BR112016026459B1

BR112016026459B1 - Métodos para determinar a quantidade de norendoxifeno e para determinar a quantidade de tamoxifeno e metabólitos do mesmo em uma amostra humana por espectrometria de massas

Info

Publication number: BR112016026459B1
Application number: BR112016026459-2A
Authority: BR
Inventors: Nigel Clarke
Original assignee: Quest Diagnostics Investments Incorporated
Priority date: 2014-05-12
Filing date: 2015-05-12
Publication date: 2022-09-27
Also published as: CA2948823A1; EP4220178A2; US20150323513A1; BR112016026459A2; US11428682B2; AU2018275011A1; US11835505B2; US10830746B2; JP6279104B2; JP2017516104A; US20170023537A1; US20190212317A1; CN106537139B; JP2023109874A; JP6821610B2; AU2023204389A1; EP3143392B1; SA516380291B1; US9835606B2; AU2020239700A1

Abstract

QUANTIFICAÇÃO DE TAMOXIFENO E METABÓLITOS DO MESMO POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS. A invenção refere-se a métodos para determinar a quantidade de tamoxifeno e seus metabólitos em uma amostra por espectrometria de massas. Em alguns aspectos, os métodos oferecidos nesta invenção compreendem determinar a quantidade de norendoxifeno. Em alguns aspectos, os métodos oferecidos nesta invenção compreendem determinar a quantidade de norendoxifeno e tamoxifeno. Em alguns aspectos, os métodos oferecidos nesta invenção compreendem determinar a quantidade de norendoxifeno e outros metabólitos de tamoxifeno. Em alguns aspectos, os métodos oferecidos nesta invenção compreendem determinar a quantidade de tamoxifeno, norendoxifeno, e outros metabólitos de tamoxifeno.

Description

Referência Cruzada a Pedidos de Patente Relacionados

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisórios US N° 61/992.214, depositado em 12 de maio de 2014, cuja íntegra está aqui incorporada a título de referência.

Antecedentes da Invenção

[002] A descrição que se segue dos antecedentes da invenção é oferecido simplesmente como auxílio no entendimento da invenção e não é se considera aqui que ela descreve ou constitui técnica anterior à invenção.

[003] Tamoxifeno é um padrão de tratamento para pacientes com câncer de mama positivos para receptores hormonais depois do tratamento primário. Cinco a dez de terapia com tamoxifeno reduz o risco de recorrência e morte nesses pacientes. Ainda assim, muitos pacientes não completam o ciclo total da terapia, frequentemente devido aos efeitos colaterais desagradáveis do fármaco.

[004] Tamoxifeno é um profármaco que é convertido no endoxifeno muito mais ativo para plena eficácia. A conversão do tamoxifeno em endoxifeno se dá através de uma via metabólica dependente da variação genética, tal como em CYP2D6 (2D6). Embora a genotipagem 2D6 tenha sido desenvolvida para predizer a resposta ao tamoxifeno e a toxicidade, a associação direta em um nível individual é controversa.

[005] É necessário um método eficaz para predizer a reposta ao tamoxifeno.

Sumário da Invenção

[006] A presente invenção oferece métodos para quantificação de tamoxifeno e seus metabólitos em uma amostra por espectrometria de massas, incluindo espectrometria de massas em tandem.

[007] Em um aspecto, são oferecidos métodos para determinar a quantidade de norendoxifeno em uma amostra por espectrometria de massas, compreendendo (a) ionizar o referido norendoxifeno para produzir um ou mais íons de norendoxifeno detectáveis por espectrometria de massas; (b) detectar a quantidade de íons de norendoxifeno da etapa por espectrometria de massas; onde a quantidade de íons detectada está relacionada com a quantidade de norendoxifeno na referida amostra.

[008] Em um aspecto, são oferecidos métodos para determinar a quantidade de tamoxifeno e metabólitos do mesmo em uma amostra em um único ensaio de espectrometria de massas, compreendendo (a) ionizar o referido tamoxifeno e metabólitos para produzir um ou mais íons detectáveis por espectrometria de massas; (b) detectar a quantidade de íons da etapa por espectrometria de massas; onde a quantidade de íons detectada está relacionada com a quantidade de cada um dos tamoxifeno e metabólitos na referida amostra.

[009] Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem norendoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem endoxifeno ou N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem 4’-hidróxi tamoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem 4-hidróxi tamoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem N-desmetil-4’- hidróxi tamoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem N-desmetil tamoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem metabólitos selecionados do grupo que consiste em norendoxifeno, endoxifeno, 4’- hidróxi tamoxifeno, 4-hidróxi tamoxifeno, N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno, e N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem qualquer combinação de norendoxifeno, endoxifeno, 4’-hidróxi tamoxifeno, 4- hidróxi tamoxifeno, N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno, e N-desmetil tamoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem norendoxifeno, endoxifeno, 4’-hidróxi tamoxifeno, 4- hidróxi tamoxifeno, N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno, e N-desmetil-4’- hidróxi tamoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem qualquer combinação de norendoxifeno, endoxifeno, 4’- hidróxi tamoxifeno, 4-hidróxi tamoxifeno, N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno, e N-desmetil tamoxifeno.

[0010] Em um aspecto, os métodos oferecidos nesta invenção compreendem precipitação de proteínas. Em algumas modalidades, os métodos oferecidos nesta invenção compreendem purificação. Em algumas modalidades, a referida purificação compreende filtração. Em algumas modalidades, a referida purificação compreende cromatografia líquida. Em algumas modalidades, a referida cromatografia líquida é cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).

[0011] Em algumas modalidades, os métodos oferecidos nesta invenção compreendem detectar a quantidade de um padrão interno. Em algumas modalidades, o referido padrão interno é um norendoxifeno deuterado.

[0012] Em algumas modalidades, a ionização é por ionização química à pressão atmosférica (APCI). Em algumas modalidades, a referida ionização é em modo de íons positivos.

[0013] Em algumas modalidades, ionização é por electrospray (ESI). Em algumas modalidades, a referida ionização é em modo de íons positivos.

[0014] Em algumas modalidades, a referida amostra é uma amostra de soro.

[0015] Em algumas modalidades, a espectrometria de massas é espectrometria de massas em tandem.

[0016] Em um aspecto, oferecido nesta invenção encontra-se um método para predizer a resposta ao tamoxifeno em um paciente determinando-se a quantidade de tamoxifeno ou um ou mais metabólitos de tamoxifeno. Em algumas modalidades, uma grande quantidade de um ou mais tamoxifeno ou metabólitos de tamoxifeno indica uma resposta positiva ao tamoxifeno em um paciente. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem norendoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem endoxifeno ou N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem 4’- hidróxi tamoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem 4-hidróxi tamoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem N- desmetil tamoxifeno. Em algumas modalidades, os referidos metabólitos compreendem norendoxifeno, endoxifeno, 4’-hidróxi tamoxifeno, 4-hidróxi tamoxifeno, N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno, e N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno.

[0017] Em algumas modalidades, o método oferecido nesta invenção tem a sensibilidade medida pelo limite de quantificação (LOQ). Em algumas modalidades, o método de quantificação de tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL.

