CN109187827B

CN109187827B - 人体尿液中雌激素及其代谢产物在线检测方法

Info

Publication number: CN109187827B
Application number: CN201810920499.6A
Authority: CN
Inventors: 邬智刚; 朱文漓; 叶尚宇
Original assignee: Chengdu Yikangpu Technology Co ltd
Current assignee: Chengdu Yikangpu Technology Co ltd
Priority date: 2018-08-14
Filing date: 2018-08-14
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2038-08-14
Also published as: CN109187827A

Abstract

本发明提供了一种人体尿液中雌激素及其代谢产物的在线检测方法，涉及雌激素及其代谢产物检测技术领域。该检测方法将人体尿液与内标液混合，对其进行酶水解后，直接进行在线SPE柱纯化和在线目标产物的化学衍生。随后样本在线直接连接液相色谱‑质谱联用系统对样本中的雌激素及代谢产物进行同步的定性和定量分析。该方法适用于人体尿液中结构类似、化学物理性质接近的雌激素及其代谢产物的同步批量检测，样品处理完全在线进行，具有速度快、无污染、重复性好、自动化程度高等优点。相比一般的离线样本处理方法，效率大大提高的同时保证了检测结果的一致性，充分满足大规模临床检验的需要，具有较高的临床应用价值。

Description

人体尿液中雌激素及其代谢产物在线检测方法

技术领域

本发明涉及雌激素代谢产物检测技术领域，尤其是涉及一种人体尿液中雌激素代谢产物的检测方法。

背景技术

雌激素是脊椎动物中存在的一类重要的性激素，对机体的生长发育和系统的功能维持有着及其重要的作用。在生殖系统、内分泌系统、神经系统等方面发挥着关键性的角色。

雌激素是一类脂溶性的类固醇小分子化合物，有游离态和结合物这俩种形态。其中在机体内主要是以结合态存在，在血中70％与性激素结合球蛋白(SHBG)结合，25％与白蛋白结合，5％保持游离状态。其中，结合态的雌激素不具有生理活性，而游离态的雌激素可以自由透过靶细胞内并与相应的受体结合，调节细胞转录，诱导功能蛋白质的合成，发挥生物学效应。

胆固醇是所有类固醇激素的前体，而雌二醇β-Estradiol(E2)是体内最常见的内源性雌激素，可以与受体结合参与调控基因表达，促进人体的生长。雌酮Estrone(E1)是卵巢分泌合成雌二醇的前体物质，在酶的催化下可以转化为雌二醇。该反应为可逆反应，雌二醇也可被还原为雌酮。雌三醇Estriol(E3)是E1和E2的外周组织代谢物，活性较低，被认为是具有解毒功能的一种雌激素。

雌激素在体内主要经过儿茶酚代谢途径发生代谢反应，主要是雌酮或雌二醇发生氧化代谢(羟基化反应)与结合代谢(O-甲基化，葡萄糖醛酸化及磺化反应等)。在细胞色素酶P450的催化下，E1和E2的C-2，C-4和C-16位点发生羟基化反应，产生A环代谢物 2-OH E1，2-OH E2，4-OH E1，4-OH E2和D环代谢物16α-OH E1。其中，2-OH E1，2- OH E2，4-OH E1，4-OH E2可以在P450和过氧化酶的作用下再进一步形成氧化产物醌类物质。在此转变过程中产生一系列的活性氧自由基，引发脂质过氧化反应，通过不断的氧化代谢循环使其成为羟基化雌激素代谢的协同因子，再与DNA加合导致DNA的氧化损伤。醌类物质同时还可以与乳腺细胞中引起细胞转化和非正常细胞繁殖的致癌基因和抑癌基因的 DNA反应形成去嘌呤加合物等毒性代谢物，并且产生脱嘌呤核苷位点，从而引起体内碱基的丢失和致癌性DNA突变。4-OH E1在体内的半衰期相比2-OH E1更长，更容易被氧化成醌类物质，与DNA结合并增加DNA复制的错误机会，在乳腺癌患者中变化更明显，从而增加了乳腺癌的患病风险。因此，E1和E2的羟基化代谢物是致癌性的分子标志物。

雌激素甲基化反应被认为是对雌激素致癌效应的起到防御作用的主要途径。2-OHE1， 4-OH E1可以在儿茶酚-O-甲基转移酶、磺基转移酶等作用下脱离形成醌类物质的代谢途径，形成甲基化产物，迅速失活并形成可溶于水的代谢产物随尿液排出体外。儿茶酚-O-甲基转移酶介导的部分甲基化雌激素代谢物如2-MeO E2被认为具有解毒作用甚至具有抑癌作用，其与激素受体ER和ER的结合力均很低，因此雌激素活性也很弱。可以通过诱导细胞凋亡、抑制细胞转移和上皮细胞的血管生长和直接抑制肿瘤细胞的增值起到抑癌的作用。

