1
					44		0.1	0.1	0.1
	52	0.1	0.1	0.1
					30℃/65％RH		13	0.1	0.1	NT
26	0.1	NT	0.1
				39			NT	0.1	0.1
44	0.2	0.1	0.1
				52			0.2	0.2	0.2
40℃/75％RH	13	0.1	0.1							0.1
				26	0.2		0.2	0.2
	0.96RRT(维生素D3异构体)	最初的	0						0.2	0.3	0.2
25℃/60％RH				13	NT	0.2	0.2
		26	0.1					0.2	NT
				39	0.1	NT	0.1
		44	0.1					0.2	0.1
				52	0.1	0.2	0.1
		30℃/65％RH	13					0.2	0.2	NT
26				0.1	NT	0.1
			39				NT	0.2	0.1
44				0.1	0.2	0.1

降解物	贮藏条件	W周_	％标签要求(相对于维生素D的wt％)
									Lot 001	Lot 002	Lot 003
		52	0.1	0.2	0.1
						40℃/75％RH	13	0.2	0.2	0.1
	26	0.0_	0.1	0.0_
					1.09RRT(维生素D3降解物)		最初的	0	NR	NR	NR
25℃/60％RH	13	NT	NR	NR
						26	0.0_	0.0_	0.0_
	39	0.0_	NT	0.0_
						44	0.1	0.0_	0.0_
	52	0.1	0.0_	0.1
						30℃/65％RH	13	0.0_	0.0_	NT
26	0.1	NT	0.0_
				39			NT	0.1	0.1
44	0.2	0.1	0.1
				52			0.1	0.1	0.2
40℃/75％RH	13	0.1	0.1							NR
				26		0.2	0.1	0.1
	1.39RRT(C8维生素D3酯)	最初的	0						0.1	0.1	0.1
25℃/60％RH				13	NT	0.1	0.1
		26	0.2					0.2	NT
				39	0.2	NT	0.2
		44	0.2					0.2	0.2
				52	0.2	0.2	0.3
		30℃/65％RH	13					0.1	0.1	NT
26				0.2	NT	0.2
			39				NT	0.3	0.3
43				0.3	0.3	0.3
			52				0.4	0.3	0.4
40℃/75％RH				13	0.2	0.2				0.2
		26	0.5				0.4	0.5
				1.52RRT(C10维生素D3酯)	最初的	0			0.0_	0.0_	0.0_
25℃/60％RH	13	NT	0.0_				0.0_
					26	0.0_		0.0_	NT
	39	0.1	NT				0.1
					44	0.1		0.1	0.1
	52	0.1	0.1				0.1
					30℃/65％RH	13		0.0_	0.0_	NT
26	0.1	NT	0.1
						39	NT	0.1	0.2
44	0.2	0.2	0.2
						52	0.2	0.2	0.2
40℃/75％RH	13	0.1	0.1							0.1
					26	0.3	0.2	0.3
	总的降解物	最初的	0						0.7	0.7	0.6
25℃/60％RH				13	NT	0.7	0.6
		26	0.6					0.8	NT
				39	0.8	NT	0.8
		44	1.0					0.9	0.8

降解物	贮藏条件	周_	％标签要求(相对于维生素D的wt％)
									Lot 001	Lot 002	Lot 003
		52	1.0	1.0	1.0
						30℃/65％RH	13	0.7	0.8	NT
	26	0.9	NT	0.9
					39		NT	1.1	1.0
	44	1.2	1.2	1.1
					52		1.2	1.3	1.2
	40℃/75％RH	13	1.0	1.1						0.9
					26	1.2	1.3	1.2
		_表示周中的理论的时间点_0.0代表结果＜0.1％或未检测NT＝未检验NR＝未报告

实施例7

维生素D₃和阿仑膦酸的药代动力学

在236名年龄在18-65岁的健康非怀孕妇女和男性中进行开放标记、随机、两部分、两期、交叉研究。该研究在两个部分(部分I和II)中进行，每个部分由一个两期、交叉设计构成。每个受试者仅参加研究中的一个部分(即，每个受试者仅在部分I或仅在部分II中)。在研究的每个部分内受试者按顺序进入研究，在研究的每个部分内在治疗间之间具有至少12天的冲失(washout)期。部分I包括治疗A和B，部分II包括治疗A和C。治疗由下列方案构成：治疗A-根据下面的表7-3，70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂的单剂量；治疗B-根据下面表7-2，70mg阿仑膦酸的单剂量；治疗C-根据下面表7-4，2800IU维生素D₃片剂(含有取代阿仑膦酸的安慰剂赋形剂)的单剂量。

在部分I中，每个时期在服用剂量前2小时开始，和之后36小时收集尿，用于测定阿仑膦酸的总的尿排泄。在部分II中，每个时期在服药前24、18、12和6小时、在0小时(恰在服药前)、和在服药后120小时中所选择的时间收集血液样本用于血清维生素D₃测定。

研究的部分I评估根据下面表7-3的70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂和根据下面表7-2的70mg阿仑膦酸片剂中阿仑膦酸的生物等效性。研究的部分II评估服用70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂和2800IU维生素D₃片剂后所获得的维生素D₃的血清药代动力学(AUC_0-120小时，C_max)。2800IU维生素D₃片剂含有2800IU维生素D₃和阿仑膦酸/维生素D₃组合片剂中的无活性的赋形剂。

部分I中的主要药代动力学参数是服用口服剂量后0-36小时的阿仑膦酸的总的尿排泄。由于口服后血浆浓度低并且很难检测，因此阿仑膦酸的总尿排泄的测定与以前的通过尿排泄表征阿仑膦酸的口服生物利用率的研究一致。