[0018] Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL.

[0019] Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,2 ng/mL.

[0020] Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,2 ng/mL.

[0021] Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4- hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4- hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,4 ng/mL.

[0022] Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil- 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,4 ng/mL.

[0023] Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,5 ng/mL.

[0024] Em algumas modalidades, o método oferecido nesta invenção tem a sensibilidade medida pelo limite de detecção (LOD). Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,6 ng/mL.

[0025] Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,6 ng/mL.

[0026] Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,1 ng/mL.

[0027] Em algumas modalidades, o método de detecção de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,1 ng/mL.

[0028] Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 0,4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 0,2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 0,15 ng/mL.

[0029] Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,4 ng/mL.

[0030] Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,5 ng/mL.

[0031] Conforme usado neste relatório, o termo "purificação" ou "purificar" não se refere a remover todos os materiais da amostra além dos analitos de interesse. Ao contrário purificação refere-se a um procedimento que enrique a quantidade de um ou mais analitos de interesse em relação a um ou mais outros componentes da amostra. Purificação, conforme usado neste relatório, não requer o isolamento de um analito de todos os outros. Em modalidades preferidas, uma etapa ou procedimento de purificação pode ser usado para remover uma ou mais substâncias interferentes, por exemplo, uma ou mais substâncias que interfeririam na operação dos instrumentos usados nos métodos ou substâncias que poderiam interferir na detecção de íons de um analatito por espectrometria de massas.

[0032] Conforme usado neste relatório, o termo "cerca de" em relação a medições quantitativas, sem incluir a medição da massa de um íon, refere-se ao valor indicado mais ou menos 10%.

[0033] Conforme usado neste relatório, o termo "substancialmente todos" refere-se a qualquer proporção maior que 50%, mais preferivelmente maior que 60%, mais preferivelmente maior que 70%, mais preferivelmente maior que 80%, e mais preferivelmente maior que 90%.

[0034] Conforme usado neste relatório, o termo "amostra" refere- se a qualquer amostra que possa conter o analito de interesse. Conforme usado neste relatório, o termo "fluido ou tecido corporal" significa qualquer fluido ou tecido que pode ser isolado do corpo de um indivíduo. Por exemplo, "fluido ou tecido corporal" pode incluir sangue, plasma, soro, bile, saliva, urina, lágrima, perspiração, entre outros. Se um tecido sólido tiver que ser analisado, ele deve ser processado para liberar uma fração líquida que poderia conter qualquer analito presente no tecido. A fração líquida pode ser então submetida aos métodos descritos neste relatório.

[0035] Conforme usado neste relatório, o termo "técnica se separação por tamanho" significa qualquer técnica (física ou química) que permite a separação de pelo menos uma espécie de uma amostra de teste com base em qualquer um ou mais dentre o peso molecular e o formato. Exemplos de tais técnicas incluem, porém sem limitação, filtração, cromatografia, e certos aspectos de espectrometria de massas.

[0036] Conforme usado neste relatório, o termo "cromatografia" refere-se a um processo no qual uma mistura química transportada por um líquido ou gás é separada em componentes como resultado da distribuição diferencial das entidades químicas enquanto elas circulam em volta, sobre, e/ou através de uma fase líquida ou sólida estacionária.

[0037] Conforme usado neste relatório, o termo "cromatografia líquida" ou "LC" significa um processo de retardamento seletivo de um ou mais componentes de uma solução fluida à medida em que o fluido percola uniformemente através de uma coluna de uma substância finamente dividida, ou através de passagens capilares. O retardamento resulta da distribuição dos componentes da mistura entre uma ou mais fases estacionários e o fluido em massa (i.e., a fase móvel), à medida em que este líquido se desloca em relação às fases estacionárias. "Cromatografia líquida" inclui cromatografia líquida (RPLC) em fase reversa, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e cromatografia líquida de alta turbulência (HTLC).

[0038] Conforme usado neste relatório, o termo "cromatografia líquida de alta eficiência" ou "HPLC" refere-se à cromatografia líquida na qual o grau de separação é aumentado forçando-se a fase móvel sob pressão através de uma fase estacionária, tipicamente uma coluna densamente empacotada.

[0039] Conforme usado neste relatório, o termo "espectrometria de massas" ou "MS" refere-se a uma técnica analítica para identifica compostos por sua massa. MS refere-se a métodos de filtração, detecção, e medição de íons com base sua massa m/z. A tecnologia MS geralmente inclui (1) ionizar os compostos para fazer espécies carregadas (por exemplo, íons); e (2) detectar o peso molecular dos íons e calcular sua m/z. Os compostos podem ser ionizados e detectados por qualquer meio adequado. Um "espectrômetro de massa" geralmente inclui um ionizador e um detector de íons. Em geral, uma ou mais moléculas de interesse são ionizadas, e os íons são subsequentemente introduzidos em um instrumento espectrográfico de massas onde, devido a uma combinação de campos magnéticos e elétricos, os íons seguem um percurso no espaço que é dependente da massa ("m") e da carga ("z"). vide, por exemplo, as Patentes US Nos 6,204,500, intitulada "Mass Spectrometry From Surfaces;" 6,107,623, intitulada "Methods and Apparatus for Mass Spectrometry in tandem;" 6,268,144, intitulada "DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry;" 6,124,137, intitulada "Surface- Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes"; Wright et al., Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2:264-76 (1999); e Merchant e Weinberger, Electrophoresis 21:1164-67 (2000).

[0040] Conforme usado neste relatório, o termo "operando em modo de íons positivos" refere-se àqueles métodos de espectrometria de massas onde íons positivos são detectados. Similarmente, o termo "operando em modo de íons negativos" refere-se àqueles métodos de espectrometria de massas onde íons negativos são detectados.

[0041] Conforme usado neste relatório, o termo "ionização" ou "ionizar" refere-se ao processo para gerar um íons de analito tendo uma carga elétrica líquida igual a uma ou mais unidades de elétrons. Íons positivos são aqueles tendo uma carga positiva líquida de uma ou mais unidades de elétrons. Íons negativos são aqueles tendo uma carga negativa líquida uma ou mais unidades de elétrons.

[0042] Conforme usado neste relatório, o termo "ionização eletrônica" ou "EI" refere-se a métodos nos quais um analito de interesse em uma fase gasosa ou vapor interage com um fluxo de elétrons. O impacto dos elétrons com o analito produz íons de analito, que podem então ser submetidos a uma técnica de espectrometria de massas.

[0043] Conforme usado neste relatório, o termo "ionização química" ou "CI" refere-se a métodos nos quais um gás reagente (por exemplo, amônia) é submetido a impacto eletrônico, e íons de analito são formados pela interação de íons do gás reagente e das moléculas de analito.

[0044] Conforme usado neste relatório, o termo "bombardeamento atômico rápido" ou "FAB" refere-se a métodos nos quais um feixe de átomos de alta energia (geralmente Xe ou Ar) impacta uma amostra não volátil, dessorvendo e ionizando as moléculas contidas na amostra. As amostras de teste são dissolvidas em uma matriz líquida viscosa tal como glicerol, tioglicerol, m-nitrobenzil álcool, 18-crown-6 crown éter, 2-nitrofeniloctil éter, sulfolano, dietanolamina, e trietanolamina. A escolha de uma matriz apropriada para um composto ou amostra é um processo empírico.

