JP2015166740A - 複合試料中のステロイド化合物の質量分析 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、質量分析によるステロイド化合物の定量的測定に関する。特定の態様におい
て、本発明は、質量分析による複数の試料からのステロイド化合物の定量的測定の方法に
関する。
ステロイド化合物は、4つの環に配置された17個の炭素原子を基本として有し、ステ
ロール及び胆汁酸、副腎及び性ホルモン、ジギタリス化合物などの特定の天然薬物、並び
に特定のビタミン及び関連化合物(ビタミンD、ビタミンD類似体及びビタミンD代謝物
など)を含む多数の天然に存在する又は合成脂溶性有機化合物のいずれかである。
ム(Ca2+)恒常性の正の制御に重要な生理学的役割を有する必須栄養素である。ビタ
ミンDは、日光への曝露により皮膚で新たに産生され得る。或いはビタミンDは、食事か
ら吸収され得る。2つの形態のビタミンD、すなわち、ビタミンD2(エルゴカルシフェ
ロール)とビタミンD3(コレカルシフェロール)が存在する。ビタミンD3は、動物に
より新規に合成される形である。これは、米国で製造される乳製品及び特定の食品に添加
される一般的な栄養補助食品でもある。食事性及び内因的に合成されたビタミンD3は、
生物活性代謝物を生ずるために代謝活性化を受けなければならない。ヒトにおいて、ビタ
ミンD3の活性化の最初の段階は、主として肝臓で起こり、中間代謝物25−ヒドロキシ
コレカルシフェロール(カルシフェジオール;25OHD3)を生成するヒドロキシル化
を伴う。カルシフェジオールは、循環におけるビタミンD3の主な形である。循環25O
HD3は、次に腎臓により変換されて、最も高い生物学的活性を有するビタミンD3の代
謝物であると一般的に考えられている1,25−ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリ
オール;1,25(OH)2D3)を生ずる。
シフェロール(ビタミンD3)ではなくエルゴカルシフェロール(ビタミンD2)を含む
。米国において入手できる唯一の高い効力の処方箋薬の形のビタミンDであるドリスドル
(Drisdol)は、エルゴカルシフェロールを用いて製剤化されている。ビタミンD2は、
ヒトにおいてビタミンD3と同様の経路の代謝活性化を受けて、代謝物25OHD2及び
1,25(OH)2D2を生ずる。ビタミンD2とビタミンD3は、ヒトにおいて生物学
的に同等であると長年にわたり推測されていたが、最近の報告で、これらの2つの形態の
ビタミンDの生物学的活性及び生物学的利用能の差異があり得ることが示唆されている(
Armasら、(2004年)、J. Clin. Endocrinol. Metab.、89巻、5387〜5391頁)。
5−ヒドロキシビタミンD3、25−ヒドロキシビタミンD2及び総25−ヒドロキシビ
タミンD(「25OHD」)の血清レベルは、ビタミンD栄養状態及び特定のビタミンD
類似体の有効性の有用な指標である。25OHDの測定は、カルシウム代謝の障害の診断
及び管理に一般的に用いられている。この点に関して、25OHDの低いレベルは、低カ
ルシウム血症、低リン酸血症、二次性副甲状腺機能亢進症、アルカリホスファターゼの上
昇、成人における骨軟化症及び小児におけるくる病などの疾患に関連するビタミンDの欠
乏を示す。ビタミンD中毒の疑いのある患者において、25OHDのレベルの上昇により
、この障害を高カルシウム血症を引き起こす他の障害と区別することができる。
OH)2Dの循環レベルに反映され、例えば、腎疾患及び腎不全は、1,25(OH)2
Dの低いレベルをしばしばもたらし得る。1,25(OH)2Dのレベルの上昇は、過剰
な副甲状腺ホルモンを示し得るものであり、或いはサルコイドーシス又はある種のリンパ
腫など特定の疾患を示し得る。
用いた放射免疫測定法により実施されている。現在の免疫学に基づくアッセイは、25O
HD2及び25OHD3を別々に分析しないため、他の試験を用いずにビタミンDの栄養
欠乏の原因を確定することができない。質量分析を用いて特定のビタミンD代謝物を検出
する方法を開示する報告が公表された。一部の報告において、質量分析の前にビタミンD
代謝物が誘導体化されたが、他の報告では、それらが誘導体化されなかった。例えば、2
007年12月28日に出願されたHolmquistら、米国特許出願第11/946765号
;Yeung Bら、J Chromatogr.、1993年、645巻(1号)、115〜23頁;Higashi Tら、Steroids
.、2000年、65巻(5号)、281〜94頁;Higashi Tら、Biol Pharm Bull、2001年、24巻(7号)
、738〜43頁;Higashi Tら、J Pharm Biomed Anal.、2002年、29巻(5号)、947〜55頁;Hi
gashi Tら、Anal. Bioanal Chem、2008年、391巻、229〜38頁;及びAronovら、Anal Bioa
nal Chem、2008年、391巻、1917〜30頁は、質量分析の前に代謝物を誘導体化することに
より種々のビタミンD代謝物を検出する方法を開示している。非誘導体化ビタミンD代謝
物を検出する方法は、2005年4月6日に出願された米国特許出願第11/101,1
66号及び2006年3月21日に出願された第11/386,215号においてClarke
ら並びに2004年10月24日に出願された米国特許出願第10/977,121号に
おいてSinghらにより報告されている。クックソン型試薬、具体的には4−フェニル−1
,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)及び4−[2−(6,7−ジメト
キシ−4−メチル−3−オキソ−3,4−ジヒドロキノキサリル)エチル]−1,2,4
−トリアゾリン−3,5−ジオン(DMEQ−TAD)によるビタミンD3の誘導体化を
開示している報告も公表された。Aberhart Jら、J. Org. Chem.、1976年、41巻(12号)、2
098〜2102頁及びKamao Mら、J Chromatogr.、B 2007、859巻、192〜200頁を参照のこと。
本発明は、単一の質量分析により複数の試験試料のそれぞれにおけるステロイド化合物
の量を検出する方法を提供する。該方法は、各試験試料を別々に処理して複数の処理済み
試料を調製するステップであって、処理の結果として、各処理済み試料中のステロイド化
合物が他の処理済み試料中のステロイド化合物と質量分析により区別できる、ステップと
;処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと;質量分析により検出できる1つ
又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合試料をイオン化源にさらすステッ
プであって、各処理済み試料からのステロイド化合物から発生する1つ又は複数のイオン
が他の処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンと異なっている
、ステップと;質量分析により各処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複
数のイオンの量を検出するステップと;各処理済み試料からのステロイド化合物からの1
つ又は複数のイオンの量を各試験試料中のステロイド化合物の量と関連づけるステップと
を含む。
化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異なる誘導体化剤にさらすステップを含む
。いくつかの実施形態において、1つの試験試料は、試料を誘導体化剤にさらすことなく
処理してもよい。
いの同位体バリアントである。いくつかの実施形態において、異なる誘導体化剤は、クッ
クソン型誘導体化剤であり、例えば、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5
−ジオン(PTAD)、4−[2−(6,7−ジメトキシ−4−メチル−3−オキソ−3
,4−ジヒドロキノキサリル)エチル]−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(
DMEQTAD)、4−(4−ニトロフェニル)−1,2,4−トリアゾリン−3,5−
ジオン(NPTAD)、4−フェロセニルメチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−
ジオン(FMTAD)及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択されるクックソ
ン型誘導体化剤などである。1つの関連実施形態において、クックソン型誘導体化剤は、
4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の同位体バリア
ントである。特定の実施形態において、複数の試料は、2つの試料を含み、第1のクック
ソン型誘導化試薬は、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PT
AD)であり、第2のクックソン型誘導化試薬は、13C6−4−フェニル−1,2,4
−トリアゾリン−3,5−ジオン(13C6−PTAD)である。
合物である。関連実施形態において、ステロイド化合物は、ビタミンD2、ビタミンD3
、25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)、25−ヒドロキシビタミンD3(2
5OHD3)、1α,25−ジヒドロキシビタミンD2(1α,25OHD2)及び1α
,25−ジヒドロキシビタミンD3(1α,25OHD3)からなる群から選択される。
特定の実施形態において、ステロイド化合物は、25−ヒドロキシビタミンD2(25O
HD2)又は25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)である。
物の分析のために実施することができる。これらの実施形態の一部において、各試験試料
中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物は、25−ヒドロキシビタミンD2(25OH
D2)及び25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)からなる群から選択される少
なくとも1つのステロイド化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、各試験試料
中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物は、25−ヒドロキシビタミンD2(25OH
D2)及び25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)である。
ミンD又はビタミンD関連化合物の量を単一の質量分析により測定する。この実施形態に
おいて、1つ若しくは複数のビタミンD又はビタミンD関連誘導体を得るのに適する条件
下で4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第1の同
位体バリアントに第1の試験試料をさらすことによって第1の処理済み試料を調製し;1
つ若しくは複数のビタミンD又はビタミンD関連誘導体を得るのに適する条件下で4−フ
ェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第2の同位体バリア
ントに第2の試験試料をさらすことによって第2の処理済み試料を調製し、ここでPTA
Dの第1及び第2の同位体バリアントが質量分析により区別できるものであり;第1の処
理済み試料を第2の処理済み試料と合せて複合試料を調製し;質量分析により検出できる
1つ又は複数のイオンを得るのに適する条件下で複合試料中の各処理済み試料からの1つ
若しくは複数のビタミンD又はビタミンD関連誘導体をイオン化源にさらし、ここで第1
の処理済み試料からの各ビタミンD又はビタミンD関連誘導体からの1つ又は複数のイオ
ンが第2の処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体からの1つ又は複数
のイオンと異なっており;各処理済み試料からの1つ若しくは複数のビタミンD又はビタ
ミンD関連誘導体の量を質量分析により測定し;測定されたイオンの量を第1又は第2の
試験試料中のビタミンD又はビタミンD関連誘導体の量と関連づける。
5−ジオン(PTAD)の第1の同位体バリアントは、4−フェニル−1,2,4−トリ
アゾリン−3,5−ジオン(PTAD)であり、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリ
ン−3,5−ジオン(PTAD)の第2の同位体バリアントは、13C6−4−フェニル
−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(13C6−PTAD)である。
連化合物は、25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)及び25−ヒドロキシビタ
ミンD3(25OHD3)からなる群から選択される。いくつかの関連する特定の実施形
態において、1つ若しくは複数のビタミンD又はビタミンD関連化合物は、25−ヒドロ
キシビタミンD2(25OHD2)及び25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)
を含む。いくつかの関連する特定の実施形態において、1つ若しくは複数のビタミンD又