许多研究表明，乳腺癌是一种与患者体内雌激素密切相关的肿瘤，与雌激素的水平及其代谢异常显著相关。一旦内分泌失衡、代谢紊乱就容易造成乳腺增生并导致乳腺癌的发生。在分子水平上，雌激素代谢途径基因的多态性与乳腺癌发生关系的流行病学也表明技术代谢物与乳腺癌发生发展的相关性。

综合分析认为，E1，E2, 2-OH E2，4-OH E1，4-OH E2，16α-OH E1为可能的致癌性分子标志物，2-OH E1为良性雌激素分子，雌激素甲基化产物如2-MeO E2为潜在的抑癌分子标志物。这些雌激素代谢产物在乳腺癌的发生、发展中发挥着重要的作用。通过对雌激素代谢产物的定性定量分析，可以获得全面完整的代谢物变化信息，有助于了解乳腺癌的发病机制及代谢途径的变化，为乳腺癌的早期诊断及筛查、预防和风险评估提供重要的依据。

发明人在之前的研究中开发一种尿液中雌激素代谢产物的检测方法。为了提高检测效率，目前对该方法进行进一步的优化，开发了自动化程度更高，检测速度更快的在线样本处理平台。与离线样本处理相比，该方法检测结果一致，重复性、灵敏度也基本一致。新的在线样本处理平台自动化程度高，检测批量大，检测效率大大提高。能高效的对雌激素代谢产物进行精确的定量检测，具有更好的商业检测应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种在线样本处理平台联用液相色谱串联质谱技术检测人体尿液中雌激素代谢产物的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

1、将人体尿液与内标液混合，随后对混合液进行酶水解后，通过在线SPE柱纯化和在线目标产物的化学衍生得到待测样本；

2、将上述待测样本在线直接连接液相色谱质谱分析系统进行检测，得到雌激素以及各种雌激素代谢物的种类和含量。

进一步的，上述步骤1中酶水解的时间为3-12小时、水解温度为37-50℃、水解液与样本的用量体积比为1-3:1。

3、进一步的，上述步骤1中在线样本处理平台包含3个泵、两个6通道双向阀，该平台包含在线SPE柱纯化和目标化合物衍生。

4、更进一步的，所述步骤1中在线样本处理平台第一步为样本上SPE柱通过泵1 进行清洗、纯化，液相分析柱同步通过泵3进行液相平衡。

5、更进一步的，所述步骤1中在线样本处理平台第二步为纯化后的目标化合物在SPE柱上进行在线化学衍生，所用的试剂为丹酰氯或邻苯二甲醛、苯甲酰氯、荧光胺、对酞内酰胺苯璜酰氯等衍生试剂中的一种。衍生试剂的碳酸盐缓冲液通过泵2对SPE柱上的目标化合物进行在线衍生。所述的在线化学衍生时间为4-10分钟，柱温度为50-70℃。

6、更进一步的，所述步骤1中在线样本处理平台第三步为衍生后的目标化合物从SPE柱上通过泵3洗脱，在线直接进入液质联用系统进行定性定量分析。

7、进一步的，上述步骤2中具体包括以下步骤：

步骤A：称取雌激素标准品，用甲醇溶解，得到不同浓度的标准液；

步骤B:量取上述甲醇定容后的内标液，将其分别加入步骤A得到的标准液中，用超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；

步骤C：将步骤B得到的待测标准液和步骤1得到的待测样本通过液质联用检测，得到雌激素代谢产物的种类及含量。

进一步的，所述雌激素及其代谢产物包括Estrone(E1),Estradiol(E2),Estriol(E3),16α- Hydroxyestrone(16α-OHE1),4-Hydroxyestrone(4-OHE1),2-Hydroxyestradiol(2-OHE2),4- Hydroxyestradiol(4-OHE2),16-Ketoestradiol(16-ketoE2),2-Hydroxyestrone(2-OHE1),2- Methoxyestradiol(2-MeOE2),4-Methoxyestradiol(4-MeOE2),2-Methoxyestrone(2-MeOE1),4- Methoxyestrone(4-MeOE1),2-Hydroxyestrone-3-methylether(3-MeOE1)。