[0045] Conforme usado neste relatório, o termo "ionização e dessorção a laser assistida por matriz" ou "MALDI" refere-se a métodos nos quais uma amostra não volátil é exposta à radiação laser, que dessorve e ioniza analitos na amostra por várias vias de ionização, incluindo fotoionização, protonação, desprotonação, e decaimento em aglomerado ("cluster decay"). Para MALDI, a amostra é misturada com uma matriz absorvente de energia, que facilita a dessorção das moléculas de analito.

[0046] Conforme usado neste relatório, o termo "ionização e dessorção a laser de superfície melhorada" ou "SELDI" refere-se a um outro método no qual uma amostra não volátil é exposta à radiação laser, que dessorve e ioniza analitos na amostra por várias vias de ionização, incluindo fotoionização, protonação, desprotonação, e decaimento em aglomerado. Para SELDI, a amostra é tipicamente ligada a uma superfície que preferencialmente retém um ou mais analitos de interesse. Como na MALDI, este processo também pode empregar um material absorvente de energia para facilitar a ionização.

[0047] Conforme usado neste relatório, o termo "ionização por electrospray" ou "ESI", refere-se a métodos nos quais uma solução é passada por um comprimento curto de um tubo capilar, em cuma extremidade é aplicado um potencial elétrico positivo ou negativo alto. Ao atingir a extremidade do tubo a solução é vaporizada (nebulizada) na forma de um jato ou spray de gotas muito pequenas de solução em vapor de solvente. Esta névoa de gotas atravessa uma câmara de evaporação, que é levemente aquecida para prevenir a condensação e evaporar o solvente. À medida que as gotas ficam menores, a densidade de carga elétrica superficial aumenta até o momento em que a repulsão natural entre cargas iguais provoca a liberação de íons assim como de moléculas neutras.

[0048] Conforme usado neste relatório, o termo "ionização química à pressão atmosférica" ou "APCI", refere-se a métodos de espectroscopia de massas que são similares ao ESI; no entanto, a APCI produz íons por reações de íons-moléculas que ocorrem em um plasma à pressão atmosférica. O plasma é mantido por uma descarga elétrica entre o capilar de spray e o eletrodo de um contador. Então, os íons são tipicamente extraídos no analisador de massas por meio do uso de um conjunto de estágios de destilação com bombeamento diferencial. Um contrafluxo de gás N2 seco e pré-aquecido pode ser usado para melhorar a remoção do solvente. A ionização em fase gasosa na APCI pode ser mais eficaz que a ESI para analisar espécies menos polares.

[0049] O termo "fotoionização à pressão atmosférica" ou "APPI", conforme usado neste relatório, refere-se à forma de espectroscopia de massas onde o mecanismo para a fotoionização da molécula M é absorção de fótons e ejeção de elétrons para formar a M+ molecular. Como a energia dos fótons tipicamente fica logo acima do potencial de ionização, o íon molecular é menos suscetível à dissociação. Em muitos casos, pode ser possível analisar amostras sem a necessidade de cromatografia, dessa forma economizando tempo e gastos significativos. Na presença de vapor d’água ou solventes próticos, o íon molecular pode extrair H para formar MH+. Isto tende a ocorrer se M tiver uma alta afinidade protônica. Isto não afeta a acurácia da quantificação porque a soma de M+ e MH+ é constante. Compostos medicamentos em solventes próticos usualmente são observados como MH+, ao passo que compostos não polares tais como naftaleno ou testosterona usualmente formam M+. Robb, D.B., Covey, T.R. e Bruins, A.P. (2000): Vide, por exemplo, Robb et al., Atmospheric pressure photoionization: An ionization method for liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem. 72(15): 3653-3659.

[0050] Conforme usado neste relatório, o termo "plasma indutivamente acoplado" ou "ICP" refere-se a métodos nos quais uma amostra é interagida com um gás parcialmente ionizado a uma temperatura suficientemente alto para atomizar e ionizar a maioria dos elementos.

[0051] Conforme usado neste relatório, o termo"dessorção de campo" refere-se a métodos nos quais uma amostra de teste não volátil é colocada sobre uma superfície de ionização, e um campo elétrico intenso é usado para gerar íons de analito.

[0052] Conforme usado neste relatório, o termo "dessorção" refere-se à remoção de um analito de uma superfície e/ou à entrada de um analto em uma fase gasosa.

[0053] Conforme usado neste relatório, o termo "limite de quantificação" ou "LOQ" refere-se ao ponto no qual as medições passam a ser quantitativamente significativas. A resposta do analito neste LOQ é identificável, discreta e reproduzível com uma precisão de 20% e uma acurácia de 80% a 120%.

[0054] Em certas modalidades preferidas dos métodos divulgados neste relatório, a espectrometria de massas é realizada em modo de íons positivos. Em certas modalidades particularmente preferidas dos métodos divulgados neste relatório, a espectrometria de massas é realizada usando-se ESI.

[0055] Em outras modalidades preferidas, um padrão interno detectável separadamente é oferecido na amostra.

[0056] Em uma modalidade, os métodos envolvem a combinação de LC com espectrometria de massas. Em uma outra modalidade preferida, a espectrometria de massas é espectrometria de massas em tandem (MS/MS).

[0057] O sumário da invenção descrito da invenção não é limitativo e outros aspectos e vantagens da invenção tornar-se-ão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada da invenção, e das reivindicações.

Descrição Detalhada da Invenção

[0058] São descritos métodos para medir quantitativamente o tamoxifeno e/ou metabólitos do mesmo em uma amostra de um paciente. Esta medição quantitativa é obtida através do uso de técnicas de LC-MS/MS. Antes de se usar a LC-MS/MS, as amostras podem ser preparadas pela técnica a seguir, ou qualquer porção da mesma. Uma primeira purificação de tamoxifeno e/ou metabólitos do mesmo em uma amostra pode ser conduzida através do uso de uma purificação, filtração, ou cromatografia de proteínas.

[0059] Qualquer técnica de separação por tamanho adequada pode ser utilizada mas, nos exemplos que se seguem, tanto a primeira quanto a segunda técnicas de separação por tamanho são filtração através de um filtro de corte de peso molecular. Também é possível, como discutido nos exemplos que se seguem, selecionar um filtro de corte de peso molecular um corte de peso molecular apropriado de modo que o mesmo filtro possa ser usado tanto a primeira de separação por tamanho quanto para a segunda de separação por tamanho.

[0060] LC, ainda mais preferivelmente HPLC, é utilizada, e pode ser utilizada seja isoladamente ou em combinação com outros métodos de purificação, para purificar analitos selcionados. Esta purificação é combinada com MS/MS, oferecendo assim um sistema de ensaio para quantificar analitos selecionados em uma amostra de teste. A quantidade dos analitos selecionados na amostra é então usada para determinar a quantidade de tamoxifeno na amostra de teste original. Os métodos de quantificação oferecidos nesta invenção possuem especificidade aumentada e são menos sujeitos a problemas metodológicos (tais como interferência de anticorpos).

