CN104797715A - 通过质谱法定量甲状腺球蛋白 - Google Patents

通过质谱法定量甲状腺球蛋白 Download PDF

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Abstract

提供利用各种纯化步骤和随后的质谱法确定样品中甲状腺球蛋白的量的方法。该方法总体上涉及纯化试样中的甲状腺球蛋白、消化甲状腺球蛋白以形成肽T129、纯化肽T129、电离肽T129、检测生成的肽T129离子的量、和将肽T129离子的量与原始存在于样品中的甲状腺球蛋白的量相关联。

Description

通过质谱法定量甲状腺球蛋白
相关申请的交叉参考
本申请根据《美国法典》第35卷第119节第五款(35U.S.C.§119(e))的规定要求2012年9月20日提交的美国临时申请序列号：61/703,721的权益，其全部内容通过引用并入本发明。
发明领域
本发明涉及甲状腺球蛋白的定量。在特定方面，本发明涉及通过质谱法定量甲状腺球蛋白的方法。
发明背景
本公开背景的以下描述仅仅作为理解本发明的辅助而提供，且不认为对本发明描述或构成现有技术。
甲状腺球蛋白或Tg是分子量为660kDa的大二聚体分泌性糖蛋白，其由非共价结合的同型二聚体组成。
Tg分子以几种形式存在。在UniProt Knowledgebase(Swiss-Prot+TrEMBL)找到的三种主要的Tg分子序列是P01266(人甲状腺球蛋白前体)、P01266-2(P01266的同种型2)和Q59GF02(人甲状腺球蛋白变体)(分别参见图1、2和3)。
P01266是P01266的主要变体，其长度为2768个AA；P01266-2是P01266的同种型，其长度为2711个AA。P01266-2与P01266在Tg的1510至1567位氨基酸不同；Q59GF0是甲状腺球蛋白片段，其长度为1574个AA。Q59GF0包含Tg的1212至2768位的氨基酸。
Tg只能在甲状腺中产生，可由正常良好分化的良性甲状腺细胞或甲状腺癌细胞产生。其为用于甲状腺激素合成的前体蛋白，并充当甲状腺碘储存的基质。Tg由甲状腺用来产生甲状腺激素甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)。血液中的Tg水平可用作分化型甲状腺癌(DTC)的肿瘤标志物。血液中高水平的Tg并非单独为甲状腺癌的指示物，而是在甲状腺手术切除之后Tg在血液内的存留指示甲状腺组织的存留。在甲状腺手术切除之后检测血液中Tg后的治疗过程可包括施用放射性碘以切除所有剩余的正常甲状腺。切除所有正常甲状腺之后血液中Tg的继续存留可指示仍然存在一定量的肿瘤。
已经开发了几种定量Tg的方法。例如Spencer,et al.,Thyroid,1999,9(5):435-41and Persoon,et al.,Clinical Chem 2006,52(4):686-691公开免疫测定法、放射性免疫测定法、以及免疫化学发光分析法用于定量Tg。这些方法均面临方法学问题，如标准化的不同、批间分析灵敏度和精确度的变化性、钩状效应和由Tg抗体造成的干扰。由Tg抗体造成的干扰问题尤其对监测Tg水平作为肿瘤标志物的临床应用造成困难，因为高达20％的甲状腺癌患者具有Tg自身抗体。
发明概述
本发明提供通过包括串联质谱法的质谱法定量样品中Tg的方法。
一方面，提供确定试样中Tg的量的方法，包括：(a)对含Tg的试样进行消化，引起Tg肽的产生；(b)纯化一种或多种Tg肽；(c)电离一种或多种Tg肽；(d)通过质谱法检测Tg肽离子(一种或多种)的量；和(e)使所检测的Tg肽离子(一种或多种)的量与试样中Tg的量相关联。制备Tg肽的优选的酶为胰蛋白酶。用于该方法的合适的Tg肽为可通过质谱法评价且可从可由除了Tg之外的蛋白质生成的有关肽中充分纯化的Tg肽。一种这样的肽的示例为肽T129(序列VIFDANAPVAVR；SEQID NO：1)，其包含Tg第1579至1590位的氨基酸，分子量为大约1,270Da，且在Tg的所有三种同种型中存在。参见图4。
肽T129的形成提供了针对甲状腺球蛋白特有的胰蛋白酶生成肽。并且，从Tg的胰蛋白酶消化而产生肽T129应当不受Tg抗体存在或不存在的影响。因此，测量试样中肽T129的增加提供定量试样中初始Tg的量而不受Tg抗体干扰影响的方法。
可使用任何合适的方法确定由样品中Tg消化引起的Tg肽的量。在试样可包含内源Tg肽的情况下，可采取步骤确保内源肽不与通过消化样品中Tg生成的肽相混淆。一种途径是在消化Tg之前从样品中去除内源Tg肽。其可例如利用尺寸分离技术完成。另一种途径是根据本发明要求保护的方法分析部分试样，但除去消化步骤，从而建立试样中内源肽的基准水平。在这种途径中，一旦确定基准，其可从消化后的肽水平中减去，消化后的肽水平表示内源肽和消化生成的肽。
由于该方法可应用于复杂的试样(尤其是体液或源自组织的试样)，可采取步骤在消化之前纯化试样中的Tg。这可例如利用尺寸分离技术完成。
在一些实施方式中，方法包括生成一种或多种Tg肽离子，其中至少一种该离子具有与(带单电荷或多电荷的)肽T129离子的质荷比(m/z)相当的质荷比。在优选的相关实施方式中，方法包括生成一种或多种Tg肽离子，其中至少一种具有1272.8±0.5、636.4±0.5、或424.3±0.5的m/z(相当于带单电荷、双电荷或三电荷的肽T129离子)。在相关的优选实施方式中，方法可包括生成Tg肽离子的一种或多种碎片离子，其中至少一种具有541.3±0.5、612.3±0.5、726.4±0.5、797.4±0.5、912.4±0.5或1059.5±0.5的m/z；优选地，该碎片离子的一种或多种选自具有797.4±0.5、912.4±0.5和1059.5±0.5的m/z的离子。
在一些实施方式中，步骤(b)中的纯化使用至少一种尺寸分离技术完成。优选地，尺寸分离技术可以是过滤、LC或其任何组合。在某些优选实施方式中，试样为体液或组织。在一些实施方式中，包括额外的步骤，其中对第二量的试样进行步骤(b)至(e)，从而建立一种或多种内源Tg肽的基准水平。在这些实施方式中，该基准水平可从在试样中检测的Tg肽离子(一种或多种)的量中减去，以确定由原始试样中的Tg产生的Tg肽离子的量。在其它实施方式中，方法包括在消化之前纯化试样中Tg的额外初始步骤。在这些实施方式中，消化前纯化和/或步骤(b)中的纯化可各自使用至少一种尺寸分离技术完成。优选地，在消化前纯化和步骤(b)中均使用的至少一种尺寸分离技术是过滤；更优选地，该过滤利用具有分子量截止的分子量截止过滤器完成，该过滤器使得Tg保留在过滤器的上方，并使得Tg肽跟随滤液通过。在相关实施方式中，分子量截止为大约2kD至300kD；更加优选地为大约100kD至300kD。在这些实施方式中，两种过滤(预消化和步骤(b))可利用相同的过滤器进行。
在第二个方面，提供确定试样中Tg的量的方法，包括：(a)对含Tg的试样进行消化，引起肽T129的产生；(b)纯化肽T129；(c)电离肽T129以生成具有636.4±0.5的m/z的前体离子；(d)使肽T129前体离子碎裂，以形成一种或多种碎片离子，其中至少一种具有大约797.4±0.5、912.4±0.5或1059.5±0.5的m/z；通过质谱法检测肽T129前体离子、一种或多种碎片离子、或二者的量；和(e)将所检测的离子(一种或多种)的量与试样中Tg的量相关联。在某些优选实施方式中，试样为体液或组织。在一些实施方式中，包括额外的步骤，其中对第二量的试样进行步骤(b)至(e)，从而建立一种或多种内源肽T129的基准水平。在这些实施方式中，该基准水平可从在试样中检测的肽T129离子(一种或多种)的量中减去，以确定由原始试样中的Tg产生的肽T129离子(一种或多种)的量。在其它实施方式中，方法包括在消化之前纯化试样中Tg的额外初始步骤。在这些实施方式中，预消化纯化和/或步骤(b)中的纯化可各自利用至少一种尺寸分离技术完成。优选地，在预消化纯化和步骤(b)中均使用的至少一个尺寸分离技术为过滤；更优选地，该过滤利用具有分子量截止的分子量截止过滤器完成，该过滤器使得Tg保留在过滤器的上方，并使得Tg肽跟随滤液通过。在相关实施方式中，分子量截止为大约2kD至300kD；更优选地为大约100kD至300kD。在这些实施方式中，两种过滤(预消化和步骤(b))可利用相同的过滤器进行。