はビタミンD関連化合物は、25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)及び25−
ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)である。
析カラムにかける。いくつかの関連する実施形態において、抽出カラムは、固相抽出(S
PE)カラムである。他の関連する実施形態において、抽出カラムは、乱流液体クロマト
グラフィー(TFLC)カラムである。いくつかの実施形態において、分析カラムは、高
速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである。
、2つ又はそれ以上のこれらの構成要素は、自動試料処理及び分析を可能にするためにオ
ンライン式で接続することができる。
ム質量分析を用いる実施形態において、タンデム質量分析は、例えば、多重反応モニタリ
ング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンを含む当技術分野で公知のいずれ
かの方法により実施することができる。
適切なイオン化法によりイオン化することができる。いくつかの実施形態において、イオ
ン化源は、レーザーダイオード熱脱離(LDTD)イオン化源である。
プールして単一「複合」試料を調製することにより調製し、次に質量分析にかける試料を
意味する。本明細書で述べた方法において、2つ又はそれ以上の試験試料をそれぞれ別々
に処理して、複数の別々に処理された試料を調製する。これらの複数の別々に処理された
試料を次にプールして、単一「複合」試料を調製し、これを次に質量分析にかける。
れた17個の炭素原子を基本として有し、ステロール及び胆汁酸、副腎及び性ホルモン、
ジギタリス化合物などの特定の天然薬物、並びに特定のビタミン及び関連化合物(ビタミ
ンD、ビタミンD類似体及びビタミンD代謝物など)を含む多数の天然に存在する又は合
成脂溶性有機化合物のいずれかを意味する。
、天然若しくは合成形のビタミンD又はビタミンD代謝の中間体及び生成物などのビタミ
ンDの変換により生成したビタミンDに関連するいずれかの化学種を意味する。例えば、
ビタミンDは、ビタミンD2及びビタミンD3の1つ又は複数を意味し得る。ビタミンD
は、ビタミンDの変換により生成した化学種と区別するために「栄養」ビタミンDとも呼
ばれる。ビタミンD関連化合物は、ビタミンD2若しくはビタミンD3の類似体の生体内
変化により生成した化学種、又はビタミンD2若しくはビタミンD3に関連する化学種を
含み得る。ビタミンD関連化合物、具体的にはビタミンD代謝物は、動物の循環に見いだ
すことができ、且つ/又は動物などの生物有機体により生成される可能性がある。ビタミ
ンD代謝物は、天然に存在する形のビタミンDの代謝物であり得又は合成ビタミンD類似
体の代謝物であり得る。特定の実施形態において、ビタミンD関連化合物は、25−ヒド
ロキシビタミンD3、25−ヒドロキシビタミンD2、1α,25−ジヒドロキシビタミ
ンD3及び1α,25−ジヒドロキシビタミンD2からなる群から選択される1つ又は複
数のビタミンD代謝物を含み得る。
を生成することを意味する。したがって、誘導体化剤は、他の物質と反応して該物質を誘
導体化する作用剤である。例えば、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−
ジオン(PTAD)は、ビタミンD代謝物と反応させて、PTAD誘導体化ビタミンD代
謝物を生成させることができる誘導体化試薬である。
ができる誘導体化剤である。1例として、同じ誘導体化剤の2つの同位体バリアントは、
質量分析により区別することができる。他の例として、同じ誘導体化剤のハロゲン化変異
型も質量分析により区別することができる。例えば、4−フェニル−1,2,4−トリア
ゾリン−3,5−ジオン(PTAD)などの同じクックソン型作用剤のハロゲン化及び非
ハロゲン化異形を用いることができる。さらに、異なるハロゲンで、又は異なる数のハロ
ゲンでハロゲン化されたこと以外は同じクックソン型作用剤の2つのハロゲン化バリアン
トを用いることができる。他の例として、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3
,5−ジオン(PTAD)、4−メチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(
MTAD)及び4−(4−ニトロフェニル)−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオ
ン(NPTAD)などの2つの異なる同じクックソン型作用剤を用いることができる。上
の例は、質量分析により区別することができる誘導体化剤の原則を例示するものである。
上のいずれかの組合せを含む他の例は、当業者により理解されるように可能であり得る。
質に関する表示を含む。例えば、25−ヒドロキシビタミンD2のPTAD誘導体は、P
TAD−25−ヒドロキシビタミンD2(又はPTAD−25OHD2)と示す。
トリアゾリン−3,5−ジオン化合物である。具体例としてのクックソン型誘導体化剤は
、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)、4−メチル
−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(MTAD)、4−[2−(6,7−ジメ
トキシ−4−メチル−3−オキソ−3,4−ジヒドロキノキサリル)エチル]−1,2,
4−トリアゾリン−3,5−ジオン(DMEQTAD)、4−(4−ニトロフェニル)−
1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(NPTAD)及び4−フェロセニルメチル
−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(FMTAD)などである。さらに、クッ
クソン型誘導体化剤の同位体標識変体をいくつかの実施形態で用いることができる。例え
ば、13C6−PTAD同位体バリアントは、通常のPTADより6質量単位重く、いく
つかの実施形態で用いることができる。クックソン型試薬によるビタミンD及びビタミン
D関連化合物を含むステロイド化合物の誘導体化は、いずれかの適切な方法により実施す
ることができる。例えば、2007年12月28日に出願されたHolmquistら、米国特許
出願第11/946765号;Yeung Bら、J Chromatogr.、1993年、645巻(1号)、115〜2
3頁;Higashi Tら、Steroids.、2000年、65巻(5号)、281〜94頁;Higashi Tら、Biol Pha
rm Bull.、2001年、24巻(7号)、738〜43頁;Higashi Tら、J Pharm Biomed Anal.、2002
年、29巻(5号)、947〜55頁;Higashi Tら、Anal. Biochanal Chem、2008年、391巻、229
〜38頁;及びAronovら、Anal Bioanal Chem、2008年、391巻、1917〜30頁を参照のこと。
ドで実施する。或いは、質量分析を陰イオンモードで実施する。例えば、大気圧化学イオ
ン化(APCI)又はエレクトロスプレーイオン化(ESI)などの様々なイオン化源を
本発明の実施形態において用いることができる。特定の実施形態において、ビタミンD及
びビタミンD関連化合物を含むステロイド化合物をAPCIを用いて陽イオンモードで測
定する。
、その量も試料中で測定する。これらの実施形態において、試料中に存在する対象の分析
物(単数又は複数)及び内部標準(単数又は複数)の両方のすべて又は一部をイオン化し
て、質量分析計で検出できる複数のイオンを発生させ、それぞれから発生した1つ又は複
数のイオンを質量分析により検出する。具体例としての内部標準(単数又は複数)は、ビ
タミンD2−[6,19,19]−2H3、ビタミンD2−[24,24,24,25,
25,25]−2H6、ビタミンD3−[6,19,19]−2H3、ビタミンD3−[
24,24,24,25,25,25]−2H6、25OHD2−[6,19,19]−
2H3、25OHD2−[24,24,24,25,25,25]−2H6、25OHD
3−[6,19,19]−2H3、25OHD3−[24,24,24,25,25,2
5]−2H6、1α,25OHD2−[6,19,19]−2H3、1α,25OHD2
−[24,24,24,25,25,25]−2H6、1α,25OHD3−[6,19
,19]−2H3、1α,25OHD3−[24,24,24,25,25,25]−2
H6などである。
処理の前に試料に供給することができる。これらの実施形態において、1つ又は複数の内
部標準は、内在性ステロイド化合物とともに誘導体化を受けることができ、その場合、誘
導体化内部標準のイオンは、質量分析により検出される。これらの実施形態において、対
象の分析物から発生したイオンの存在又は量は、試料中の対象の分析物の量の存在と関連
づけることができる。いくつかの実施形態において、内部標準は、検討中のステロイド化
合物の同位体標識異形であってよい。例えば、ビタミンD代謝物が対象の分析物であるア
ッセイにおいて、25OHD2−[6,19,19]−2H3又は25OHD3−[6,
19,19]−2H3を内部標準として用いることができる。25OHD2−[6,19
,19]−2H3を内部標準として用いる実施形態において、質量分析計で検出できるP
TAD−25OHD2−[6,19,19]−2H3イオンは、573.30±0.50
及び301.10±0.50の質量/電荷比(m/z)を有する陽イオンからなる群から
選択される。関連する実施形態において、PTAD−25OHD2−[6,19,19]
−2H3前駆体イオンは、573.30±0.50のm/zを有し、フラグメントイオン
は、301.10±0.50のm/zを有する。25OHD3−[6,19,19]−2
H3を内部標準として用いる実施形態において、質量分析計で検出できるPTAD−25
OHD3−[6,19,19]イオンは、561.30±0.50及び301.10±0
.50の質量/電荷比(m/z)を有する陽イオンからなる群から選択される。関連する
実施形態において、PTAD−25OHD3−[6,19,19]前駆体イオンは、56
1.30±0.50のm/zを有し、フラグメントイオンは、301.10±0.50の
m/zを有する。
標識分子と比較して標識分子の質量シフトをもたらす。適切な標識の例としては、重水素
(2H)、13C及び15Nなどがある。例えば、25OHD2−[6,19,19]及
び25OHD3−[6,19,19]は、25OHD2及び25OHD3より約3質量単
位高い質量を有する。同位体標識は、分子における1つ又は複数の位置に組み込むことが
でき、1つ又は複数の種類の同位体標識を同じ同位体標識分子に用いることができる。
の外部参照標準との比較により測定することができる。具体例としての外部参照標準は、
25OHD2、25OHD2−[6,19,19]、25OHD3及び25OHD3−[
6,19,19]の1つ又は複数のものをスパイクしたブランク血漿又は血清などである
。外部標準は一般的に、質量分析の前の1つ又は複数のクックソン型試薬による処理を含
む、分析すべきいずれかの他の試料と同じ処理及び分析を受ける。
/mL〜10ng/mLの範囲内(1.9と10を含む)にあり、好ましくは1.9ng
/mL〜5ng/mLの範囲内(1.9と5を含む)にあり、好ましくは約1.9ng/
mLである。特定の好ましい実施形態において、25OHD3の定量限界(LOQ)は、
3.3ng/mL〜10ng/mLの範囲内(3.3と10を含む)にあり、好ましくは
3.3ng/mL〜5ng/mLの範囲内(3.3と5を含む)にあり、好ましくは約3
.3ng/mLである。
e」は、複数のものを含む。したがって、例えば、「a protein」への言及は、
複数のタンパク質分子を含む。
(単数又は複数)以外のすべての物質を試料から除去することを意味しない。それよりも
むしろ、精製は、対象の分析物の検出を妨害する可能性がある試料中の他の成分と比較し
て1つ又は複数の対象の分析物の量を高める処置を意味する。様々な手段による試料の精
製は、1つ又は複数の妨害物質、例えば、質量分析による選択される親又は娘イオンの検
出を妨害する可能性がある又は可能性がない1つ又は複数の物質の相対的減少を可能にし
得る。この用語を用いるときの相対的減少は、精製すべき物質中の対象の分析物とともに
存在するいずれかの物質が精製により完全に除去されることを必要としない。
又は周りを通る固体(すなわち、固相)に対する溶液(すなわち、移動相)に溶解又は懸
濁した成分の親和性の結果として化学混合物が成分に分離される方法を意味する。ある場
合に、移動相が固相を通過又はその周りを通るとき、移動相の望ましくない成分が固相に
保持されて、移動相中の分析物の精製がもたらされる可能性がある。他の場合に、分析物
が固相に保持されて、移動相の望ましくない成分を固相を通過又はその周りを通らせる可
能性がある。これらの場合に、第2の移動相を用いて、さらなる処理又は分析のために保
持された分析物を固相から溶出させる。TFLCを含むSPEは、単一又は混合モードメ
カニズムにより動作し得る。混合モードメカニズムは、同じカラムにおけるイオン交換及
び疎水性保持を利用するものであり、例えば、混合モードSPEカラムの固相は、強い陰
イオン交換及び疎水性保持を示し、或いは強い陽イオン交換及び疎水性保持を示し得る。
より運ばれる化学混合物が、液体又は固体の固定相の周り又はその上を流れるときに化学
物質の差別的分布の結果として成分に分離される方法を意味する。
、流体が微細に分割された物質のカラム又は毛細管通路に均一に浸透するときに流体溶液