部分II中主要药代动力学参数是维生素D₃的AUC_0-120小时和C_max。在每个时期的下列时间点收集血液用于血清维生素D₃浓度的测定：服药前-24、-18、-12和-6小时、0小时(恰在服药前)、和在服药后2、3、5、7、16、24、36、48、72、96和120小时。

收集研究药物施用前24小时的血清维生素D₃浓度以提供在控制的环境中24小时后维生素D₃的内源性水平的行为的指示。由于在皮肤中通过暴露于紫外线光合成维生素D₃，因此使受试者住在研究单位并且在采集药代动力学样本时间期间(例如，144小时，从服药前24小时直到服药后120小时)不暴露于直接的阳光。要求受试者擦防晒霜(SPF 45)并在整个研究中限制阳光照射，包括冲失期间。也限制受试者食用已知高维生素D₃的食物(例如，鲑鱼、青鱼、鲭、鳕鱼、金枪鱼、箭鱼、牡蛎和沙丁鱼)以及已知补充维生素D₃的食物(例如，某些谷类食品、强化奶和一些酸乳酪)。

部分I中的每名受试者以随机、交叉方式接受70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂的一个口服剂量和70mg阿仑膦酸的一个口服剂量。部分II的受试者以随机、交叉方式接受70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂的一个口服剂量和2800IU维生素D₃片剂的一个口服剂量。在服药前夜2100小时开始的过夜禁食(除了水)后，将剂量与240mL普通自来水一起服用。要求受试者在服药和成分确定的饮食之间不能躺下并且保持直立(至少45度角、坐着或站立)。受试者禁食直到标准的饮食，其在服药后2小时给予。服用阿仑膦酸/维生素D₃组合片剂的过程与服用阿仑膦酸的那些过程相同。

在下面的表7-1至7-4中阐述研究中所服用的组合物。

                 表7-1

                临床供应

药物	效能	剂型
			阿仑膦酸钠/维生素D3阿仑膦酸钠维生素D3	70mg/2800IU70mg2800IU	片剂片剂片剂

                   表7-2

              70mg阿仑膦酸片剂

组合物(每片)
		阿仑膦酸钠微晶纤维素NF无水乳糖NF交联羧甲基纤维素钠NF硬脂酸镁NF含量试验(阿仑膦酸)均值范围	91.37mg_140.0mg113.4mg3.50mg1.75mg70.42mg66.5-73.5mg
_由Merck制造部制造的商品化的阿仑膦酸钠70mg片剂产品_等同于70.0mg无水游离酸

                         表7-3

          70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂

组合物(每片)
		阿仑膦酸钠Dry维生素D3100颗粒无水乳糖NF微晶纤维素NF胶体二氧化硅NF交联羧甲基纤维素钠NF硬脂酸镁NF(颗粒内)硬脂酸镁NF(颗粒外)含量试验(阿仑膦酸)均值RSD范围含量试验(维生素D3)均值RSD范围	91.37mg_26.67mg_62.32mg§131.00mg0.812mg9.740mg2.275mg0.812mg70.5mg0.89％69.7-71.6mg2742IU1.59％2643-2822IU
_等同于70.0mg无水游离酸_维生素D3Dry药物级颗粒也含有中等链甘油三酯、明胶、蔗糖、丁基化的羟基甲苯、淀粉和硅酸铝钠。根据试验进行调整。定量说明假设和105,000I.U./g的试验§为了达到325mg最终的靶片剂重量，根据所添加的维生素D3100,000I.U./g的量进行调整

                            表7-4

                     2800IU维生素D₃片剂

组合物(每片)
		Dry维生素D3100颗粒微晶纤维素NF无水乳糖NF交联羧甲基纤维素钠NF胶体二氧化硅NF硬脂酸镁NF含量试验(维生素D3)均值RSD范围	26.72mg_97.68mg46.61mg5.34mg0.445mg1.336mg2789IU2.7％2660-2957IU
_Dry维生素D3100颗粒也含有中等链甘油三酯、明胶、蔗糖、丁基化的羟基甲苯、淀粉和硅酸铝钠。根据试验调整。定量说明假设105,000 I.U./g试验。片剂重量根据所添加的维生素D3100,000I.U./g的量而变化。

通过对最后样本收集的梯形法，使用未调整的维生素D₃的浓度(C_t)计算服药后0-120小时的血清对时间曲线下的面积(AUC_0-120小时)。为了计算目的，将浓度比定量试验限度(LOQ)更低的样本指定为零。通过检查所测量的血清中维生素D₃的浓度和样本收集的实际记录时间，获得所观察到的最大浓度(C_max)和C_max的时间(T_max)。也以三个不同方法测量血清中维生素D₃的浓度分布图，其中的两个以下面所讨论的方式说明基线维生素D₃血清浓度。以相同的方式计算AUC_0-120小时、C_max和T_max。

使用阿仑膦酸/维生素D₃组合片剂对单独的阿仑膦酸片剂的阿仑膦酸的总尿排泄的GMR，估计70mg阿仑膦酸片剂/2800IU维生素D₃组合片剂相对于单独的70mg阿仑膦酸片剂的生物利用率。使用AUC_0-120小时和C_max的GMR(阿仑膦酸加维生素D₃/单独的维生素D₃)，估计70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂对单独的2800IU维生素D₃片剂的相对生物利用率。

使用三种不同的方法，比较服用70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂和2800IU维生素D₃片剂后维生素D₃单剂量药代动力学。在第一种方法中，服用两种治疗后比较内源性维生素D₃血清浓度的维生素D₃药代动力学。