如本文使用的，术语“纯化(purification)”或“纯化(purifying)”不是指除感兴趣分析物(一种或多种)之外将所有物质从样品中去除。相反，纯化是指相对于样品的一种或多种其它组分富集感兴趣的一种或多种分析物的量的过程。本文使用的纯化不需要使分析物从所有其它物质中分离。在优选的实施方式中，纯化步骤或过程可用于去除一种或多种干扰物质，例如一种或多种将干扰该方法中使用的仪器运行的物质或可干扰通过质谱法检测分析物离子的物质。
如本文使用的，与不包含测量离子质量的定量测量有关的术语“大约”是指指示值加上或减去10％。
如本文使用的，术语“基本上所有的”是指任何大于50％、更优选地大于60％、更优选地大于70％、更优选地大于80％、和更优选地大于90％的比例。
如本文使用的，术语“试样”是指任何可包含Tg的样品。如本文使用的，术语“体液或组织”是指任何可从个体的身体分离的液体或组织。例如，“体液或组织”可包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿、眼泪、汗和类似物。如果要分析实体组织，其可受到处理以释放可含有任何存在于组织中的Tg的液体组分。然后，可对该液体组分进行本文所述的方法。
如本文使用的，术语“消化”是指蛋白酶剪切蛋白质成肽。消化剂可包括胰蛋白酶、Lyc-C、Arg-R、Asp-N和类似物。通过将消化剂(即酶)添加至样品和温育一段时间而进行消化。
如本文使用的，“Tg”或“Tg分子”是指完整的Tg蛋白分子。
如本文使用的，术语“Tg肽”是指作为天然Tg的片段的100个氨基酸或更少氨基酸的任何肽。Tg肽可以内源于试样或由于Tg的消化而形成。肽T129是由于Tg的胰蛋白酶消化而形成的Tg肽的实例。
如本文使用的，术语“尺寸分离技术”是指允许基于任何一种或多种分子量和形状从试样中分离至少一种物质的任何技术(物理技术或化学技术)。这类技术的实例包括但不限于过滤、层析和质谱法的某些方面。
如本文使用的，术语“层析”是指这样的过程，其中由于化学实体在液体固定相或固体固定相周围、之上和/或通过其流动时它们的差异分配，而使液体或气体携带的化学混合物分为组分。
如本文使用的，术语“液相层析”或“LC”是指当流体均匀地渗透通过精细分散的物质的柱或通过毛细管通道时，选择性阻滞流体溶液一种或多种组分的过程。阻滞由在体相流体(即流动相)相对于固定相移动时混合物组分在一种或多种固定相和该流体之间的分配所造成。“液相层析”包括反相液相层析(RPLC)、高效液相层析(HPLC)和高湍流液相层析(HTLC)。
如本文使用的，术语“高效液相层析”或“HPLC”是指这样的液相层析，其中通过迫使流动相在压力下通过固定相而增加分离程度，该固定相通常为密集填充的柱。
如本文使用的，术语“质谱法”或“MS”是指通过化合物的质量将它们识别的分析技术。MS是指基于离子的m/z将它们过滤、检测和测量的方法。MS技术通常包括(1)电离化合物以形成带电物质(例如离子)；和(2)检测该离子的分子量和计算它们的m/z。可通过任何合适的方法电离和检测化合物。“质谱仪”通常包括电离源和离子检测器。通常，电离感兴趣的一种或多种分子，随后将离子引入质谱仪器，在此由于磁场和电场的结合，离子遵循空间内取决于质量(“m”)和电荷(“z”)的路线。参见，例如，名为“Mass Spectrometry From Surfaces”的美国专利号6,204,500；名为“Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry”的美国专利号6,107,623；名为“DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry”的美国专利号6,268,144；名为“Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For DesorptionAnd Detection Of Analytes”的美国专利号6,124,137；Wright et al.,Prostate Cancer andProstatic Diseases 2:264-76(1999)；和Merchant and Weinberger,Electrophoresis 21:1164-67(2000)。
如本文使用的，术语“以正离子模式运行”是指那些检测正离子的质谱法。类似地，术语“以负离子模式运行”是指那些检测负离子的质谱法。
如本文使用的，术语“电离(ionization)”或“电离(ionizing)”是指生成具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子。
如本文使用的，术语“电子电离”或“EI”是指其中气相或汽相的感兴趣分析物与电子流相互作用的方法。电子与分析物的碰撞产生分析物离子，随后可对分析物离子进行质谱法技术。
如本文使用的，术语“化学电离”或“CI”是指这样的方法，其中对试剂气体(例如氨)进行电子碰撞，且分析物离子由试剂气体离子和分析物分子的相互作用形成。
如本文使用的，术语“快原子轰击”或“FAB”是指这样的方法，其中一束高能量原子(通常为Xe或Ar)碰撞非挥发性样品，解吸和电离样品中包含的分子。试样溶解在粘性液相基质如甘油、硫甘油、m-硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯辛基醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。化合物或样品合适的基质的选择是经验性过程。
如本文使用的，术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”是指这样的方法，其中将非挥发性样品暴露于激光辐射，激光辐射通过各种电离途径——包括光离子化、质子化、脱质子化和簇衰变解吸和电离样品中的分析物。对于MALDI，样品与能量吸收基质混合，其促进分析物分子的解吸。
如本文使用的，术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”是指另一种方法，其中将非挥发性样品暴露于激光辐射，激光辐射通过各种电离途径——包括光离子化、质子化、脱质子化和簇衰变解吸和电离样品中的分析物。对于SELDI，样品通常结合到优选地保留感兴趣的一种或多种分析物的表面。与在MALDI中一样，该过程也可使用能量吸收材料来促进电离。
如本文使用的，术语“电喷雾电离”或“ESI”是指这样的方法，其中溶液沿一根短长度的毛细管通过，高的正电势或负电势施加至毛细管的末端。将到达管末端的溶液汽化(雾化)成溶剂蒸气中的极小溶液滴的喷气或喷雾。该液滴雾流动通过蒸发室，其被轻微加热，从而防止冷凝并从而蒸发溶剂。随着液滴变得更小，表面电荷密度增加，直到同性电荷之间的自然排斥力引起离子和中性分子释放之时。