の1つ又は複数の成分の選択的遅延の方法を意味する。遅延は、この流体が固定相(単数
又は複数)に対して移動するときの1つ又は複数の固定相とバルク流体(すなわち、移動
相)との間の混合物の成分の分配に起因する。「液体クロマトグラフィー」の例としては
、逆相液体クロマトグラフィー(RPLC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
及び乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)(高乱流液体クロマトグラフィー(HTL
C)又は高処理液体クロマトグラフィーとして時として公知)などがある。
高圧液体クロマトグラフィー」として時として公知)という用語は、加圧下で移動相を固
定相、一般的に密に充填されたカラムに強制的に通すことにより分離の程度を増加させる
液体クロマトグラフィーを意味する。
乱流液体クロマトグラフィー又は高処理液体クロマトグラフィーとして時として公知)と
いう用語は、分離を行うための基礎としてカラム充填剤を通る被分析物質の乱流を利用す
るクロマトグラフィーの形を意味する。TFLCは、質量分析による分析の前の2つの不
特定の薬物を含む試料の調製に適用されている。Zimmerら、J Chromatogr、A854、23〜35
頁(1999年)を参照のこと。さらにTFLCを説明している米国特許第5,968,367
号、第5,919,368号、第5,795,469号及び第5,772,874号も参
照のこと。当業者は、「乱流」を理解している。流体がゆっくりと且つ滑らかに流れると
き、その流れは「層流」と呼ばれる。例えば、低い流速でHPLCカラムを通って移動す
る流体は、層流である。層流においては、流体の粒子の運動は整然としており、粒子は一
般的に直線的に移動する。より速い速度では、水の慣性が流体摩擦力に打ち勝ち、乱流が
生ずる。不規則な境界と接触しない流体は、摩擦により遅くなる又は平坦でない表面によ
り偏る流体を「追い越す」。流体が乱れて流れているとき、流体は渦をなし、回転して(
又は渦流で)流れ、流れが層流であるときより「抵抗」が大きい。流体の流れが層流又は
乱流である場合を判断することに資するための多くの参考文献が入手可能である(例えば
、Turbulent Flow Analysis: Measurement and Prediction、P.S. Bernard & J.M. Walla
ce、John Wiley & Sons, Inc.、(2000年); An Introduction to Turbulent Flow、Jean M
athieu & Julian Scott、Cambridge University Press(2001年))。
、試料混合物が蒸発し、液体又は粒子状固体で構成されている固定相を含むカラム中を移
動するキャリアガス(窒素又はヘリウムとして)の流れに注入され、固定相に対する化合
物の親和力に従ってその成分化合物に分離されるクロマトグラフィーを意味する。
50μmより大きい平均粒子直径を含むクロマトグラフィーカラムを意味する。
定を可能にするのに十分なカラムから流出する試料中の物質の分離を行うのに十分なクロ
マトグラフィー段を有するクロマトグラフィーカラムを意味する。好ましい実施形態にお
いて、分析カラムは、直径が約5μmの粒子を含む。そのようなカラムは、さらなる分析
のための精製試料を得るために非保持物質から保持物質を分離又は抽出するという一般的
目的を持つ「抽出カラム」としばしば区別される。
に用いられているような「オンライン」又は「インライン」という用語は、操作者の介入
の必要なしに実施される処置を意味する。これと対照的に、本明細書で用いている「オフ
ライン」という用語は、操作者の手作業での介入を必要とする処置を意味する。したがっ
て、試料を沈澱にかけ、上清を次に手作業でオートサンプラーに装填する場合、沈澱及び
装填ステップは、後のステップからオフラインである。方法の種々の実施形態において、
1つ又は複数のステップは、オンライン自動式で実施することができる。
らの質量により同定するための分析法を意味する。MSは、イオンを、それらの質量対電
荷比、すなわち「m/z」に基づいてフィルターし、検出し、測定する方法を意味する。
MS技術は、一般的に(1)化合物をイオン化して荷電化合物を生成するステップ;及び
(2)荷電化合物の分子量を検出し、質量対電荷比を計算するステップを含む。化合物は
、適切な手段によりイオン化し、検出することができる。「質量分析計」は、一般的にイ
オン化装置及びイオン検出器を含む。一般的に、対象の1つ又は複数の分子がイオン化さ
れ、その後イオンが質量分析機器に導入され、そこで磁界と電界の組合せにより、イオン
が質量(「m」)及び電荷(「z」)に依存する空間内の経路をたどる。例えば、「Mass
Spectrometry From Surfaces」と題する米国特許第6,204,500号、「Methods a
nd Apparatus for Tandem Mass Spectrometry」と題する第6,107,623号、「DNA
Diagnostics Based On Mass Spectrometry」と題する第6,268,144号、「Surfa
ce-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of A
nalytes」と題する第6,124,137号、Wrightら、Prostate Cancer and Prostatic
Diseases、1999年、2号、264〜76頁並びにMerchant及びWeinberger、Electrophoresis、
2000年、21巻、1164〜67頁を参照のこと。
を発生させ、検出する質量分析法を意味する。「陽イオンモードで操作する」という用語
は、本明細書で用いているように、陽イオンを発生させ、検出する質量分析法を意味する
。
は複数電子単位に等しい正味電荷を有する分析物イオンを発生させる方法を意味する。陰
イオンは、1又は複数電子単位の正味負電荷を有するものであり、一方、陽イオンは、1
又は複数電子単位の正味正電荷を有するものである。
蒸気相中の対象の分析物が電子の流れと相互作用する方法を意味する。電子と分析物との
衝突が、次に質量分析法にかけることができる分析物イオンを発生させる。
(例えば、アンモニア)に電子衝撃を受けさせ、試薬ガスイオンと分析物分子との相互作
用により分析物イオンを生じさせる方法を意味する。
ルギー原子(しばしばXe又はAr)のビームが不揮発性試料に衝突して、試料に含まれ
ている分子を脱離させ、イオン化する方法を意味する。試験試料は、グリセロール、チオ
グリセロール、m−ニトロベンジルアルコール、18−クラウン−6クラウンエーテル、
2−ニトロフェニルオクチルエーテル、スルホラン、ジエタノールアミン及びトリエタノ
ールアミンなどの粘性液体マトリックスに溶解する。化合物又は試料に対して適切なマト
リックスの選択は、経験的過程である。
LDI」という用語は、不揮発性試料をレーザー照射に曝露し、光イオン化、プロトン化
、脱プロトン化及びクラスタ崩壊などの様々なイオン化経路により試料中の分析物を脱離
させ、イオン化する方法を意味する。MALDIのために、試料を、分析物分子の脱離を
促進するエネルギー吸収性マトリックスと混合する。
LDI」という用語は、不揮発性試料をレーザー照射に曝露し、光イオン化、プロトン化
、脱プロトン化及びクラスタ崩壊などの様々なイオン化経路により試料中の分析物を脱離
させ、イオン化する他の方法を意味する。SELDIのために、試料を一般的に、対象の
1つ又は複数の分析物を優先的に保持する表面に結合させる。MALDIと同様に、この
方法もイオン化を促進するためのエネルギー吸収性物質を用いる。
用語は、末端に高い正又は負電位が印加されている短い長さの毛細管に沿って溶液を通す
方法を意味する。管の末端に到達した溶液が蒸発して(噴霧されて)溶媒蒸気中溶液の非
常に小さい液滴のジェット又は噴霧になる。この液滴のミストが、凝縮を防ぎ、溶媒を蒸
発させるためにわずかに加熱されている蒸発チャンバー中に流れる。液滴がより小さくな
ると、中性分子が放出されると同時に同符号間の自然反発がイオンを生じさせるような時
まで表面電荷密度が増加する。
、ESIと同様な質量分析法を意味するが、APCIは、大気圧のプラズマ内で起こるイ
オン−分子反応によりイオンを発生させる。プラズマは、噴霧毛細管と対極との間の放電
により維持される。次にイオンは、一般的に一連の差動ポンプ式スキマーステージ(diff
erentially pumped skimmer stages)を用いて質量分析装置内に抽出される。向流の乾燥
予熱N2ガスを用いて溶媒の除去を改善することができる。APCIにおける気相イオン
化は、極性がより低い種を分析するのにESIより有効であり得る。
分子Mの光イオン化のメカニズムが分子イオンM+を生成する光子の吸収と電子の放出で
ある質量分析の形態を意味する。光子のエネルギーが一般的にイオン化ポテンシャルのす
ぐ上であるため、分子イオンは、脱離をより受けにくい。多くの場合、クロマトグラフィ
ーの必要なしに試料を分析することが可能であり、したがって、かなりの時間と費用の節
約となり得る。水蒸気又はプロトン性溶媒が存在する場合、分子イオンは、Hを抽出して
MH+を生成し得る。これは、Mが高いプロトン親和性を有する場合に起こる傾向がある
。M+とMH+の合計は一定であるため、定量の正確度に影響しない。プロトン性溶媒中
の薬物化合物は通常MH+として観測されるが、ナフタレン又はテストステロンなどの非
極性化合物は通常M+を生成する。例えば、Robbら、Anal. Chem.、2000年、72巻(15号)
、3653〜3659頁を参照のこと。
とんどの元素が原子にされ、イオン化されるような十分に高い温度で試料が部分的にイオ
ン化したガスと相互作用する方法を意味する。
化表面上にのせ、強い電界を用いて分析物イオンを発生させる方法を意味する。
と及び/又は分析物が気相に入ることを意味する。レーザーダイオード熱脱離(LDTD
)は、分析物を含む試料をレーザーパルスにより気相中に熱的に脱離させる技術である。
レーザーは、金属の底を有する特別製の96ウエルプレートの裏面に当たる。レーザーパ
ルスが底を加熱し、熱が試料を気相に移行させる。気相試料が次にイオン化源内に引き込
まれ、そこで、気相試料が質量分析計における分析に備えてイオン化される。LDTDを
用いる場合、気相試料のイオン化は、コロナ放電(例えば、APCIによる)によるイオ
ン化によるなどの当技術分野で公知の適切な技術により達成することができる。
い質量範囲内、一般的に約1質量単位内のイオンのみが検出される質量分析機器の検出モ
ードである。
反応モード」は、前駆体イオン及び1つ又は複数のフラグメントイオンが選択的に検出さ
れる質量分析機器の検出モードである。
用語は、測定が定量的に意味があるようになる点を意味する。このLOQにおける分析物
の応答は、特定可能であり、個別的であり、20%未満の相対標準偏差(RSD%)及び
80%〜120%の正確度で再現性がある。
れに伴う不確かさより大きい点である。LODは、値がその測定に伴う不確かさを超える
点であり、ゼロ濃度における平均値のRSDの3倍と定義される。
の検出できる分析物の質量を反映する絶対値を意味する。しかし、量は、他の分析物の量
と比較した相対量も意図する。例えば、試料中の分析物の量は、試料中に通常存在する分
析物の対照又は正常レベルより大きい量であり得る。
いているように、表示された値プラス又はマイナス10%を意味する。質量分析機器は、
所定の分析物の質量の測定がわずかに変化し得る。イオンの質量又はイオンの質量/電荷
比に関連する「約」という用語は、+/−0.5原子質量単位を意味する。
発明の詳細な説明から、また特許請求の範囲から明らかである。
試料中のビタミンD及びビタミンD関連化合物などのステロイド化合物を測定する方法
を述べる。より具体的には、単一の質量分析アッセイで複数の試験試料中のステロイド化
合物を検出し、定量する方法を述べる。該方法は、誘導体化ステロイド化合物を得るため
のPTADなどのクックソン型試薬を質量分析(MS)と併用し、それにより、複数の試
験試料中のステロイド化合物を検出し、定量するための高処理アッセイシステムを提供す
ることができる。好ましい実施形態は、大規模臨床施設における自動ステロイド化合物定
量への適用に特に十分に適している。
などである。いくつかの好ましい実施形態において、試料は、生物学的試料、すなわち、
動物、細胞培養、器官培養等のいずれかの生物学的源から得られた試料である。特定の好
ましい実施形態において、試料は、イヌ、ネコ、ウマ等の哺乳動物から得られる。特に好
ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくはヒト男性又は女性である。好ましい試料は、
血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液又は組織試料などの体液、好ましくは血漿(EDTA
及びヘパリン血漿を含む)及び血清、最も好ましくは血清を含む。そのような試料は、例
えば、患者、すなわち、疾患又は状態の診断、予後診断又は治療のために臨床の場に出頭
する男性又は女性生存者から得ることができる。
テロイド化合物の定量アッセイ用のキットは、本明細書で述べた組成物を含むキットを含
み得る。例えば、キットは、少なくとも1回のアッセイに十分な量の包装材料及び測定さ
れた量の同位体標識内部標準を含み得る。一般的に、キットは、ステロイド化合物の定量
アッセイに用いる包装済み試薬を使用することに関する有形の形式(例えば、紙又は電子
媒体上に含まれた)で記録された指示も含まれる。
のマトリックスを用いて調製することが好ましい。