使用该方法，使用对2期、交叉设计的适当的ANOVA模型比较服用70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂和2800IU维生素D₃片剂后，内源性维生素D₃血清浓度的维生素D₃单剂量药代动力学(AUC_0-120小时和C_max)。在药代动力学参数上使用适当的转化(即，对AUC_0-120小时、C_max的log转化，对T_max的排列，以及对表观t_1/2的倒转)。报道后转化的总结性统计数值和推论性结果。检验ANOVA模型假设的正态性。对于AUC_0-120小时和C_max通常满足正态性假设。

为了估计70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂中的维生素D₃相对于2800IU维生素D₃片剂中的生物利用率，90％CI，根据t-分布，计算AUC_0-120小时和C_max的GMR(70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂/2800IU维生素D₃片剂)并然后与预先指定的生物等效性范围(0.80，1.25)比较。也提供维生素D₃的T_max的总结性统计数值和治疗之间的比较。

作为测量药代动力学参数的另一种方法，血浆中服药前维生素D₃的考虑明确地导致发展用于观察试验期间维生素D₃浓度变化的模型。该模型考虑从基线维生素D₃血浆浓度中减去贡献并能估计只由该化合物的口服施用引起的药代动力学参数。该模型基于下列假设：(1)当没有施用外源性维生素D₃时，作为时间的函数(C_t＝C_i+C_m·t，其中C_i和C_m是直线的截距和斜率，t是相对于剂量服用的小时数)，背景浓度以大约线性方式改变；(2)内源性的和摄取的维生素D₃的药代动力学行为相互之间是独立的，就是说，身体以相同的方式处理内源性可获得的维生素D₃。无论添加的剂量是否是摄入的(在该研究的上下文中是治疗的和未治疗的)，在剂量施用前在体内存在可变量的该化合物时，也同样地处理摄入的维生素D₃；(3)以与当施用内源性化合物(大部分药物产物)时所观察到的类似的药物动力学方式服用剂量后，浓度分布图回到基线，(即，回到基线的末期相将是log线性)。

根据这些假设，通过最小平方最小化法描述该方式的基线的总和的函数C_t＝C_i+C_m·t和两室模型(见下面等式)适合个体C_t对t分布图(-24到服药后120小时)，使用在微软EXCEL(Solver Routine)中所进行的普遍减少的梯度非线性优化法。强制该适合以产生近似接近基线log线性行为的终末相。然后使用每个分布图的最适系数以在服药后0-120小时的范围内插入基线值并且从每个分布图中减去所插入的基线。

$C_t=C_i+C_{m}t+A{e}^{-k_d(t-t_{\log })}+{\mathrm{Be}}^{-k_{e1}(t-t_{\log })}-(A+B)e^{-k_a(t-t_{\log })}$

其中

t＝相对于剂量服用的时间

C_t＝预测的血清中维生素D₃的浓度

C_i＝预测的在t＝0时的基线值

C_n＝预测的基线的斜率

以及A、B、K_d、K_e1和K_a是具有第一顺序吸收的两室模型的参数，t_lag是口服维生素D₃后的个体吸收延迟。

以与上述使用第一测量法相同的方式计算使用该模型所测量的药代动力学参数(AUC_0-120小时、C_max、T_max)。在下面的表7-5中表示36小时后阿仑膦酸的总尿排泄的总结性的统计数值。之后，对于70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂和单独的70mg阿仑膦酸，单剂量、阿仑膦酸的总尿排泄的LS均值分别是197.5和191.9μg。阿仑膦酸(70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂对单独的70mg阿仑膦酸片剂)的总的尿排泄的GMR和相应的90％CI是1.03(0.91，1.17)。90％CI落入预先确定的生物等效性范围(0.80，1.25)内。

表7-5

服用单剂量的70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂或单独的70mg阿仑膦酸片剂后，阿仑膦酸(μg)总的尿排泄的总结性统计数值和具有相应的90％置信区间的GMR

治疗	N	LS_均值	中位数	最小	最大	SD_	GMR§	GMR的90％CI‖
									阿仑膦酸+维生素D3阿仑膦酸	207207	197.5191.9	209.8204.4	11.30.1	3617.71629.6	329.1522.2	1.03	(0.91，1.17)
ANOVA模型中log数值的均方根误(RMSE)＝0.778_LS＝最小平方(从log数值的后一转化)_SD＝从log数值后一转化的受试者间的标准差§GMR＝几何均值比(阿仑膦酸+维生素D3的LS均值/阿仑膦酸的LS均值)‖CI＝置信区间

关于血浆测量值，对于70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂和2800IU维生素D₃片剂，维生素D₃AUC_0-120小时(不考虑内源性维生素D₃血清浓度)的LS均值分别是296.4和337.9ng·h/mL(表7-6)。AUC_0-120小时GMR(阿仑膦酸加维生素D₃组合片剂/维生素D₃片剂)是0.88，具有90％CI(0.81，0.95)。

表7-6

服用70mg阿仑膦酸加2800IU维生素D₃组合片剂或单独的2800IU维生素D₃片剂的单剂量后，不考虑内源性维生素D₃血清浓度的维生素D₃AUC_0-120小时(ng.hr/ml)的总结性统计数值和具有相应的90％置信区间的GMR

治疗	N	LS均值_	中位数	最小	最大	受试者间SD_	GMR§	GMR的90％CI‖
									阿仑膦酸/维生素D3单独的维生素D3	2828	296.4337.9	257.5309.6	85.0111.9	1648.81485.9	375.5344.2	0.88	(0.81，0.95)
均方根误(RMSE)＝0.168(ANOVA模型的)_从log数值后转化的最小平方均值_SD＝从log数值后转化的标准差§GMR＝几何均值比(维生素D3+阿仑膦酸的LS均值/维生素D3的LS均值)‖CI＝置信区间