如本文使用的，术语“大气压化学电离”或“APCI”是指与ESI类似的质谱法；然而，APCI通过在大气压下在等离子体内发生的离子-分子反应而产生离子。血浆通过喷雾毛细管和对电极之间的放电维持。通常通过使用一组差分抽气分流器级将离子提取到质量分析器中。可使用干燥和预热的N2气体的逆流来提高溶剂的去除。APCI中的气相电离可比ESI更有效地用于分析较低极性的物质。
本文所使用的术语“大气压光电离”或“APPI”是指其中光电离分子的M的机制为光子吸收和电子射出以形成分子M+的质谱法形式。由于光子能量通常刚刚超过电离电位，分子离子不易于离解。在很多情况下，可能无需层析而分析样品，从而节约大量的时间和费用。在存在水蒸气或质子溶剂的情况下，分子离子可提取H以形成MH+。如果M具有高的质子亲和力，则这往往发生。这不影响定量精确性，因为M+和MH+之和恒定不变。质子溶剂中的药物化合物通常作为MH+而观察到，而非极性化合物如萘或睾酮通常形成M+。Robb,D.B.,Covey,T.R.and Bruins,A.P.(2000):参见例如，Robb et al.,Atmospheric pressure photoionization:An ionization method for liquidchromatography-mass spectrometry.Anal.Chem.72(15):3653-3659。
如本文使用的，术语“感应耦合等离子体”或“ICP”是指其中样品与部分电离的气体在足够高的温度下相互作用以原子化和电离大部分成分的方法。
如本文所使用的，术语“场解吸”是指其中将非挥发性试样放置在电离表面上，和使用强电场以生成分析物离子的方法。
如本文使用的，术语“解吸”是指从表面去除分析物和/或分析物进入气相。
如本文使用的，术语“定量限值”或“LOQ”是指测量变得定量有意义的点。在该LOQ的分析物响应是可识别的、独立的和可重复的，精密度为20％且准确度为80％至120％。
在本文公开的方法的某些优选实施方式中，质谱法以正离子模式进行。在本文公开的方法的某些尤其优选的实施方式中，使用ESI作为从Tg肽产生离子的方法进行质谱法。
在优选的实施方式中，在质谱仪中可检测的来自Tg肽电离的离子选自具有636.4±0.5、1059.5±0.5、921.4±0.5、797.4±0.5、726.4±0.5、612.3±0.5和541.3±0.5的m/z的离子；所列的第一种离子(636.4±0.5的m/z)是具有正的2个电子单位的净电荷的前体离子，所列的后面六种离子是前体离子的碎片离子。在尤其优选的实施方式中，前体离子具有正的2个电子单位的净电荷和大约636.4±0.5的m/z，碎片离子具有1059.5±0.5、921.4±0.5或797.4±0.5的m/z。
在一些优选的实施方式中，在胰蛋白酶消化之后将可单独检测的内标肽(例如，T129)引入试样。在这些实施方式中，来自内源Tg消化和内标添加的存在于试样中的全部或部分肽受到电离，以产生多种可在质谱仪中检测的离子，由肽电离产生的一种或多种离子在质谱仪检测到。
在其它优选的实施方式中，在胰蛋白酶消化之前在试样中提供可单独检测的内部Tg标准。在这些实施方式中，存在于试样中的全部或部分内源Tg和内标均由胰蛋白酶消化，导致Tg肽的形成。将Tg肽电离以产生多种可在质谱仪中检测的离子，由Tg肽电离产生的一种或多种离子通过质谱法检测。
在优选的实施方式中，由Tg消化造成的Tg肽电离所产生的可在质谱仪中检测的离子选自具有636.4±0.5、1059.5±0.5、921.4±0.5、797.4±0.5、726.4±0.5、612.3±0.5和541.3±0.5的m/z的离子；所列的第一种离子(636.4±0.5的m/z)是具有正的2个电子单位的净电荷的前体离子，所列的后面六种离子是前体离子的碎片离子。在尤其优选的实施方式中，前体离子具有正的2个电子单位的净电荷和636.4±0.5的m/z，碎片离子具有1059.5±0.5、921.4±0.5、797.4±0.5的m/z。
在优选的实施方式中，Tg肽离子的存在或量与原始试样中Tg与参照Tg样品相比的存在或量相关。
在一种实施方式中，方法涉及LC与质谱法的结合。在另一种优选的实施方式中，质谱法为串联质谱法(MS/MS)。
以上所述的本发明概述是非限制性的，通过本发明以下详细的描述和权利要求，将使本发明的其它特征和优势明显。
附图说明
图1显示通过MS/MS验证具有相当于肽T129的m/z的Tg肽离子的定量限值。详细情况描述于实施例1中。
图2显示利用LC-MS/MS测定对连续稀释的储备样品中肽T129进行定量的线性。详细情况描述于实施例1。
图3显示通过MS/MS验证脱去的血清(stripped serum)中肽T129的定量限值。详细情况描述于实施例2。
图4显示利用LC-MS/MS测定对肽T129加标脱去的血清中肽T129进行定量的线性。详细情况描述于实施例2。
图5显示根据本文所述的方法，在处理和浓缩之前，在用Tg加标的脱去血清中利用LC-MS/MS测定，对具有相当于肽T129的m/z的Tg肽离子进行定量的线性。详细情况描述于实施例3。
图6显示如实施例4所示用作内标的同位素标记的甲状腺球蛋白肽标准品的示例实施方式。
图7-10显示如实施例5所述来自抗体阴性的患者废弃物(图7、9)和抗体阳性的患者废弃物(图8、10)的，通过现有技术方法定量试样中甲状腺球蛋白(Y轴)与通过免疫测定或放射免疫测定定量(X轴)的图。
图11显示P01266的氨基酸序列(人甲状腺球蛋白前体；SEQ ID NO：3)。
图12显示P01266-2的氨基酸序列(P01266的同种型2；SEQ ID NO：4)。
图13显示Q59GF0的氨基酸序列(甲状腺球蛋白变体-片段；SEQ ID NO：5)。
图14显示图1-3中包含的三个序列的比较，表明它们都包含相当于Tg第1579至1590位的氨基酸。序列P01266在上方；序列P01266-2在中间；序列Q59GF0在底部。
发明详述
定量测量试样中Tg的方法得到描述。这种定量测量通过使用LC-MS/MS技术得以实现。在使用LC-MS/MS之前，样品可通过以下技术或其任何部分制备。可通过使用尺寸分离技术首先进行试样中Tg的纯化，使得试样中基本上所有的Tg得到保留。在首先的纯化步骤之后，可进行Tg的酶消化，产生感兴趣的Tg肽。在消化之后，可利用尺寸分离技术的另一次使用，使得在Tg酶消化中生成的所选Tg肽得到纯化。该第二尺寸分离技术可用于去除基本上所有未消化的、较高分子量的物质。正确执行样品制备技术确保通过LC-MS/MS定量的所选的Tg肽由原始处于试样中的Tg的酶消化直接产生；因此，在LC-MS/MS的开始试样中所选Tg肽的水平与原始存在于试样中的Tg的量成正比。
可使用任何合适的尺寸分离技术，但在以下的实施例中，第一和第二尺寸分离技术均通过分子量截止过滤器过滤。如以下实施例中所述，也可以选择具有适当的分子量截止的分子量截止过滤器，使得相同的过滤器可用于第一尺寸分离和第二尺寸分离。
使用LC、最优选的为HPLC，其可单独或与其它纯化方法结合使用，从而纯化所选Tg肽。该纯化与MS/MS结合，从而提供用于定量试样中所选Tg肽的测定系统。然后利用试样中所选Tg肽的量来确定原始试样中Tg的量。本文提供的Tg定量方法具有增强的特异性且不容易面临方法问题(如Tg抗体干扰)。
合适的试样可包括任何可包含感兴趣的分析物的试样。在一些优选的实施方式中，样品是生物样品；即，由任何生物来源如动物、细胞培养物、器官培养物等获得的样品。在特定的优选实施方式中，样品由哺乳动物如犬、猫、马等获得。尤其优选的哺乳动物是灵长类，最优选地为人。尤其优选的样品包括血液、血浆、血清、尿、唾液、眼泪、脑脊液或其它体液或组织样品。这些样品可获自例如患者；即，使自身经历用于诊断、预断或治疗疾病或状况的临床环境的有生命的人。试样优选地获自患者，例如，血清或血浆。
用于质谱法的样品制备
