CN110914691A - 用于定量胰岛素和c-肽的方法 - Google Patents
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Abstract
描述了用于诊断或预后糖尿病和糖尿病前期患者中胰岛素抵抗性的方法,该方法包括确定样品中胰岛素和C‑肽的量。本文提供的是用于检测和定量生物样品中胰岛素和C‑肽的质谱法,其利用与串联质谱或高分辨/高准确度质谱技术偶联的富集和/或纯化方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2017年3月31日提交的美国临时申请序号62/480,029和2018年3月16日提交的美国临时申请序62/644,378的权益,其内容通过引用以其全部并入本公开。
背景技术
在表面健康的人群中,胰岛素抵抗性变化数倍,并且这些个体的最胰岛素抵抗的四分之一和三分之一之间的某些值处于发展一系列代谢异常和相关临床综合征的增加的风险下。在临床水平上,直接估计胰岛素介导的葡糖糖处置(glucose disposal)是不切实际的。但是,血浆胰岛素浓度与胰岛素介导的葡糖糖处置的直接测量高度相关,并且这已经导致引入基于血浆胰岛素和葡萄糖浓度的测量值的胰岛素抵抗性的几种替代评估。不幸的是,没有标准化的胰岛素测定法。结果,不可能建立普遍适用的数值分割点,用它来鉴定具有足够胰岛素抵抗的表面健康的个体处于许多不良临床结果的高风险下。
响应于该难题,已经提出了许多基于通常测量的与IR相关的代谢异常的替代标志物,以帮助在明显疾病发展之前鉴定胰岛素抵抗的个体。例如,代谢综合征(MetS)的诊断就是这种方法的例子。尽管MetS的诊断与直接测量胰岛素介导的葡糖糖处置相关,但表面健康人的最胰岛素抵抗群体的三分之一中仅约50%有资格诊断MetS。
需要可靠和准确的方法用于鉴定胰岛素抵抗性。
发明内容
在一个方面中,本文提供了用于诊断或预后糖尿病和糖尿病前期患者的胰岛素抵抗性的方法,该方法包括通过确定样品中胰岛素和C-肽的量测量患者的胰岛素和c-肽水平。
在某些实施方式中,本文提供的方法包括通过质谱法同时测量样品中胰岛素和C-肽的量的多重测定(multiplexed assay)。在一些实施方式中,方法包括:(a)在适于产生通过质谱法可检测的一种或多种胰岛素和C-肽离子的条件下使来自样品的胰岛素和C-肽经受电离源;和(b)通过质谱法确定一种或多种胰岛素和C-肽的量。
在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的胰岛素值大于或等于7μIU/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的胰岛素值大于或等于8μIU/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的胰岛素值大于或等于9μIU/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的胰岛素值大于或等于10μIU/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的胰岛素值大于或等于11μIU/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的胰岛素值大于或等于12μIU/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的胰岛素值大于或等于13μIU/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的胰岛素值大于或等于14μIU/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的胰岛素值大于或等于15μIU/mL,则诊断胰岛素抵抗性。
在优选实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的胰岛素值大于或等于15μIU/mL,则诊断胰岛素抵抗性。
在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的C-肽值大于或等于1.4ng/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的C-肽值大于或等于1.5ng/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的C-肽值大于或等于1.6ng/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的C-肽值大于或等于1.7ng/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的C-肽值大于或等于1.8ng/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的C-肽值大于或等于1.9ng/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的C-肽值大于或等于2ng/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的C-肽值大于或等于2.1ng/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的C-肽值大于或等于2.2ng/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的C-肽值大于或等于2.3ng/mL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的C-肽值大于或等于2.4ng/mL,则诊断胰岛素抵抗性。
在优选实施方式中,如果通过本文描述的质谱法确定的C-肽值大于或等于2.4ng/mL,则诊断胰岛素抵抗性。
在一些实施方式中,本文基于通过本文提供的方法测量的胰岛素和C-肽的水平提供胰岛素抵抗性评分(RS)和/或发展胰岛素抵抗性的概率P(IR)。
在一些实施方式中,通过以下确定胰岛素抵抗性评分(RS)和/或发展胰岛素抵抗性的概率P(IR):
RS=(胰岛素×0.0295)+(C-肽×0.00372)
在一些实施方式中,本文基于通过本文提供的方法测量的胰岛素和C-肽的水平和通过标准方法测量的肌酸提供胰岛素抵抗性评分(RS)和/或发展胰岛素抵抗性的概率P(IR)。
在一些实施方式中,通过以下确定胰岛素抵抗性评分(RS)和/或发展胰岛素抵抗性的概率P(IR):
RS=(胰岛素×0.0265)+(C-肽×0.00511)+(肌酸酐×-3.2641)
在一些实施方式中,本文基于通过本文提供的方法测量的胰岛素和C-肽的水平和通过标准方法测量的肌酸、甘油三酯(TG)/HDL-C和BMI提供胰岛素抵抗性评分(RS)和/或发展胰岛素抵抗性的概率P(IR)。
在一些实施方式中,通过以下确定胰岛素抵抗性评分(RS)和/或发展胰岛素抵抗性的概率P(IR):
RS=(胰岛素×0.0227)+(C-肽×0.0046)+(肌酸酐×-3.5553)+(TG/HDL-C x0.101)+(BMI×0.0711)
在一些实施方式中,如果稳态血浆葡萄糖(SSPG)浓度处于给定人群的前三分位数,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果SSPG浓度为≥190mg/dL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果SSPG浓度为≥195mg/dL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果SSPG浓度为≥198mg/dL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果SSPG浓度为≥200mg/dL,则诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,如果SSPG浓度为≥205mg/dL,则诊断胰岛素抵抗性。
在一些实施方式中,通过本文描述的质谱法确定的胰岛素和C-肽值的组合诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,通过本文描述的质谱法确定的胰岛素和C-肽值的组合诊断胰岛素抵抗性。在一些实施方式中,通过本文描述的质谱法确定的胰岛素和C-肽值的组合和SSPG浓度诊断胰岛素抵抗性。
在一些实施方式中,确定的一种或多种离子的量被用于确定样品中胰岛素和C-肽的量。在一些实施方式中,样品中胰岛素和C-肽的量与患者的胰岛素的量相关。
在一些实施方式中,方法包括(a)使样品经受富集过程以获得胰岛素和C-肽富集的级分,(b)在适于产生通过质谱法可检测的一种或多种胰岛素和C-肽离子的条件下使富集的胰岛素和C-肽经受电离源;(c)通过质谱法确定一种或多种胰岛素和C-肽离子的量。在一些实施方式中,确定的一种或多种离子的量被用于确定样品中胰岛素和C-肽的量。在一些实施方式中,样品中胰岛素和C-肽的量与患者的胰岛素的量相关。在一些实施方式中,样品中胰岛素和C-肽的量被用于确定患者的胰岛素与C-肽的比。
在一些实施方式中,本文提供的富集过程包括使用抗体免疫捕获胰岛素和C-肽。在一些实施方式中,方法包括(a)免疫捕获胰岛素和C-肽,(b)在适于产生通过质谱法可检测的一种或多种胰岛素和C-肽离子的条件下使免疫捕获的胰岛素和C-肽经受电离源;(c)通过质谱法确定一种或多种胰岛素和C-肽离子的量。
在一些实施方式中,本文提供的免疫捕获包括使用抗-胰岛素抗体和抗-C-肽抗体。在一些实施方式中,本文提供的抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中,本文提供的抗体是小鼠单克隆抗体。在一些实施方式中,本文提供的抗体是单克隆IgG抗体。在一些实施方式中,本文提供的抗体是多克隆抗体。
在一些实施方式中,抗-胰岛素抗体和抗-C-肽抗体固定在磁珠上。在一些实施方式中,洗涤和洗脱免疫捕获在磁珠上的胰岛素和C-肽。
在一些实施方式中,本文提供的方法包括在质谱法之前,纯化样品。在一些实施方式中,方法包括使用液相色谱法纯化样品。在一些实施方式中,液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)或高湍流液相色谱法(HTLC)。在一些实施方式中,方法包括使样品经受固相提取(SPE)。
在一些实施方式中,质谱法包括串联质谱法。在一些实施方式中,质谱法是高分辨质谱法。在一些实施方式中,质谱法是高分辨/高准确度质谱法。