[0061] Amostras adequadas podem incluir qualquer amostra de teste que possa conter o analito de interesse. Em algumas modalidades preferidas, uma amostra é uma amostra biológica, isto é, uma amostra obtida de qualquer fonte biológica, tal como um animal, uma cultura de células, uma cultura de órgão, entre outras. Em certas modalidades preferidas, as amostras são obtidas de um animal mamífero, tal como um cachorro, gato, cavalo, etc. Animais mamíferos particularmente preferidos são primatas, mais preferivelmente seres humanos. Amostras particularmente preferidas incluem sangue, plasma, sero, urina, saliva, lágrima, fluido cerebrospinhal, ou amostras de outros fluidos ou tecidos corporais. Tais amostras podem ser obtidas, por exemplo, de um paciente, isto é, de uma pessoa viva que comparece a uma clínica para diagnóstico, prognóstico, ou tratamento de uma doença ou condição. A amostra de teste é preferivelmente obtida de um paciente, por exemplo, soro ou plasma. Preparação de Amostras para Espectrometria de Massas

[0062] As amostras podem ser processadas ou purificadas para obtenção de preparações que sejam adequadas para análise por espectrometria de massas. Tal purificação geralmente inclui cromatografia, tal como cromatografia líquida, e com frequência também pode envolver um procedimento de purificação adicional que é realizado antes da cromatografia. Vários procedimentos podem ser usados para tanto, dependendo do tipo de amostra ou do tipo de cromatografia. Exemplos incluem filtração, centrifugação, e combinações das mesmas, entre outros.

[0063] Filtração é um método preferido para o preparo de uma amostra de teste, especialmente uma amostra de teste biológica, tal como soro ou plasma, para cromatografia. Tal filtração é realizada filtrando-se a amostra de teste através de um filtro de corte de peso molecular para separar espécies com pesos moleculares mais altos que o corte do filtro daquelas com pesos moleculares mais baixos que o corte do filtro. A amostra de teste que fica acima do filtro subsequente à filtração completa (ou quase completa) é substancialmente livre de espécies potencialmente interferentes com pesos moleculares mais baixos que o corte do filtro.

[0064] Já foram descritos vários métodos envolvendo o uso de hpcl para limpeza da amostra antes da análise por espectrometria de massas. Vide, por exemplo, Taylor et al., Therapeutic Drug Monitoring 22:608-12 (2000) (precipitação manual de amostras de sangue, seguida por extração manual em fase sólida C18, injeção em uma HPLC para cromatografia em uma coluna analítica C18, e análise por MS/MS); e Salm et al., Clin. Therapeutics 22 Supl. B:B71-B85 (2000) (precipitação manual de amostras de sangue, seguida por extração manual em fase sólida C18, injeção em uma HPLC para cromatografia em uma coluna analítica C18, e análise por MS/MS). O especialista na técnica pode escolher os instrumentos e colunas de HPLC que são adequados para uso nos métodos. A coluna cromatográfica tipicamente inclui um meio (i.e., um material de empacotamento) para facilitar a separação das porções químicas (i.e., fracionamento). O meio pode incluir partículas diminutas. As partículas incluem uma superfície ligada que interage com as várias porções químicas para facilitar a separação das porções químicas. Uma superfície ligada adequada é uma superfície ligada hidrófoba tal como uma superfície ligada a alquil. Superfícies ligadas a alquil podem incluir grupos C-4, C-8, ou C-18 alquil ligados, preferivelmente grupos ligados C-8. A coluna cromatográfica inclui um orifício de entrada para receber uma amostra e um orifício de saída para descarregar um efluente que inclui a amostra fracionada.

[0065] Em certas modalidades, um analito pode ser purificado aplicando-se uma amostra a uma coluna em condições nas quais o analito de interesse fica reversivelmente retido pelo material de empacotamento da coluna, ao passo que um ou mais outros materiais não ficam retidos. Nessas modalidades, pode ser empregada uma primeira condição de fase móvel onde o analito de interesse fica retido pela coluna e uma segunda condição de fase móvel pode ser subsequentemente empregada para remover o material retido da coluna, depois que todos os materiais não retidos forem removidos. Alternativamente, um analito pode ser purificado aplicando-se uma amostra a uma coluna em condições de fase móvel nas quais o analito de interesse elui a uma taxa diferencial em comparação com um ou mais outros materiais. Tais procedimentos podem enriquecer a quantidade de um ou mais analitos de interesse em relação a um ou mais outros componentes da amostra.

[0066] Em uma modalidade, a amostra a ser analisada é aplicada à coluna no orifício de entrada, eluída com um solvente ou mistura de solventes, e descarregada pelo orifício de saída. Diferentes modos de solvente podem ser selecionados para eluição dos analistos de interesse. Por exemplo, cromatografia líquida pode ser realizada usando-se um modo de gradiente, um modo isocrático, ou um modo politíptico (i.e., misturado). Em modalidades preferidas, a HPLC é realizada em um sistema de HPLC analítico com uma fase sólida C8 usando 0,2% de ácido fórmico em água ultrapura grau de HPLC e 0,2% de ácido fórmico em 100% de metanol como as fases móveis.

[0067] Numerosos materiais para empacotamento de colunas encontram-se disponíveis para separação cromatográfica de amostras e a seleção de um protocolo de separação apropriado é um processo empírico que depende das características da amostra, do analito de interesse, da presença de substâncias interferentes e suas características, etc. Colunas de HPLC comercialmente disponíveis incluem, porém sem limitação, colunas polares, de troca iônica (tanto catiônica quanto aniônica), de interação hidrófoba, fenílicas, C-2, C-8, C-18, e de revestimento polar sobre colunas de polímero porosas.

[0068] Em uma modalidade, a coluna de HPLC tem uma fase sólida C8 com um tamanho de partícula médio de 5 μm (nominal) e e um tamanho de poro de partícula médio de 100 Â. Em uma modalidade preferida, as dimensões da coluna são 1,0 mm de diâmetro interno ID x 50 mm de diâmetro (Phenomenex Corp. Luna 5μ C8(2) 100 Â New Column 50 x 1,0 mm, Phenomenex Cat. No. 00B- 4249-A0 ou equivalente).

[0069] Durante a cromatografia, a separação dos materiais é efetuada por variáveis tais como a escolha do eluente (também conhecido como "fase móvel"), a escolha de eluição por gradiente e as condições do gradiente, temperatura, etc. Detecção e Quantificação por Espectrometria de Massas

[0070] Em várias modalidades, os analitos podem ser ionizados por qualquer método conhecido pelo especialista na técnica. Espectrometria de massas é realizada usando-se um espectrômetro de massas, que inclui uma fonte de íons para ionizar a amostra fracionada e criar moléculas carregadas para análise posterior. As fontes de ionização usadas em várias técnicas de MS incluem, por exemplo, ionização eletrônica, ionização química, ionização por electrospray (ESI), ionização fotônica, ionização química à pressão atmosférica (APCI), fotoionização, fotoionização à pressão atmosférica (APPI), bombardeamento atômico rápido (FAB)/ionização secundária líquida (LSIMS), ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI), ionização de campo, ionização termospray/plasmaspray, ionização e dessorção a laser de superfície melhorada (SELDI), plasma indutivamente acoplado (ICP) e ionização de feixes de partículas. O especialista na técnica entende que a escolha do método de ionização pode ser determinada com base no analito a ser medido, no tipo de amostra, no tipo de detector, na escolha do modo positivo versus negativo, etc.