可处理或纯化样品以获得适于通过质谱法分析的制备物。这种纯化通常包括层析，如液相层析，且可通常包含在层析之前进行的额外的纯化过程。根据样品的种类或层析的种类，各种过程可用于此目的。实例包括过滤、离心、其组合和类似方法。在某些优选实施方式中，Tg在酶消化之前存在于试样中。
过滤是一种优选的制备用于层析的试样、尤其是生物学试样如血清或血浆的方法。这种过滤通过使试样穿过分子量截止过滤器过滤而进行，以将具有高于过滤器截止(包括Tg)的分子量的物质与具有低于过滤器截止的分子量的物质分离。在完全(或接近完全)过滤之后保留在过滤器上方的试样基本上不含具有低于过滤器截止的分子量的潜在干扰物质。
然后，可将试样的pH可调节至消化剂所需的任何点。在某些优选实施方式中，消化剂是胰蛋白酶，且可利用乙酸铵溶液调节pH，以使pH适于该酶。在这些优选的实施方式中，随后用胰蛋白酶消化样品以形成Tg肽(包括肽T129)。
在胰蛋白酶消化之后，可利用第二过滤纯化样品。可类似于上述预消化过滤进行这种消化后过滤(除了保留滤液之外)，从而从具有高于过滤器截止的分子量的潜在干扰物质中分离Tg片段，该潜在干扰物质也可能存在于样品中。然后，来自该消化后过滤的滤液可通过液相层析纯化并随后进行质谱法分析。
已经描述了涉及在质谱法分析之前使用用于样品净化的HPLC的各种方法。参见，例如，Taylor et al.,Therapeutic Drug Monitoring 22:608-12(2000)(手动沉淀血液样品，随后为手动C18固相萃取，注入HPLC中用于在C18分析柱上层析，和MS/MS分析)；和Salm et al.,Clin.Therapeutics 22Supl.B:B71-B85(2000)(手动沉淀血液样品，随后为手动C18固相萃取，注入HPLC中用于在C18分析柱上层析，和MS/MS分析)。本领域技术人员可选择适于在该方法中使用的HPLC仪器和柱。层析柱通常包含介质(即填充材料)以促进化学部分的分离(即分级)。介质可包含微小的颗粒。颗粒包含与各种化学部分相互作用的结合表面，以促进化学部分的分离。一种合适的结合表面是疏水结合表面如烷基结合表面。烷基结合表面可包含C-4、C-8或C-18结合烷基，优选地为C-8结合基团。层析柱包含用于接收样品的入口和用于排出包含被分级的样品的流出液的出口。
在特定的实施方式中，通过在感兴趣的分析物由柱填充材料可逆地保留而一种或多种其它物质不得到保留的情况下将样品施加至柱，可纯化分析物。在这些实施方式中，可利用其中感兴趣的分析物由柱保留的第一流动相条件，一旦将未保留的物质洗涤通过，则随后可利用第二流动相条件以从柱中去除所保留的物质。可选地，通过在感兴趣的分析物与一种或多种其它物质相比以差别速率洗脱的流动相情况下将样品施加至柱，可纯化分析物。这些过程可相对于样品的一种或多种其它组分富集一种或多种感兴趣的分析物的量。
在一种实施方式中，将待分析的样品在入口处施加至柱，用溶剂或溶剂混合物洗脱，并在出口处排出。可选择不同的溶剂模式用于洗脱感兴趣的分析物。例如，可使用梯度模式、等度模式或多型(即混合的)模式进行液相层析。在优选的实施方式中，HPLC在具有C8固相的分析HPLC系统上进行，使用HPLC级超纯水中0.2％的甲酸和100％甲醇中0.2％的甲酸作为流动相。
许多柱填充物可用于样品的层析分离，合适的分离方案的选择是经验性过程，其取决于样品特征、感兴趣的分析物、干扰物质的存在以及它们的特征等。商业上可提供的HPLC柱包括但不限于极性型、离子交换(阳离子和阴离子)型、疏水作用型、苯基型、C-2型、C-8型、C-18型以及多孔聚合柱上的极性涂层型。
在一种实施方式中，HPLC柱具有C8固相，其具有5μm(公称的)的中值粒径和的中值粒孔径。在优选的实施方式中，柱的尺寸为1.0mm ID×50mm长(Phenomenex Corp.Luna 5μC8(2)New Column 50×1.0mm,Phenomenex目录号00B-4249-A0或等同物)。
在层析过程中，物质的分离受变量如洗脱液(也称为“流动相”)的选择、梯度洗脱和梯度条件的选择、温度等的影响。
通过质谱法检测和定量
在各种实施方式中，可通过本领域技术人员所知的任何方法电离Tg肽。使用包含离子源的质谱仪进行质谱法，离子源用于电离分级的样品并产生带电荷的分子用于进一步分析。在各种MS技术中使用的电离源包括但不限于电子电离、化学电离、电喷雾电离(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光电离、大气压光电离(APPI)、快原子轰击(FAB)/液体二次电离(LSIMS)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场致电离、场解吸、热喷涂/等离子体喷涂电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、感应耦合等离子体(ICP)和微粒束电离。本领域技术人员将理解，可基于带测量的分析物、样品的类型、检测器的类型、阳性与阴性模式的选择等确定电离方法的选择。
在优选的实施方式中，通过电喷雾电离(ESI)电离Tg肽，产生Tg肽前体离子。在相关的优选实施方式中，Tg肽前体离子处于气态且惰性碰撞气体为氩。
在样品已经被电离之后，可分析由此产生的带正电荷的离子以确定m/z。用于确定m/z的合适分析器包括四极分析器、离子阱分析器和飞行时间分析器。可使用几种检测模式之一检测离子。例如，使用选择性离子监测模式(SIM)可仅检测所选的离子，或可选地，使用扫描模式例如多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)，可检测多种离子。在优选的实施方式中，使用SRM检测离子。
优选地，使用四极仪器确定m/z。在“四极”或“四极离子阱”仪器中，振荡射频场中的离子受到与施加在电极之间的DC电势、RF信号的振幅和m/z成比例的力。可选择电压和振幅，使得只有具有特定m/z的离子行进四极的长度，而所有其它离子偏转。因此，四极仪器可充当注入仪器的离子的“质量过滤器”和“质量检测器”。
通过利用“串联质谱法”或“MS/MS”，可增强MS技术的分辨度。在这种技术中，由感兴趣的分子生成的前体离子(也称为母离子)可在MS仪器中得到过滤，随后前体离子碎裂以产生一种或多种碎片离子(也称为子离子或产物离子)，然后在第二MS过程中分析碎片离子。通过仔细选择前体离子，只有由特定分析物产生的离子被传递到碎裂室，在此与惰性气体原子的碰撞产生碎片离子。由于前体和碎片离子均在给定的电离/碎裂条件组下以可重复的方式产生，MS/MS技术可提供极其强大的分析工具。例如，过滤/碎裂的结合可用于消除干扰物质，且在复杂的样品如生物样品中可尤其有用。
此外，技术的最新进展如基质辅助激光解吸电离加上飞行时间分析器(“MALDI-TOF”)允许在非常短的离子脉冲中分析处于毫微微摩尔水平的分析物。将飞行时间分析器与串联MS结合的质谱仪也是技术人员公知的。此外，在被称为“MS/MS”的方法中可结合多个质谱法步骤。可使用各种其它组合，如MS/MS/TOF、MALDI/MS/MS/TOF、或SELDI/MS/MS/TOF质谱法。
质谱仪通常向使用者提供离子扫描；即，具有给定范围(例如400至1600amu)内的特定m/z的每种离子的相对丰度。通过多种本领域已知的方法，分析物测定即质谱的结果可与原始样品中的分析物的量关联。例如，鉴于取样和分析参数受到小心控制，可将给定离子的相对丰度与将该相对丰度转换成原始分子绝对量的表相比较。可选地，分子标准品可与样品一起运行，基于由这些标准品生成的离子绘制标准曲线。利用该标准曲线，可将给定离子的相对丰度转换成原始分子的绝对量。在特定的优选实施方式中，利用内标生成标准曲线，用于计算Tg的量。生成和利用这些标准曲线的方法是本领域公知的，技术人员能够选择合适的内标。将离子的量与原始分子的量关联的多种其它方法是本领域技术人员公知的。