在一些实施方式中,电离是通过电喷雾电离(ESI)。在一些实施方式中,电离是通过大气压化学电离(APCI)。在一些实施方式中,所述电离处于正离子模式。
在一些实施方式中,本文提供的方法包括向样品添加内标。在一些实施方式中,胰岛素的内标是牛胰岛素。在一些实施方式中,C-肽的内标是C-肽重内标。在一些实施方式中,内标是标记的。在一些实施方式中,内标是氘代或同位素标记的。
在一些实施方式中,患者样品是血清样本。在一些实施方式中,患者样品是血浆样品。在一些实施方式中,患者样品是血液、唾液或尿液样品。
在一些实施方式中,电离之前,使样品经受酸性条件。在一些实施方式中,使样品经受酸性条件包括使富集的胰岛素和C-肽经受甲酸。
在一些实施方式中,质谱法之前,使样品经受碱性条件。在一些实施方式中,使样品经受碱性条件包括使样品经受缓血酸胺(trizma)。在一些实施方式中,使样品经受碱性条件包括使样品经受缓血酸胺和乙醇。
在一些实施方式中,一种或多种离子包括质荷比(m/z)为968.7±0.5的胰岛素先驱离子。在一些实施方式中,一种或多种离子包括选自m/z为136.0±0.5、226.1±0.5和345.2±0.5的离子的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中,m/z为226.1±0.5的胰岛素碎片离子是定量离子(quantifier ion)。在一些实施方式中,一种或多种离子包括质荷比(m/z)为956.8±0.5的牛胰岛素先驱离子。在一些实施方式中,一种或多种离子包括选自m/z为136.0±0.5、226.1±0.5和315.2±0.5的离子的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中,m/z为136.0±0.5的牛胰岛素碎片离子是定量离子。
在一些实施方式中,一种或多种离子包括质荷比(m/z)为1007.7±0.5的C-肽先驱离子。在一些实施方式中,一种或多种离子包括选自m/z为533.3±0.5、646.4±0.5和927.5±0.5的离子的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中,m/z为533.3±0.5、646.4±0.5和927.5±0.5或它们的总强度的任意C-肽碎片离子可以被用来进行定量。在一些实施方式中,一种或多种离子包括质荷比(m/z)为1009.5±0.5的C-肽重内标先驱离子。在一些实施方式中,一种或多种离子包括选自m/z为540.3±0.5、653.4±0.5和934.5±0.5的离子的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中,m/z为540.3±0.5、653.4±0.5和934.5±0.5或它们的总强度的任意C-肽重内标碎片离子可以被用来进行定量。
在一些实施方式中,本文提供的是利用质谱法确定样品中胰岛素和C-肽的量,方法包括:(a)通过提取技术富集样品中的胰岛素和C-肽;(b)使步骤(a)中纯化的胰岛素和C-肽经受液相色谱法,以从样品中获得胰岛素和C-肽富集的级分;(c)在适于产生通过质谱法可检测的胰岛素先驱离子的条件下,使富集的胰岛素经受电离源;以及(d)通过质谱法确定碎片离子中一种或多种的量。在一些实施方式中,确定的一种或多种离子的量被用于确定样品中胰岛素和C-肽的量。在一些实施方式中,样品中胰岛素和C-肽的量与患者的胰岛素的量相关。在一些实施方式中,样品中胰岛素和C-肽的量被用于确定患者的胰岛素与C-肽的比。
在一些实施方式中,本文提供的提取技术包括使用抗体免疫捕获胰岛素和C-肽。在一些实施方式中,本文提供的提取技术包括固相提取(SPE)。
在一些实施方式中,碰撞能量在约40至60V的范围内。在一些实施方式中,碰撞能量在约40至50V的范围内。
在另一方面中,本文提供的是通过质谱法确定样品中胰岛素或C-肽的量的方法,其包括(a)免疫捕获肽或C肽,(b)在适于产生通过质谱法可检测的一种或多种胰岛素或C-肽离子的条件下,使免疫捕获的胰岛素或C-肽经受电离源;(c)通过质谱法确定一种或多种胰岛素或C-肽离子的量。在一些实施方式中,本文提供的是通过质谱法确定样品中胰岛素的量的方法,其包括(a)免疫捕获胰岛素,(b)在适于产生通过质谱法可检测的一种或多种胰岛素离子的条件下,使免疫捕获的胰岛素经受电离源;(c)通过质谱法确定一种或多种胰岛素离子的量。在一些实施方式中,本文提供的是通过质谱法确定样品中C-肽的量的方法,其包括(a)免疫捕获C-肽,(b)在适于产生通过质谱法可检测的一种或多种C-肽离子的条件下,使免疫捕获的C-肽经受电离源;(c)通过质谱法确定一种或多种C肽离子的量。在一些实施方式中,免疫捕获包括使用抗-胰岛素抗体或抗-C-肽抗体。在一些实施方式中,抗-胰岛素抗体或抗-C-肽抗体被固定在磁珠上。在一些实施方式中,洗涤和洗脱免疫捕获在磁珠上的胰岛素或C-肽。
在另一方面中,本文提供的是诊断糖尿病和糖尿病前期患者的其他糖血紊乱(glycemic disorders)的方法。在一些实施方式中,本文提供的内源性胰岛素和C-肽的定量方法被用于诊断糖尿病。在一些实施方式中,本文提供的内源性胰岛素和C-肽的定量方法被用于区分作为低血糖的原因的分泌胰岛素的肿瘤与外源性胰岛素施用。在一些实施方式中,本文提供的内源性胰岛素和C-肽的定量方法被用于区分2型糖尿病和2型糖尿病。在一些实施方式中,本文提供的内源性胰岛素和C-肽的定量方法被用于评估糖尿病前期患者的糖尿病风险。
在一些实施方式中,质谱法包括串联质谱法。在一些实施方式中,质谱法是高分辨质谱法。在一些实施方式中,质谱法是高分辨/高准确度质谱法。
在另一方面中,本文提出的某些方法利用高分辨/高准确度质谱法确定样品中胰岛素的量。在一些利用高准确度/高分辨质谱法的实施方式中,方法包括:(a)在适于产生多倍电荷的胰岛素离子——其中胰岛素离子可由质谱法检测——的条件下,使来自样品的胰岛素经受电离源;和(b)通过高分辨/高准确度质谱法确定一种或多种多倍电荷的胰岛素离子的量。在这些实施方式中,在步骤(b)中确定的一种或多种离子的量与样品中胰岛素的量相关。在一些实施方式中,高分辨/高准确度质谱法以10,000的FWHM和50ppm的质量准确度进行。在一些实施方式中,高分辨/高准确度质谱法利用高分辨/高精密飞行时间(TOF)质谱仪进行。在一些实施方式中,电离条件包括在酸性条件下胰岛素的电离。在一些相关的实施方式中,酸性条件包括在电离之前用甲酸处理所述样品。在一些实施方式中,多倍电荷的胰岛素离子选自4+、5+和6+电荷的胰岛素离子。
在一些实施方式中,处于6+电荷态的一种或多种胰岛素离子包括m/z在约968.8±1.5的范围内的一种或多种离子。在一些实施方式中,处于6+电荷态的一种或多种胰岛素离子包括选自m/z为968.28±0.1、968.45±0.1、968.62±0.1、968.79±0.1、968.95±0.1、969.12±0.1、969.28±0.1、969.45±0.1、969.61±0.1的离子的一种或多种离子;诸如m/z为968.95±0.1的离子。
在一些实施方式中,处于5+电荷态的一种或多种胰岛素离子包括m/z在约1162.5±1.0的范围内的一种或多种离子。在一些实施方式中,处于5+电荷态的一种或多种胰岛素离子包括选自m/z为1161.72±0.1、1161.92±0.1、1162.12±0.1、1162.32±0.1、1162.52±0.1、1162.72±0.1、1162.92±0.1、1163.12±0.1、1163.32±0.1的离子的一种或多种离子;诸如m/z为1162.54±0.1的离子。
在一些实施方式中,处于4+电荷态的一种或多种胰岛素离子包括m/z在约1452.9±0.8的范围内的一种或多种离子。
在任意本文描述的方法中,样品可以包括生物样品。在一些实施方式中,生物样品可以包括生物流体,诸如尿液、血浆或血清。在一些实施方式中,生物样品可以包括来自人的样品;诸如来自成年男性或女性,或青少年男性或女性,其中青少年在18岁以下、在15岁以下、在12岁以下或在10岁以下。可以分析人样品以诊断或监测疾病状态或病症,或监测治疗疾病状态或病症的治疗功效。在一些相关实施方式中,本文描述的方法可以被用于确定当取自人时生物样品中胰岛素的量。
在利用串联质谱法的实施方式中,串联质谱法可以通过本领域中已知的任意方法进行,包括例如多反应监测、先驱离子扫描或产物离子扫描。
在一些实施方式中,串联质谱法包括将先驱离子碎裂为一种或多种碎片离子。在确定两种或更多种碎片离子的量的实施方式中,可以对量进行本领域内已知的任意数学运算,以使测量的离子量与样品中胰岛素的量相关。例如,两种或更多种碎片离子的量可以求和为确定样品中胰岛素的量的一部分。
在本文描述的任意方法中,在电离之前,可以通过高效液相色谱法(HPLC)从样品纯化感兴趣的分析物(如,胰岛素,或化学修饰或未修饰的胰岛素)。在本文描述的任意方法中,可以通过提取技术(诸如使样品经受固相提取(SPE)柱)从样品纯化感兴趣的分析物。在一些实施方式中,提取技术不是免疫纯化技术。具体而言,在一些实施方式中,SPE柱不是免疫亲和柱。在一些实施方式中,在方法的任何点处均不使用免疫纯化。在一些实施方式中;可以以在线方式进行提取技术和HPLC,从而允许自动化样品处理和分析。
在一些实施方式中,以大于或等于约10,000,诸如大于或等于约15,000、诸如大于或等于约20,000、诸如大于或等于约25,000的分辨率(FWHM)进行高分辨/高准确度质谱法。在一些实施方式中,以小于或等于约50ppm,诸如小于或等于约20ppm、诸如小于或等于约10ppm、诸如小于或等于约5ppm、诸如小于或等于约3ppm的准确度进行高分辨/高准确度质谱法。在一些实施方式中,以大于或等于约10,000的分辨率(FWHM)和小于或等于约50ppm的准确度进行高分辨/高准确度质谱法。在一些实施方式中,分辨率大于约15,000和准确度小于或等于约20ppm。在一些实施方式中,分辨率大于或等于约20,000和准确度小于或等于约10ppm;优选地,分辨率大于或等于约20,000和准确度小于或等于约5ppm,诸如小于或等于约3ppm。
在一些实施方式中,高分辨/高准确度质谱法可以利用轨道阱质谱仪、飞行时间(TOF)质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(有时称作傅里叶变换质谱仪)。