对于70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂和2800IU维生素D₃片剂，维生素D₃C_max的LS均值，不考虑内源性维生素D₃血清浓度，分别是5.9和6.6ng/mL(表7-7)。C_max的GMR(阿仑膦酸加维生素D₃组合片剂/维生素D₃片剂)是0.89，具有90％CI(0.84，0.95)。AUC_0-120小时的90％CI和不考虑维生素D₃血清浓度的C_maxGMR，落入预先确定的生物等效性范围(0.80，1.25)内。

表7-7

服用70mg阿仑膦酸加2800IU维生素D₃组合片剂或单独的2800IU维生素D₃片剂的单剂量后，不考虑内源性维生素D₃血清浓度的维生素D₃C_max(ng/mL)的总结性的统计学数值和具有相应的90％置信区间的GMR

治疗	N	LS均值_	中位数	最小	最大	受试者间SD_	GMR§	GMR的90％CI‖
									阿仑膦酸/维生素D3单独的维生素D3	2828	5.96.6	5.36.2	2.53.5	17.418.1	3.33.1	0.89	(0.84，0.95)
均方根误(RMSE)＝0.138(ANOVA模型的)_从log数值后转化的最小平方均值_SD＝从log数值后转化的标准差§GMR＝几何均值比(维生素D3+阿仑膦酸的LS均值/维生素D3的LS均值)‖CI＝置信区间

表7-8显示不考虑内源性维生素D₃T_max血清浓度，从血清分布图中获得的维生素D₃的统计分析的结果。具有和不具有阿仑膦酸的维生素D₃的中间T_max分别是12.0和9.0小时。观察到治疗之间没有显著差异(p值＞0.200)。

表7-8

服用70mg阿仑膦酸加2800IU维生素D₃组合片剂或单独的2800IU维生素D₃片剂的单剂量后，不考虑内源性维生素D₃血清浓度，从血清分布图中获得的维生素D₃ T_max(小时)的总结性统计数值

治疗	N	中位数	最小	最大	受试者间SD_	p值_
							阿仑膦酸/维生素D3单独的维生素D3	2828	12.09.0	7.07.0	16.016.0	2.62.3	0.978
_SD＝标准差_使用排列分析计算p值

对于70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂和2800IU维生素D₃片剂，维生素D₃AUC_0-120小时的LS均值分别是297.5和336.7ng·h/mL(表7-9)。AUC_0-120小时GMR(阿仑膦酸加维生素D，组合片剂/维生素D₃片剂)是0.88，具有90％CI(0.82，0.95)。

表7-9

服用70mg阿仑膦酸加2800IU维生素D₃组合片剂或单独的2800IU维生素D₃片剂的单剂量后，以时间＝0时服药前维生素D₃浓度作为Covariate，维生素D₃AUC_0-120小时(ng·h/ml)的总结性统计数值和具有相应的90％置信区间的GMR

治疗	N	LS均值_	中位数	最小	最大	受试者间SD_	GMR§	GMR的90％CI‖
									阿仑膦酸/维生素D3单独的维生素D3	2828	297.5336.7	257.5309.6	85.0111.9	1648.81485.9	376.8343.0	0.88	(0.82，0.95)
均方根误(RMSE)＝0.154(ANOVA模型的)_从log数值后转化的最小平方均值_SD＝从log数值中后转化的标准差§GMR＝几何均值比(维生素D3+阿仑膦酸的LS均值/维生素D3的LS均值)‖CI＝置信区间

对于70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂和2800IU维生素D₃片剂，维生素D₃的LS均值C_max分别是5.9和6.6ng/mL，如下面的表7-10所示。C_maxGMR(70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂/2800IU维生素D₃片剂)是0.90，具有90％CI(0.85，0.95)。AUC_{0-120 小时}和具有在时间＝0时的服药前维生素D₃浓度作为covariate的C_maxGMR的90％CI，落入预先指定的生物等效性范围(0.80，1.25)内。

表7-10

服用70mg阿仑膦酸加2800IU维生素D₃组合片剂或单独的2800IU维生素D₃片剂后，具有在时间＝0时的服药前维生素D₃浓度作为Covariate的维生素D₃C_max(ng/ml)的总结性统计数值和具有相应的90％置信区间的GMR

治疗	N	LS均值_	中位数	最小	最大	受试者间SD_	GMR§	GMR的90％CI‖
									阿仑膦酸/维生素D3单独的维生素D3	2828	5.96.6	5.36.2	2.53.5	17.418.1	3.33.1	0.90	(0.85，0.95)
均方根误(RMSB)＝0.115(ANOVA模型的)_从log数值中后转化的最小平方均值_SD＝从log数值中后转化的标准差§GMR＝几何均值比(维生素D3+阿仑膦酸的LS均值/维生素D3的LS均值)‖CI＝置信区间

在表7-11中总结使用基于模型的维生素D₃基线浓度所测量的维生素D₃的AUC_0-120小时的数据分析的结果。对于70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂和2800IU维生素D₃片剂，使用基于模型的维生素D₃基线浓度所测量的维生素D₃AUC_0-120小时的LS均值分别是143.1和169.lng·h/mL。AUC_0-120小时GMR(阿仑膦酸加维生素D₃组合片剂/维生素D₃片剂)是0.85，具有90％CI(0.76，0.94)。90％CI的更低限度恰好落入预先指定的更低的0.80范围下面。

表7-11

服用70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂的单剂量后，使用基于模型的维生素D₃基线浓度测量的维生素D₃AUC0-120小时(ng.hr/ml)的总结性统计数值和具有相应的90％置信区间的GMR