该方法一个或多个步骤可利用自动化机器进行。在特定实施方式中，一种或多种纯化步骤在线进行，更优选地，所有LC纯化和质谱法步骤可以以在线的方式进行。
在特定的实施方式中，可利用技术如MS/MS分离前体离子用于进一步碎裂。在这些实施方式中，可利用碰撞活化解离(CAD)生成碎片离子用于进一步检测。在CAD中，前体离子通过与惰性气体碰撞而增加能量，随后通过称为“单分子分解”的过程而碎裂。必须在前体离子中投入足够的能量，以使得离子中特定的键可由于增加的振动能而断裂。在可选的实施方式中，可利用电子转移解离(ETD)生成碎片离子。在ETD中，利用自由基负离子将电子转移至多电荷肽或蛋白阳离子，引起沿肽骨架的随机分裂。
在尤其优选的实施方式中，利用如下的LC-MS/MS检测和/或定量Tg。对如上所述制备的富集Tg肽的试样进行LC。来自层析柱的液体溶剂流进入LC-MS/MS分析器的加热的雾化器界面，溶剂/分析物混合物在界面的加热管中转换成蒸汽。包含在雾化溶剂中的分析物(例如Tg肽)通过界面的电晕放电针电离，电晕放电针将大的电压施加至雾化的溶剂/分析物混合物。离子(即Tg肽前体离子)穿过仪器的孔并进入第一四极。四极1和3(Q1和Q3)为质量过滤器，其允许基于离子的m/z选择离子(即“前体”和“碎片”离子)。四极2(Q2)为碰撞室，在此碎裂离子。Q1选择具有肽T129前体离子m/z(m/z为636.4±0.5)的离子。允许所选前体离子传递进入碰撞室(Q2)，而具有任何其它m/z的离子与Q1的侧面碰撞并被除去。利用碰撞活化解离(CAD)通过与中性氩气分子碰撞可碎裂进入Q2的前体离子。可选地，如果进入Q2的前体离子是多电荷阳离子，其可利用电子转移解离(ETD)碎裂。生成的碎片离子被传递进入Q3，在此收集所选的碎片离子而除去其它离子。
使用本领域公知的标准方法，本领域技术人员能够识别可用于在Q3中选择的特定Tg肽前体离子的一种或多种碎片离子。特异性碎片离子是不由其它具有类似分子结构的分子以显著的量形成的碎片离子。相反，非特异性碎片离子是由期望的分析物之外的分子形成的碎片离子。可通过测试各种分子标准品而识别合适的特异性碎片离子，以确定由所选Tg肽形成的碎片离子是否也由其它具有类似结构或特征的分子形成。优选地，识别至少一种对具有相当于肽T129离子m/z的m/z的Tg肽离子有特异性的碎片离子。更优选地，这些碎片离子的一种或多种具有797.4±0.5、912.4±0.5或1059.5±0.5的m/z。
当离子与检测器碰撞时，其产生转换成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传达至计算机，计算机绘制每单位时间的离子数。测量对应特定离子的峰下的面积或这些峰的振幅，面积或振幅与感兴趣的分析物的量相关联。在特定实施方式中，测量碎片离子和/或前体离子曲线下的面积或峰的振幅，以确定具有相当于肽T129的m/z的Tg肽的量。如上所述，利用基于分子内标一种或多种离子的峰的校准标准曲线，可将给定离子的相对丰度转换成原始分析物的绝对量。然后，可将通过LC-MS/MS检测的分析物的绝对量转换成原始试样中存在的Tg的绝对量。
利用标记的甲状腺球蛋白肽标准品的系统校准
甲状腺球蛋白的不完全消化可引起甲状腺球蛋白定量不准确。在一些实施方式中，可在消化之前将甲状腺球蛋白肽标准品添加至试样。在一些实施方式中，当消化时，甲状腺球蛋白肽标准品产生一种或多种与由甲状腺球蛋白产生的Tg肽相同的Tg肽。在一些方面，添加至样品的甲状腺球蛋白肽标准品的量是已知的。
当通过质谱法定量Tg肽的量时，可计算消化率。在一些方面，甲状腺球蛋白肽标准品被配置为包含Tg肽周围相同的消化位点，使得甲状腺球蛋白肽标准品的消化率与甲状腺球蛋白的消化率相同或相似。因此，甲状腺球蛋白消化率得到确定，其可用于校准或校正试样中甲状腺球蛋白的定量。
在一些实施方式中，甲状腺球蛋白肽标准品短于甲状腺球蛋白。一方面，甲状腺球蛋白肽标准品不长于约100个氨基酸残基，不长于约75个氨基酸残基，或不长于约70、60、50、40、30、25或20个氨基酸残基长。
在一些实施方式中，消化甲状腺球蛋白肽标准品以形成T129肽，或形成与T129具有至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的肽。
在一些实施方式中，甲状腺球蛋白肽标准品包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列(KVPESKVIFDANAPVAVRSKVPDS)。在一些实施方式中，甲状腺球蛋白肽标准品包括与SEQ ID NO：2(KVPESKVIFDANAPVAVRSKVPDS)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性但可在消化后形成T129肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，消化为胰蛋白酶消化。
在一些实施方式中，甲状腺球蛋白肽标准品的一个或多个残基用同位素标记，例如，使用13C、15N或二者。在一些实施方式中，标记的氨基酸残基是缬氨酸残基。在一些实施方式中，甲状腺球蛋白肽标准品包括KVPESKVIFDANAPV*AV*RSKVPDS，其在胰蛋白酶消化后产生K、VPESK、VIFDANAPV*AV*R(T-129-IS1)、SK和VPDS。
以下实施例用来说明本发明。这些实施例绝不旨在限制方法的范围。
实施例
实施例1：肽T129的MS定量的说明
从已知肽T129浓度的样品开始通过连续稀释制备几种具有各种已知浓度的肽T129的样品。肽T129的LOQ和校准曲线由这些样品的LC-MS/MS分析产生。
利用Phenomenex分析柱(Phenomenex Corp.Luna 5μC8(2)New Column 50x1.0mm)进行LC。将由超纯水(HPLC级)中0.2％的甲酸(流动相A)和100％甲醇中0.2％的甲酸(流动相B)组成的二元HPLC洗脱液施加至分析柱，以从样品中包含的其它物质中分离所选Tg肽。二元洗脱液根据以下梯度形式施加：第一步，施加80/20的流动相A/流动相B混合物120秒；第二步，施加30/70的流动相A/流动相B混合物60秒；第三步，混合物中流动相B的相对量在120秒的时间内渐变成5/95的流动相A/流动相B混合物；第四步，施加5/95的流动相A/流动相B混合物60秒；第五步和最后一步，施加80/20的流动相A/流动相B混合物240秒。
然后，对分离的样品进行MS/MS，用于定量一种或多种具有相当于肽T129的m/z的Tg肽。
使用Finnigan TSQ Quantum Ultra MS/MS系统(Thermo Electron Corporation)进行MS/MS。本文实施例中使用全部来自ThermoElectron的以下软件程序：Tune MasterV 1.2或更新版本、Xcalibur V 2.0SR1或更新版本、TSQ Quantum 1.4或更新版本、LCQuan V 2.0或更新版本和XReport 1.0或更新版本。离开分析HPLC柱的液体溶剂/分析物流动至Thermo Finnigan MS/MS分析器加热的雾化器界面。溶剂/分析物混合物在界面的加热管中转换成蒸汽。雾化溶剂中的分析物由界面的电晕放电针电离，放电针将电压施加至雾化溶剂/分析物混合物。
离子传递至第一四级(Q1)，第一四级选择具有636.4±0.5的m/z的离子。进入四极2(Q2)的离子与氩气碰撞以生成离子碎片，其被传递至四极3(Q3)用于进一步选择。表1中显示用于在对正极性验证的过程中定量具有相当于肽T129的m/z的前体离子的质量转变。