在一些实施方式中,通过高分辨/高准确度质谱法可检测的一种或多种胰岛素离子是选自m/z在约1452.9±0.8、1162.5±1和968.8±1.5的范围内的离子的一种或多种离子。这些范围内的离子分别对应带有4+、5+和6+的电荷的胰岛素离子。带有这些电荷的单同位素离子主要落入所引用的m/z范围内。然而,较低丰度的天然存在的同位素变体可以在这些范围外出现。1162.5±1的范围内的胰岛素离子优选地包括m/z为约1161.72±0.1、1161.92±0.1、1162.12±0.1、1162.32±0.1、1162.52±0.1、1162.72±0.1、1162.92±0.1、1163.12±0.1、1163.32±0.1的胰岛素离子;诸如m/z为1162.54±0.1的离子。968.8±1.5的范围内的胰岛素离子优选地包括m/z为约968.28±0.1、968.45±0.1、968.62±0.1、968.79±0.1、968.95±0.1、969.12±0.1、969.28±0.1、969.45±0.1、969.61±0.1的胰岛素离子;诸如m/z为968.95±0.1的离子。在一些实施方式中,使通过质谱法检测的一种或多种胰岛素离子的量与样品中胰岛素蛋白的量相关包括与内标的比较;诸如人或非人胰岛素蛋白。内标可以任选地是同位素标记的。
在本文提出的任意方法中,样品可以包括生物样品;优选地,体液样品,包括例如血浆或血清。
质谱法(串联或高分辨/高准确度)可以以正离子模式执行。可选地,质谱法可以以负离子模式执行。各种电离源(包括例如大气压化学电离(APCI)或电喷雾电离(ESI))可以被用于电离胰岛素。在一些实施方式中,胰岛素和/或化学修饰的或未修饰的胰岛素B链以正离子模式通过ESI进行电离。
在本文提出的任意方法中,可以在样品中提供可单独检测的内标,其量也在样品中确定。在利用可单独检测的内标的实施方式中,样品中存在的全部或部分感兴趣的分析物和内标都被电离,从而产生在质谱仪中可检测的多种离子,并且通过质谱法检测由每个产生的一种或多种离子。在这些实施方式中,通过与检测的内标离子的量进行比较,可以使由感兴趣的分析物产生的离子的存在或量与样品中感兴趣的分析物的量的存在相关。
可选地,可以通过与一种或多种外部参考标准品进行比较确定样品中胰岛素的量。示例性外部参考标准品包括掺加(spiked with)人或非人胰岛素、合成胰岛素类似物或其同位素标记的变体的空白血浆或血清。
在一些实施方式中,方法能够以约10μIU/mL至500μIU/mL的范围内的水平确定样品中胰岛素的量。
上面描述的本发明的发明内容是非限制性的,并且根据下面的发明详述和权利要求,本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
附图说明
图1A-1C显示了在胰岛素或C-肽水平前四分位数的那些与不在前四分位数的那些的优势比(odds ratio)。优势比来自针对年龄、性别、空腹血糖、胰岛素、C-肽、HDL-C、LDL-C、甘油三酯、肌酸酐、丙氨酸转氨酶、身体质量指数、收缩压和舒张压调整的模型。
图2显示了空腹血糖<90mg/dL(左)、空腹血糖在90至<100mg/dL(中)和空腹血糖在100至125mg/dL(右)的患者的空腹胰岛素水平的框线图。通过参数(ANOVA)和非参数(Kruksal-Wallis)方法评估类别之间的胰岛素水平的差异。
图3显示了血糖正常参与者(空腹血糖<100mg/dL)的空腹胰岛素水平的框线图,左:BMI<26;右:BMI≥26。通过t检验评估类别之间的胰岛素水平的差异。
图4显示了空腹血糖测量值与空腹胰岛素水平之间的关系。
图5显示了空腹血糖测量值与空腹C-肽水平之间的关系。
图6显示了根据BMI类别、性别和空腹血糖的胰岛素水平。
图7显示了本文提出的方法的概述。
图8显示了完整胰岛素碎裂和所测量的离子的质荷比。
图9显示了C-肽碎裂和所测量的离子的质荷比。
图10显示了胰岛素和C-肽色谱法。
图11显示了胰岛素和C-肽标准曲线。
图12显示了对照与针对肽含量进行调整的校准物(calibrator)的准确度。
图13显示了本文提出的方法与Beckman测定的胰岛素相关性(n=117)。
图14显示了本文提出的方法与Centaur ICMA测定的C-肽相关性(n=121)。
图15显示了Centaur ICMA中的C-肽校准物。
图16显示了针对胰岛素的验证结果的概述。
图17显示了针对C-肽的验证结果的概述。
图18显示了肌酸酐和C-肽之间的关系。
图19显示了基于胰岛素和C-肽水平的样品胰岛素抵抗性评分。
具体实施方式
如本文所使用的,除非另外陈述,否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因而,例如,提及“蛋白”包括多个蛋白分子。
如本文所使用的,术语“纯化(purification)”、“纯化(purifying)”、和“富集”不是指从样品去除除感兴趣的分析物(一种或多种)之外的所有材料。相反,这些术语指的是相对于样品中可能干扰感兴趣的分析物的检测的其它组分富集一种或多种感兴趣的分析物的量的过程。通过各种方式对样品进行纯化可以允许一种或多种干扰物质的相对减少,例如,一种或多种可能干扰或不干扰通过质谱法检测所选的母离子或子离子的物质。当使用该术语时,相对减少不需要通过纯化将与待纯化的材料中的感兴趣的分析物一起存在的任何物质完全去除。
如本文所使用的,术语“免疫纯化(immunopurification、immunopurify)”是指利用包括多克隆或单克隆抗体在内的抗体来富集一种或多种感兴趣的分析物的纯化过程。免疫纯化可以使用本领域内熟知的任何免疫纯化方法进行。通常,免疫纯化过程利用结合、缀合或以其他方式附加至固体支持体的抗体,固体支持体例如是柱、孔、管、凝胶、胶囊、颗粒等。本文所用的免疫纯化包括但不限于:本领域通常称为免疫沉淀的过程,以及本领域通常称为亲和色谱法或免疫亲和色谱法的过程。
如本文所使用的,术语“免疫颗粒”是指具有结合、缀合或以其他方式附加至其表面(在颗粒上和/或颗粒中)的抗体的胶囊、珠、凝胶颗粒等。在某些优选实施方式中,免疫颗粒是琼脂糖凝胶(sepharose)或琼脂糖珠。在可选的优选实施方式中,免疫颗粒包括玻璃、塑料或二氧化硅珠或硅胶。
如本文所使用的,术语“抗-胰岛素抗体”是指对胰岛素具有亲和力的任何多克隆或单克隆抗体。在各种实施方式中,胰岛素抗体对除胰岛素以外的化学种类的特异性可以变化;例如,在某些优选实施方式中,抗-胰岛素抗体对胰岛素具有特异性,并因此对除胰岛素以外的化学种类具有很少或没有亲和力,而在其他优选实施方式中,抗-胰岛素抗体是非特异性的,并因此与除胰岛素以外的某些化学种类结合。
如本文所使用的,术语“样品”是指可包含感兴趣的分析物的任何样品。如本文所用,术语“体液”意思是可以从个体的身体分离的任何流体。例如,“体液”可包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、眼泪、汗液等。在优选实施方式中,样品包括来自人的体液样品;优选地血浆或血清。
如本文所使用的,术语“固相提取”或“SPE”指的是由于溶解或悬浮于溶液(即,流动相)的组分对溶液穿过或围绕的固体(即,固相)的亲和力,化学混合物分离为组分的过程。在一些情况下,在流动相穿过或围绕固相时,固相可以保留流动相的非期望的组分,其导致纯化流动相中的分析物。在其它情况下,固相可以保留分析物,其允许流动相的非期望的组分穿过或围绕固相。在这些情况下,然后使用第二流动相将保留的分析物从固相洗脱下来,用于进一步的处理或分析。SPE——包括TFLC——可以经由单一或混合模式机制操作。混合模式机制利用相同柱中的离子交换和疏水保留;例如,混合模式SPE柱的固相可展示出强的阴离子交换和疏水保留;或可以展示出强的阳离子交换和疏水保留。
通常,SPE柱填充材料对分析物的亲和力可能由于各种机制中的任一种,比如一种或多种化学相互作用或免疫亲和相互作用。在一些实施方式中,在不使用免疫亲和柱填充材料的情况下实施胰岛素的SPE。即,在一些实施方式中,通过不是免疫亲和柱的SPE柱从样品纯化胰岛素。
如本文所使用的,术语“色谱法”指的是这样的方法,其中由于化学实体围绕固定的液相或固相流动或在其上流动时它们的差别分配,将由液体或气体携带的化学混合物分离为组分。
如本文所使用的,术语“液相色谱法”或“LC”意思是当流体均匀地渗滤通过细分物质的柱或通过毛细通道时,选择性地阻滞流体溶液的一种或多种组分的方法。阻滞源于当体相流体(bulk fluid)(即,流动相)相对于固定相(一种或多种)移动时,混合物的组分在一种或多种固定相和该流体之间的分配。“液相色谱法”的实例包括反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)和湍流液相色谱法(TFLC)(有时也称为高湍流液相色谱法(HTLC)或高通量液相色谱法)。
如本文所使用的,术语“高效液相色谱法”或“HPLC”(有时称为“高压液相色谱法”)指的是通过在压力下迫使流动相通过固定相——通常是致密填充柱——来增加分离程度的液相色谱法。
如本文所使用的,术语“湍流液相色谱法”或“TFLC”(有时被称为高湍流液相色谱法或高通量液相色谱法)指的是利用通过柱填充物被测定的材料的湍流作为进行分离的基础的色谱法形式。TFLC已经被应用于在通过质谱法分析之前制备包含两种不知名药物的样品。参见,如,Zimmer et al.,J Chromatogr A 854:23-35(1999);还参见美国专利号5,968,367、5,919,368、5,795,469和5,772,874,其进一步解释了HTLC。本领域普通技术人员理解“湍流”。当流体缓慢地和平稳地流动时,流动被称为“层流”。例如,以低流速移动通过HPLC柱的流体是层状的。在层流中,流体颗粒的运动是有序的,其中颗粒一般以大体直线移动。在较快的速度下,水的惯性克服流体摩擦力并产生湍流。未接触不规则边界的流体“超过”由于摩擦减慢或由于不平表面偏转的流体。当流体湍急地流动时,其以涡流和旋转(或漩涡)流动,其具有比流动是层状时更大的“阻力”。许多参考文献可用于帮助确定流体流动何时是层流或湍流(如,Turbulent Flow Analysis: Measurement and Prediction,P.S.Bernard&J.M.Wallace,John Wiley&Sons,Inc.,(2000);An Introduction to Turbulent Flow,Jean Mathieu&Julian Scott,Cambridge University Press(2001))。
如本文所使用的,术语“气相色谱法”或“GC”指的是如下色谱法:其中样品混合物被汽化并注入移动通过柱——其包含由液体或微粒固体组成的固定相——的运载气体流(如氮气或氦气),并且根据化合物对固定相的亲和力分离为其组分化合物。
如本文所使用的,术语“大颗粒柱”或“提取柱”指的是包含大于约50μm的平均粒径的色谱柱。如在此上下文中使用的,术语“约”意思是±10%。