質量分析の準備において、例えば、液体クロマトグラフィー、ろ過、遠心分離、薄層ク
ロマトグラフィー(TLC)、キャピラリー電気泳動を含む電気泳動、イムノアフィニテ
ィー分離を含むアフィニティー分離、酢酸エチル若しくはメタノール抽出を含む抽出法及
びカオトロピック剤の使用又は上記のもののいずれかの組合せなどを含む当技術分野で公
知の様々な方法により、1つ又は複数のステロイド化合物を試料中の1つ又は複数の他の
化合物(例えば、タンパク質)と比較して濃縮することができる。これらの濃縮ステップ
は、処理前の個々の試験試料、誘導体化後の個々の処理済み試料、又は処理済み試料を混
合した後の複合試料に適用することができる。
法である。タンパク質精製法は、当技術分野で周知であり、例えば、Polsonら、Journal
of Chromatography、B 2003、785巻、263〜275頁は、本発明の方法に用いるのに適するタ
ンパク質沈澱法を記載している。タンパク質沈澱は、試料からタンパク質の大部分を除去
して上清中に1つ又は複数のステロイド化合物を残すために用いることができる。試料を
遠心分離して沈澱タンパク質から液体上清を分離することができ、或いは試料をろ過して
沈澱タンパク質を除去することができる。得られた上清又はろ液は、次に質量分析に直接
、又は別法として液体クロマトグラフィーに、そしてその後に質量分析にかけることがで
きる。特定の実施形態において、血漿又は血清などの個々の試験試料は、ハイブリッドタ
ンパク質沈澱/液−液抽出法により精製することができる。これらの実施形態において、
未処理試験試料をメタノール、酢酸エチル及び水と混合し、得られる混合物をボルテック
スし、遠心分離する。1つ又は複数の精製ステロイド化合物を含む得られた上清を除去し
、完全に乾燥し、アセトニトリルで再構成する。アセトニトリル溶液中の1つ又は複数の
精製ステロイド化合物は、次にクックソン型試薬、好ましくはPTAD又はその同位体標
識変体で誘導体化することができる。
(LC)である。HPLCを含む液体クロマトグラフィーの特定の方法は、比較的遅い層
流技術に依拠している。伝統的なHPLC分析は、カラム中の試料の層流が試料からの対
象の分析物の分離の基礎であるカラム充填剤に依拠している。当業者は、そのようなカラ
ム中の分離が拡散過程であることを理解し、誘導体化ステロイド化合物とともに用いるの
に適するHPLCを含むLC、機器及びカラムを選択することができる。クロマトグラフ
ィーカラムは、一般的に化学構成成分の分離(すなわち、分別)を促進するための媒体(
すなわち、充填剤)を含む。該媒体は、微細粒子を含み得る、或いは多孔性通路を有する
モノリス材料を含み得る。媒体の表面は、一般的に化学構成成分の分離を促進するための
様々な化学構成成分と相互作用する結合面(bonded surface)を含む。1つの適切な結合
面は、アルキル結合面、シアノ結合面又は高度に純粋なシリカ表面などの疎水性結合面で
ある。アルキル結合面は、C−4、C−8、C−12又はC−18結合アルキル基を含み
得る。好ましい実施形態において、カラムは、高度に純粋なシリカカラム(Thermo
Hypersil Gold Aqカラムなど)である。クロマトグラフィーカラムは
、試料を受け入れるための入口及び分別試料を含む流出液を排出するための出口を含む。
試料は、直接、又はオンラインSPEカートリッジ若しくはTFLC抽出カラムなどの抽
出カラムから入口に供給することができる。好ましい実施形態において、複合試料は、質
量分析の前に液体クロマトグラフィーにより精製することができる。
で溶出させ、出口で排出させることができる。対象の分析物(単数又は複数)を溶出する
ための各種溶媒モードを選択することができる。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾
配モード、無勾配モード又はポリティプティック(polytyptic)(すなわち混合)モード
を用いて実施することができる。クロマトグラフィーの実施中、物質の分離は、溶離剤(
「移動相」としても公知である)、溶出モード、勾配条件、温度等の選択などの変数によ
る影響を受ける。
1つ又は複数の他の物質は保持されない条件下で複合試料をカラムに加えることにより、
分析物を精製することができる。これらの実施形態において、対象の分析物がカラムによ
り保持される第1の移動相条件を用いることができ、保持されない物質が洗い流された時
点で保持された物質を除去するための第2の移動相条件をその後に用いることができる。
或いは、対象の分析物が1つ又は複数の他の物質と比較して異なる速度で溶出する移動相
条件下で複合試料をカラムに加えることにより、分析物を精製することができる。そのよ
うな処置は、試料の1つ又は複数の他の成分と比較して特定の時点(すなわち、特性保持
時間)の溶出液中の対象の分析物の量を高くし得る。
ィーシステムを用いて実施する。特定の好ましい実施形態において、高度に純粋なシリカ
カラム(Thermo Hypersil Gold Aqカラムなど)を用いる。特定
の好ましい実施形態において、HPLC及び/又はTFLCを、HPLC用水を移動相A
として、HPLC用エタノールを移動相Bとして用いて実施する。
1つのクロマトグラフィーカラムから次のカラムに送られるように、2つ又はそれ以上の
クロマトグラフィーカラムを必要に応じて接続することができる。好ましい実施形態にお
いて、バルブ及び配管の選択は、必要なステップを実施するように事前にプログラムされ
たコンピュータにより制御される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムはまた
、そのようなオンライン式で検出器システム、例えば、MSシステムに接続されている。
したがって、操作者が試料のトレーをオートサンプラーに入れることができ、残りの操作
がコンピュータ制御下で実施され、選択されるすべての試料の精製及び分析が得られる。
に用いることができる。そのような実施形態において、分析物を捕捉する抽出カラムを用
いて試料を抽出し、次に溶出させ、イオン化の前に第2の抽出カラム又は分析HPLCカ
ラム上でクロマトグラフィーにかけることができる。例えば、TFLC抽出カラムによる
試料の抽出は、大粒径(50μm)充填カラムを用いて達成することができる。このカラ
ムから溶出した試料は、次に質量分析の前のさらなる精製のためにHPLC分析カラムに
移すことができる。これらのクロマトグラフィー法に関係するステップは自動式で連結さ
せることができるので、分析物の精製時の操作者の関与の必要を最小限にすることができ
る。この特徴により、時間と費用が節約され、操作者の誤りの機会がなくなる可能性があ
る。
パク質沈澱及び酢酸エチル/水抽出を含むハイブリッドタンパク質沈澱/液−液抽出法に
より達成される。得られたステロイド化合物は、抽出カラムにかける前に誘導体化するこ
とができる。好ましくは、ハイブリッドタンパク質沈澱/液−液抽出法と抽出カラムをオ
ンライン式で接続する。ステロイド化合物がビタミンD及びビタミンD関連化合物からな
る群から選択される好ましい実施形態において、抽出カラムは、好ましくは、Cohes
ive Technologies C8XLオンライン抽出カラム(粒径50μm、0
.5x50mm)又は同等物などのC−8抽出カラムである。抽出カラムからの溶出液は
、次に、質量分析の前にオンライン式のHPLCカラムなどの分析LCカラムに加えるこ
とができる。これらのクロマトグラフィー法に関係するステップは自動式で連結させるこ
とができるので、分析物の精製時の操作者の関与の必要を最小限にすることができる。こ
の特徴により、時間と費用が節約され、操作者の誤りの機会がなくなる可能性がある。
様々な実施形態において、誘導体化ステロイド化合物は、当業者に公知のいずれかの方
法によりイオン化させることができる。質量分析は、分別試料をイオン化し、さらなる分
析のための荷電分子を生成するためのイオン源を含む質量分析計を用いて実施される。例
えば、試料のイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化(
ESI)、光子イオン化、大気圧化学イオン化(APCI)、光イオン化、大気圧光イオ
ン化(APPI)、高速原子衝撃(FAB)、液体二次イオン化(LSI)、マトリック
ス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー
/プラズマスプレーイオン化、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化(SELDI)、
誘導結合プラズマ(ICP)、粒子ビームイオン化及びLDTDにより行うことができる
。当業者は、イオン化法の選択は、測定する分析物、試料の種類、検出器の種類、ポジテ
ィブモード対ネガティブモードの選択等に基づいて決定することができる。
ができる。好ましい実施形態において、誘導体化ステロイド化合物をAPCIによりポジ
ティブモードでイオン化させる。関連する好ましい実施形態において、誘導体化ステロイ
ド化合物イオンは、気体状態であり、不活性衝突ガスは、アルゴン又は窒素、好ましくは
アルゴンである。
に荷電したイオンを分析して質量対電荷比を測定することができる。質量対電荷比を測定
するための適切な分析計は、四重極分析計、イオントラップ型分析計及び飛行時間型分析
計などである。具体例としてのイオントラップ法は、Bartolucciら、Rapid Commun. Mass
Spectrom.、2000年、14巻、967〜73頁に記載されている。
イオンは、選択的イオンモニタリングモード(SIM)を用いて検出することができ、又
は別法として、衝突誘発解離に起因する質量遷移又は中性損失は、例えば、多重反応モニ
タリング(MRM)又は選択反応モニタリング(SRM)を用いてモニターすることがで
きる。好ましくは、質量対電荷比は、四重極分析計を用いて測定する。例えば、「四重極
」又は「四重極イオントラップ」装置において、振動高周波電界内のイオンは、電極間に
印加されたDC電位、RFシグナルの振幅並びに質量/電荷比に比例した力を受ける。電
圧及び振幅は、特定の質量/電荷比を有するイオンのみが四重極の長さを移動するが、他
のすべてのイオンは偏向させられるように選択することができる。したがって、「四重極
」装置は、装置に注入されたイオンに対して「質量フィルター」及び「質量検出器」の両
方として働き得る。
ることができる。この技術において、対象の分子から発生した前駆体イオン(親イオンと
も呼ばれる)をMS装置でフィルターにかけることができ、前駆体イオンをその後フラグ
メント化して、第2のMS法で分析される1つ又は複数のフラグメントイオン(娘イオン
又は生成物イオンとも呼ばれる)を生成させる。前駆体イオンを注意深く選択することに
より、特定の分析物により生成されたイオンのみがフラグメント化チャンバーに通され、
不活性ガスの原子との衝突によりフラグメントイオンが生ずる。前駆及びフラグメントイ
オンは、所定の組のイオン化/フラグメント化条件のもとで再現性のある形で生成するた
め、MS/MS法は、極めて強力な分析ツールとなり得る。例えば、フィルトレーション
/フラグメンテーションの組合せは、妨害物質の除去に用いることができ、生物学的試料
のような複雑な試料に特に有用であり得る。
ンスキャンなどである。これらの運転モードの説明については、例えば、E. Michael Thu
rmanら、Chromatographic-Mass Spectrometric Food Analysis for Trace Determination
of Pesticide Residues、Chapter 8 (Amadeo R. Fernandez-Alba編、Elsevier、2005年)
(387)を参照のこと。
量と関連づけることができる。例えば、サンプリング及び分析パラメーターが注意深く管
理されていることを前提として、所定のイオンの相対量は、当相対量を最初の分子の絶対
量に換算する表と比較することができる。或いは、外部標準の分析を試料とともに実施し
、それらの標準から発生したイオンに基づいて標準曲線を作成することができる。そのよ
うな標準曲線を用いて、所定のイオンの相対量を最初の分子の絶対量に換算することがで
きる。特定の好ましい実施形態において、内部標準を用いて、ステロイド化合物の量を計
算するための標準曲線を作成することができる。そのような標準曲線を作成し、用いる方
法は、当技術分野で周知であり、当業者は、適切な内部標準を選択することができる。例
えば、いくつかの実施形態において、1つ又は複数の同位体標識ビタミンD代謝物(例え
ば、25OHD2−[6,19,19]−2H3及び25OHD3−[6,19,19]
−2H3)を内部標準として用いることができる。イオンの量を最初の分子の量と関連づ
ける多くの他の方法は、当業者には周知であろう。
施形態において、1つ又は複数の精製ステップをオンラインで実施し、より好ましくは、
精製及び質量分析ステップのすべてをオンライン式で実施することができる。
るフラグメント化のために前駆体イオンを単離する。CADにおいて、前駆体イオンは、
不活性ガスとの衝突によりエネルギーを獲得し、その後、「単分子分解」と呼ばれる過程
により分解する。振動エネルギーの増加によりイオン内の特定の結合を切断することがで
きるように十分なエネルギーが前駆体イオンに蓄積されなければならない。
することができる。試料を最初にタンパク質沈澱又はハイブリッドタンパク質沈澱/液−
液抽出法により精製することができる。次に、精製試料中の1つ又は複数のステロイド化
合物をPTAD又はその同位体バリアントのようなクックソン型試薬で誘導体化する。次
に精製試料を好ましくは抽出カラム(TFLCカラムなど)とそれに続く分析カラム(H
PLCカラムなど)上の液体クロマトグラフィーにかけることができる;クロマトグラフ