表1.具有相当于肽T129的m/z的前体离子的质量转变(正极性)
为了确定具有20％的精密度和80％至120％的准确度的定量限值(LOQ)，测定处于不同浓度的七种不同的样品并确定各自的再现性(CV)。具有相当于肽T129的m/z的一种或多种Tg肽的LOQ限定在约67amol/μl。
表2显示被收集和使用以生成图5和6中的LOQ和校准曲线的数据。
表2.被收集和使用以生成加标脱去血清样品中的肽T129的LOQ和校准曲线的数据
实施例2：定量肽T129加标处理的、浓缩的和消化脱去的血清中肽T129的说明
在商业可得的300kDa分子量的截止过滤器芯子(Pall Corp.Nanosep 300kDa,PallCorp.目录号OD300C33)的过滤器元件的顶部添加500μl脱去血清的样品(例如，该实施例中的试样)。
在13kg下离心芯子6分钟之后，试样被完全过滤。去除和弃去滤液。然后，将500μl的HPLC级水添加至过滤器的顶部，芯子再次在13kg下离心6分钟。然后去除和弃去滤液。接着，将200μl的20mM乙酸铵添加至过滤器的顶部。芯子再次在13kg下离心3分钟。然后，去除和弃去滤液，将100μl的20mM乙酸铵添加至过滤器的顶部。
随后，将15μg胰蛋白酶(Promega Trypsin Gold，质谱级，Promega Corp.目录号V5280或等同物)添加至残留在过滤器顶部上的试样。所得的混合物在37℃温育高达17小时而不从过滤器芯子中去除。
温育之后，过滤器芯子在13kg下离心6分钟，并保留滤液。随后，过滤器芯子通过将50μl的20mM乙酸铵添加至过滤器的顶部而被洗涤，并在13kg下离心6分钟。通过合并两种保留的消化后滤液，产生用于通过LC-MS/MS分析的试样。
进行以上处理和浓缩的脱去血清样品的初始体积为约500μl。每种合并的消化后滤液的最终体积为约130μl。因此，以上过程使样品浓缩了3.83倍。
随后，将肽T129以不同的浓度添加至合并的消化后滤液。然后，分析30μl样品，用于根据实施例1中所述的过程通过LC-MS/MS定量肽T129，除了利用表3中所示的质量转变。由于由被处理、浓缩的脱去血清产生增加的背景，因此未使用具有797.4±0.5的m/z的碎片离子。
表3.具有相当于来自肽T129加标脱去血清样品的肽T129的m/z的前体离子的质量转变(正极性)
前体离子(m/z) 碎片离子(m/z)
636.4±0.5 912.4±0.5和1059.5±0.5
表4显示被收集和使用以生成图7和8所示的LOQ和校准曲线的数据。
表4.被收集和使用以生成肽T129的LOQ和校准曲线的数据
实施例3：定量含有各种浓度添加的Tg的脱去血清中肽T129的说明
若干500μl含有各种浓度添加的Tg的脱去血清的样品根据实施例2中详述的过程制备。按照实施例1中详述的步骤实施所得试样的LC-MS/MS。
表5显示被收集和使用以生成图9中所示校准曲线的数据。
表5.被收集和使用以生成Tg加标脱去血清(如实施例3所述被处理和浓缩)中肽T129的MS/MS校准曲线的数据。
实施例4：确定Tg消化程度的过程
为了确定良好的Tg消化，将合成的“有翼的”肽添加至试样，该肽必须被消化以释放同位素标记的T-129内标。理想地，将使用可在制备过程(变性/还原、烷基化和消化)之前添加至血清样品的充分标记的Tg。然而，目前不可能获得这样的标记的Tg蛋白。因此合成其中含有同位素标记的T-129的短Tg肽(T129-IS1)。在处理过程中以与来自血清样品中存在的Tg的T129相同的方式生成T129-IS1。因此，其充当标记的Tg蛋白的替代并确定样品的完全处理。
图6示例该过程的示例实施方式。简单来说，制备序列KVPESKVIFDANAPV*AV*RSKVPDS的肽，其在所标示的位置处具有同位素标记的缬氨酸。缬氨酸残基被标记13C5和15N。将肽在胰蛋白酶消化之前添加至试样。在消化过程中产生以下片段：K、VPESK、VIFDANAPV*AV*R(T-129-IS1)、SK和VPDS。T-129-IS1的量以与T-129相同的方式定量并能够确定T-129消化程度。
实施例5：比较抗体阴性和抗体阳性的患者样品中Tg的定量
利用免疫测定和当前的质谱法定量患者样品中的Tg。如下表中所示，对于抗体阴性的样品，实验的结果良好相关，但当患者试样为抗体阳性时，其产生非常不同的结果。下表显示，在存在显著TgAb浓度情况下，通过免疫测定检测到的Tg的量低，而通过LC-MS/MS测定的Tg的量较高。
IA TgAb(IU/mL) IA Tg(ng/mL) LC-MS/MS Tg ng/mL 比率
56 4.6 3.3 0.7
65 0.2 <1 NA
65 0.2 <1 NA
137 0.2 <1 NA
218 0.2 <1 NA
1263 0.2 <1 NA
133 2.2 2.2 1
153 65.2 72.4 1.1
83 2.4 3.2 1.3
259 2.1 4.2 2
85 5.7 13.4 2.3
180 3.7 10 2.7
220 2.3 7.4 3.2
223 0.2 1.8 6
45 0.2 1.3 6.5
317 0.2 1.3 6.5
137 0.6 4.9 8.2
812 0.8 7.2 9
2565 0.2 1.9 9.4
81 0.2 2 10.2
1474 0.5 5.3 10.6
90 0.9 11.1 12.3
524 0.2 3.2 16
218 0.2 3.2 16
621 0.2 5.6 27.9
下表显示利用加标标准品测量的定量测定的回收率。
下表比较混合前和混合后实验之间的回收率。
实施例6：来自Tg抗体阳性患者的试样的Tg定量
在本实施例中，37岁患有DTC的女性经历甲状腺根除性切除和放射性碘切除。发现患者呈Tg Ab阳性。患者在自动ICMA平台上测试，结果为0.2ng/mL的Tg。输送样品用于RIA测试并产生15ng/mL的Tg，其为与ICMA测试相矛盾的结果。进行现有技术的LC-MS/MS测定。后者的测定破坏干扰抗体并返回5.6ng/mL的Tg的结果，表明患者需要随访且潜在地需要进一步手术。
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在本文中，已经宽泛地和一般性地描述了本发明。落入一般性公开内容内的更狭义的种类和次一般性分组也形成方法的一部分。这包括方法的一般性描述，其具有将任何主题从这些种类中去除的限制性条件或负面限制，无论本文是否具体地描述了删去的材料。
其它实施方式处于以下权利要求中。此外，当根据马库什群组描述方法的特征或特点时，本领域技术人员认识到本发明也由此根据马库什群组成员的任何单独成员或亚组来描述。

Claims (19)

1.确定试样中甲状腺球蛋白的量的方法，包括：
(a)消化所述试样中的甲状腺球蛋白和添加的同位素标记的甲状腺球蛋白肽标准品，以形成Tg肽和Tg肽标准产物；
(b)纯化来自步骤(a)的所述Tg肽和Tg肽标准产物；
(c)电离来自步骤(b)的所述Tg肽和Tg肽标准产物，以产生一种或多种可通过质谱法检测的Tg肽离子和Tg肽标准产物离子；
(d)通过质谱法检测来自步骤(c)的一种或多种离子的量；其中步骤(d)中检测的一种或多种离子的量与所述试样中甲状腺球蛋白的量和在步骤(a)中消化的甲状腺球蛋白肽标准品的量相关；和
(e)确定所述试样中甲状腺球蛋白的量，考虑步骤(d)中检测的Tg肽标准产物的离子的量。
2.权利要求1所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品长度小于50个氨基酸残基。
3.权利要求2所述的方法，其中Tg肽和Tg肽标准产物均包括T129肽(SEQID NO：1，VIFDANAPVAVR)。