如本文所使用的,术语“分析柱”指的是如下色谱柱:其具有足够的色谱板以实现从柱洗脱的样品中分离材料,所述分离足以允许确定分析物的存在或量。这样的柱通常区别于“提取柱”,所述“提取柱”具有从非保留的材料分离或提取保留的材料以便获得纯化的样品用于进一步分析的一般目的。如在此上下文中使用的,术语“约”意思是±10%。在优选的实施方式中,分析柱包含直径约5μm的颗粒
如本文所使用的,术语“在线(on-line)”和“线上(inline)”,例如,如在“在线自动化方式”或“在线提取”中使用的,指的是在不需要操作者介入的情况下进行的过程。相反,如本文使用的术语“离线(off-line)”指的是需要操作者手动介入的过程。因而,如果样品经受沉淀,并且上清液然后被手动装载入自动进样器,则沉淀和装载步骤与后续步骤是离线的。在方法的多个实施方式中,一个或多个步骤可以以在线自动化方式进行。
如本文所使用,术语“质谱法”或“MS”指的是通过它们的质量鉴定化合物的分析技术。MS指的是基于它们的质荷比或“m/z”来过滤、检测和测量离子的方法。MS技术一般包括(1)电离化合物以形成带电的化合物;和(2)检测带电化合物的分子量并计算它们的质荷比。化合物可以通过任何适合的手段电离和检测。“质谱仪”一般包括电离源、质量分析仪和离子检测器。通常地,一种或多种感兴趣的分子被电离,并且随后离子被引入质谱仪器,在这里由于磁场和电场的组合,离子沿着空间中依赖于质量(“m”)和电荷(“z”)的路径前进。参见如,名称为“Mass Spectrometry From Surfaces”的美国专利序号6,204,500;名称为“Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry”的6,107,623;名称为“DNADiagnostics Based On Mass Spectrometry”的6,268,144;名称为“Surface-EnhancedPhotolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes”的6,124,137;Wright et al.,Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999,2:264-76;和Merchant and Weinberger,Electrophoresis 2000,21:1164-67。
如本文所使用的,“高分辨/高准确度质谱法”指的是使用质量分析器——其能够以足够的精确度和准确度测量带电种类的质荷比以确认独特的化学离子——实施的质谱法。当来自离子的个体同位素峰可容易地分辨时,对该离子确认独特的化学离子是可能的。确认独特的化学离子需要的具体的分辨率和质量准确度随着离子的质量和电荷状态而变化。
如本文所使用的,术语“分辨率”或“分辨率(FWHM)”(本领域也称为“m/Δm50%”)指的是观察到的质荷比除以在50%最大高度处质量峰的宽度(半峰全宽,“FWHM”)。
如本文所使用的,关于质谱法的“独特的化学离子”指的是具有单个原子组成的单个离子。单个离子可以是单电荷的或多倍电荷的。
如本文所使用的,关于质谱法的术语“准确度”(或“质量准确度”)指的是仪器响应与调查的离子的真实m/z的潜在偏差。通常以百万分之一(ppm)表示准确度。
本发明的高分辨/高准确度质谱法可以在能够以大于10,000、15,000、20,000、25,000、50,000、100,000或甚至更大的FWHM进行质量分析的仪器上实施。同样,本发明的方法可以在能够以小于50ppm、20ppm、15ppm、10ppm、5ppm、3ppm或甚至更小的准确度进行质量分析的仪器上实施。能够具有这些性能特性的仪器可以包含某些轨道阱质量分析器、飞行时间(“TOF”)质量分析器或傅里叶变换离子回旋共振质量分析器。在优选的实施方式中,使用包括轨道阱质量分析器或TOF质量分析器的仪器进行方法。
术语“轨道阱”描述了由外部桶形电极和同轴内部电极构成的离子阱。离子切线地注入电极之间的电场,并且在离子围绕同轴内部电极运行时,离子因为离子和电极之间的静电相互作用被离心力平衡而被捕获。在离子围绕同轴内部电极运行时,捕获的离子的轨迹沿着中心电极的轴以相对于离子的质荷比的谐振频率振荡。检测轨道振荡频率允许轨道阱被用作具有高准确度(低至1-2ppm)和高分辨率(FWHM)(高至约200,000)的质量分析器。基于轨道阱的质量分析器在美国专利号6,995,364中详细描述,其通过引用以其整体并入本文。
如本文所使用的,术语“以负离子模式操作”指的是产生和检测负离子的那些质谱法。如本文中所使用,术语“以正离子模式操作”指的是产生和检测正离子的那些质谱法。在优选的实施方式中,质谱法以正离子模式进行。
如本文所使用的,术语“电离(ionization、ionizing)”指的是产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的方法。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的那些离子,而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的那些离子。
如本文所使用的,术语“电子电离”或“EI”指的是其中气态或蒸汽相中的感兴趣的分析物与电子流相互作用的方法。电子与分析物的撞击产生分析物离子,然后可以使其经受质谱法技术。
如本文所使用的,术语“化学电离”或“CI”指的是其中使反应物气体(如氨)经受电子撞击,并通过反应物气体离子与分析物分子的相互作用形成分析物离子的方法。
如本文所使用的,术语“快原子轰击”或“FAB”指的是其中高能原子束(通常为Xe或Ar)撞击非易挥发的样品,解吸并电离样品中包含的分子的方法。测试样品被溶解在粘性液体基质中,诸如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝苯基辛基醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。对于化合物或样品的合适基质的选择是经验方法。
如本文所使用的,术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”指的是其中将非易挥发性样品暴露至激光照射的方法,其通过各种电离途径解吸并电离样品中的分析物,所述电离途径包括光致电离、质子化、脱质子化和簇衰变(cluster decay)。对于MALDI,使样品与能量吸收基质混合,这促进分析物分子的解吸。
如本文所使用的,术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”指的是其中将非易挥发性样品暴露至激光照射的另一种方法,其通过各种电离途径解吸并电离样品中的分析物,所述电离途径包括光致电离、质子化、脱质子化和簇衰变。对于SELDI,样品通常被结合至优先地保留一种或多种感兴趣的分析物的表面。如在MALDI中一样,该方法也可以采用能量吸收材料来促进电离。
如本文所使用的,术语“电喷雾电离”或“ESI”指的是其中使溶液沿短长度的毛细管——向其末端施加高正电势或负电势——穿过的方法。到达管的末端的溶液在溶剂蒸汽中被汽化(雾化)为溶液的非常小的液滴的射流或喷雾。该液滴的雾流动通过蒸发室。随着液滴变小,表面电荷密度增加,直到相同电荷之间的自然斥力使得离子以及中性分子被释放的这类时刻。
如本文所使用的,术语“大气压化学电离”或“APCI”指的是类似于ESI的质谱法;然而,APCI通过在大气压下等离子体内发生的离子-分子反应产生离子。通过在喷雾毛细管和对电极之间放电保持等离子体。通常通过使用一组差别泵送的撇取器站(differentiallypumped skimmer stages)将离子提取入质量分析仪。干燥和预加热的N2气的逆流可以被用于提高溶剂的移除。对于分析较少极性的种类,APCI中的气相电离可以比ESI更有效。
如本文所使用的,术语“大气压光致电离”或“APPI”指的是如此形式的质谱法,其中分子M的电离机制是光子吸附和电子喷射以形成分子离子M+。因为光子能量通常刚好在电离势以上,所以分子离子较不易于离解。在许多情况中,分析样品而不需要色谱法是可能的,因此节约显著的时间和费用。在水蒸气或质子溶剂存在的情况中,分子离子可以提取H以形成MH+。如果M具有高质子亲和力,则这倾向于发生。因为M+和MH+的和是恒定的,因此这不影响定量准确度。在质子溶剂中的药物化合物通常观察为MH+,而非极性化合物诸如萘或睾酮通常形成M+。参见如,Robb et al.,Anal.Chem.2000,72(15):3653-3659。
如本文所使用的,术语“电感耦合等离子体”或“ICP”指的是其中在足够高的温度下使样品与部分电离的气体相互作用,使得大部分元素被原子化和电离的方法。
如本文所使用的,术语“场解吸”指的是其中将非易挥发性测试样品放置在电离表面并使用强电场产生分析物离子的方法。
如本文所使用的,术语“解吸”指的是从表面移出分析物和/或分析物进入气相。激光解吸热解吸是如下技术:其中通过激光脉冲将包含分析物的样品热解吸入气相。激光击中具有金属基底的特制的96孔板的背面。激光脉冲加热基底并且热引起样品转移入气相。气相样品然后被吸入质谱仪。
如本文所使用的,术语“选择性离子监测”是质谱仪器的检测模式,其中仅检测相对窄的质量范围内——通常约一个质量单位——的离子。
如本文所使用的,“多反应模式”——有时称为“选择的反应监测”——是质谱仪器的检测模式,其中选择性地检测先驱离子和一种或多种碎片离子。
如本文所使用的,术语“量化下限”、“定量下限”或“LLOQ”指的是测量变得数量上有意义的点。在此LOQ处的分析物反应是可鉴定的、离散的和可再现的,其具有小于20%的相对标准偏差(RSD%)和85%至115%的准确度。
如本文所使用的,术语“检测限”或“LOD”是测量值大于与其相关联的不确定性的点。LOD是值超过与其测量相关联的不确定性的点,并且被定义为零浓度下平均值的RSD的3倍。
如本文所使用的,体液样品中分析物的“量”通常指的是反映在样品的体积中可检测的分析物的质量的绝对值。然而,量也考虑与另一种分析物量比较的相对量。例如,样品中分析物的量可以是大于对照或在样品中正常存在的分析物的正常水平的量。
如本文关于定量测量——不包括离子质量的测量——使用的术语“约”指的是指示的值加或减10%。在确定给定的分析物的质量中,质谱仪器可以轻微地变化。在离子的质量或离子的质/荷比的上下文中的术语“约”指的是+/-0.50个原子质量单位。