[0071] Em modalidades preferidas, os analitos são ionizados por ionização por electrospray (ESI) criando íons precursores de analito. Em modalidades preferidas relacionadas, os íons precursores de analito estão em um estado gasoso e o gás de colisão inerte é argônio.

[0072] Depois que a amostra foi ionizada, os íons carregados positivamente criados dessa maneira podem ser analisados para determinar a m/z. Analisadores adequados para determinar a m/z incluem analisadores de quadrupolo, analisadores tipo armadilha de íons, e analisadores por tempo de voo. Os íons podem ser detectados usando-se um de vários modos de detecção. Por exemplo, somente os íons selecionados podem ser detectados usando-se um modo de monitoramente seletivo de íons (SIM), ou alternativamente, múltiplos íons podem ser detectados usando-se um modo de varredura, por exemplo, monitoramento de múltiplas reações (MRM) ou monitoramento de reações selecionadas (SRM). Em modalidades preferidas, os íons são detectados usando-se SRM.

[0073] Preferivelmente, a m/z é determinada usando-se um instrumento tipo quadrupolo. Em um instrumento tipo "quadrupolo" ou "armadilha de íons tipo quadrupolo", os íons em um campo de radiofrequência oscilante experimentam uma força proporcional ao potencial DC aplicado entre os eletrodos, a amplitude do sinal FR, e m/z. A voltagem e a amplitude podem ser selecionadas de modo que apenas íons tendo um m/z particular percorram o comprimento do quadrupolo, enquanto que todos os outros íons são defletidos. Por conseguinte, instrumentos do tipo quadrupolo podem agir tanto como um "filtro de massa" quanto como um "detector de massa" para os íons injetados no instrumento.

[0074] É possível melhorar a resolução da técnica de MS empregando-se "espectrometria de massas em tandem", ou "MS/MS". Nesta técnica, um íon precursor (também chamado de íon parental) gerado a partir de uma molécula de interesse pode ser filtrado em um instrumento MS, e o íon precursor subsequentemente fragmentado para dar um ou mais fragmentos iônicos (também chamados de íons- filhas ou produtos iônicos) que são analisados em um segundo procedimento de MS. Pela escolha cautelosa dos íons precursores, somente íons produzidos por certos analitos são passados para a câmara de fragmentação, onde a colisão com átomo de um gás inerte produz os fragmentos iônicos. Como tanto os íons precursores quanto os fragmentos iônicos são produzidos de forma reproduzível em um dado conjunto de condições de ionização/fragmentação, a técnica de MS/MS pode constituir uma ferramenta analítica extremamente poderosa. Por exemplo, a combinação de filtração/fragmentação pode ser usada para eliminar substâncias interferentes, e pode ser particularmente útil em amostras complexas, tais como amostras biológicas.

[0075] Adicionalmente, os recentes avanços na tecnologia, tais como ionização e dessorção a laser assistida por matriz acoplada com analisadores por tempo de voo ("MALDI-TOF") permitem a análise de analitos em níveis de femtomole em pulsos de íons muito curtos. Espectrômetros de massas que combinam t analisadores por tempo de voo com MS em tandem também são bastante conhecidos pelo especialista na técnica. Adicionalmente, múltiplas etapas de espectrometria de massas podem ser combinadas em métodos conhecidos como "MS/MS". Várias outras combinações podem ser empregadas, tais como espectrometria de massas MS/MS/TOF, MALDI/MS/MS/TOF, ou SELDI/MS/MS/TOF.

[0076] O espectrômetro de massas tipicamente proporciona ao usuário uma imagem de íons, isto é, a abundância relativa de cada íon com uma m/z particular em uma dada faixa (por exemplo, 400 a 1600 amu). Os resultados de um ensaio de analito, isto é, um espectro de massa, pode ser relacionado à quantidade do analito na amostra original por numerosos métodos conhecidos na literatura. Por exemplo, uma vez que os parâmetros de amostragem e análise são cuidadosamente controlados, a abundância relativa de um dado íon pode ser comparada com uma tabela que converte aquela abundância relativa em uma quantidade absoluta da molécula original. Alternativamente, os padrões moleculares podem ser executados com as amostras e uma curva padrão pode ser construída com base nos íons gerados a partir daqueles padrões. Com o uso de tal curva padrão, a abundância relativa de um dado íon pode ser convertida em uma quantidade absoluta da molécula original. Em certas modalidades preferidas, um padrão interno é usado para gerar uma curva padrão para calcular a quantidade de tamoxifeno. Métodos para gerar e usar tais curvas padrão são bastante conhecidos na literatura e o especialista na técnica é capaz de selecionar um padrão interno apropriado. Numerosos outros métodos para relacionar a quantidade de um íon com a quantidade da molécula original molecule são bastante conhecidos pelos especialistas na técnica.

[0077] Uma ou mais etapas dos métodos podem ser realizadas usando-se máquinas automáticas. Em certas modalidades, uma ou mais etapa de purificação são realizadas on-line, e mais preferivelmente todas as etapas de purificação LC e espectrometria de massas podem ser realizadas on-line.

[0078] Em certas modalidades, técnicas tais como MS/MS são usadas para isolar íons precursores para fragmentação adicional. Nessas modalidades, dissociação de ativação da colisão (CAD) pode ser usada para gerar os fragmentos iônicos para detecção posterior. Na CAD, os íons precursores ganham energia através de colisões com um gás inerte, e subsequentemente fragmentam por um processo denominado "decomposição unimolecular". Energia suficiente deve ser depositada no íon precursor para que certas ligações no íon possam ser rompidas devido à energia vibracional aumentada. Em modalidades alternativas, dissociação por transferência de elétrons (ETD) pode ser usada para gerar os fragmentos iônicos. Na ETD, ânions de radicais são usados para transferir elétrons para cátions de peptídios ou proteínas com cargas múltiplas resultando em uma clivagem aleatória ao longo do esqueleto do peptídio.

[0079] Em modalidades particularmente preferidas, o analito é detectado e/ou quantificado usando-se LC-MS/MS da seguinte maneira. Uma amostra enriquecida com analito preparada da maneira descrita acima é submetida à LC. O fluxo de solvente líquido proveniente da coluna cromatográfica entra na interface de nebulizador aquecida de um analisador de LC-MS/MS e a mistura solvente/anaalito é convertida em vapor na tubulação aquecida da interface. O analito contido no solvente nebulizado é ionizado pela agulha de descarga corona da interface, que aplica uma alta voltagem à mistura de solvente nebulizado/analito. Os íons atravessam o orifício do instrumento e entram no primeiro quadrupolo. Os quadrupolos 1 e 3 (Q1 e Q3) são filtros de massa, permitindo a seleção de íons (i.e., íons "precursores" e "fragmentos") com base em sua m/z. O quadrupolo 2 (Q2) é a célula de colisão, onde os íons são fragmentados. Q1 seleciona os íons com m/z de íons precursores. Os íons precursores selecionados são deixados passar para dentro da câmara de colisão (Q2), enquanto que íons com qualquer outra m/z colidem com as laterais de Q1 e são eliminados. Os íons precursores que entram em Q2 podem ser fragmentados com dissociação ativada por colisão (CAD) através de colisões com moléculas de gás argônio neutras. Alternativamente, se os íons precursores que entram em Q2 forem cátions com cargas múltiplas, eles podem ser fragmentados com dissociação por transferência de elétrons (ETD). Os fragmentos iônicos gerados são passados para Q3, onde os fragmentos iônicos selecionados são coletados enquanto que os outros íons são eliminados.