4.权利要求3所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列(KVPESKVIFDANAPVAVRSKVPDS)。
5.权利要求3所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品包括与SEQ IDNO：2具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列，并可在步骤(a)的消化之后形成T129肽。
6.权利要求3所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品的一个或多个残基用13C、15N或二者进行同位素标记。
7.权利要求6所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品的一个或多个缬氨酸残基是同位素标记的。
8.权利要求1所述的方法，其中添加至所述试样的所述同位素标记的甲状腺球蛋白肽标准品的量是已知的。
9.权利要求1所述的方法，其中考虑在步骤(a)的消化效率而调整所述试样中甲状腺球蛋白的量，所述的消化效率由Tg肽标准品的量和添加至所述试样的所述同位素标记的甲状腺球蛋白肽标准品的量之间的比率来测量。
10.权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中产生的所述Tg肽离子包括选自具有541.3±0.5、612.3±0.5、636.4±0.5、726.4±0.5、797.4±0.5、912.4±0.5、或1059.5±0.5的质荷比的离子的一种或多种离子。
11.权利要求1所述的方法，其中所述电离包括生成具有636.4±0.5的质荷比的Tg肽前体离子，和生成一种或多种选自具有797.4±0.5、912.4±0.5和1059.5±0.5的质荷比的离子的碎片离子。
12.权利要求1所述的方法，其中所述试样为体液或组织。
13.确定试样中甲状腺球蛋白的量的方法，包括：
(a)消化所述试样中的甲状腺球蛋白，以形成肽T129，和消化在所述试样中添加的同位素标记的甲状腺球蛋白肽标准品，以形成同位素标记的肽T129内标；
(b)纯化来自步骤(a)的所述肽T129和肽T129内标；
(c)电离来自步骤(b)的所述肽T129和肽T129内标，以生成两种或更多种可通过串联质谱法检测的前体离子；其中所述前体离子对肽T129具有636.4±0.5的质荷比；
(d)在所述质谱仪器中碎裂所述前体离子，以生成一种或多种可通过质谱法检测的碎片离子，其中肽T129的所述碎片离子的一种或多种选自具有797.4±0.5、912.4±0.5或1059.5±0.5的质荷比的离子清单；和
(f)通过质谱法检测步骤(d)的所述前体离子、步骤(e)的所述碎片离子的一种或多种、或二者的量；
其中步骤(f)中检测的一种或多种离子的量与所述试样中所述甲状腺球蛋白的量相关。
14.权利要求13所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品包括SEQ IDNO：2的氨基酸序列。
15.权利要求13所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品包括与SEQ IDNO：2具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列，并可在步骤(a)的消化之后形成T129肽。
16.权利要求13所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品的一个或多个残基用13C、15N或二者进行同位素标记。
17.权利要求16所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品的一个或多个缬氨酸残基是同位素标记的。
18.权利要求13所述的方法，其中添加至所述试样的所述同位素标记的甲状腺球蛋白肽标准品的量是已知的。
19.权利要求13所述的方法，其中考虑在步骤(a)的消化效率而调整所述试样中甲状腺球蛋白的量，所述消化效率由Tg肽标准品的量和添加至所述试样的所述同位素标记的甲状腺球蛋白肽标准品的量之间的比率来测量。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111684273A (zh) * 2018-02-09 2020-09-18 浜松光子学株式会社 试样支撑体、电离法以及质量分析方法
CN112119310A (zh) * 2018-03-16 2020-12-22 奎斯特诊断投资有限公司 通过质谱检测嗜铬粒蛋白a的方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7745226B2 (en) 2005-04-06 2010-06-29 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting vitamin D metabolites
US7972868B2 (en) 2007-11-28 2011-07-05 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting dihydroxyvitamin D metabolites by mass spectrometry
US8030084B2 (en) 2007-12-06 2011-10-04 Quest Diagnostics Investments Incorporated Thyroglobulin quantitation by mass spectrometry
US7977117B2 (en) 2009-12-03 2011-07-12 Quest Diagnostics Investments Incorprated Vitamin D metabolite determination utilizing mass spectrometry following derivatization
WO2011072163A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometric determination of non-derivatized, non-metabolized vitamin d
WO2011072152A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry of steroidal compounds in multiplex samples
US9012394B2 (en) 2012-09-20 2015-04-21 Quest Diagnostics Investments, Inc. Thyroglobulin quantitation by mass spectroscopy
EP2939024B1 (en) 2012-12-26 2021-04-28 Quest Diagnostics Investments Incorporated C peptide detection by mass spectrometry
JP7007761B2 (ja) * 2017-09-18 2022-03-04 国立台湾大学 甲状腺癌の予後のためのバイオマーカー
WO2023164672A2 (en) * 2022-02-24 2023-08-31 Venn Biosciences Corporation Sample preparation for glycoproteomic analysis that includes diagnosis of disease