血清中胰岛素的确定主要地用于在胰岛素抵抗性综合征的评估中诊断糖尿病和糖尿病前期患者中的糖血紊乱。C肽是如下肽:其连接胰岛素的2个肽链和在处理期间从胰岛素原释放并且随后从胰岛β细胞共分泌。由于半衰期和肝清除率的差异,C肽和胰岛素的外周血水平不再是等克分子的,但是保持高度相关性。在本实施方式中,本文提供的方法测量内源性胰岛素和C肽,其用于区分(1)作为低血糖的原因的分泌胰岛素的肿瘤与外源性胰岛素施用和(2)1型糖尿病与2型糖尿病。
在一个方面中,本文提供的是通过使用质谱法确定样品中胰岛素和C-肽的量测量患者中胰岛素水平的方法。在一些实施方式中,本文提供的方法包括通过质谱法同时测量样品中胰岛素和C-肽的量的多重测定。在一些实施方式中,方法包括(a)在适于产生通过质谱法可检测的一种或多种胰岛素和C-肽离子的条件下使来自样品的胰岛素和C-肽经受电离源;和(b)通过质谱法确定一种或多种胰岛素和C-肽的量。在一些实施方式中,确定的一种或多种离子的量被用于确定样品中胰岛素和C-肽的量。在一些实施方式中,样品中胰岛素和C-肽的量与患者的胰岛素的量相关。在一些实施方式中,样品中胰岛素和C-肽的量被用于确定患者的胰岛素与C-肽的比。
在一些实施方式中,方法包括(a)使样品经受富集过程以获得胰岛素和C-肽富集的级分,(b)在适于产生通过质谱法可检测的一种或多种胰岛素和C-肽离子的条件下使富集的胰岛素和C-肽经受电离源;(c)通过质谱法确定一种或多种胰岛素和C-肽离子的量。在一些实施方式中,确定的一种或多种离子的量被用于确定样品中胰岛素和C-肽的量。在一些实施方式中,样品中胰岛素和C-肽的量与患者的胰岛素的量相关。在一些实施方式中,样品中胰岛素和C-肽的量被用于确定患者的胰岛素与C-肽的比。在一些实施方式中,本文提供的富集过程包括使用抗体免疫捕获胰岛素和C-肽。在一些实施方式中,方法包括(a)免疫捕获胰岛素和C-肽,(b)在适于产生通过质谱法可检测的一种或多种胰岛素和C-肽离子的条件下使免疫捕获的胰岛素和C-肽经受电离源;(c)通过质谱法确定一种或多种胰岛素和C-肽离子的量。在一些实施方式中,本文提供的免疫捕获包括使用抗-胰岛素抗体和抗-C-肽抗体。在一些实施方式中,本文提供的抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中,本文提供的抗体是小鼠单克隆抗体。在一些实施方式中,本文提供的抗体是单克隆IgG抗体。在一些实施方式中,本文提供的抗体是多克隆抗体。在一些实施方式中,抗-胰岛素抗体和抗-C-肽抗体被固定在磁珠上。在一些实施方式中,洗涤和洗脱免疫捕获在磁珠上的胰岛素和C-肽。
在一些实施方式中,本文提供的方法包括在质谱法之前,纯化样品。在一些实施方式中,方法包括使用液相色谱法纯化样品。在一些实施方式中,液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)或高湍流液相色谱法(HTLC)。在一些实施方式中,方法包括使样品经受固相提取(SPE)。
在一些实施方式中,质谱法包括串联质谱法。在一些实施方式中,质谱法是高分辨质谱法。在一些实施方式中,质谱法是高分辨/高准确度质谱法。在一些实施方式中,电离是通过电喷雾电离(ESI)。在一些实施方式中,电离是通过大气压化学电离(APCI)。在一些实施方式中,所述电离处于正离子模式。
在一些实施方式中,本文提供的方法包括向样品添加内标。在一些实施方式中,胰岛素的内标是牛胰岛素。在一些实施方式中,C-肽的内标是C-肽重内标。在一些实施方式中,内标是标记的。在一些实施方式中,内标是氘代或同位素标记的。
在一些实施方式中,患者样品是血清样本。在一些实施方式中,患者样品是血浆样品。在一些实施方式中,患者样品是血液、唾液或尿液样品。
在一些实施方式中,在电离之前,使样品经受酸性条件。在一些实施方式中,使样品经受酸性条件包括使富集的胰岛素和C-肽经受甲酸。在一些实施方式中,在之前,使样品经受碱性条件。在一些实施方式中,使样品经受碱性条件包括使样品经受缓血酸胺。在一些实施方式中,使样品经受碱性条件包括使样品经受缓血酸胺和乙醇。
在一些实施方式中,一种或多种离子包括质荷比(m/z)为968.7±0.5的胰岛素先驱离子。在一些实施方式中,一种或多种离子包括选自m/z为136.0±0.5、226.1±0.5和345.2±0.5的离子的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中,m/z为226.1±0.5的胰岛素碎片离子是定量离子。在一些实施方式中,一种或多种离子包括质荷比(m/z)为956.8±0.5的牛胰岛素先驱离子。在一些实施方式中,一种或多种离子包括选自m/z为136.0±0.5、226.1±0.5和315.2±0.5的离子的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中,m/z为136.0±0.5的牛胰岛素碎片离子是定量离子。在一些实施方式中,一种或多种离子包括质荷比(m/z)为1007.7±0.5的C肽先驱离子。在一些实施方式中,一种或多种离子包括选自m/z为533.3±0.5、646.4±0.5和927.5±0.5的离子的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中,m/z为533.3±0.5、646.4±0.5和927.5±0.5的任何C肽碎片离子可以被用作定量离子。在一些实施方式中,一种或多种离子包括质荷比(m/z)为1009.5±0.5的C肽重内标先驱离子。在一些实施方式中,一种或多种离子包括选自m/z为540.3±0.5、653.4±0.5和934.5±0.5的离子的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中,m/z为540.3±0.5、653.4±0.5和934.5±0.5的任何C肽重内标碎片离子可以被用作定量离子。
在一些实施方式中,本文提供了利用质谱法确定样品中胰岛素和C肽的量,方法包括:(a)通过提取技术富集样品中的胰岛素和C肽;(b)使来自步骤(a)的纯化的胰岛素和C肽经受液相色谱法以获得来自样品的富集的胰岛素和C肽的级分;(c)在适合生成通过质谱法可检测的胰岛素先驱离子的条件下,使富集的胰岛素经受电离源;和(d)通过质谱法确定碎片离子中的一种或多种的量。在一些实施方式中,确定的一种或多种离子的量被用于确定样品中胰岛素和C肽的量。在一些实施方式中,样品中胰岛素和C肽的量与患者中胰岛素的量相关。在一些实施方式中,样品中胰岛素和C肽的量被用于确定患者中胰岛素与C肽的比。在一些实施方式中,本文提供的提取技术包括使用抗体免疫捕获胰岛素和C肽。在一些实施方式中,本文提供的提取技术包括固相提取(SPE)。
在一些实施方式中,碰撞能量在约40至60eV的范围内。在一些实施方式中,碰撞能量在约40至50eV的范围内。
在另一方面中,本文提供了通过质谱法确定样品中胰岛素或C肽的量的方法,其包括(a)免疫捕获胰岛素或C肽;(b)在适合生成通过质谱法可检测的一种或多种胰岛素或C肽离子的条件下,使免疫捕获的胰岛素或C肽经受电离源;(c)通过质谱法确定一种或多种胰岛素或C肽离子的量。在一些实施方式中,本文提供了通过质谱法确定样品中胰岛素的量的方法,其包括(a)免疫捕获胰岛素;(b)在适合生成通过质谱法可检测的一种或多种胰岛素离子的条件下,使免疫捕获的胰岛素经受电离源;(c)通过质谱法测定一种或多种胰岛素离子的量。在一些实施方式中,本文提供了通过质谱法确定样品中C肽的量的方法,其包括(a)免疫捕获C肽;(b)在适合生成通过质谱法可检测的一种或多种C肽离子的条件下,使免疫捕获的C肽经受电离源;(c)通过质谱法确定一种或多种C肽离子的量。在一些实施方式中,免疫捕获包括使用抗胰岛素抗体或抗C肽抗体。在一些实施方式中,抗胰岛素抗体或抗C肽抗体被固定在磁珠上。在一些实施方式中,洗涤和洗脱在磁珠上免疫捕获的胰岛素或C肽。
在另一方面中,本文提供了用于诊断糖尿病和糖尿病前期患者中的糖血紊乱或胰岛素抵抗性综合征的方法。在一些实施方式中,本文提供的定量内源性胰岛素和C肽的方法被用于诊断糖尿病。在一些实施方式中,本文提供的定量内源性胰岛素和C肽的方法被用于区分作为低血糖的原因的分泌胰岛素的肿瘤与外源性胰岛素施用。在一些实施方式中,本文提供的定量内源性胰岛素和C肽的方法被用于区分1型糖尿病与2型糖尿病。在一些实施方式中,本文提供的定量内源性胰岛素和C肽的方法被用于评估糖尿病前期患者中糖尿病的风险。
用于本发明的方法的合适的测试样品包括可包含感兴趣的分析物的任何测试样品。在一些优选的实施方式中,样品是生物样品;即,从任何生物来源比如动物、细胞培养物或器官培养物等获得的样品。在某些优选的实施方式中,从哺乳动物比如狗、猫、马等获得样品。特别优选的哺乳动物是灵长类,最优选地,男人或女人。优选的样品包括体液,比如血液、血浆、血清、唾液、脑脊液或组织样品;优选地,血浆和血清。这样的样品可以获得自例如患者;即,自身处于用于诊断、预后或治疗疾病或病症的临床环境的活人——男性或女性。在样品包括生物样品的实施方式中,当样品获得自生物来源时,方法可以被用于确定样品中胰岛素的量。
本发明还考虑用于胰岛素定量测定的试剂盒。用于胰岛素定量测定的试剂盒可以包括含有本文提供的组合物的试剂盒。例如,试剂盒可以包括包装材料和测量量的同位素标记的内标,所述量足以进行至少一次测定。通常,试剂盒还将包括以有形形式记录(例如,包含在纸或电子媒介上)的将包装的试剂用于胰岛素定量测定的说明书。
用于本发明的实施方式的校准和QC库(pool)优选地使用与预期样品基质类似的基质制备,条件是实质上不存在胰岛素。
用于质谱分析的样品制备
在质谱分析的准备中,通过本领域已知的多种方法,可以相对于样品中的一种或多种其它组分富集胰岛素,所述方法包括例如免疫捕获、液相色谱法、过滤、离心、薄层色谱(TLC)、电泳(包括毛细管电泳)、亲和分离(包括免疫亲和分离)、提取方法(包括乙酸乙酯或甲醇提取)、和使用离液剂或上面的任意组合等。
可以在质谱法之前使用的一种样品纯化方法是在如下条件下将样品施加至固相提取(SPE)柱:通过柱填充材料可逆地保留感兴趣的分析物,而不保留一种或多种其它材料。在此技术中,可以采用通过柱保留感兴趣的分析物的第一流动相条件,并且随后在洗涤掉(wash through)非保留的材料后可以采用第二流动相条件以从柱移出保留的材料。
在一些实施方式中,样品中的胰岛素可以被可逆地保留在具有填充材料——其包括烷基结合表面——的SPE柱上。例如,在一些实施方式中,在质谱分析之前,C-8在线SPE柱(比如来自Phenomenex,Inc.的Oasis HLB在线SPE柱/盒(2.1mm×20mm)或等效物)可以被用于富集胰岛素。在一些实施方式中,使用HPLC级0.2%水性甲酸作为洗涤液和使用乙腈中的0.2%甲酸作为洗脱液实施SPE柱的使用。