治疗	N	LS均值_	中位数	最小	最大	受试者间SD_	GMR§	GMR的90％CI‖
									阿仑膦/维生素D3单独的维生素D3	2828	143.1169.1	153.5175.0	61.1107.2	236.1251.4	47.737.3	0.85	(0.76，0.94)
均方根误(RMSE)＝0.224(ANOVA模型的)_从log数值中后转化的最小平方均值_SD＝从log数值中后转化的标准差§GMR＝几何均值比(维生素D3+阿仑膦酸的LS均值/维生素D3的LS均值)‖CI＝置信区间

对于70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂和2800IU维生素D₃片剂，使用基于模型的维生素D₃基线浓度所测量的维生素D₃的LS均值C_max分别是4.0和4.6ng/mL，如表7-12所示。C_maxGMR(70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂/2800IU维生素D₃片剂)是0.88，具有90％CI(0.83，0.93)。使用基于模型的维生素D₃基线浓度所测量的C_maxGMR的90％CI落入预先指定的生物等效性范围(0.80，1.25)内。

表7-12

服用70mg阿仑膦酸加2800IU维生素D₃组合片剂或单独的2800IU维生素D₃片剂的单剂量后，使用基于模型的维生素D₃基线浓度所测量的维生素D₃C_max的总结性统计数值和具有相应的90％置信区间的GMR

治疗	N	LS均值_	中位数	最小	最大	受试者间SD_	GMR§	GMR的90％CI‖
									阿仑膦酸/维生素D3单独的维生素D3	2828	4.04.6	4.04.6	1.93.0	6.07.2	1.10.9	0.88	(0.83，0.93)
均方根误(RMSE)＝0.115(ANOVA模型的)_从log数值中后转化的最小平方均值_SD＝从log数值中后转化的标准差§GMR＝几何均值比(维生素D3+阿仑膦酸的LS均值/维生素D3的LS均值)‖CI＝置信区间

表7-13显示从使用基于模型的基线维生素D₃T_max浓度所测量的分布图中获得的维生素D₃的统计分析的结果。具有或没有阿仑膦酸的维生素D₃的中位数T_max分别是12.0和9.0小时。观察到治疗之间没有显著差异(p值＞0.200)。

表7-13

服用70mg阿仑膦酸加2800IU维生素D₃组合片剂或单独的2800IU维生素D₃片剂的单剂量后，从使用基于模型的基线维生素D₃浓度测量的分布图中获得的维生素D₃T_max(小时)的总结性统计数值

治疗	N	中位数	最小	最大	受试者间的SD_	P值_
							阿仑膦酸/维生素D3单独的维生素D3	2828	12.09.0	7.07.0	16.016.0	2.62.3	0.978
_SD＝标准差_使用排列分析计算p值

在表7-14中总结了使用基于模型的维生素D₃背景浓度所测量的维生素D₃的t_1/2的数据分析的结果。具有和不具有阿仑膦酸的维生素D₃的调和平均表观t_1/2分别是24.0和25.5小时：观察到治疗之间没有显著差异(p值＞0.200)。

表7-14

服用70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃组合片剂或单独的2800IU维生素D₃片剂的单剂量后，使用基于模型的维生素D₃基线浓度所测量的维生素D₃的表观t_1/2(小时)的总结性统计数值

治疗	N	调和平均	受试者间SD_	最小	中位数	最大	P值_
								维生素D3+阿仑膦酸维生素D3	2828	23.823.2	11.918.5	11.55.3	24.025.5	100.8188.0	0.833
_SD＝标准差_使用反转化计算p值

实施例8

降解检测法

已发展了用于阿仑膦酸/维生素D₃组合片剂(70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃)中维生素D₃的组合物分析的方法。从溶于约50mL 5％水/95％甲醇稀释液的15个片剂中提取维生素D₃。将溶液搅拌10分钟，超声处理30分钟，以及再搅拌3小时。将样本离心并将100μL的上清液注射到用于反相HPLC分析的Phenomenex Phenosphere 80_ODS(1)柱(150×4.6mm，3μm)上。该方法是具有265nm检测波长的65分钟梯度法。定量前维生素D₃和维生素D₃峰并合计以计算样本中维生素D₃的总量。证实该方法达到满意的特异性、线性、回收、精确、再现性、溶解稳定性、灵敏度和强大。

下面列出示例性的层析条件：

流速	1.2mL/分钟
		柱温度	25℃
注射体积	100μL
		流动相	梯度，A＝0.025％磷酸，B＝99％乙腈/1％A
流动时间	65分钟
		柱	Phenosphere 80_，ODS(1)柱，150×4.6mm，3μm
样品盘温度	5℃
		检测器波长	265nm

梯度时间表

T(分钟)	0	16	39	43	57	57.01	65
								％水性的％混合物	51.548.5	1387	1090	0100	0100	51.548.5	51.548.5

组合片剂的制剂组合物(70mg阿仑膦酸/2800IU维生素D₃)

组合物	单位重量(mg)	重量％
			阿仑膦酸钠Dry维生素D3100颗粒Avicel PH102乳糖，无水交联羧甲基纤维素钠胶体二氧化硅颗粒内硬脂酸镁颗粒外硬脂酸镁	91.526.7*13162.29.750.812.280.81	28.2％8.2％40.3％19.1％3.00％0.25％0.70％0.25％
片剂重量	325	100％

*26.7克Dry维生素D₃100颗粒含有105,000IU/g维生素D₃

在表8-1中呈现关于维生素D₃的赋形剂峰和具有它们的典型的保留时间和相对的保留时间(RRT)的降解物。如图5所示，维生素D₃的主要降解途径是光异构化、热异构化以及酯基转移。