采用在线样本处理平台处理人体尿液中的上述雌激素及雌激素代谢产物，利用高效液相色谱将14种雌激素及代谢产物分离，再利用质谱内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述雌激素及其代谢产物的含量。

进一步的，上述步骤C液质联用检测的液相色谱条件为：

色谱柱为键合相色谱柱，进样量为5-20μL，流动相包括A和B，其中A为水溶液，B为混合溶液，流动相的流速为0.1-0.4mL/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：

0-3min,A:30-100％,B:70-0％；

3.1-5min,A:10-60％,B:90-40％；

5.1-7min,A:0-50％,B:100-50％；

7.1-9min,A:50-100％,B:50-0％；

9.1min,A:30-100％,B:70-0％。

更进一步的，上述键合相色谱柱为C18或C8等键合相色谱柱，规格为(50-150mm)×(1-4.6mm),粒径为1.7-5μm。

更进一步的，液相色谱条件中，流动相A为5-10mmol/L的乙酸铵水溶液+0.1％甲酸，流动相B为乙腈甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇的质量比为9-1:1-9。

进一步的，上述液质联用检测的质谱条件为：ESI离子源，正离子MRM扫描，雾化气流速为5-10L/min，气帘气流速为5-20L/min，离子源电压为2000-4500V，离子源温度为200-400℃。

进一步的，在电喷雾正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，目标物的离子对监测如下：E1(m/z 504.2—171.1)；E2(m/z 506.2—171.1)；16α-OHE1(m/z520.2— 171.1)；E3(m/z 522.0—171.1)；16-ketoE2(m/z 520.2-171.1)；2-MeOE1(m/z534.2—171.1)；3- MeOE1(m/z 534.2—171.1)；4-MeOE1(m/z 534.2—171.1)；2-MeOE2(m/z 536.2—171.1)；4- MeOE2(m/z 536.2—171.1)；2-OHE1(m/z 753.3—170.1)；4-OHE1(m/z 753.3—170.1)；2- OHE2(m/z 755.3—170.1)；4-OHE2(m/z 755.3—170.1)；TanshinoneIIA(m/z 295.2—277.2)。

与已有技术相比，本发明的优势在于：

1、本发明提供的人体尿液中雌激素及其代谢产物的在线检测方法通过在线样本处理平台，将尿液样本的纯化、化学衍生同步自动化完成。大大的提高了检测效率，与离线样本处理方法相比，样本处理时间减少约2小时，在线直接连接液质联用系统检测与离线处理的样本结果一致，重复性、灵敏度也基本一致。从而可以更高效的进行大样本量的人体尿液中雌激素及其代谢产物的定性定量检测；

2、本发明提供的在线样本处理平台自动化程度高，操作简单，减少了人工的操作误差，避免了操作不当造成的交叉污染，便于在不同的检验实验室推广，保证了各个实验室结果的一致性和可靠性。

附图说明

图1：在线样本处理及分析平台示意图。

图2：同一样本离线处理与在线处理检测结果对比图。

图3：同一样本重复在线处理结果对比图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，但不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例都属于本发明保护的范围。

实施例1：

1.材料

方法学研究实验的样本来自于四川省华西医院内分泌科2018年6月至7月部分就诊患者的尿液样本。

仪器：岛津三重四级杆液相色谱质谱联用仪(Shimadzu公司)；双向溶剂进样泵140B液相色谱系统(Applied Biosystem公司)；十万分之一天平；色谱柱(C18)；氮吹仪；高速台式冷冻离心机；冻干机；固相萃取柱；可调移液器；玻璃仪器、烧杯、量筒等。

试剂耗材：色谱纯甲醇；乙腈；甲酸；乙酸铵；抗坏血酸；乙酸钠；水解酶Glucuronidase/Sulfatase；碳酸氢钠；氢氧化钠；丙酮；丹酰氯；冰醋酸；氢氧化钠；活性炭；磷酸。

标准品：Estrone(E1),Estradiol(E2),Estriol(E3),16α-Hydroxyestrone(16α-OHE1),4- Hydroxyestrone(4-OHE1),2-Hydroxyestradiol(2-OHE2),4-Hydroxyestradiol(4-OHE2),16- Ketoestradiol(16-ketoE2),2-Hydroxyestrone(2-OHE1),2-Methoxyestradiol(2-MeOE2),4- Methoxyestradiol(4-MeOE2),2-Methoxyestrone(2-MeOE1),4-Methoxyestrone(4-MeOE1),2- Hydroxyestrone-3-methylether(3-MeOE1)购于Sigma-Aldrich；内标Tanshinone IIA购于中检院。