在其它实施方式中,方法包括在质谱分析之前免疫纯化胰岛素。可以使用本领域熟知的任何免疫纯化方法进行免疫纯化步骤。通常,免疫纯化过程利用结合、缀合、固定或以其它方式附加至固体支持体——例如柱、孔、管、胶囊、颗粒等——的抗体。通常,免疫纯化方法包含(1)将包含感兴趣的分析物的样品与抗体一起培育,以便分析物结合至抗体,(2)进行一个或多个洗涤步骤,和(3)从抗体洗脱分析物。
在某些实施方式中,使用在溶液中游离的抗体进行免疫纯化的培育步骤,并且抗体随后在洗涤步骤之前被结合或附加至固体表面。在某些实施方式中,这可以使用为抗胰岛素抗体的一次抗体和附加至固体表面的二次抗体——其对一次抗胰岛素抗体具有亲和力——实现。在可选的实施方式中,在培育步骤之前,将一次抗体结合至固体表面。
适当的固体支持体非限制性地包括管、载玻片、柱、珠、胶囊、颗粒、凝胶等。在一些优选的实施方式中,固体支持体是多孔板,比如,例如,96孔板、384孔板等。在一些实施方式中,固体支持体是琼脂糖凝胶或琼脂糖珠或凝胶。存在众多本领域熟知的方法,通过其抗体(例如,胰岛素抗体或二次抗体)可以被结合、附加、固定或偶联至固体支持体,例如,共价或非共价键吸附、亲和结合、离子键等。在一些实施方式中,使用CNBr偶联抗体,例如抗体可以被偶联至CNBr活化的琼脂糖凝胶。在其它实施方式中,抗体通过抗体结合蛋白比如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L被附加至固体支持体。
免疫纯化方法的洗涤步骤通常包含洗涤固体支持体,以便胰岛素保持结合至固体支持体上的抗-胰岛素抗体。免疫纯化的洗脱步骤通常包含添加破坏胰岛素与抗-胰岛素抗体的结合的溶液。示例性洗脱液包括有机溶液、盐溶液、和高或低pH溶液。
可以在质谱法之前使用的另一种样品纯化方法是液相色谱法(LC)。在液相色谱技术中,可以通过在流动相条件下将样品施加至色谱分析柱来纯化分析物,其中在与一种或多种其它材料相比,感兴趣的分析物在差异的速率下洗脱。这样的过程可以相对于样品的一种或多种其它组分富集一种或多种感兴趣的分析物的量。
某些液相色谱方法——包括HPLC——依赖于相对缓慢的层流技术。传统的HPLC分析依赖于柱填充物,其中通过柱的样品的层流是从样品分离感兴趣的分析物的基础。技术人员将理解这样的柱中的分离是分配过程并且可以选择适合与C肽一起使用的LC——包括HPLC、仪器和柱。色谱分析柱通常包括促进化学部分的分离(即,分级)的介质(即,填充材料)。介质可以包括微小的颗粒。颗粒通常包括与多种化学部分相互作用以促进化学部分分离的结合表面。一种适合的结合表面是疏水性结合表面,比如烷基结合或氰基结合表面。烷基结合表面可以包括C-4、C-8、C-12或C-18结合的烷基。在一些实施方式中,色谱分析柱是整体C-18柱。色谱分析柱包括接收样品的入口和排出包括分级样品的流出物的出口。样品可以被直接地供给至入口,或从SPE柱比如在线SPE柱或TFLC柱供给。在一些实施方式中,可以在SPE柱和/或HPLC柱之前使用在线过滤器以在样品到达SPE和/或TFLC和/或HPLC柱之前去除样品中的微粒和磷脂。
在一个实施方式中,样品可以在入口处施加至LC柱,使用溶剂或溶剂混合物洗脱,并且在出口处排出。可以选择不同溶剂模式用于洗脱感兴趣的分析物(一种或多种)。例如,可以使用梯度模式、等度模式、或多型(即混合)模式进行液相色谱法。在色谱法期间,材料的分离通过下述变量实现,比如洗脱剂(也称为“流动相”)的选择、洗脱模式、梯度条件、温度等。
在一些实施方式中,使用HPLC富集样品中的胰岛素。可以使用整体C-18柱色谱系统——例如,来自Phenomenex Inc.的Onyx整体C-18柱(50×2.0mm)或等效物——实施该HPLC。在某些实施方式中,使用HPLC级0.2%水性甲酸作为溶剂A和乙腈中的0.2%甲酸作为溶剂B进行HPLC。
通过仔细选择阀和连接器管道(plumbing),可以根据需要连接两个或更多个色谱柱,以便材料从一个传至下一个,而不需要任何手动步骤。在优选的实施方式中,通过预编程以执行必需步骤的计算机控制阀和管道的选择。最优选地,色谱系统还以这样的在线方式被连接至检测器系统,例如,MS系统。因而,操作者可以将样品托盘放置在自动进样器中,并且在计算机控制下进行其余的操作,其导致纯化和分析选择的所有样品。
在一些实施方式中,TFLC可以被用于在质谱法之前纯化胰岛素。在这样的实施方式中,可以使用捕获分析物的TFLC柱提取样品。分析物然后被洗脱和在线转移至分析HPLC柱。例如,可以使用具有大粒径(50μm)填充物的TFLC提取盒完成样品提取。然后在质谱法之前,从此柱洗脱下的样品可以被在线转移至HPLC分析柱上用于进一步的纯化。因为可以以自动化方式连接涉及这些色谱程序的步骤,所以可以最小化在分析物的纯化期间对操作者参与的需要。此特征可以导致节省时间和成本,并且消除操作者误差的机会。
在一些实施方式中,上面的纯化技术中的一种或多种可以被并行地用于纯化胰岛素以允许同时处理多个样品。在一些实施方式中,采用的纯化技术不包括免疫纯化技术,比如免疫亲和色谱法。
通过质谱法检测和定量胰岛素
使用质谱仪——其包括用于电离分级样品和产生带电分子用于进一步分析的离子源——进行质谱法。在多个实施方式中,可以通过技术人员已知的任何方法电离胰岛素。例如,可以通过电子电离、化学电离、电喷雾电离(ESI)、质子电离、大气压化学电离(APCI)、光致电离、大气压光致电离(APPI)、激光二极管热解吸(LDTD)、快原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离进行胰岛素的电离。技术人员将理解可以基于待测量的分析物、样品的类型、检测器的类型、正对负模式的选择等确定电离方法的选择,可以以正或负模式电离胰岛素。在优选的实施方式中,以正离子模式通过ESI电离胰岛素。
通常在质谱技术中,在样品已经被电离后,可以分析由此产生的带正电或负电的离子以确定质荷比(m/z)。用于确定m/z的多种分析器包括四极杆分析器、离子阱分析器、飞行时间分析器、傅里叶变换离子回旋共振质量分析器和轨道阱分析器。在Bartolucci,etal.,Rapid Commun.Mass Spectrom.2000,14:967-73中描述了一些示例性离子阱方法。
可以使用数种检测模式检测离子。例如,即,可以使用选择性离子监测模式(SIM)检测选择的离子,或可选地,可以监测由碰撞诱发的解离或中性丢失引起的质量转变,例如,多反应监测(MRM)或选择的反应监测(SRM)。在一些实施方式中,使用四极杆分析器确定质荷比。在“四极杆”或“四极杆离子阱”仪器中,振荡射频场中的离子经历与在电极之间施加的DC电位、RF信号的振幅和质/荷比成比例的力。可以选择电压和振幅,使得仅具有特定质/荷比的离子行进四极杆的长度,而所有其它离子被偏转。因而,四极杆仪器可以充当注入仪器的离子的“质量过滤器”和“质量检测器”二者。
在离子与检测器碰撞时,它们产生转化为数字信号的电子脉冲。获取的数据被中继至计算机,其标绘收集的离子的计数对时间。得到的质量色谱图与以传统的HPLC-MS方法中生成的色谱图类似。可以测量对应于特定离子的峰下面积、或这样的峰的振幅,并且与感兴趣的分析物的量相关联。在某些实施方式中,测量碎片离子(一种或多种)和/或先驱离子的曲线下面积、或峰的振幅以确定胰岛素的量。基于内部或外部分子标准品的一种或多种离子的峰,使用校准标准曲线,可以将给定的离子的相对丰度转换为原始分析物的绝对量。
可以通过“串联质谱法”或“MS/MS”增强采用某些质谱分析器的MS技术的分辨率。在此技术中,可以在MS仪器中过滤由感兴趣的分子生成的先驱离子(也称为母离子),并且随后碎裂先驱离子以产生一种或多种碎片离子(也称为子离子或产物离子),其然后在第二个MS程序中被分析。通过仔细选择先驱离子,仅由某些分析物产生的离子被传至碎裂室,在其中与惰性气体的原子碰撞产生碎片离子。因为在给定组的电离/碎裂条件下以可再现方式产生先驱离子和碎片离子二者,所以MS/MS技术可以提供极强大的分析工具。例如,过滤/碎裂的组合可以被用于消除干扰物质,并且在复杂的样品比如生物样品中是特别有用的。在某些实施方式中,采用具有多个四极杆分析器的质谱仪器(比如三重四极杆仪器)实施串联质谱分析。
在使用MS/MS技术的某些实施方式中,先驱离子被分离用于进一步的碎裂,并且碰撞活化解离(CAD)被用于由先驱离子生成碎片离子用于进一步的检测。在CAD中,先驱离子通过与惰性气体的碰撞获得能量,并且随后通过称为“单分子分解”的过程被碎裂。必须在先驱离子中蓄积足够的能量,使得离子内的某些键可以由于增加的振动能量而被破坏。
在一些实施方式中,如下使用MS/MS检测和/或定量样品中的胰岛素。通过首先使样品经受SPE,然后经受液相色谱法,优选地HPLC富集样品中的胰岛素;来自色谱分析柱的液体溶剂流进入MS/MS分析器的加热的喷雾器接口;并且在接口的加热的带电管道系统中将溶剂/分析物混合物转化为蒸汽。在这些过程期间,分析物(即,胰岛素)被电离。离子例如先驱离子穿过仪器的孔口并且进入第一四极杆。四极杆1和3(Q1和Q3)是质量过滤器,其允许基于它们的质荷比(m/z)选择离子(即,分别选择Q1和Q3中的“先驱”离子和“碎片”离子)。四极杆2(Q2)是碰撞单元(collision cell),在其中离子被碎裂。质谱仪的第一四极杆(Q1)选择具有胰岛素离子的m/z的分子。具有正确的m/z的先驱离子被允许传入碰撞室(Q2),而具有任何其它m/z的不需要的离子与四极杆的侧面碰撞并且被消除。进入Q2的先驱离子与中性气体分子(比如氩分子)碰撞并且碎裂。生成的碎片离子被传入四极杆3(Q3),在其中选择碎片离子进行检测。
电离胰岛素可以导致多倍电荷先驱离子(比如4+、5+、6+等先驱离子)。电离条件——特别是在电喷雾技术中利用的缓冲剂的pH——极大地影响生成的胰岛素先驱离子的身份和数量。例如,在酸性条件下,正电喷雾电离可能主要生成m/z分别为1162.5±0.5和968.5±0.5的5+和6+电荷胰岛素先驱离子。然而,在碱性条件下,正电喷雾电离可能主要生成m/z分别为1453.75±0.5和1162.94±0.5的4+和5+电荷胰岛素先驱离子。该方法可以利用酸性或碱性条件;优选地,酸性条件。
方法可以包含以正或负离子模式进行的MS/MS;优选地,正离子模式。在某些实施方式中,电喷雾缓冲剂是酸性的并且Q1选择m/z为约1162.5±0.5或968.5±0.5的胰岛素先驱离子。这些胰岛素先驱离子中任一种的破碎生成m/z为约226.21±0.5和/或135.6±0.5的碎片离子。因而,在Q1选择选自m/z为约1162.5±0.5和968.5±0.5的离子的一种或多种胰岛素先驱离子的实施方式中,Q3可以选择选自m/z为约226.21±0.5和135.6±0.5的离子的一种或多种碎片离子。在某些实施方式中,可以测量来自单一先驱离子的单一碎片离子的相对丰度。可选地,可以测量自单一先驱离子的两种或更多种碎片离子的相对丰度。在这些实施方式中,每种碎片离子的相对丰度可以经受任何已知的数学处理以定量地评估样品中最初的胰岛素。在其它实施方式中,来自两种或更多种先驱离子的一种或多种碎片离子可以如上面被测量和用于定量地评估样品中最初的胰岛素。