表8-1

用于组合片剂的峰鉴别的总结

保留时间(分钟)	RRT	分类
			3.08	0.09	赋形剂相关的
3.63	0.10	赋形剂相关的
			3.88	0.108	赋形剂相关的
4.05	0.11	赋形剂相关的
			4.23	0.12	赋形剂相关的
4.78	0.13	赋形剂相关的
			7.53	0.21	未知的
11.33	0.32	赋形剂相关的
			17.25	0.48	未知的
17.47	0.49	赋形剂相关的
			18.05	0.50	赋形剂相关的
20.64	0.57	赋形剂相关的
			26.70	0.74	反式维生素D3
28.15	0.78	维生素D3异构体
			31.33	0.87	前维生素D3
34.42	0.96	维生素D3异构体
			35.94	1.00	维生素D3
39.17	1.09	维生素D3异构体
			43.45	1.21	赋形剂相关的
49.85	1.39	C8-维生素D3酯
			54.52	1.40	C8-前维生素D3酯
50.52	1.52	C10-维生素D3酯
			55.65	1.55	C10-前维生素D3酯

通过注射不同浓度的维生素D₃溶液并选择具有信号-噪音比高于10的最低浓度，测定定量的限度(LOQ)。测定LOQ是约9ng/mL(注射体积100μL)，其是对于10次重复测定具有平均信号-噪音比为11.1的该方法浓度的0.04％。

实施例9

每周一次服药方案

可制备含有根据阿仑膦酸活性，约70mg阿仑膦酸和约5,600IU维生素D的阿仑膦酸和维生素D片剂或其它固体制剂。(见实施例1、2和3)。可向受试者每周一次口服施用该片剂或其它固体剂型，即，优选地约每7天一次(例如，每个星期天)，至少一年的周期。预计该施用方法在提供维生素D营养的时候可用于和便于治疗或预防骨质疏松。也预计该方法可用于改善受试者接受和顺从性，并且确保所有服用二膦酸的受试者接受足够的维生素D营养。

可选择地，可制备含有根据阿仑膦酸活性，约70mg阿仑膦酸和约2,800IU维生素D的阿仑膦酸和维生素D片剂或其它固体制剂。(见，例如，实施例1和3)。可向受试者每周一次口服施用该片剂或其它固体剂型，即，优选地约每7天一次(例如，每个星期天)，至少一年的周期。预计该施用方法在提供维生素D营养的时候可用于和便于治疗或预防骨质疏松。也预计该方法可用于改善受试者接受和顺从性，并且确保所有服用二膦酸的受试者接受足够的维生素D营养。

可选择地，可制备含有根据阿仑膦酸活性，约35mg-约70mg阿仑膦酸和约2,800IU维生素D的阿仑膦酸和维生素D片剂或其它固体制剂。(见，例如，实施例3)。可向受试者每周一次口服施用该片剂或其它固体剂型，即，优选地约每7天一次(例如，每个星期天)，至少一年的周期。预计该施用方法在提供维生素D营养的时候可用于和便于治疗或预防骨质疏松。也预计该方法可用于改善受试者接受和顺从性，并且确保所有服用二膦酸的受试者接受足够的维生素D营养。

可制备含有根据阿仑膦酸活性，约280mg阿仑膦酸和约5,600IU维生素D的阿仑膦酸和维生素D片剂或其它固体制剂。(见，例如，实施例2和3)。可向受试者每周一次口服施用该片剂或其它固体剂型，即，优选地约每7天一次(例如，每个星期天)，至少1-6个月的周期。预计该施用方法在提供维生素D营养的时候可用于和便于治疗Paget病。也预计该方法可用于改善受试者接受和顺从性，并且确保所有服用二膦酸的受试者接受足够的维生素D营养。

可选择地，可制备含有根据阿仑膦酸活性，约280mg阿仑膦酸和约2,800IU维生素D的阿仑膦酸和维生素D片剂或其它固体制剂。(见，例如，实施例3)。可向受试者每周一次口服施用该片剂或其它固体剂型，即，优选地约每7天一次(例如，每个星期天)，至少1-6个月的周期。预计该施用方法在提供维生素D营养的时候可用于和便于治疗Paget病。也预计该方法可用于改善受试者接受和顺从性，并且确保所有服用二膦酸的受试者接受足够的维生素D营养。

可制备含有根据阿仑膦酸活性，约280mg阿仑膦酸和5,600IU或2,800IU维生素D的阿仑膦酸和维生素D片剂或其它固体制剂。(见，例如，实施例1、2和3)。可向受试者每周一次口服施用该片剂或其它固体剂型，即，优选地约每7天一次(例如，每个星期天)。预计该施用方法在提供维生素D营养的时候可用于和便于治疗转移性骨病。也预计该方法可用于改善受试者接受和顺从性，并且确保所有服用二膦酸的受试者接受足够的维生素D营养。

可在不偏离本发明或权利要求的范围或精神，对本发明的方法和组合物进行各种修饰用于抑制骨吸收，这对于本领域的那些技术人员将会是显而易见的。也打算本发明和所附的权利要求覆盖发明和组合物的修饰、变化和等同物用于抑制本发明的骨吸收。

Claims (50)

1、一种药物组合物，包含：二膦酸、二膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物；以及维生素D化合物。

2、权利要求1的药物组合物，其中二膦酸具有化学式：

其中，R₁独立地选自H、OH和Cl，R₂独立地选自CH₃、Cl、CH₂CH₂NH₂、(CH₂)₃NH₂、CH₂-3-吡啶基、CH₂-S-苯基-Cl、CH₂CH₂N(CH₃)(戊基)、CH₂-咪唑、CH₂-2-咪唑并-吡啶基、N-(环庚基)、CH₂CH(CH₃)₂、(CH₂)₅NH₂、和CH₂-1-吡咯烷基，及其它们的组合。