ィーカラムからの液体溶媒の流れは、MS/MS分析計の噴霧器インターフェースに入り
;溶媒/分析物混合物は、インターフェースの加熱荷電チューブ中で蒸気に転換される。
溶媒中に含まれている分析物(単数又は複数)(例えば、誘導体化ビタミンD代謝物など
の誘導体化ステロイド化合物)は、溶媒/分析物混合物に大電圧を印加することによりイ
オン化される。分析物がインターフェースの荷電チューブを出るとき、溶媒/分析物混合
物が霧状になり、溶媒が蒸発し、分析物イオンが残る。或いは、精製試料中の誘導体化ス
テロイド化合物をイオン化の前に液体クロマトグラフィーにかけなくてよい。むしろ、試
料を96ウエルプレート上にスポットし、LDTDにより蒸発させ、イオン化させること
ができる。
し、第1の四重極に入る。タンデム質量分析装置において、四重極1及び3(Q1及びQ
3)は、イオンの質量対電荷比(m/z)に基づいてイオンの選択(すなわち、それぞれ
Q1及びQ3における「前駆」及び「フラグメント」イオンの選択)を可能にするマスフ
ィルターである。四重極2(Q2)は、イオンがフラグメント化される衝突セルである。
質量分析計の第1の四重極(Q1)は、対象の誘導体化ステロイド化合物の質量対電荷(
m/z)比を有する分子を選択する。正しい質量/電荷比を有する前駆体イオンは、衝突
チャンバー(Q2)に入るが、他の質量/電荷比を有する望ましくないイオンは、四重極
の側面と衝突し、除去される。Q2に入った前駆体イオンは、中性アルゴンガス分子およ
びフラグメントと衝突し、分解する。発生したフラグメントイオンは、四重極3(Q3)
に入り、そこで、対象の誘導体化ステロイド化合物のフラグメントイオンは選択されるが
、他のイオンは除去される。
含み得る。当技術分野で周知の標準的方法を用いて、当業者は、四重極3(Q3)におけ
る選択に用いることができる誘導体化ステロイド化合物の特定の前駆体イオンの1つ又は
複数のフラグメントイオンを特定することができる。
スを発生させる。取得データは、収集されたイオンの計数対時間をプロットするコンピュ
ータに伝送される。得られる質量クロマトグラムは、伝統的HPLC−MS法で得られる
クロマトグラムと類似している。特定のイオンに対応するピーク下面積又はそのようなピ
ークの振幅は、測定し、対象の分析物の量と相関させることができる。特定の実施形態に
おいて、フラグメントイオン(単数又は複数)及び/又は前駆体イオンのピークの曲線下
面積又は振幅を測定して、特定のステロイド化合物の量を決定する。上述のように、所定
のイオンの相対量は、内部分子標準の1つ又は複数のイオンのピークに基づく較正標準曲
線を用いて最初の分析物の絶対量に換算することができる。
上に略述した処置の後に、各患者試料を別々に処理する場合、複数の患者試料を複合と
することができる(すなわち、混合し、一緒に分析することができる)。「別々に処理す
る」という語句は、複合試料に含める各患者試料を、最初は質量分析により区別できない
2つ又はそれ以上の患者試料中のステロイド化合物が処理の後に区別できるようになるよ
うな方法で処理することを意味する。これは、ステロイド化合物を誘導体化する異なる作
用剤を用いて各患者試料を処理することにより達成することができる。使用するために選
択される誘導体化剤は、質量分析により区別できる誘導体化ステロイド化合物を生成しな
ければならない。質量分析により誘導体化ステロイド化合物を区別するための基礎となる
ものは、誘導体化ステロイド化合物のイオンの質量の差である。質量の差は、PTAD及
びDMEQTADなどの2つ又はそれ以上の異なる誘導体化剤を用いることにより生じ得
る。質量の差は、PTAD及び13C6−PTADなどの同じ誘導体化剤の2つ又はそれ
以上の同位体バリアントを用いることによっても生じ得る。これらの2つのアプローチは
、相互に排他的でなく、分析する複数の患者試料中の各患者試料中のステロイド化合物を
一意的に標識するために異なる誘導体化剤と同じ誘導体化剤の同位体バリアントの任意の
組合せを用いることができる。場合によって、複数の患者試料の1つの試料は、誘導体化
剤を用いずに処理してもよい。
試料中の同じステロイド化合物とは異なる質量分析プロファイルを有するであろう。処理
済み患者試料を混合して、処理ステロイド化合物のレベルを測定するために次に分析する
複合試料を作る場合、検出される処理ステロイド化合物の質量分析プロファイルの差によ
り、各処理ステロイド化合物を元の患者試料に帰属させることができる。したがって、2
つ又はそれ以上の患者試料中のステロイド化合物の量は、複合試料の単一の質量分析によ
り測定される。
ることができ、例えば、1つの患者試料をPTADで誘導体化し、第2の患者試料をDM
EQTADで誘導体化することができる。異なるクックソン型試薬を用いることにより、
誘導体化分析物の間に一般的に大きい質量の差が生ずる。例えば、PTADで誘導体化さ
れたステロイド化合物とDMEQTADで誘導体化された同じ化合物との質量の差は、約
200質量単位(PTADとDMEQTADとの質量の差)である。
るのに用いることができる。例えば、1つの患者試料をPTADで誘導体化し、第2の患
者試料を13C6−PTADで誘導体化することができる。この例において、PTADと
13C6−PTADとの質量の差は、約6質量単位である。
よる本発明を例示する役割を果たす。これらの実施例は、方法の範囲を限定するものでは
ない。特に、以下の実施例では、25OHD2−[6,19,19]−2H3又は25O
HD3−[6,19,19]−2H3を内部標準として用いた質量分析によるビタミンD
代謝物の定量を示す。ビタミンD代謝物に適用した本発明の方法を示すことは、ビタミン
D及びビタミンD関連化合物への方法の適用可能性を制限するものではない。同様に、内
部標準としての25OHD2−[6,19,19]−2H3又は25OHD3−[6,1
9,19]−2H3の使用は、限定的であることを意味するものでない。当業者により容
易に決定される適切な化学種をステロイド化合物の定量のための内部標準として用いるこ
とができる。
実施例
以下の自動化ハイブリッドタンパク質沈澱/液−液抽出法は、患者血清試料において実
施した。ゲルバリア血清(すなわち、血清分離管に採取された血清)並びにEDTA血漿
及びヘパリン血漿もこのアッセイに許容できるものと立証された。
owerロボットを用いて以下の処置を自動化した。各試料について、50μLの血清を
96ウエルプレートのウエルに加えた。次いで、25μLの内部標準カクテル(同位体標
識25OHD2−[6,19,19]−2H3及び25OHD3−[6,19,19]−
2H3を含む)を各ウエルに加え、プレートをボルテックスした。次いで、75μLのメ
タノールを加え、その後さらにボルテックスした。次いで、300μLの酢酸エチル及び
75μLの水を加え、その後さらにボルテックスし、遠心分離し、得られた上清を新しい
96ウエルプレートに移した。
ールド下で完全に乾燥した。誘導体化は、クックソン型誘導体化剤PTADのアセトニト
リル中0.1mg/mL溶液100μLを各ウエルに加えることにより遂行した。誘導体
化反応は、約1時間進行させ、反応混合物に100μLの水を加えて停止させた。
試料の注入は、Aria OS V1.5.1又はより新しいソフトウエアを用いたC
ohesive Technologies Aria TX−4 TFLCシステムに
より行った。
e Technologies C8XLオンライン抽出カラム(粒径50μm、005
x50mm、Cohesive Technologies,Inc.製)に自動的に注
入した。試料は、抽出カラム内の乱流を形成するために高流速で負荷された。この乱流に
より、カラム中の大粒子への誘導体化ビタミンD代謝物の最適化結合並びに過剰な誘導体
化試薬の通過及びデブリの排出が保証される。
o Hypersil Gold Aq分析カラム(粒子径5μm、50x2.1mm)
に溶出させた。HPLC勾配を分析カラムに適用して、試料中の他の分析物からビタミン
D代謝物を分離した。移動相Aは水であり、移動相Bはエタノールであった。HPLC勾
配は、35%有機物勾配で開始し、約65秒で99%に上昇させた。
MS/MSは、Finningan TSQ Quantum Ultra MS/M
Sシステム(Thermo Electron Corporation)を用いて実施
した。すべてがThermo Electronから入手した以下のソフトウエアプログ
ラムを本明細書で述べる実施例に用いた:Quantum Tune Master V
1.5又はより新しいもの、Xcalibur V2.07又はより新しいもの、LCQ
uan V2.56(Thermo Finnigan)又はより新しいもの及びARI
A OS v1.5.1(Cohesive Technologies)又はより新し
いもの。分析カラムから出た液体溶媒/分析物をMS/MS分析計の噴霧器インターフェ
ースに流した。溶媒/分析物混合物がインターフェースのチューブ中で蒸気に変換された
。霧化溶媒中の分析物をESIによりイオン化した。
た。PTAD−25OHD2については570.32±0.50のm/zを有するイオン
が選択され、PTAD−25OHD3については558.32±0.50のm/zを有す
るイオンが選択された。四重極2(Q2)に入ったイオンは、アルゴンガスと衝突してイ
オンフラグメントを発生し、これが、さらなる選択のために四重極3(Q3)に通された
。質量分析計の設定を表1に示す。同時に、内部標準PTAD−25OHD2−[6,1
9,19]−2H3及びPTAD−25OHD3−[6,19,19]−2H3を用いて
同位体希釈質量分析を用いる同じ処理を実施した。以下の質量遷移を正極性についてのバ
リデーション時の検出及び定量のために用いた。示した質量遷移は、限定的であることを
意味しない。以下の実施例でわかるように、定量的データを得るために各分析物について
他の質量遷移を選択することができた。
S)、PTAD−25OHD2及びPTAD−25OHD2−[6,19,19]−2H
3(IS)の具体例としてのクロマトグラムをそれぞれ1A、1B、1C及び1Dに示す
。
それぞれ図2A及び2Bに示す。
LLOQは、測定が定量的に意味があるようになる点である。このLLOQにおける分
析物の応答は、特定可能であり、個別的であり、20%より大きい精度(すなわち、変動
係数(CV))及び80%〜120%の正確度で再現性がある。LLOQは、予測された
LLOQに近いレベルのPTAD−25OHD2及びPTAD−25OHD3をスパイク
した5種のヒト血清試料を分析し、再現性を評価することにより決定した。収集データの
解析から、約4ng/mLの濃度を有する試料が約20%のCVをもたらしたことがわか
る。PTAD−25OHD2及びPTAD−25OHD3に関するこの分析のLLOQは
、約4ng/mLと確定された。両分析物についてのCV対濃度のグラフ表示を図3A〜
Bに示す(図3Aは広範な濃度範囲にわたるプロットを示すが、図3BはLOQ近くの拡
大した同じプロットを示す)。
と定義される。LODを決定するために、一般的に、適切なマトリックスのブランク試料
を得て、妨害の有無を試験する。しかし、25OHD3の内在性濃度が0である適切な生
物学的マトリックスを得ることができず、したがって、リン酸緩衝生理食塩水中5%ウシ
血清アルブミンの溶液(推定1.5ng/mL 25OHD3を含む)をLOD試験に用
いた。標準をそれぞれ20回の反復で行い、統計的に解析して、25OHD2及び25O
HD3のLODがそれぞれ約1.9及び3.3ng/mLであると決定した。これらの試
験の生データを下の表3に示す。
分析における誘導体化ビタミンD代謝物の検出の線型性は、4つのプール血清を高内在
性濃度の25OHD2又は25OHD3で希釈し、未希釈検体及び1:2、1:4及び1
:8の希釈検体を4回ずつ分析することにより判断した。データの二次回帰を行ったとこ
ろ、R2=0.97の試験した濃度範囲にわたる相関係数が得られた。これらの試験によ
り、平均回収率が101%で、約4〜約512ng/mLの報告できる範囲を可能にする
、1:4で希釈することができることが示された。検体希釈レベルのそれぞれについての
平均測定値及び線形回帰分析からの相関値を下の表4Aに示す。検体希釈レベルのそれぞ
れについての回収率を下の表4Bに示す。
類似分析物に対する分析の特異性は、分析において25OHD3と同様に挙動する3−
エピ−25OHD3を除いて、試験したいずれのビタミンD代謝物についても交差反応性
を有さないと判断された。25OHD2及び25OHD3の側鎖標識安定同位体もイオン
源において起こる水素交換による交差反応性を示した。したがって、25OHD2及び2
5OHD3の側鎖標識安定同位体は、内部標準として用いるべきでない。下の表5に試験
した化合物及び交差反応性試験の結果を示す。
各分析物ごとの5、15、30、60、90及び120ng/mLの6つの標準を定量
の再現性の手段としてすべてのアッセイにおいて測定した。日間再現性は、19回のアッ
セイからの較正曲線を用いて決定した。これらの19回のアッセイからの結果を表6A(
25OHD2について)及び表6B(25OHD3について)に示す。
アッセイ内変動は、単一アッセイ内の試料についての結果の再現性と定義される。アッ
セイ内変動を評価するために、各分析物ごとの任意の超低、低、中及び高濃度の25OH
D2及び25OHD3を含むプールした血清からのアッセイの報告できる範囲にわたる4
つの品質管理(QC)プールのそれぞれ20個の複製品を調製し、測定した。変動係数(
CV)の許容できるレベルは、3つの高濃度については15%未満であり、最低濃度(ア
ッセイのLOQ又はそれに近い)については20%未満である。
については13.7ng/mL、30.0ng/mL、52.4ng/mL及び106.