可以在某些实施方式中使用的操作串联质谱仪器的替代模式包括产物离子扫描和先驱离子扫描。对于这些操作模式的描述,参见,如,E.Michael Thurman,et al.,Chromatographic-Mass Spectrometric Food Analysis for Trace Determination ofPesticide Residues,Chapter 8(Amadeo R.Fernandez-Alba,ed.,Elsevier 2005)(387)。
在其它实施方式中,高分辨/高准确度质量分析器可以被用于根据本发明的方法定量分析胰岛素。为了取得定量结果的可接受的精确度,质谱仪必须能够对感兴趣的离子展示出10,000或更大的分辨率(FWHM),以及约50ppm或更小的准确度;优选地,质谱仪展示出18,000或更好的分辨率(FWHM),以及约5ppm或更小的准确度;比如20,000或更好的分辨率(FWHM)和约3ppm或更小的准确度;比如25,000或更好的分辨率(FWHM)和约3ppm或更小的准确度。对胰岛素离子能够展示出必需性能水平的三种示例性分析器是轨道阱质量分析器、某些TOF质量分析器和傅里叶变换离子回旋共振质量分析器。
在生物学活性分子中发现的元素——比如碳、氧和氮——以许多不同的同位素形式天然存在。例如,大部分碳作为12C存在,但是所有天然存在的碳的约1%作为13C存在。因而,一些部分的包含至少一个碳原子的天然存在的分子将包含至少一个13C原子。在分子中包括天然存在的元素同位素导致多种分子同位素形式。分子同位素形式的质量差异是至少1个原子质量单位(amu)。这是因为元素同位素相差至少一个中子(一个中子的质量≈1amu)。当分子同位素形式被电离至多倍电荷状态时,因为质谱检测基于质荷比(m/z),因此同位素形式之间的质量区别可以变得难以分辨。例如,质量相差1amu的均被电离至5+状态的两种同位素形式将在其m/z中展示仅仅0.2的差异。高分辨/高准确度质谱仪能够分辨高度多倍带电离子(比如带有±2、±3、±4、±5、或更高电荷的离子)的同位素形式。
由于天然存在的元素同位素,对于每种分子离子,通常存在多种同位素形式(如果使用足够灵敏的质谱仪器进行分析,其每种可以导致可单独检测的谱峰)。多种同位素形式的m/z比和相对丰度共同地构成分子离子的同位素特征。在一些实施方式中,可以利用两种或更多种分子同位素形式的m/z比和相对丰度以确认调查的分子离子的身份。在一些实施方式中,来自一种或多种同位素形式的质谱峰被用于定量分子离子。在一些相关的实施方式中,来自一种同位素形式的单个质谱峰被用于定量分子离子。在其它相关的实施方式中,多个同位素峰被用于定量分子离子。在这些随后的实施方式中,多个同位素峰可以经受任何适当的数学处理。数种数学处理是本领域已知的并且包括但不限于对多个峰下面积求和、或平均来自多个峰的反应。
在一些实施方式中,使用高分辨/高准确度质谱仪测量一种或多种离子的相对丰度,以便定量地评估样品中胰岛素的量。在一些实施方式中,通过高分辨/高准确度质谱法测量的一种或多种离子是多倍电荷胰岛素离子。这些多倍电荷离子可以包括m/z在约1453±0.8(即,来自4+离子的一个或多个单同位素峰)、和/或1162±1(即,来自5+离子的一个或多个单同位素峰)、和/或约968.8±1.5(即,来自6+离子的一个或多个单同位素峰)的范围内的一种或多种离子。
可以通过本领域已知的众多方法使分析物测定的结果与原始样品中分析物的量相关。例如,考虑到仔细地控制取样和分析参数,给定离子的相对丰度可以与将该相对丰度转换为原始分子的绝对量的表格比较。可选地,外标可以与样品一起运行,并且基于由那些标准品生成的离子构建标准曲线。使用这样的标准曲线,给定离子的相对丰度可以被转换为原始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中,内标被用于生成计算胰岛素的数量的标准曲线。生成和使用这样的标准曲线的方法是本领域熟知的并且普通技术人员能够选择适当的内标。例如,在优选的实施方式中,一种或多种形式的同位素标记的胰岛素可以被用作内标。使离子的量与原始分子的量相关的众多其它方法将是本领域普通技术人员熟知的。
如本文所使用的,当通过质谱技术进行分析时,相对于未标记的分子,“同位素标记”在标记的分子中产生质量偏移。合适的标记的实例包括氘(2H)、13C和15N。可以在分子中的一个或多个位置处并入一个或多个同位素标记,并且可以在相同同位素标记的分子上使用一种或多种同位素标记。
在其它实施方式中,胰岛素可以在质谱分析之前经受化学处理以生成胰岛素的组成链。可以通过本领域已知的任何化学处理分离胰岛素的B链以引起二硫化物还原。例如,可以使用TCEP(三(2-羧基乙基)膦处理胰岛素以还原胰岛素的二硫键并且分离A链和B链。
下列实施例用来说明本发明。这些实施例绝不意欲限制方法的范围。
实施例
实施例1:人胰岛素抵抗性研究
人对象表面上是健康的,自我描述为非西班牙裔白人,无心血管疾病史。所有个体均书面知情同意参加研究。
空腹血糖≥126mg/dL的对象或服用降糖药物或诊断为糖尿病的对象被排除在分析之外。
在病史期间确定人种和种族。体重和身高在个体穿着轻便衣服且没有鞋子的情况下进行测量。身体质量指数是通过将体重(以千克计)除以身高(以米计)的平方来计算的。使用自动血压记录仪测量血压。在进行这些测量之前,使对象安静地坐在椅子上5分钟,脚放在地板上,手臂支撑在心脏水平上。使用适当大小的袖带,以1分钟间隔采集3个血压读数并取平均值。如果存在以下特征中的三个,则存在代谢综合征:BMI>30kg/m2;FG>100mg/dL;高血压(SBP)≥130mmHg或DBP≥85mmHg),低HDL-C(女性,<50mg/dL;男性,<40mg/dL),TG≥150mg/dL。
通过使用胰岛素抑制测试(IST)来定量胰岛素介导的葡萄糖处置。评估奥曲肽以通过胰岛素抑制测试评估胰岛素介导的葡萄糖处置。使用一个导管抽取血液样品,而另一个导管被用于施用180分钟输注奥曲肽(0.27μg/m2/min)、胰岛素(32mU/m2/min)和葡萄糖(267mg/m2/min)。从输注的150分钟到180分钟以10分钟间隔对血液进行采样,以确定稳态血浆葡萄糖(SSPG)和稳态血浆胰岛素(SSPI)浓度。由于IST期间所有个体的SSPI浓度均相似,因此SSPG浓度提供了对胰岛素介导输注的葡萄糖负荷的处置的能力的直接测量。因此,SSPG浓度越高,个体越胰岛素抵抗性的。如IST确定的胰岛素介导的葡萄糖处置与通过正常血糖、高胰岛素钳夹技术获得的高度相关。为了本研究的目的,IR被定义为测量的胰岛素抵抗性(SSPG≥198mg/dL)的前三分位数。用于测量胰岛素和C-肽的血清样品源自于IST方案启动前获得的空腹基线样品。
分析包括335名具有一组完整生化和人体测量学测量值的对象(39%男性)。
在该群体中,335名对象中有118名患有代谢综合征。
表1显示了被分类研究的患者群体的临床特征,其中根据对象的胰岛素抵抗性状态对其进行分类。具有胰岛素抵抗性的对象中,男性比例更高,并且具有更高的空腹血浆葡萄糖(FPG)、胰岛素、C-肽、甘油三酯、丙氨酸转氨酶、身体质量指数(BMI)和收缩压。具有胰岛素抵抗性的对象中,HDL-C和LDL-C较低。
表1.通过胰岛素抵抗性状态研究群体特征
胰岛素抵抗的被定义为前三分位数(SSPG≥198)内的SSPG水平。
代谢综合征通过以下定义:存在下面特征中的三个:BMI>30kg/m2;FG>100mg/dL;高血压(SBP≥130mmHg或DBP≥85mmHg),低HDL-C(女性,<50mg/dL;男性,<40mg/dL),TG≥150mg/dL。
值报道为平均值±标准差,或者n(%),除了甘油三酯,甘油三酯报道为中值(四分位距)。
缩写:SBP,收缩压;DBP,舒张压;SSPG,稳态血浆葡萄糖。
实施例2:胰岛素和C-肽测量
我们使用SSPG来评价632名非糖尿病的非西班牙裔白人参加者(FG<125mg/dL并且没有诊断为糖尿病)中的IR。IR被定义为在该群体中SSPG的前三分位数(≥201mg/dL)。
通过多重串联质谱法测定评价胰岛素和C-肽。
将血清去脂,然后使用固定在磁珠上的抗体免疫捕获胰岛素和C-肽。洗涤珠,并在水中用酸化的乙腈从珠上洗脱肽。添加缓血酸胺碱以增强肽的稳定性。使用Hamilton机器人液体处理器,自动化校准物制备、内标添加、去脂化、珠沉积、免疫捕获、从珠上洗涤和洗脱肽的过程。
将洗脱板转移至ThermoFisher TurboFlow Aria TX4 HTLC系统中。将样品注入亲水/亲脂平衡(HLB)捕获柱上,在该柱中从背景污染物中进一步富集胰岛素和C-肽。转移溶剂用于从提取盒放出肽,并将它们转移到反相分析柱中。乙腈梯度色谱法分辨胰岛素和C-肽与残留背景污染物以及彼此。
来自HPLC柱的溶剂流被导向至Agilent 6490质谱仪的加热的电喷雾源。在质谱仪中,仅具有期望的质荷比的离子被允许穿过四极杆1(Q1)区域进入碰撞室(Q2)。然后,加速的离子与中性氩气分子碰撞而成为小碎片。最后,在Q3中,仅选择的离子被选择到达检测器。检测器处信号的强度与进入质谱仪的分子的数目成比例。然后针对一组已知的校准物计算峰面积比并建立校准曲线。校准公式可以然后被用于测定患者样品中胰岛素和C肽的浓度。
使用m/z为968.7(先驱)和136.0、226.1和345.2(碎片)的胰岛素。使用m/z为1007.7(先驱)和533.3、646.4和927.5(碎片)的C-肽。
实施例3:测定内(intra-assay)和测定间(inter-assay)精确度
测定内精确度被定义为测定内测量的再现性并且由测定来自QCL、QCM和QCH的5个重复生成。样品的5个重复的变化系数(CV)被用于确定再现性是否是可接受的(≤15%)。对实验(run)结果进行的统计确定QC的再现性(CV)对于胰岛素在6.2至11.5%的范围内和对于C肽在5.1至6.3%的范围内(表2)。也可以跨越所有测定计算测定内精确度(参见930TP5319:Assay Validation Calculator)。对于实验内的胰岛素,CV在4.7至9.6%的范围内,并且对于实验内的C肽,CV在4.7至7.0%的范围内。
测定间变化被定义为测量在测定之间的再现性。在5天内评估QCL、QCM和QCH。库的测定间变化(%CV)对于胰岛素在7.3–11.3%的范围内和对于C肽在6.2至9.0%的范围内。胰岛素和C肽的所有QC库满足≤15%CV的可接受的再现性的要求(表3)。
实施例4:分析灵敏度(检测限)