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090042213A1 (en) * 2007-06-13 2009-02-12 Washington, University Of Methods and compositions for detecting thyroglobulin in a biological sample
CN101782581A (zh) * 2002-10-03 2010-07-21 诺曼·利·安德森 用质谱法高灵敏度定量肽
US20120009614A1 (en) * 2007-12-06 2012-01-12 Quest Diagnostics Investments Incorporated Thyroglobulin quantitation by mass spectrometry

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
DE69432791T2 (de) 1993-05-28 2004-06-03 Baylor College Of Medicine, Houston Verfahren und massenspektrometer zur desorption und ionisierung von analyten
GB9717926D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Micromass Ltd Methods and apparatus for tandem mass spectrometry
JP2002502086A (ja) 1998-01-23 2002-01-22 アナリティカ オブ ブランフォード インコーポレーテッド 表面からの質量分光測定
WO2003046148A2 (en) 2001-11-29 2003-06-05 Thermo Finnigan Llc Polypeptide quantitation
US7632686B2 (en) 2002-10-03 2009-12-15 Anderson Forschung Group High sensitivity quantitation of peptides by mass spectrometry
US8227259B2 (en) 2005-03-31 2012-07-24 Georgetown University Free thyroxine and free triiodothyronine analysis by mass spectrometry
US20070105179A1 (en) 2005-11-09 2007-05-10 Dionex Corporation Methods of detecting N-and O-linked oligosaccharides in glycoproteins
US7855057B2 (en) 2006-03-23 2010-12-21 Millipore Corporation Protein splice variant/isoform discrimination and quantitative measurements thereof
JP2010502425A (ja) 2006-08-30 2010-01-28 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション 膜を評価するシステム及び方法並びに膜濾過装置
US9274124B2 (en) * 2010-03-15 2016-03-01 Anderson Forschung Group, Inc. Mass spectrometric assays for peptides
JPWO2012111249A1 (ja) * 2011-02-14 2014-07-03 学校法人麻布獣医学園 質量分析法における質量変化を検出する方法及び安定同位体標識タンパク質の絶対量の定量方法
US9140695B2 (en) * 2012-01-18 2015-09-22 University Of Utah Research Foundation Methods for analysis of free and autoantibody-bound biomarkers and associated compositions, devices, and systems
US9012394B2 (en) * 2012-09-20 2015-04-21 Quest Diagnostics Investments, Inc. Thyroglobulin quantitation by mass spectroscopy

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101782581A (zh) * 2002-10-03 2010-07-21 诺曼·利·安德森 用质谱法高灵敏度定量肽
US20090042213A1 (en) * 2007-06-13 2009-02-12 Washington, University Of Methods and compositions for detecting thyroglobulin in a biological sample
US20120009614A1 (en) * 2007-12-06 2012-01-12 Quest Diagnostics Investments Incorporated Thyroglobulin quantitation by mass spectrometry

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREW等人: "Quantification of Thyroglobulin a low-Abundance Serum Protein， by Immunoaffinity Peptide Enrichment and Tandem Mass Spectrometry", 《CLINICAL CHEMISTRY》 *
罗家伦等: "甲状腺球蛋白及抗甲状腺球蛋白抗体", 《中华临床医师杂志（电子版）》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111684273A (zh) * 2018-02-09 2020-09-18 浜松光子学株式会社 试样支撑体、电离法以及质量分析方法
CN111684273B (zh) * 2018-02-09 2023-09-05 浜松光子学株式会社 试样支撑体、电离法以及质量分析方法
CN112119310A (zh) * 2018-03-16 2020-12-22 奎斯特诊断投资有限公司 通过质谱检测嗜铬粒蛋白a的方法
CN112119310B (zh) * 2018-03-16 2024-04-09 奎斯特诊断投资有限公司 通过质谱检测嗜铬粒蛋白a的方法

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EP2898088A1 (en) 2015-07-29
US10718779B2 (en) 2020-07-21

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