9ng/mLの平均濃度でそれぞれ9.1%、6.4%、5.0%及び5.9%であり、
PTAD−25OHD3については32.8ng/mL、15.0ng/mL、75.4
ng/mL及び102.3ng/mLの平均濃度でそれぞれ3.5%、4.9%、5.1
%及び3.3%であることがわかる。これらの複製品の解析の結果を表7A及び7Bに示
す。
ッセイ間の変動係数(CV)を測定した。アッセイ内変動試験の結果から、4つのQCプ
ールのアッセイ間CVは、PTAD−25OHD2については約13.1ng/mL、2
9.8ng/mL、51.9ng/mL及び107.8ng/mLの平均濃度でそれぞれ
約8.3%、6.2%、8.1%及び6.4%であり、PTAD−25OHD3について
は約31.1ng/mL、14.5ng/mL、75.1ng/mL及び108.4ng
/mLの平均濃度でそれぞれ約4.8%、6.7%、4.7%及び6.7%であることが
わかる。これらの複製品の解析の結果を表8A及び8Bに示す。
2つの回収試験を実施した。第1のものは、それぞれ2種の濃度の25OHD2及び2
5OHD3をスパイクした6つの検体を用いて実施した。これらのスパイクした検体を、
実施例1で述べたハイブリッドタンパク質沈澱/液液抽出処置にかけた。次いで、スパイ
ク検体の抽出物の分割検体を、上述の手順に従って通常のPTADにより誘導体化し、4
回ずつ分析した。スパイク濃度は、アッセイの実行できる範囲内にあった。6つのプール
は、約44ng/mLより大きいスパイクレベルで約89%、約73ng/mLより大き
いスパイクレベルで約92%の平均正確度を示した。24実験的回収率のうちの2つのみ
が85%未満であり、残りの22アッセイが85〜115%の許容できる正確度範囲内に
あった。スパイク検体回収試験の結果を下の表9に示す。
つは25OHD2の高い内在性濃度を有し、3つは25OHD3の高い内在性濃度を有し
ていた。検体を対にし、4:1、1:1及び1:4の比率で混合した。得られた混合物を
、実施例1で述べたハイブリッドタンパク質沈澱/液−液抽出処置にかけた。次いで、混
合検体の抽出物の分割検体を、上述の手順に従って通常のPTADにより誘導体化し、4
回ずつ分析した。これらの実験で、25OHD2については約98%、25OHD3につ
いては約93%の平均正確度が得られた。すべての個別結果は、85〜115%の許容で
きる正確度範囲内にあった。混合検体回収試験の結果を下の表10に示す。
PTAD誘導体化後のビタミンD代謝物を検出する方法を、分析の前にビタミンD代謝
物を誘導体化しない質量分析法と比較した。そのような方法は、公開米国特許出願第20
06/0228808号(Caulfieldら)に記載されている。8つの検体を分割し、両方
法により分析した。2つの方法の間の相関は、完全なデータセット(較正試料、QCプー
ル及び未知など)並びに未知のみについて線形回帰、デミング回帰及びブランド−アルト
マン分析により評価した。
及び図5A〜B(25OHD3について)に示す。
アッセイに対する溶血、脂血症及び黄疸の影響も検討した。
料をプールして、アッセイのダイナミックレンジにわたる濃度を有する5種のプールを調
製することにより評価した。次いで、溶解全血をプールにスパイクして、軽度及び中等度
に溶血した試料を調製した。
試料のレベルと比較した。比較の結果は、25OHD2及び25OHD3について15%
未満の差(%)を示すものであった。したがって、軽度から中等度に溶血した試料は、分
析に許容できる。
者試料をプールして、アッセイのダイナミックレンジにわたる濃度を有する5種のプール
を調製することにより評価した。次いで、粉末状脂質抽出物をプールに加えて、軽度及び
著しい脂血症検体を調製した。検体を4回ずつ測定し、結果を非脂血症プールの結果と比
較し、正確度を計算した。データは、25OHD2の測定は脂血症による影響を受けない
(すべての値が85〜115%の許容できる正確度の範囲内にあった)が、25OHD3
は脂血症の影響を受け、予測された値より低い測定がもたらされることを示すものである
。不一致の程度は、脂血症の程度とともに増大した。したがって、軽度であるが、著しく
ない脂血症検体は、許容できる。
料をプールして、アッセイのダイナミックレンジにわたる濃度を有する5種のプールを調
製することにより評価した。次いで、ビリルビンの濃縮溶液をプールにスパイクして、軽
度及び著しい黄疸検体を調製した。検体を4回ずつ測定し、結果を非黄疸プールの結果と
比較し、正確度を計算した。データは、25OHD2及び25OHD3が黄疸による影響
を受けない(すべての値が85〜115%の許容できる正確度の範囲内にある)ことを示
すものであった。したがって、黄疸検体は許容できる。
試料間のキャリーオーバーを評価するために高濃度の25OHD2及び25OHD3を
含む検体の直後にブランクマトリックスを測定した。これらの試験により、分析物又は内
部標準の保持時間における応答は、アッセイの完全性を損なうのに十分に大きくなかった
ことがわかった。これらの試験のデータを下の表11に示す。
種々の検体の種類についてアッセイを行った。ヒト血清及びゲルバリア血清(すなわち
、血清分離管からの血清)並びにEDTA血漿及びヘパリンは、許容できる試料の種類と
確認された。これらの試験において、同じ患者から同時に採取したヒト血清(血清)、ゲ
ルバリア血清(SST)、EDTA血漿(EDTA)及びヘパリン(Na Hep)の組
を25OHD2(40検体の組)及び25OHD3(6検体の組)について試験した。既
存の自動ピペッティングシステムの凝血検出/検知に関する制限のため、自動化された処
置について血漿を試験しなかった。
2A及びBに示す。
異なる誘導体化剤による誘導体化の後の患者試料の複合化を以下のクロスオーバー実験
で示した。
ッドタンパク質沈澱/液−液抽出処置にかけた。次いで、試料A及び試料Bの抽出物の分
割試料を上述の手順に従って通常のPTADにより誘導体化した。試料A及び試料Bの第
2の分割検体の抽出物も上述の手順に従って13C6−PTADで誘導体化した。
AD誘導体化試料Bと混合し、13C6−PTAD誘導体化試料Aの一部をPTAD誘導
体化試料Bと混合した。
グラフィー−質量分析法により分析した。再び、25OHD2−[6,19,19]−2
H3及び25OHD3−[6,19,19]−2H3を内部標準として用いた(下の表1
3で25OHD2−IS及び25OHD3−ISと示した)。質量分析計は、表13に示
すPTAD−及び13C6−PTAD誘導体化ビタミンD代謝物複合体をモニターするよ
うにプログラムした。表示された質量遷移は、限定的であることを意味しない。続く実施
例でわかるように、定量的なデータを得るために各分析物について他の質量遷移を選択す
ることができた。
データの適合度を評価した。これらの結果を図6A〜D、7A〜D及び8A〜Dに示す。
較するプロットである。これらのプロットは、極めてよく一致したR2値を示している(
すなわち、4つすべての変体のR2値が0.98を超える)。これにより、誘導体化剤が
不変であるという前提で、混合試料の分析が非混合試料の分析と同じ結果を示すことがわ
かる。
である(ただし、混合試料対混合試料又は非混合試料対非混合試料を比較)。これらのプ
ロットも極めてよく一致したR2値を示している(すなわち、4つすべての変体のR2値
が0.98を超える)。これにより、少なくとも比較した試料が両方とも混合又は非混合
である場合にPTADと13C6−PTADとの間の同位体変化がアッセイの成績の差の
原因でないことがわかる。
についてのものである、異なる誘導体化剤で処理した同じ検体の分析の結果を比較するプ
ロットである。これらのプロットも極めてよく一致したR2値を示している(すなわち、
4つすべての変体のR2値が0.99を超える)。これにより、混合試料と非混合試料と
の間の変化と組合されたPTADと13C6−PTADとの間の同位体変化がアッセイの
成績の差の原因でないことがわかる。
AD誘導体化剤の同位体変化は意味のある差をもたらさなかった。患者試料の複合化の立
証に成功した。
ンD3のLDTD−MS/MS分析による具体例としてのスペクトル
非誘導体化及びPTAD誘導体化25−ヒドロキシビタミンD2及び25−ヒドロキシ
ビタミンD3をLDTD−MS/MSにより分析した。これらの分析の結果を下に示す。
としてのQ1スキャンスペクトルをそれぞれ図9A及び10Aに示す。これらのスペクト
ルは、約350〜450のm/z範囲にわたりQ1をスキャンすることにより収集した。
に示す。Q1で選択された前駆体イオン及び前駆体をフラグメント化するのに用いられた
衝突エネルギーを表14に示す。
m/zを有する前駆体イオンを約208.8又は251.0のm/zを有する生成物イオ
ンにフラグメント化することである。25−ヒドロキシビタミンD3の定量のための好ま
しいMRM遷移は、約383.2のm/zを有する前駆体イオンを約186.9又は25
7.0のm/zを有する生成物イオンにフラグメント化することである。しかし、図9B
及び10Bにおける生成物イオンスキャンにおいてわかるように、好ましいフラグメント
イオンを切替え又は増補するために追加の生成物イオンを選択することができる。
3の分析からの具体例としてのQ1スキャンスペクトルをそれぞれ図11A及び12Aに
示す。これらのスペクトルは、約520〜620のm/z範囲にわたりQ1をスキャンす
ることにより収集した。
Bに示す。Q1で選択された前駆体イオン及び前駆体をフラグメント化するのに用いられ
た衝突エネルギーを表15に示す。
70.3のm/zを有する前駆体イオンを約298.1のm/zを有する生成物イオンに
フラグメント化することである。PTAD−25−ヒドロキシビタミンD3の定量のため
の好ましいMRM遷移は、約558.3のm/zを有する前駆体イオンを約298.1の
m/zを有する生成物イオンにフラグメント化することである。しかし、図11B及び1
2Bにおける生成物イオンスキャンにおいてわかるように、好ましいフラグメントイオン
を切替え又は増補するために追加の生成物イオンを選択することができる。
シビタミンD3のLDTD−MS/MS分析による具体例としてのスペクトル
1α,25−ジヒドロキシビタミンD2及び1α,25−ジヒドロキシビタミンD3の
PTAD誘導体は、各分析物の保存溶液の分割試料をアセトニトリル中でPTADにより
処理することにより調製した。誘導体化反応は、約1時間進行させ、反応混合物に水を加
えることにより停止させた。次いで、上に略述したLDTD−MS/MSの手順に従って
誘導体化分析物を分析した。
ロキシビタミンD3を含む試料の分析からの具体例としてのQ1スキャンスペクトルをそ
れぞれ図13A及び14Aに示す。これらのスペクトルは、約520〜620のm/z範
囲にわたりQ1をスキャンすることによりLDTD−MS/MSにより収集した。
キシビタミンD3のそれぞれの3種の前駆体イオンから発生した具体例としての生成物イ
オンスキャンをそれぞれ図13B〜D及び14B〜Dに示す。Q1で選択された前駆体イ
オン及びこれらの生成物イオンスペクトルを得るのに用いた衝突エネルギーを表16に示
す。
M遷移は、約550.4のm/zを有する前駆体イオンを約277.9のm/zを有する
生成物イオンにフラグメント化すること;約568.4のm/zを有する前駆体イオンを
約298.0のm/zを有する生成物イオンにフラグメント化すること;及び約586.
4のm/zを有する前駆体イオンを約314.2のm/zを有する生成物イオンにフラグ
メント化することを含む。PTAD−1α,25−ヒドロキシビタミンD3の定量のため
の具体例としてのMRM遷移は、約538.4のm/zを有する前駆体イオンを約278
.1のm/zを有する生成物イオンにフラグメント化すること;約556.4のm/zを
有する前駆体イオンを約298.0のm/zを有する生成物イオンにフラグメント化する
こと;及び約574.4のm/zを有する前駆体イオンを約313.0のm/zを有する
生成物イオンにフラグメント化することを含む。しかし、図6B〜D及び7B〜Dにおけ
る生成物イオンスキャンにおいてわかるように、前駆体イオンのフラグメント化により他
のいくつかの生成物イオンが発生する。典型的なフラグメントイオンを切替え又は増補す
るために追加の生成物イオンを図13B〜D及び14B〜Dに示したものから選択するこ
とができる。
25−ジヒドロキシビタミンD2−[26,26,26,27,27,27]−2H6、
1α,25−ジヒドロキシビタミンD3−[6,19,19]−2H3及び1α,25−
ジヒドロキシビタミンD3−[26,26,26,27,27,27]−2H6のPTA
D誘導体を調製し、上のように分析した。
,27]−2H6の定量のための具体例としてのMRM遷移は、約556.4のm/zを
有する前駆体イオンを約278.1のm/zを有する生成物イオンにフラグメント化する
こと;約574.4のm/zを有する前駆体イオンを約298.1のm/zを有する生成
物イオンにフラグメント化すること;及び約592.4のm/zを有する前駆体イオンを
約313.9のm/zを有する生成物イオンにフラグメント化することを含む。
量のための具体例としてのMRM遷移は、約541.4のm/zを有する前駆体イオンを
約280.9のm/zを有する生成物イオンにフラグメント化すること;約559.4の
m/zを有する前駆体イオンを約301.1のm/zを有する生成物イオンにフラグメン
ト化すること;及び約577.4のm/zを有する前駆体イオンを約317.3のm/z
を有する生成物イオンにフラグメント化することを含む。PTAD−1α,25−ジヒド
ロキシビタミンD2−[26,26,26,27,27,27]−2H6の定量のための
具体例としてのMRM遷移は、約544.4のm/zを有する前駆体イオンを約278.