[0080] Usando métodos tradicionais bastante conhecidos na literatura, o especialista na técnica é capaz de identificar um ou mais fragmentos iônicos de um íon precursor particular que podem ser usados para seleção em Q3. Um fragmento iônico específico é um íon que não será formado em quantidades significativas por outras moléculas com estruturas moleculares similares. Ao contrário, um fragmento iônico inespecífico é um íon que é formado por moléculas outras que não o analito desejado. Fragmentos iônicos específicos adequados podem ser identificados testando-se vários padrões moleculares para determinar se os fragmentos iônicos por um analito selecionado também podem ser formados por outras moléculas com estruturas ou características similares. Preferivelmente, pelo menos um fragmento iônico específico para íons com m/z correspondente àquela dos íons de analito é identificado.

[0081] À medida que os íons colidem com o detector, eles produzem um pulso de elétrons que são convertidos em um sinal digital. Os dados adquiridos são transmitidos para um computador, que plota as contagens de íons por unidade de tempo. As áreas sob os picos correspondentes a íons particulares, ou a amplitude de tais picos, são medidas e a área ou amplitude é correlacionado com a quantidade do analito de interesse. Em certas modalidades, a área sob as curvas, ou a amplitude dos picos, para fragmentos iônicos e/ou íons precursores é medida para determinar a quantidade de analitos com m/z. Como descrito acima, a abundância relativa de um dado íon pode ser convertida em uma quantidade absoluta do analito original usando- se curvas padrão de calibração baseadas nos picos de um ou mais íons de um padrão molecular interno. A quantidade absoluta de um analito detectado por LC-MS/MS pode ser convertida em uma quantidade absoluta do analito que estava presente na amostra de teste original.

[0082] Em algumas modalidades, o método oferecido nesta invenção tem a sensibilidade medida pelo limite de quantificação (LOQ). Em algumas modalidades, o método de quantificação de tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL.

[0083] Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL.

[0084] Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,2 ng/mL.

[0085] Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,2 ng/mL.

[0086] Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4- hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4- hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,4 ng/mL.

[0087] Em algumas modalidades, o método de quantificação de N- desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil- 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,4 ng/mL.

[0088] Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de quantificação de norendoxifeno tem um limite de quantificação menor ou igual a 0,5 ng/mL.

[0089] Em algumas modalidades, o método oferecido nesta invenção tem a sensibilidade medida pelo limite de detecção (LOD). Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,6 ng/mL.

[0090] Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,6 ng/mL.

[0091] Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’- hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,1 ng/mL.

[0092] Em algumas modalidades, o método de detecção de 4- hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de 4-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,1 ng/mL.

[0093] Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 0,4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 0,2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) tem um limite de detecção menor ou igual a 0,15 ng/mL.

[0094] Em algumas modalidades, o método de detecção de N- desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,4 ng/mL.

[0095] Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 4 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 3 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,5 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1,2 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 1 ng/mL. Em algumas modalidades, o método de detecção de norendoxifeno tem um limite de detecção menor ou igual a 0,5 ng/mL.

[0096] Os exemplos a seguir servem para ilustrar a invenção. Estes exemplos não se destinam de forma alguma a limitar o âmbito dos métodos. Exemplos Exemplo 1: Determinação de tamoxifeno e seus metabólitos

[0097] No procedimento a seguir, tamoxifeno e seus metabólitos são extraídos de soro. O soro é adicionado a uma placa-filtro, e em seguida misturado com acetonitrila/IS, que forma então um precipitado. A mistura é então colocada sobre um cadafalso de pressão positiva, a fração orgânica é passada através de uma placa coletora. A placa é tampada, e então colocada no sistema Cohesive para injeção em MS/MS. A MS está no modo APCI-positivo. A quantificação baseia-se em transições únicas de matriz-produto. Os analitos com transições similares foram separados cromatograficamente. Preparo do Paciente

Tipo e manipulação do espécime

Resumo dos reagentes

Calibradores/Padrões Usados

[0098] Uma calibração de 12 pontos é usada para cada analito. Inicialmente, apenas um padrão é feito (Std-12), com uma série de diluições realizadas para gerar os padrões restantes. O padrão (#12) deve ser retirado do congelador a -70°C e descongelado. Enquanto descongelada, doze tubos de 12x75 mm devem ser etiquetados.

[0099] Adicionar 3,0 mL do padrão 12 ao tubo 12. A partir deste padrão, a tabela abaixo deve ser seguida para a criação da curva padrão. Uma curva padrão deve ser gerada para cada ensaio. O padrão inicial deve ser recolocado no congelador a uma temperatura de -60 a -90°C.

[00100] Depois de os analitos serem acrescentados, QS para 200 mL com soro Biocell. Misturar, e introduzir alíquotas em tubos centrífuga de 15 mL. Etiquetar (Std-12), e então colocar os tubos no congelador a uma temperatura de -60 a -90°C para armazenamento. Estável por 1 ano. Concentrações Alvo dos Padrões *Nota: Todas as concentrações em ng/mL.

Curva de calibração Diluições:

Procedimento de Calibração

EQUIPAMENTOS E SUPRIMENTOS Plataforma de Ensaio

[00101] Um sistema Thermo LC/MS/MS contendo os seguintes módulos foi usado para este ensaio:

Equipamento

Suprimentos

Espectrometria de massas

*A forma Z é a forma ativa que é monitorada. Petição 870220042132, de 16/05/2022, pág. 55/126 47/111 VALORES ESPERADOS Faixas de Referência: Tamoxifeno: 12,54-233,07 ng/mL N-desmetil tamoxifeno: 2,59-373,96 ng/mL 4’-hidróxi tamoxifeno: 0,4-6,33 ng/mL 4-hidróxi tamoxifeno: 0,24-5,05 ng/mL N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno): 0,93-43,19 ng/mL N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno: 1,17-19,95 ng/mL Faixa das Medições Analíticas (AMR) Tamoxifeno: 1,47-1500 ng/mL N-desmetil tamoxifeno: 1,47-1500 ng/mL 4’-hidróxi tamoxifeno: 0,2-200 ng/mL 4-hidróxi tamoxifeno: 0,2-200 ng/mL N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno): 0,39-400 ng/mL N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno: 0,39-400 ng/mL

[00102] Precisão: Estudos de precisão inter- (período do ensaio) e intra-ensaios (1 dia) foram conduzidos usando os controles baixo, médio, e alto. Todos os analitos apresentaram um CV <12% durante o período de validação.