3、权利要求1的药物组合物，其中二膦酸包括阿仑膦酸或其药学上可接受的盐。

4、权利要求3的药物组合物，其中阿仑膦酸的药学上可接受的盐选自阿仑膦酸一钠、阿仑膦酸一钠一水合物和阿仑膦酸一钠三水合物。

5、权利要求1的药物组合物，其中该药物组合物包含约100IU-约36,000IU的维生素D化合物。

6、权利要求5的药物组合物，其中维生素D化合物是胆钙化固醇。

7、权利要求1的药物组合物，其中该药物组合物包含约0.5mg-约1120mg二膦酸，或者二膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物。

8、权利要求1的药物组合物，其中该药物组合物包含约2,800IU胆钙化固醇和约70mg阿仑膦酸或阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物。

9、权利要求1的药物组合物，其中该药物组合物包含约5,600IU胆钙化固醇和约70mg阿仑膦酸或阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物。

10、权利要求1的药物组合物，进一步包含选自填充剂、稀释剂、粘合剂、润滑剂、助流剂或崩解剂中的一种或多种赋形剂。

11、权利要求1的药物组合物，进一步包含选自无水乳糖、微晶纤维素、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠或硬脂酸镁中的一种或多种赋形剂。

12、权利要求11的药物组合物，其中药物组合物包含约0.5％-约90％重量的阿仑膦酸钠、约1％-约70％重量的胆钙化固醇颗粒(等于约0.0005％-约20％重量的胆钙化固醇)、约10％-约80％重量的无水乳糖、约5％-约50％重量的微晶纤维素、约0.1％-约5％重量的胶体二氧化硅、约0.5％-约10％重量的交联羧甲基纤维素钠和约0.5％-约5％重量的硬脂酸镁。

13、权利要求6的药物组合物，其中胆钙化固醇包括药物级胆钙化固醇。

14、权利要求13的药物组合物，其中药物组合物适于以每周一次、每两周一次、每月一次、每月两次和每两月一次的时间间隔施用。

15、一种在哺乳动物中预防、抑制、减少或治疗代谢性骨病的方法，包括向哺乳动物施用包含二膦酸，二膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物，和维生素D化合物的药物组合物。

16、权利要求15的方法，其中二膦酸包括阿仑膦酸或其药学上可接受的盐。

17、权利要求15的方法，其中维生素D化合物是胆钙化固醇。

18、权利要求17的方法，其中维生素D化合物包括约100IU-约36,000IU胆钙化固醇，其中二膦酸化合物包括约0.5mg-约1120mg阿仑膦酸，或者阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物。

19、权利要求15的方法，其中二膦酸包括阿仑膦酸一钠三水合物，药物组合物包含约2.5mg-约560mg阿仑膦酸一钠三水合物。

20、权利要求18的方法，其中药物组合物包含约2800IU胆钙化固醇，以及约70mg阿仑膦酸或阿仑膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物。

21、权利要求15的方法，其中代谢性骨病选自骨质疏松、绝经后骨质疏松、类固醇诱导的骨质疏松、男性骨质疏松、其它疾病诱导的骨质疏松、原发性骨质疏松以及糖皮质激素诱导的骨质疏松。

22、权利要求15的方法，包括向患有维生素D缺乏或不足的哺乳动物施用包含二膦酸，二膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物；和胆钙化固醇的药物组合物。

23、用于在哺乳动物中预防、抑制、减少或治疗关节炎病症的方法，包括向哺乳动物施用权利要求1的药物组合物，该组合物包含：

二膦酸，二膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物；和维生素D化合物。

24、用于在哺乳动物中预防、抑制、减少或治疗骨吸收的方法，包括向哺乳动物口服施用权利要求1的药物组合物，其中根据具有每周一次的服药间隔的连续的给药时间表，药物组合物作为单位剂量施用。

25、用于在哺乳动物中预防、抑制、减少或治疗骨质疏松的方法，包括向哺乳动物口服施用权利要求1的药物组合物，其中根据具有每周一次的服药间隔的连续的给药时间表，药物组合物作为单位剂量施用。

26、用于在哺乳动物中减少骨折风险的方法，包括向哺乳动物口服施用权利要求1的药物组合物，其中根据具有每周一次的服药间隔的连续的给药时间表，药物组合物作为单位剂量施用。

27、一种制备阿仑膦酸-胆钙化固醇组合物的方法，包括：

制备包含阿仑膦酸的粉末混合物；

将粉末混合物压紧以形成阿仑膦酸混合物；

碾磨并将阿仑膦酸混合物与胆钙化固醇颗粒混合以形成终混合物；以及润滑并压缩终混合物。

28、一种制备阿仑膦酸-胆钙化固醇固体剂型的方法，包括：

将阿仑膦酸、胶体二氧化硅、无水乳糖、微晶纤维素和交联羟甲基纤维素钠混合以形成预混合物；

将预混合物和硬脂酸镁混合以形成第一润滑的混合物；

滚筒压紧第一润滑的混合物以形成压紧的带状物；

碾磨压紧的带状物以形成润滑的混合物；

将润滑的混合物与胆钙化颗粒混合以形成第二润滑的混合物；以及将第二润滑的混合物压缩成固体剂型。

29、由权利要求28的方法所制备的药物组合物。

30、由如下方法所制备的权利要求1的药物组合物，包括：将包括约0.5％-约90％重量的阿仑膦酸钠、约0.1％-约5％重量的胶体二氧化硅、约10％-约80％重量的无水乳糖、约5％-约50％重量的微晶纤维素、约0.5％-约10％重量的交联羧甲基纤维素钠和约0.5％-约5％重量的硬脂酸镁的成分混合以形成第一混合物；