0のm/zを有する生成物イオンにフラグメント化すること;約562.4のm/zを有
する前駆体イオンを約298.2のm/zを有する生成物イオンにフラグメント化するこ
と;及び約580.4のm/zを有する前駆体イオンを約314.0のm/zを有する生
成物イオンにフラグメント化することを含む。
のスペクトル
ビタミンD2及びビタミンD3のPTAD誘導体は、各分析物の保存溶液の分割試料を
アセトニトリル中でPTADにより処理することにより調製した。誘導体化反応は、約1
時間進行させ、反応混合物に水を加えることにより停止させた。次いで、誘導体化分析物
をMS/MSにより分析した。
してのQ1スキャンスペクトルをそれぞれ図15A及び16Aに示す。これらの分析は、
対象の分析物を含む標準溶液をFinnigan TSQ Quantum Ultra
MS/MSシステム(Thermo Electron Corporation)に
直接注入することにより実施した。分析物の導入の上流のHPLCカラムに800μL/
分の80%アセトニトリル、0.1%ギ酸を含む20%水を通すことにより液体クロマト
グラフィー移動相をシミュレートした。スペクトルは、約500〜620のm/z範囲に
わたりQ1をスキャンすることにより収集した。
生した具体例としての生成物イオンスキャンをそれぞれ図15B及び16Bに示す。Q1
で選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンスペクトルを得るのに用いた衝突エ
ネルギーを表17に示す。
m/zを有する前駆体イオンを約297.9のm/zを有する生成物イオンにフラグメン
ト化することを含む。PTAD−ビタミンD3の定量のための具体例としてのMRM遷移
は、約560.2のm/zを有する前駆体イオンを約298.0のm/zを有する生成物
イオンにフラグメント化することを含む。しかし、図15B及び16Bにおける生成物イ
オンスキャンにおいてわかるように、前駆体イオンのフラグメント化により他のいくつか
の生成物イオンが発生する。典型的なフラグメントイオンを切替え又は増補するために追
加の生成物イオンを図15B及び16Bに示したものから選択することができる。
,19]−2H3、ビタミンD2−[26,26,26,27,27,27]−2H6、
ビタミンD3−[6,19,19]−2H3及びビタミンD3−[26,26,26,2
7,27,27]−2H6のPTAD誘導体を調製し、上のように分析した。
MRM遷移は、約572.2のm/zを有する前駆体イオンを約301.0のm/zを有
する生成物イオンにフラグメント化することを含む。PTAD−ビタミンD2−[26,
26,26,27,27,27]−2H6の定量のための具体例としてのMRM遷移は、
約578.2のm/zを有する前駆体イオンを約297.9のm/zを有する生成物イオ
ンにフラグメント化することを含む。
MRM遷移は、約563.2のm/zを有する前駆体イオンを約301.0のm/zを有
する生成物イオンにフラグメント化することを含む。PTAD−ビタミンD3−[26,
26,26,27,27,27]−2H6の定量のための具体例としてのMRM遷移は、
約566.2のm/zを有する前駆体イオンを約298.0のm/zを有する生成物イオ
ンにフラグメント化することを含む。
的に入手できる情報は、それぞれの個々の刊行物が参照により組み込まれると具体的且つ
別々に示されたかのようなことと同じ程度にそれらの全体として参照により組み込まれて
いる。出願者は、そのような論文、特許及び特許出願又は他の物理的及び電子的文書から
のいずれか及びすべての資料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保する。
の要素、制限又は複数の制限がない場合に適切に実施することができる。したがって、例
えば、「を含む(comprising)」、「を含む(including)」、「を含有する(containin
g)」等は、拡張的且つ制限なく読むものとする。さらに、本明細書で用いた用語及び表
現は、記述の用語として用い、制限の用語として用いず、示し、記述した特徴又はその一
部の同等物を除くそのような用語及び表現を用いないものとする。請求した本発明の範囲
内で様々な変更が可能であることが認識される。したがって、本発明を好ましい実施形態
及び任意選択の特徴により具体的に開示したが、開示した本明細書で具体化された本発明
の変更形態及び変形形態は当業者が用いることができること、またそのような変更形態及
び変形形態は本発明の範囲内にあることを理解すべきである。
概念及び下位概念分類のそれぞれも方法の一部をなす。これは、削除された事柄が本明細
書で具体的に列挙されているか否かにかかわりなく、但し書又は類概念から主題を除外す
る消否定的限定による方法の一般的記述を含む。
カッシュグループにより記述されている場合、当業者は、本発明もそれによりマーカッシ
ュグループの個々のメンバー又はメンバーのサブグループにより記述されていることを認
識するであろう。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
[1] 処理前のステロイド化合物が各試験試料中で同じである、複数の試験試料のそれぞれにおけるステロイド化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
各試験試料を別々に処理して複数の処理済み試料を調製するステップであって、前記処理の結果として、各処理済み試料中のステロイド化合物が他の処理済み試料中のステロイド化合物と質量分析により区別できる、ステップと、
処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる1つ又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合試料をイオン化源にさらすステップであって、各処理済み試料からのステロイド化合物から発生する1つ又は複数のイオンが他の処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
質量分析により各処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンの量を検出するステップと、
各処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンの量を各試験試料中のステロイド化合物の量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。
[2] 前記複数の処理済み試料が非誘導体化ステロイド化合物を含む1つの処理済み試料を含む、上記[1]に記載の方法。
[3] 前記処理が、各試験試料を、誘導体化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異なる誘導体化剤にさらすステップを含む、上記[1]に記載の方法。
[4] 前記異なる誘導体化剤が互いの同位体バリアントである、上記[3]に記載の方法。
[5] 前記異なる誘導体化剤がクックソン型誘導体化剤である、上記[3]に記載の方法。
[6] 前記クックソン型誘導体化剤が、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)、4−メチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(MTAD)、4−[2−(6,7−ジメトキシ−4−メチル−3−オキソ−3,4−ジヒドロキノキサリル)エチル]−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(DMEQTAD)、4−(4−ニトロフェニル)−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(NPTAD)、4−フェロセニルメチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(FMTAD)及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択される、上記[5]に記載の方法。
[7] 前記クックソン型誘導体化剤が4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の同位体バリアントである、上記[5]に記載の方法。
[8] 複数の試料が2つの試料を含み、第1の誘導化試薬が4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)であり、第2の誘導化試薬が 13 C 6 −4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン( 13 C 6 −PTAD)である、上記[3]から[7]のいずれか一項に記載の方法。
[9] 前記ステロイド化合物がビタミンD又はビタミンD関連化合物である、上記[1]から[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10] 前記ステロイド化合物が、ビタミンD 2 、ビタミンD 3 、25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )、25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )、1α,25−ジヒドロキシビタミンD 2 (1α,25OHD 2 )及び1α,25−ジヒドロキシビタミンD 3 (1α,25OHD 3 )からなる群から選択される、上記[1]から[9]のいずれか一項に記載の方法。
[11] 前記ステロイド化合物が、25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )又は25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )である、上記[10]に記載の方法。
[12] 複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさらに含む、上記[1]から[11]のいずれか一項に記載の方法。
[13] 抽出カラムが固相抽出(SPE)カラムである、上記[12]に記載の方法。
[14] 抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、上記[12]に記載の方法。
[15] 分析カラムが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、上記[12]から[14]のいずれか一項に記載の方法。
[16] 質量分析がタンデム質量分析である、上記[1]から[15]のいずれか一項に記載の方法。
[17] 前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンとして実施される、上記[16]に記載の方法。
[18] 抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、上記[12]から[17]のいずれか一項に記載の方法。
[19] 前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離(LDTD)を含む、上記[1]から[18]のいずれか一項に記載の方法。
[20] 前記イオン化源が、エレクトロスプレーイオン化源(ESI)又は大気圧化学イオン化源(APCI)を含む、上記[1]から[19]のいずれか一項に記載の方法。
[21] 前記試験試料が生物学的試料を含む、上記[1]から[20]のいずれか一項に記載の方法。
[22] 前記試験試料が血漿又は血清を含む、上記[21]に記載の方法。
[23] 複数の試験試料のそれぞれにおける2つ又はそれ以上のステロイド化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
各試験試料を別々に処理して、複数の処理済み試料を調製するステップであって、前記処理の結果として、各処理済み試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が他の処理済み試料中の同じ2つ又はそれ以上のステロイド化合物と質量分析により区別できる、ステップと、
処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる1つ又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合試料をイオン化源にさらすステップであって、各処理済み試料からのステロイド化合物のそれぞれについて発生する1つ又は複数のイオンが他の処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
質量分析により各処理済み試料からの2つ又はそれ以上のステロイド化合物のそれぞれからの1つ又は複数のイオンの量を検出するステップと、
各処理済み試料からの2つ又はそれ以上のステロイド化合物のそれぞれからの1つ又は複数のイオンの量を各試験試料中のステロイド化合物のそれぞれの量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。
[24] 前記複数の処理済み試料が非誘導体化ステロイド化合物を含む1つの処理済み試料を含む、上記[23]に記載の方法。
[25] 前記処理が、各試験試料を、誘導体化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異なる誘導体化剤にさらすステップを含む、上記[23]に記載の方法。
[26] 前記異なる誘導体化剤が互いの同位体バリアントである、上記[25]に記載の方法。
[27] 前記異なる誘導体化剤がクックソン型誘導体化剤である、上記[25]に記載の方法。
[28] 前記クックソン型誘導体化剤が、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)、4−メチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(MTAD)、4−[2−(6,7−ジメトキシ−4−メチル−3−オキソ−3,4−ジヒドロキノキサリル)エチル]−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(DMEQTAD)、4−(4−ニトロフェニル)−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(NPTAD)、4−フェロセニルメチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(FMTAD)及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択される、上記[27]に記載の方法。
[29] 前記クックソン型誘導体化剤が、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の同位体バリアントである、上記[27]に記載の方法。
[30] 複数の試料が2つの試料を含み、第1の誘導体化試薬が4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)であり、第2の誘導体化試薬が 13 C 6 −4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン( 13 C 6 −PTAD)である、上記[23]から[29]のいずれか一項に記載の方法。
[31] 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物がビタミンD又はビタミンD関連化合物である、上記[23]から[30]のいずれか一項に記載の方法。
[32] 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が、ビタミンD 2 、ビタミンD 3 、25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )、25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )、1α,25−ジヒドロキシビタミンD 2 (1α,25OHD 2 )及び1α,25−ジヒドロキシビタミンD 3 (1α,25OHD 3 )からなる群から選択される、上記[23]から[31]のいずれか一項に記載の方法。
[33] 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )及び25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )からなる群から選択される少なくとも1つのステロイド化合物を含む、上記[32]に記載の方法。
[34] 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が、25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )及び25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )である、上記[32]に記載の方法。
[35] 複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさらに含む、上記[23]から[34]のいずれか一項に記載の方法。
[36] 抽出カラムが固相抽出(SPE)カラムである、上記[35]に記載の方法。
[37] 抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、上記[35]に記載の方法。
[38] 分析カラムが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、上記[[35]から[37]のいずれか一項に記載の方法。
[39] 質量分析がタンデム質量分析である、上記[23]から[38]のいずれか一項に記載の方法。
[40] 前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンとして実施される、上記[39]に記載の方法。
[41] 抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、上記[23]から[40]のいずれか一項に記載の方法。
[42] 前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離(LDTD)を含む、上記[23]から41のいずれか一項に記載の方法。
[43] 前記イオン化源が、エレクトロスプレーイオン化源(ESI)又は大気圧化学イオン化源(APCI)を含む、上記[23]から[42]のいずれか一項に記載の方法。
[44] 前記試験試料が生物学的試料を含む、上記[23]から[44]のいずれか一項に記載の方法。
[45] 前記試験試料が血漿又は血清を含む、上記[44]に記載の方法。
[46] 処理前のビタミンD又はビタミンD関連化合物がすべての試験試料中で同じである、2つの試験試料のそれぞれにおけるビタミンD又はビタミンD関連化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
ビタミンD又はビタミンD関連誘導体を得るのに適する条件下で4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第1の同位体バリアントに第1の試験試料をさらすことによって第1の処理済み試料を調製するステップと、
ビタミンD又はビタミンD関連誘導体を得るのに適する条件下で4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第2の同位体バリアントに第2の試験試料をさらすことによって第2の処理済み試料を調製するステップであって、PTADの第1及び第2の同位体バリアントが質量分析により区別できる、ステップと、
第1の処理済み試料を第2の処理済み試料と合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる1つ又は複数のイオンを得るのに適する条件下で複合試料中の各処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体をイオン化源にさらすステップであって、第1の処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体からの1つ又は複数のイオンが第2の処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体からの1つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
各処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体からの1つ又は複数のイオンの量を質量分析により測定するステップと、
測定されたイオンの量を第1及び第2の試験試料中のビタミンD又はビタミンD関連化合物の量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。
[47] 4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第1の同位体バリアントが4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)であり、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第2の同位体バリアントが 13 C 6 −4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン( 13 C 6 −PTAD)である、上記[46]に記載の方法。
[48] ビタミンD又はビタミンD関連化合物が、25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )及び25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )からなる群から選択される、上記[46]又は[47]のいずれか一項に記載の方法。