2.方法

在线样本处理平台：

500μL尿液中加入500μL水解液，37℃水解12小时。水解完成的样本取50μL通过进样泵1加入SPE柱，同时通过泵1进行清洗步骤。完成清洗后，接着通过泵2对在SPE柱上纯化后的目标化合物进行在线化学衍生，所用的试剂为丹酰氯碳酸盐缓冲液。在线化学衍生时间为4分钟，柱温度设为50℃。衍生后的目标化合物通过泵3从SPE柱上洗脱，在线直接进入液质联用系统进行雌激素及其代谢产物的定性定量分析。水解完成的样本再分别取 50μL重复两次在线处理及在线定性定量分析。

离线样品处理：

500μL尿液中加入500μL水解液，37℃水解12小时后，加入500μL乙酸乙酯萃取，取清液加入活化后的SPE小柱中，甲醇洗脱2次，每次1mL，共计2mL洗脱液，加热60℃的条件下用氮吹仪挥发干，加入100uLNaHCO₃和100μL丹酰氯溶液，在60℃下衍生10min， 0.22μm滤膜过滤后进样10μL进入液质联用系统分析检测。

色谱条件：流动相A：0.1％v/v甲酸+0.2M乙酸铵水溶液；流动相B：0.1％v/ v甲酸甲醇溶液。C18色谱柱，采用梯度洗脱方式。流速为0.3mL/min，柱温为45℃ ，进样量为10μL。

质谱条件：电喷雾电离正离子检测模式，采用多反应监测的扫描模式。喷雾电压为4kV；碰撞气为；离子源雾化气为；加热辅助气为；去溶剂温度为。。监测的目标物如下： E1(m/z 504.2—171.1)；E2(m/z 506.2—171.1)；16α-OHE1(m/z 520.2—171.1)；E3(m/z522.0— 171.1)；16-ketoE2(m/z 520.2-171.1)；2-MeOE1(m/z 534.2—171.1)；3-MeOE1(m/z 534.2—171.1)； 4-MeOE1(m/z 534.2—171.1)；2-MeOE2(m/z 536.2—171.1)；4-MeOE2(m/z 536.2—171.1)；2- OHE1(m/z 753.3—170.1)；4-OHE1(m/z 753.3—170.1)；2-OHE2(m/z 755.3—170.1)；4-OHE2(m/z 755.3—170.1)；Tanshinone IIA(m/z 295.2—277.2)。分别对各个目标的去簇电压，碰撞电压等条件进行系统优化，以达到最佳的稳定性和灵敏度。

标准品配制：分别准确称取标准品各1mg，分别置于10mL的容量瓶中，加入含0.1％抗坏血酸的甲醇溶液，配制成浓度分别为100μg/mL的标准品母液；分别从以上标准品母液中移取用溶液定容，得到浓度为1μg/mL，接着分别取固定体积标准品母液加入到统一离心管中，再加入去离子水定容到，配制成混合标准液。然后用甲醇将浓度由逐级稀释。

称取内标品，加入完全溶解得到浓度为1mg/mL的内标溶液。然后用甲醇将内标溶液的浓度稀释至50ng/mL，配制得到内标工作溶液。

同一样本离线处理与在线处理检测结果对比图见图2。

校准曲线：采用内标定量法，利用软件以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算尿液中待测物的浓度。各个目标产物在各自的浓度范围内的线性拟合方程线性良好，拟合系数大于0.99，满足定量的要求。

实施例2：

1.材料

2.方法

在线样本处理平台：

质谱条件：电喷雾电离正离子检测模式，采用多反应监测的扫描模式。喷雾电压为4kV；碰撞气为；离子源雾化气为；加热辅助气为；去溶剂温度为。监测的目标物如下： E1(m/z 504.2—171.1)；E2(m/z 506.2—171.1)；16α-OHE1(m/z 520.2—171.1)；E3(m/z522.0— 171.1)；16-ketoE2(m/z 520.2-171.1)；2-MeOE1(m/z 534.2—171.1)；3-MeOE1(m/z 534.2—171.1)； 4-MeOE1(m/z 534.2—171.1)；2-MeOE2(m/z 536.2—171.1)；4-MeOE2(m/z 536.2—171.1)；2- OHE1(m/z 753.3—170.1)；4-OHE1(m/z 753.3—170.1)；2-OHE2(m/z 755.3—170.1)；4-OHE2(m/z 755.3—170.1)；Tanshinone IIA(m/z 295.2—277.2)。分别对各个目标的去簇电压，碰撞电压等条件进行系统优化，以达到最佳的稳定性和灵敏度。