[00103] Substâncias interferentes: Amostras ictéricas e lipêmicas leves ou moderadas são aceitáveis. Amostras hemolíticas não são aceitáveis, uma vez que elas vão obstruir o filtro durante a preparação da amostra. Amostras grosseiramente hemolizadas, ictéricas, e lipêmicas não são aceitáveis. Sensibilidade Clínica (LOQ): Tamoxifeno: 1,47 ng/mL N-desmetil tamoxifeno: 1,46 ng/mL 4’-hidróxi tamoxifeno: 0,2 ng/mL 4-hidróxi tamoxifeno: 0,2 ng/mL N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno): 0,39 ng/mL N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno: 0,39 ng/mL Exemplo 2: Validação do ensaio de tamoxifeno e seus metabólitos

[00104] Este relatório contém um resumo detalhado da validação para o tamoxifeno e seus 5 principais metabólitos fase I por LC/MS/MS. O ensaio é um teste desenvolvido em laboratório.

[00105] Metodologia: tamoxifeno e seus principais metabólitos fase I (N-desmetiltamoxifeno, N-desmetil-4-hidroxitamoxifeno, N-desmetil- 4’-hidroxitamoxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, e 4’-hidroxitamoxifeno) são extraído de soro. A extração é uma precipitação de proteínas, seguida por filtração. Análise e quantificação são então feitas por LC/MS/MS. Kit ou Reagentes

Estudo de Precisão para Testes Desenvolvidos em Laboratório (LDT)

[00106] Dentro da precisão da corrida: Controles baixo, médio, e alto foram analisados (10) dentro de uma corrida. Todos os QC ficaram dentro dos critérios de aceitabilidade (<20% CV).

[00107] Precisão total: A precisão total foi baseada em todas as corridas de QC em todos os ensaios durante o processo de validação. A aceitabilidade foi baseada em < 20% CV. Todos os QC ficaram dentro desses critérios.

SENSIBILIDADE ANALÍTICA (LIMITES DE DETECÇÃO)

[00108] Limite de Detecção (LOD): O limite de detecção (LOD) foi efetuado tomando-se um lago baixo (contendo todos os analitos), e então diluindo-se o mesmo seriadamente (1:2) até o nível mais baixo observável. Supondo-se que a linearidade continuasse abaixo do nível de quantificação (LOQ), os valores abaixo seriam as concentrações quantificáveis mais baixas. Esta experiência foi realizada durante 5 dias. tamoxifeno = 0,59 ng/mL N-desmetil tamoxifeno = 0,59 ng/mL 4’-hidróxi tamoxifeno = 0,1 ng/mL N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno = 0,5 ng/mL 4-hidróxi tamoxifeno = 0,1 ng/mL N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) = 0,15 ng/mL

[00109] Limite de Quantificação (LOQ): Os critérios de aceitabilidade para o LOQ são definidos como a concentração mais baixa à qual CV<20%. Para determinar o LOQ, um padrão de nível intermediário foi diluído seriadamente 1:2. Tamoxifeno = 1,5 ng/mL N-desmetil tamoxifeno = 1,5 ng/mL 4’-hidróxi tamoxifeno = 0,4 ng/mL N-desmetil-4’-hidróxi tamoxifeno = 0,4 ng/mL 4-hidróxi tamoxifeno = 0,2 ng/mL N-desmetil-4-hidróxi tamoxifeno (endoxifeno) = 0,4 ng/mL ACURÁCIA

[00110] Recuperação de Padrões Conhecidos: Soro foi inoculado com todos os analitos até atingirem concentrações específicas, extraídos, e então analisados em triplicata. Todas as misturas foram inoculadas para cobrir uma faixa linear e terapêutica de cada analito.

ESTUDO DE INTERFERÊNCIA

[00111] Critérios de aceitabilidade: A diferença devida a uma substância interferente em potencial deve ser < TEa/4 para ser considerada aceitável.

[00112] Interferência da Hemólise: Lagos baixos e altos foram inoculados com um RBC hemolizado a concentrações baixas, médias, e altas. As amostras foram extraídas em quadruplicata. Hemólise não mostrou interferência no tamoxifeno ou nos metabólitos medidos. No entanto, devido à dificuldade com a filtração a partir de amostras com hemólise moderada e alta, apenas amostras levemente hemolisadas devem ser aceitas.

[00113] Interferência da Lipemia: Lagos baixos e altos foram inoculados com amostras lipêmicas a concentrações baixas, médias, e altas. As amostras foram extraídas em quadruplicata. As amostras lipêmicas não mostraram interferência no tamoxifeno ou metábolitos medidos.

[00114] Interferência da Bilirubina: Lagos baixos e a tos foram inoculados com uma bilirubina a concentrações baixas, médias, e altas. As amostras foram extraídas em quadruplicata. Amostras inoculadas com bilirubina não mostraram interferência no tamoxifeno ou metábolitos medidos.

Exemplo 3: Validação do ensaio de norendoxifeno

[00115] Este relatório contém um resumo detalhado da validação para o norendoxifeno por LC/MS/MS. O ensaio é um teste desenvolvido em laboratório.

[00116] Norendoxifeno é extraído de soro usando-se precipitação de proteínas, seguida por filtração. Análise e quantificação são então realizadas por LC/MS/MS. Kit ou Reagentes

Estudo de Precisão para Testes Desenvolvidos em Laboratório (LDT)

[00117] Precisão dentro da corrida: Controles baixos, médios, e altos (ng/mL) foram analisados (10) dentro de uma corrida. Todos os QC ficaram dos critérios de aceitabilidade (<20% CV).

[00118] Precisão total: A precisão total foi baseada em todas as corridas de QC em todos os ensaios durante o processo de validação. A aceitabilidade foi baseada em < 20% CV. Todos os QC ficaram dentro desses critérios.

[00119] Limite de Detecção (LOD): Norendoxifeno = 1,2 ng/mL

[00120] Limite de Quantificação (LOQ): Norendoxifeno = 1,2 ng/mL ACURÁCIA

[00121] Recuperação de Padrões Conhecidos: Soro foi inoculado com todos os analitos até atingirem concentrações específicas, extraídos, e então analisados em triplicata. Todas as misturas foram inoculadas para cobrir uma faixa linear e terapêutica de cada analito.

ESTUDO DE INTERFERÊNCIA

[00122] Critérios de aceitabilidade: A diferença devida a uma substância interferente em potencial deve ser < TEa/4 para ser considerada aceitável.

[00123] Interferência da Hemólise: Lagos baixos e altos foram inoculados com um RBC hemolizado a concentrações baixas, médias, e altas. As amostras foram extraídas em quadruplicata. Hemólise não mostrou interferência no norendoxifeno. No entanto, devido à dificuldade com a filtração a partir de amostras com hemólise moderada e alta, apenas amostras levemente hemolisadas devem ser aceitas.