[49] 試験試料が2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物をさらに含み、各試験試料中の2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物の量が測定される、上記[46]から[48]のいずれか一項に記載の方法。
[50] 2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物が25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )及び25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )を含む、上記[49]に記載の方法。
[51] 2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物が25−ヒドロキシビタミンD 2 (25OHD 2 )及び25−ヒドロキシビタミンD 3 (25OHD 3 )である、上記[49]に記載の方法。
[52] 複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさらに含む、上記[46]から[51]のいずれか一項に記載の方法。
[53] 抽出カラムが固相抽出(SPE)カラムである、上記[52]に記載の方法。
[54] 抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、上記[52]に記載の方法。
[55] 分析カラムが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、上記[52]から[54]のいずれか一項に記載の方法。
[56] 質量分析がタンデム質量分析である、上記[52]から[55]のいずれか一項に記載の方法。
[57] 前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンとして実施される、上記[56]に記載の方法。
[58] 抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、上記[52]から[57]のいずれか一項に記載の方法。
[59] 前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離(LDTD)を含む、上記[46]から[58]のいずれか一項に記載の方法。
[60] 前記イオン化源がエレクトロスプレーイオン化源(ESI)又は大気圧化学イオン化源(APCI)を含む、上記[46]から[59]のいずれか一項に記載の方法。
[61] 前記試験試料が生物学的試料を含む、上記[46]から[60]のいずれか一項に記載の方法。
[62] 前記試験試料が血漿又は血清を含む、上記[61]に記載の方法。
Claims (62)
- 処理前のステロイド化合物が各試験試料中で同じである、複数の試験試料のそれぞれに
おけるステロイド化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
各試験試料を別々に処理して複数の処理済み試料を調製するステップであって、前記処
理の結果として、各処理済み試料中のステロイド化合物が他の処理済み試料中のステロイ
ド化合物と質量分析により区別できる、ステップと、
処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる1つ又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合
試料をイオン化源にさらすステップであって、各処理済み試料からのステロイド化合物か
ら発生する1つ又は複数のイオンが他の処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ
又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
質量分析により各処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンの
量を検出するステップと、
各処理済み試料からのステロイド化合物からの1つ又は複数のイオンの量を各試験試料
中のステロイド化合物の量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。 - 前記複数の処理済み試料が非誘導体化ステロイド化合物を含む1つの処理済み試料を含
む、請求項1に記載の方法。 - 前記処理が、各試験試料を、誘導体化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異な
る誘導体化剤にさらすステップを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記異なる誘導体化剤が互いの同位体バリアントである、請求項3に記載の方法。
- 前記異なる誘導体化剤がクックソン型誘導体化剤である、請求項3に記載の方法。
- 前記クックソン型誘導体化剤が、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−
ジオン(PTAD)、4−メチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(MTA
D)、4−[2−(6,7−ジメトキシ−4−メチル−3−オキソ−3,4−ジヒドロキ
ノキサリル)エチル]−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(DMEQTAD)
、4−(4−ニトロフェニル)−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(NPTA
D)、4−フェロセニルメチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(FMTA
D)及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択される、請求項5に記載の方法。 - 前記クックソン型誘導体化剤が4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジ
オン(PTAD)の同位体バリアントである、請求項5に記載の方法。 - 複数の試料が2つの試料を含み、第1の誘導化試薬が4−フェニル−1,2,4−トリ
アゾリン−3,5−ジオン(PTAD)であり、第2の誘導化試薬が13C6−4−フェ
ニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(13C6−PTAD)である、請求
項3から7のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ステロイド化合物がビタミンD又はビタミンD関連化合物である、請求項1から8
のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ステロイド化合物が、ビタミンD2、ビタミンD3、25−ヒドロキシビタミンD
2(25OHD2)、25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)、1α,25−ジ
ヒドロキシビタミンD2(1α,25OHD2)及び1α,25−ジヒドロキシビタミン
D3(1α,25OHD3)からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項
に記載の方法。 - 前記ステロイド化合物が、25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)又は25−
ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)である、請求項10に記載の方法。 - 複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさら
に含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。 - 抽出カラムが固相抽出(SPE)カラムである、請求項12に記載の方法。
- 抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、請求項12に記
載の方法。 - 分析カラムが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、請求項12から
14のいずれか一項に記載の方法。 - 質量分析がタンデム質量分析である、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イ
オンスキャンとして実施される、請求項16に記載の方法。 - 抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、請求項12
から17のいずれか一項に記載の方法。 - 前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離(LDTD)を含む、請求項1から18の
いずれか一項に記載の方法。 - 前記イオン化源が、エレクトロスプレーイオン化源(ESI)又は大気圧化学イオン化
源(APCI)を含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。 - 前記試験試料が生物学的試料を含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験試料が血漿又は血清を含む、請求項21に記載の方法。
- 複数の試験試料のそれぞれにおける2つ又はそれ以上のステロイド化合物の量を単一の
質量分析により測定する方法であって、
各試験試料を別々に処理して、複数の処理済み試料を調製するステップであって、前記
処理の結果として、各処理済み試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が他の処理
済み試料中の同じ2つ又はそれ以上のステロイド化合物と質量分析により区別できる、ス
テップと、
処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる1つ又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合
試料をイオン化源にさらすステップであって、各処理済み試料からのステロイド化合物の
それぞれについて発生する1つ又は複数のイオンが他の処理済み試料からのステロイド化
合物からの1つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
質量分析により各処理済み試料からの2つ又はそれ以上のステロイド化合物のそれぞれ
からの1つ又は複数のイオンの量を検出するステップと、
各処理済み試料からの2つ又はそれ以上のステロイド化合物のそれぞれからの1つ又は
複数のイオンの量を各試験試料中のステロイド化合物のそれぞれの量と関連づけるステッ
プと
を含む、上記方法。 - 前記複数の処理済み試料が非誘導体化ステロイド化合物を含む1つの処理済み試料を含
む、請求項23に記載の方法。 - 前記処理が、各試験試料を、誘導体化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異な
る誘導体化剤にさらすステップを含む、請求項23に記載の方法。 - 前記異なる誘導体化剤が互いの同位体バリアントである、請求項25に記載の方法。
- 前記異なる誘導体化剤がクックソン型誘導体化剤である、請求項25に記載の方法。
- 前記クックソン型誘導体化剤が、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−
ジオン(PTAD)、4−メチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(MTA
D)、4−[2−(6,7−ジメトキシ−4−メチル−3−オキソ−3,4−ジヒドロキ
ノキサリル)エチル]−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(DMEQTAD)
、4−(4−ニトロフェニル)−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(NPTA
D)、4−フェロセニルメチル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(FMTA
D)及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択される、請求項27に記載の方法
。 - 前記クックソン型誘導体化剤が、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−
ジオン(PTAD)の同位体バリアントである、請求項27に記載の方法。 - 複数の試料が2つの試料を含み、第1の誘導体化試薬が4−フェニル−1,2,4−ト
リアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)であり、第2の誘導体化試薬が13C6−4−
フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(13C6−PTAD)である、
請求項23から29のいずれか一項に記載の方法。 - 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物がビタミンD又はビタミンD関連
化合物である、請求項23から30のいずれか一項に記載の方法。 - 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が、ビタミンD2、ビタミンD3
、25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD2)、25−ヒドロキシビタミンD3(2
5OHD3)、1α,25−ジヒドロキシビタミンD2(1α,25OHD2)及び1α
,25−ジヒドロキシビタミンD3(1α,25OHD3)からなる群から選択される、
請求項23から31のいずれか一項に記載の方法。 - 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が25−ヒドロキシビタミンD2
(25OHD2)及び25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)からなる群から選
択される少なくとも1つのステロイド化合物を含む、請求項32に記載の方法。 - 各試験試料中の2つ又はそれ以上のステロイド化合物が、25−ヒドロキシビタミンD
2(25OHD2)及び25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)である、請求項
32に記載の方法。 - 複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさら
に含む、請求項23から34のいずれか一項に記載の方法。 - 抽出カラムが固相抽出(SPE)カラムである、請求項35に記載の方法。
- 抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、請求項35に記
載の方法。 - 分析カラムが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、請求項35から
37のいずれか一項に記載の方法。 - 質量分析がタンデム質量分析である、請求項23から38のいずれか一項に記載の方法
。 - 前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イ
オンスキャンとして実施される、請求項39に記載の方法。 - 抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、請求項23
から40のいずれか一項に記載の方法。 - 前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離(LDTD)を含む、請求項23から41
のいずれか一項に記載の方法。 - 前記イオン化源が、エレクトロスプレーイオン化源(ESI)又は大気圧化学イオン化
源(APCI)を含む、請求項23から42のいずれか一項に記載の方法。 - 前記試験試料が生物学的試料を含む、請求項23から44のいずれか一項に記載の方法
。 - 前記試験試料が血漿又は血清を含む、請求項44に記載の方法。
- 処理前のビタミンD又はビタミンD関連化合物がすべての試験試料中で同じである、2
つの試験試料のそれぞれにおけるビタミンD又はビタミンD関連化合物の量を単一の質量
分析により測定する方法であって、
ビタミンD又はビタミンD関連誘導体を得るのに適する条件下で4−フェニル−1,2
,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第1の同位体バリアントに第1の試
験試料をさらすことによって第1の処理済み試料を調製するステップと、
ビタミンD又はビタミンD関連誘導体を得るのに適する条件下で4−フェニル−1,2,
4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第2の同位体バリアントに第2の試験
試料をさらすことによって第2の処理済み試料を調製するステップであって、PTADの
第1及び第2の同位体バリアントが質量分析により区別できる、ステップと、
第1の処理済み試料を第2の処理済み試料と合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる1つ又は複数のイオンを得るのに適する条件下で複合試料中
の各処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体をイオン化源にさらすステ
ップであって、第1の処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体からの1
つ又は複数のイオンが第2の処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体か
らの1つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
各処理済み試料からのビタミンD又はビタミンD関連誘導体からの1つ又は複数のイオ
ンの量を質量分析により測定するステップと、
測定されたイオンの量を第1及び第2の試験試料中のビタミンD又はビタミンD関連化
合物の量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。 - 4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第1の同位
体バリアントが4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)
であり、4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジオン(PTAD)の第2
の同位体バリアントが13C6−4−フェニル−1,2,4−トリアゾリン−3,5−ジ
オン(13C6−PTAD)である、請求項46に記載の方法。 - ビタミンD又はビタミンD関連化合物が、25−ヒドロキシビタミンD2(25OHD
2)及び25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)からなる群から選択される、請
求項46又は47のいずれか一項に記載の方法。 - 試験試料が2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物をさらに含み、各
試験試料中の2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物の量が測定される
、請求項46から48のいずれか一項に記載の方法。 - 2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物が25−ヒドロキシビタミン
D2(25OHD2)及び25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)を含む、請求
項49に記載の方法。 - 2つ又はそれ以上のビタミンD又はビタミンD関連化合物が25−ヒドロキシビタミン
D2(25OHD2)及び25−ヒドロキシビタミンD3(25OHD3)である、請求
項49に記載の方法。 - 複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさら
に含む、請求項46から51のいずれか一項に記載の方法。 - 抽出カラムが固相抽出(SPE)カラムである、請求項52に記載の方法。
- 抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー(TFLC)カラムである、請求項52に記
載の方法。 - 分析カラムが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムである、請求項52から
54のいずれか一項に記載の方法。 - 質量分析がタンデム質量分析である、請求項52から55のいずれか一項に記載の方法
。 - 前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イ
オンスキャンとして実施される、請求項56に記載の方法。 - 抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、請求項52
から57のいずれか一項に記載の方法。 - 前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離(LDTD)を含む、請求項46から58
のいずれか一項に記載の方法。 - 前記イオン化源がエレクトロスプレーイオン化源(ESI)又は大気圧化学イオン化源
(APCI)を含む、請求項46から59のいずれか一項に記載の方法。 - 前記試験試料が生物学的試料を含む、請求項46から60のいずれか一項に記載の方法
。 - 前記試験試料が血漿又は血清を含む、請求項61に記載の方法。
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