滚筒压紧第一混合物以形成压紧的带状物；

碾磨压紧的带状物以形成润滑的混合物；

将润滑的混合物与约1％-约70％重量的胆钙化固醇颗粒(等于约0.0005％-约20％重量的胆钙化固醇)混合以形成第二混合物；和

将第二混合物压缩成固体剂型。

31、权利要求6的药物组合物，其中配制组合物以便在约＜30℃和约＜30％相对湿度贮藏24月后包含胆钙化固醇的每种异构体小于约1％重量。

32、权利要求6的药物组合物，其中配制组合物以便在约＜30℃和约＜30％相对湿度贮藏24月后包含小于约5％重量的胆钙化固醇的降解物。

33、一种药物组合物，包含：

二膦酸，二膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物；

胆钙化固醇；

其中胆钙化固醇的治疗作用基本上类似于施用一周每天约400IU胆钙化固醇的治疗作用；其中药物组合物适于每周一次服药。

34、一种测量权利要求1的药物组合物中胆钙化固醇的方法，包括：

从药物组合物中提取胆钙化固醇到第一溶液中以形成第二溶液；

从第二溶液中分离含有胆钙化固醇的样本；和

检测样本中胆钙化固醇的量；其中使用反相高效液相层析(HPLC)分离法进行检测。

35、权利要求34的方法，其中进行检测以检测每个药物组合物中约2800IU-约5600IU胆钙化固醇。

36、权利要求34的方法，其中检测具有小于约9ng/mL胆钙化固醇的胆钙化固醇定量限度(LOQ)。

37、权利要求34的方法，其中使用具有无末端加帽或部分末端加帽的反相HPLC柱进行检测。

38、权利要求34的方法，其中使用具有碳负荷小于约10％碳的反相HPLC柱进行检测。

39、在哺乳动物体内保持药学上有效量的胆钙化固醇的方法，包括每周一次施用权利要求1的药物组合物，该组合物包含：

约70mg二膦酸，二膦酸的药学上可接受的盐、衍生物或水合物，或其混合物；和

约2800IU胆钙化固醇。

40、权利要求1的药物组合物，其中二膦酸是阿仑膦酸钠，施用组合物的哺乳动物之阿仑膦酸钠血浆浓度的图基本上类似在无胆钙化固醇时施用70mg阿仑膦酸钠的哺乳动物的血浆浓度的图。

41、权利要求1的药物组合物，其中二膦酸是阿仑膦酸钠，施用组合物的哺乳动物之胆钙化固醇血浆浓度的图基本上类似在无阿仑膦酸时施用2800IU胆钙化固醇的哺乳动物的血浆浓度的图。

42、权利要求1的药物组合物，其中施用组合物120小时后哺乳动物的血清浓度的图产生至少下列之一：

胆钙化固醇的最小平方(LS)均值AUC_{(0-120小时)}是约296.4ng.h/mL，其中测量药代动力学参数，不考虑基线胆钙化固醇血清浓度；

最小平方(LS)均值AUC_{(0-120小时)}是约297.5ng.h/mL，其中考虑基线胆钙化固醇血清浓度，使用服药前0小时血清胆钙化固醇浓度作为协变量，测量药代动力学参数；和

最小平方(LS)均值AUC_{(0-120小时)}是约143.1ng.h/mL，其中考虑基线胆钙化固醇血清浓度，减去120小时后估计的基线胆钙化固醇，测量药代动力学参数。

43、权利要求1的药物组合物，其中施用组合物后120小时哺乳动物的血浆浓度的图产生至少下列之一：

120小时后稳态最大血浆浓度(C_max)的最小平方(LS)均值是约5.9ng/mL，其中测量药代动力学参数，不考虑基线胆钙化固醇血清浓度；

120小时后稳态最大血浆浓度(C_max)的最小平方(LS)均值是约5.9ng/mL，其中考虑基线胆钙化固醇血清浓度，使用服用前0小时血清胆钙化固醇浓度作为协变量，测量药代动力学参数；和

稳态最大血浆浓度(C_max)的最小平方(LS)均值是约4.0ng/mL，其中考虑基线胆钙化固醇血清浓度，减去120小时后估计的基线胆钙化固醇，测量药代动力学参数。

44、权利要求1的药物组合物，其中施用用组合物120小时后，哺乳动物的胆钙化固醇的血浆浓度的图产生：

在约12小时发生C_max的算术平均时间(T_max)的胆钙化固醇的稳态最大血浆浓度(C_max)，其中不考虑基线胆钙化固醇血清浓度，测量药代动力学参数。

45、权利要求1的药物组合物，其中哺乳动物中组合物的胆钙化固醇的血浆浓度中位数表观半衰期(t_1/2)是约23.8小时，其中考虑基线胆钙化固醇血清浓度，减去估计的基线胆钙化固醇，测量药代动力学参数。

46、测量哺乳动物血清中胆钙化固醇的方法，包括：

向哺乳动物施用权利要求1的包含阿仑膦酸和胆钙化固醇的组合物；

从哺乳动物中获得血浆样本；

从血浆样本中提取胆钙化固醇以形成第一溶液；

将第一溶液中的胆钙化固醇与亲二烯体反应以形成胆钙化固醇的一种或多种狄耳斯-阿德耳加成产物；

使用高效液相层析(HPLC)分离法分离胆钙化固醇的狄耳斯-阿德耳加成产物；和

使用质谱检测样本中胆钙化固醇的量。

47、权利要求46的方法，进一步包括向每个哺乳动物血浆样本中添加氘化内标准胆钙化固醇，提取、反应、分离和检测氘化的内标准胆钙化固醇和样本胆钙化固醇。

48、权利要求46的方法，其中当测量1mL血浆时检测具有小于约0.5ng/mL胆钙化固醇的胆钙化固醇定量限度(LOQ)。

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