[00124] Interi terência da Lipemia: Lagos baixos e altos foram inoculados com amostras lipêmicas a concentrações baixas, médias, e altas. As amostras foram extraídas em quadruplicata. As amostras lipêmicas não mostraram interferência no norendoxifeno. Recuperação de Padrões Conhecidos: Soro foi inoculado com todos os analitos até atingirem concentrações específicas, extraídos, e então analisados em triplicata. Todas as misturas foram inoculadas para cobrir uma faixa linear e terapêutica de cada analito.

[00125] Interferência da Bilirubina: Lagos baixos e altos foram inoculados com uma bilirubina a concentrações baixas, médias, e altas. As amostras foram extraídas em quadruplicata. As amostras inoculadas com bilirubina não mostraram interferência no norendoxifeno.

Exemplo 4: Quantificação clínica e estudo da resposta

[00126] O protocolo operacional padrão dos Exemplos 1-3 foi usado para quantificar o tamoxifeno e seus metabólitos em amostras de pacientes e foi correlacionado com a resposta ao tamoxifeno.

[00127] Quantificação do norendoxifeno e resposta ao mesmo em amostras de pacientes.

[00128] 2o conjunto de dados para norendoxifeno

[00129] Quantificação do endoxifeno e resposta ao mesmo em amostras de pacientes.

[00130] Quantificação do 4-hidróxi tamoxifeno e resposta ao mesmo em amostras de pacientes.

[00131] Quantificação do N-desmetil-4'-hidróxi e resposta ao mesmo em amostras de pacientes.

[00132] Quantificação do 4'-hidróxi tamoxifeno e resposta ao mesmo em amostras de pacientes.

[00133] 2o conjunto de dados para 4’-hidróxi tamoxifeno

[00134] Quantificação do N-desmetil tamoxifeno e resposta ao mesmo em amostras de pacientes.

[00135] 2o conjunto de dados para N-desmetil tamoxifeno

[00136] Quantificação do Tamoxifeno e resposta ao mesmo em amostras de pacientes.

[00137] 2o conjunto de dados para tamoxifeno

[00138] Resumo de dados dos pacientes

Exemplo 5: Estudo adicional de quantificação e resposta clínica

[00139] O protocolo operacional padrão dos Exemplos 1-3 foi usado para quantificar o tamoxifeno e seus metabólitos em amostras de pacientes e foi correlacionado com a resposta ao tamoxifeno. 4’-hidróxi tamoxifeno

[00140] N-desmetil tamoxifeno

[00141] Tamoxifeno

[00142] Resumo de dados dos pacientes

[00143] O teor dos artigos, patentes, pedidos de patente, e todos os outros documentos e informações disponíveis por via eletrônica mencionados ou citados neste relatório, estão aqui incorporados em sua integridade a título de referência como se cada publicação individual estivesse especificamente e individualmente indicada como estando incorporada a título de referência. As Requerentes se reservam o direito de incorporar fisicamente todo e qualquer material e informação proveniente de tais artigos, patentes, pedidos de patente, ou outros documentos físicos e eletrônicos.

[00144] Os métodos descritos a título ilustrativo neste relatório podem ser adequadamente praticados na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente divulgados neste relatório. Por conseguinte, por exemplo, os termos "compreendendo", "incluindo", "contendo" etc. devem ser interpretados de forma ampla e sem limitação. Adicionalmente, os termos e expressões empregados neste relatório foram usados como termos descritivos e não limitativos, e não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou de partes das mesmas, ficando reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do âmbito da invenção reivindicada. Por conseguinte, deve ficar entendido que embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita por modalidades preferidas e características opcionais, modificações e variações da invenção concretizadas nas mesmas e descritas neste relatório podem surgir aos especialistas na técnica, e tais modificações e variações são consideradas dentro do âmbito desta invenção.

[00145] A invenção foi descrita de forma ampla e genérica neste relatório. Cada uma das espécies mais estreitas e grupamentos subgenéricos que se enquadram na descrição genérica também fazem parte dos métodos. Isto inclui a descrição genérica dos métodos com a condição ou limitação negativa excluir qualquer matéria referente ao gênero, independente de o material excisado estar ou não especificamente mencionado neste relatório.

[00146] Outras modalidades se enquadram nas reivindicações que se seguem. Além disso, onde as características ou aspectos dos métodos estão descritos em termos de grupos de Markush, os especialistas na técnica vão perceber que a invenção também está em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.

Claims

1. Método para determinar a quantidade de norendoxifeno em uma amostra humana por espectrometria de massas, caracterizado por compreender: (a) ionizar por ionização química à pressão atmosférica (APCI) o referido norendoxifeno para produzir um ou mais íons de norendoxifeno detectáveis por espectrometria de massas; (b) detectar a quantidade de íons de norendoxifeno da etapa (a) por espectrometria de massas; em que a quantidade de íons detectada está relacionada com a quantidade de norendoxifeno na referida amostra, em que o método tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda precipitação de proteínas antes da etapa (a).

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda purificação antes da etapa (a).

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida purificação compreende filtração.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida purificação compreende cromatografia líquida.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida cromatografia líquida é cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda detectar a quantidade de um padrão interno.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido padrão interno é um norendoxifeno deuterado.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida ionização é em modo de íons positivos.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida amostra é uma amostra de soro.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida espectrometria de massas é espectrometria de massas em tandem.

12. Método para determinar a quantidade de tamoxifeno e metabólitos do mesmo em uma amostra humana em um único ensaio de espectrometria de massas, caracterizado por compreender: (a) ionizar por ionização química à pressão atmosférica (APCI) o referido tamoxifeno e metabólitos para produzir um ou mais íons detectáveis por espectrometria de massas, e em que os referidos metabólitos de tamoxifeno compreendem norendoxifeno; (b) detectar a quantidade de íons da etapa (a) por espectrometria de massas; em que a quantidade de íons detectada está relacionada com a quantidade de cada um dos tamoxifeno e metabólitos na referida amostra, em que o método tem um limite de quantificação menor ou igual a 1,5 ng/mL de norendoxifeno.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender ainda precipitação de proteínas antes da etapa (a).

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender ainda purificação antes da etapa (a).

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a referida purificação compreende filtração.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a referida purificação compreende cromatografia líquida.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a referida cromatografia líquida é cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).

18. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender ainda detectar a quantidade de um padrão interno.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido padrão interno é um padrão interno deuterado.

20. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a referida ionização é em modo de íons positivos.

21. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a referida amostra é uma amostra de soro.

22. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a referida espectrometria de massas é espectrometria de massas em tandem.

23. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os referidos metabólitos compreendem norendoxifeno ou N-Desmetil-4-Hidróxi Tamoxifeno.

24. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os referidos metabólitos compreendem 4’-Hidróxi Tamoxifeno.

25. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os referidos metabólitos compreendem 4-Hidróxi Tamoxifeno.

26. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os referidos metabólitos compreendem N-Desmetil-4’-Hidróxi Tamoxifeno.

27. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os referidos metabólitos compreendem N-Desmetil Tamoxifeno.

28. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os referidos metabólitos compreendem norendoxifeno, endoxifeno, 4’-Hidróxi Tamoxifeno, 4-Hidróxi Tamoxifeno, N-Desmetil-4’-Hidróxi Tamoxifeno, e N-Desmetil-4-Hidróxi Tamoxifeno.