同一样本重复处理结果对比TIC图见说明书附图3。

对同一标本在线3次处理后分析的结果如下表所示。

三次重复在线处理，所有雌激素及其代谢产物的检测结果一致。3次重复试验的RSD值在 2.3％-10.8％。证明该在线样本处理及分析平台稳定，可以用于批量检测。

三次在线处理的样本比较发现测定的14种雌激素及其代谢产物的浓度测定结果基本一致。与离线处理的样本比较发现测定的14种雌激素及其代谢产物的浓度与在线处理平台的结果基本一致。证明该在线样本处理及分析平台在大大缩减了样本处理时间的条件下，保持了检测结果的准确性，适用于批量检测。与离线样本处理相比，该方法检测结果一致，重复性、灵敏度也基本一致。新的在线样本处理平台自动化程度高，检测批量大，检测效率大大提高。同时可以减少人工的操作误差，避免了操作不当造成的交叉污染，便于在不同的检验实验室推广，保证了各个实验室结果的一致性和可靠性。

Claims

1.一种人体尿液中雌激素及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

1)将人体尿液与内标液混合后，对其进行酶水解后直接进行在线SPE柱纯化和在线目标产物的化学衍生得到待测样本，所用的衍生试剂为丹酰氯；

2)上述待测样本通过在线系统洗脱后直接上样到液相色谱柱上，通过液质联用系统同步对雌激素及其代谢产物进行定性和定量的批量检测；

步骤2)中液质联用检测的液相色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，规格为150mm×4.6mm,粒径为1.7μm，流动相A为0.1％v/v甲酸+0.2M乙酸铵水溶液，流动相B为0.1％v/ v甲酸甲醇溶液；

流动相的流速为0.1-0.4mL/min；流动相的梯度，以体积百分比计：

0-3min,A:30-100％,B:70-0％，

3.1-5min,A:10-60％,B:90-40％，

5.1-7min,A:0-50％,B:100-50％，

7.1-9min,A:50-100％,B:50-0％，

9.1min,A:30-100％,B:70-0％；

所述雌激素及其代谢产物为Estrone、Estradiol、Estriol、16α- Hydroxyestrone、4-Hydroxyestrone、2-Hydroxyestradiol、4-Hydroxyestradiol、16-Ketoestradiol、2-Hydroxyestrone、2- Methoxyestradiol、4-Methoxyestradiol、2-Methoxyestrone、4-Methoxyestrone和2-Hydroxyestrone-3-methylether。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤1)和2）中尿液中雌激素及其代谢产物的纯化、化学衍生和洗脱通过包含3个泵、两个6通道双向阀的在线样本处理平台完成，通过该平台实现在线SPE柱纯化和目标化合物衍生。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，第一步为水解后的样本通过泵1上样到SPE柱，并通过泵1进行清洗、纯化，液相分析柱同步通过泵3进行液相平衡；

第二步为纯化后的目标化合物在SPE柱上进行在线化学衍生，衍生试剂的碳酸盐缓冲液通过泵2对SPE柱上的目标化合物进行在线衍生，所述的在线化学衍生时间为4-10分钟，柱温度为50-70℃；

第三步为衍生后的目标化合物从SPE柱上通过泵3洗脱，在线直接进入液质联用系统进行定性定量分析。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，泵1的清洗SPE柱的流动相为纯水。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，泵2的衍生流动相为0.15-0.5mg/mL的丹酰氯碳酸盐缓冲液。

6.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中液质联用检测的质谱条件为：采用电喷雾ESI离子源，正离子MRM扫描方式，雾化气流速为5-10L/min，气帘气流速为5-20L/min，离子源电压为2000-4500V，离子源温度为200-400℃。

7.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，采用多反应监测的质谱扫描模式，目标物的离子对监测如下：Estrone m/z 504.2—171.1；Estradiol m/z 506.2—171.1；16α-Hydroxyestrone m/z 520.2—171.1；Estriol m/z 522.0—171.1；16-Ketoestradiol m/z 520.2-171.1；2-Methoxyestrone m/z 534.2—171.1；2-Hydroxyestrone-3-methylether m/z 534.2—171.1；4-Methoxyestrone m/z 534.2—171.1；2-Methoxyestradiol m/z 536.2—171.1；4- Methoxyestradiol m/z 536.2—171.1；2-Hydroxyestrone m/z 753.3—170.1；4-Hydroxyestrone m/z 753.3—170.1-；2-Hydroxyestradiol m/z 755.3—170.1；4-Hydroxyestradiol m/z 755.3—170.1；Tanshinone IIA m/z 295.2—277.2。