空白限(LOB):LOB是测量值大于与其相关联的不确定性的点并且被任意地定义为与零浓度的2倍标准偏差(SD)。选择性是分析方法在样品中存在其它组分的情况下区分和定量分析物的能力。对于选择性,获得合适的生物学基质(处理的血清)的空白样品的分析,测试干扰并且在定量下限处确保选择性。空白被测量20次并且反算得到的面积比。
确定LOB为对于胰岛素0.9μIU/mL和对于C肽0.06ng/mL。
检测限(LOD):LOD是测量值大于与其相关联的不确定性的点并且被任意地定义为与零浓度的4倍标准偏差(SD)。选择性是分析方法在样品中存在其它组分的情况下区分和定量分析物的能力。对于选择性,获得合适的生物学基质(处理的血清)的空白样品的分析,测试干扰并且在定量下限处确保选择性。空白被测量20次并且反算得到的面积比。
确定LOD为对于胰岛素1.5μIU/mL和对于C肽0.10ng/mL。
定量限(LOQ):LOQ是测量变得在数量上有意义的点。此LOQ下的胰岛素和C肽反应是以20%的精确度和80%至120%的准确度可鉴定的、离散的和可再现的。通过在接近期望的LOQ(对于胰岛素1.25、2.5、5、10和20μIU/mL,和对于C肽0.11、0.22、0.44、0.85、0.17ng/ml)的浓度下测定五种不同的样品确定LOQ,然后在七个实验中评价测定内再现性和在进一步8个实验中评价测定间再现性(表5)。对于胰岛素和C肽分别2.5μIU/mL和0.11ng/mL是得到可接受的性能的最低浓度,其中CV的95%置信区间保持低于20%。
建立LOQ为对于胰岛素2.5或3μIU/mL和对于C肽0.11ng/mL。
实施例5:分析物测量范围(AMR)
校准验证:制备十种掺加的、处理的血清样品库(校准物的浓度是对于胰岛素1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、240和320μIU/mL,和对于C肽0.11、0.21、0.43、0.85、1.70、3.40、6.80、13.60、20.40和27.20ng/mL)并且在13个不同日子分析18次。
来自18个曲线的加权(1/X)二次回归(忽略起源)产生对于胰岛素0.989或更大的系数相关和对于C肽0.992或更大的系数相关,准确度为±20%,其揭示了对于胰岛素5至320μIU/mL的线性范围和对于C肽0.11至27.20ng/mL的线性范围(表6)。从0.11–27.20ng/mL线性。
实施例6:胰岛素抵抗性的诊断
对于335名参与者,所有拟人化量度(年龄、性别、SBP、DBP和BMI)和生物标记物(FG、胰岛素、C-肽、HDL-C、LDL-C、TG、肌酸酐和丙氨酸转氨酶(ALT))是可用的。在这335名参与者中,我们发现在针对年龄和性别进行调整的模型中,FG、胰岛素、C-肽、HDL-C、TG和BMI(所有P<0.0001)、ALT(P=0.002和SBP(P=0.008))均与IR相关。使用逐步模型选择,我们发现仅包含胰岛素、C肽和BMI的IR模型具有0.89的AUC。当模型选择仅限于生物标记物时,仅包含胰岛素和C-肽的模型具有0.88的AUC。总之,在这项非糖尿病非西班牙裔白人的研究中,空腹血清胰岛素和C-肽浓度均与IR的测量有关,并联合提供了有关IR患病率的高准确度的信息。
通过对离散变量进行Wilcoxon秩和检验和通过对连续变量进行卡方(chi-square)检验来评估有和没有IR的对象之间在传统危险因子方面的差异。使用针对年龄、性别、SBP、DBP、BMI、FG、HDL-C、LDL-C、TG、肌酸酐和ALT进行调整的逻辑回归模型评估胰岛素和C-肽之间与IR的相关性。风险评分1由胰岛素、C-肽和BMI组成。风险评分2包括胰岛素和C-肽。所有概率值均为2边的,并且给出95%的置信区间(CI)。所有分析均使用SAS 9.2版进行。
表2显示了胰岛素抵抗性与生化和人体测量学测量值之间的相关性;在针对年龄、性别和种族调整之后,除肌酸酐以外的所有均与胰岛素抵抗性相关(P≤0.05)。然而,当所有生化和人体测量学测量值都包括在模型中时,只有胰岛素、C-肽、肌酸酐和BMI与胰岛素抵抗性相关。
表2.生化和人体测量学测量值与胰岛素抵抗性的相关性
优势比为按1-标准差。
*针对年龄、性别、种族(西班牙裔、非西班牙裔白人;其他人)、空腹血浆葡萄糖、胰岛素、C-肽、HDL-C、LDL-C、甘油三酯、肌酸酐、丙氨酸转氨酶、身体质量指数、收缩压和舒张压调整。
表3.胰岛素抵抗性风险评分与胰岛素抵抗性的相关性
优势比针对风险评分的前四分位数对不在前三分位数。
*针对年龄、性别、种族、空腹血浆葡萄糖、LDL-C、HDL-C、甘油三酯、丙氨酸转氨酶、收缩压和舒张压调整。
胰岛素、C-肽、肌酸酐和BMI的系数分别为0.139、1.5971、-3.3985和0.0658。
由于胰岛素、C-肽、肌酸酐和BMI代表了我们建模中最重要的变量,因此我们将这些变量合并为单个风险评分(模型1)。该分析表明,在针对年龄、性别、种族、空腹血浆葡萄糖、LDL-C、HDL-C、甘油三酯、丙氨酸转氨酶以及收缩压和舒张压进行调整的模型中(表3),使用这种方法,与未处于前四分位数的个体相比,处于该风险评分的前四分位数的个体具有胰岛素抵抗性的可能性要>15倍(OR=15.1,95%CI 8.7至26.3)。
认识到将临床变量并入实验室诊断中可能存在操作挑战,我们还检查了仅包括胰岛素、C-肽和肌酸酐(模型2)或仅胰岛素和C-肽(模型3)的风险评分的表现。对于并入胰岛素、C-肽和肌酸酐(模型2)的风险评分,对于风险评分的前四分位数的对象对比不在前四分位数的对象,该评分前四分位数的对象的为IR的优势略微降低13.6(95%CI 7.9至23.6)。最后,仅采用胰岛素和C-肽结果(模型3),处于该风险评分前四分位数的对象比不在前四分位数的对象的胰岛素抵抗性高9倍的优势(OR=9.9,95%CI 5.8至17.0)。
长期以来,认识到代谢综合征与胰岛素抵抗性和2型糖尿病未来发展的风险密切相关。在该研究群体中,我们发现,在针对年龄、性别、种族、LDL-C、肌酸酐、丙氨酸转氨酶、收缩压和舒张压调整的模型中,代谢综合征也与胰岛素抵抗性相关(OR=3.7,95%CI2.4至5.8)。相反,在针对胰岛素和C-肽进一步调整后,代谢综合征不再与胰岛素抵抗性相关(OR=1.1,95%CI 0.6-1.9)(表1)。值得注意的是,无论是否存在代谢综合征,这3个风险评分均与胰岛素抵抗性相关(表4)。
表4.通过代谢综合征状态的胰岛素抵抗性风险评分与胰岛素抵抗性的相关性
针对风险评分的前四分位数中的对象对比不在前四分位数的对象报道的优势比。
针对年龄、性别、种族、空腹血浆葡萄糖、LDL-C、HDL-C、甘油三酯、丙氨酸转氨酶、收缩压和舒张压调整。
从这些模型中获得的信息可用于定义个体对胰岛素抵抗的概率。表5显示了在下述三个不同风险评分的不同百分位数上个体胰岛素抵抗的概率:其包括1)C-肽和胰岛素,2)C-肽、胰岛素和肌酸酐、BMI,以及3)C-肽、胰岛素、肌酸酐和BMI。显然,尽管模型之间存在细微的差异,但大多数信息都包含在并入C-肽和胰岛素的模型中。
表5.通过风险评分百分位数的胰岛素抵抗性的概率
值为胰岛素抵抗的概率(95%CI)
包括C-肽和胰岛素的风险评分的截距和系数为-4.6554和0.9777。
包括C-肽、胰岛素和肌酸酐的风险评分的截距和系数为-1.8981和1.0894。
包括C-肽、胰岛素、肌酸酐和BMI的风险评分的截距和系数为-3.8492和1。
图1显示了在具有和不具有代谢综合征的个体中,胰岛素和C-肽与胰岛素抵抗性(IR)相关。
我们已经检查了临床参数和实验室结果预测在12年期间在GCRC环境中研究的多种族组群中使用SSPG从胰岛素抵抗性的正式测量得到的胰岛素抵抗性水平的能力。与先前的研究(REFS)一致,观察到一系列临床参数与胰岛素抵抗性的正式测量相关,其包括FPG、胰岛素、C-肽、HDL-C、LDL-C、甘油三酯、丙氨酸转氨酶、身体质量指数(BMI)和血压,即使针对年龄、性别和种族调整后。值得注意的是,当针对胰岛素和C-肽结果进行调整时,这些相关性中的大多数并没有保持显著的,这表明它们本身就是潜在的胰岛素抵抗状态的反映,这几乎完全考虑了通过包括胰岛素和C-肽水平在模型中的调整。当模型包括胰岛素和C-肽的测量值时,只有BMI和肌酸酐仍然略微显著性的。
该研究的令人惊讶的发现是如此观察结果:胰岛素和C-肽的测量值均显著有助于准确预测如使用SSPG所测量的胰岛素抵抗性水平的能力。
在这项研究中,我们采用了多重测定法,以使用高通量液相色谱串联质谱法测量完整胰岛素和C-肽。这种方法允许限定特定阈值,这些阈值将随着时间而持续。
尽管对于可以传达关于推断的胰岛素抵抗性水平的信息存在多种方式,但是我们预计表达该数据的最有用的方式之一是呈现个体拥有胰岛素抵抗性的特定阈值的概率。为此目的,我们将其表示为胰岛素抵抗性的概率,此处定义为SSPG≥198mg%(前三分位数)。尽管肌酸酐和BMI可测量地修改此预测工具,但胰岛素和C-肽说明大部分信息。
总之,我们已经证明了并入空腹和C-肽测量值的模型能够以良好准确度预测使用SSPG的胰岛素抵抗性水平的正式测量值。无论是否可获得临床参数或其他实验室值,模型的简单性及其有效性都是这项研究的优势。我们的发现表明这样的风险评分对于评估个体的胰岛素抵抗性水平具有一定的价值,无论是否存在临床体征。这些发现还表明,这些测量对于纵向评估进行生活方式或药理干预以降低胰岛素抵抗性的对象——目前在研究环境之外难以进行的评估——也可以是有价值的。
胰岛素和C-肽彼此独立地并且独立于传统风险因素(包括空腹葡萄糖)与胰岛素抵抗性相关。
胰岛素和C-肽可被用于评估在具有和不具有代谢综合征的对象中使用SSPG方法正式评估的胰岛素抵抗性的概率。
组合C-肽和胰岛素的风险评分(使用C-肽和胰岛素的标准化可追溯测量)可被导出并用于为患者提供他们具有胰岛素抵抗性的概率。
同时定量完整胰岛素和C-肽浓度的高通量质谱测定的即时方法学可以作为胰岛素和C-肽测量的标准化的参比点,并最终创建鉴定胰岛素抵抗性的通用可接受的定量方法。当前的研究已采用该方法测量完整胰岛素和C-肽,并评估了这些标准化测量评估胰岛素抵抗性的实用性,如非糖尿病表面健康个体中通过胰岛素介导的葡萄糖处置所测量的。当前的分析已将此方法应用于已完成所有测量的第一组群(自我鉴定的非西班牙裔白人个体)。
实施例6:通过多重质谱法测量的完整胰岛素和C-肽水平
已经表明,升高的胰岛素水平与糖尿病发展的风险增加有关。尽管针对胰岛素和C-肽的临床测试已经使用了数十年,但胰岛素测量尚未在临床实践中广泛使用,这至少部分由于可用的免疫测定的宽范围,以及难以将一种测定平台获得的结果与从其他平台得到的结果相关联。在文献中对于胰岛素和C-肽都注意到了这一缺点。因此,我们开发了一种基于多重质谱法的测定,其测量完整胰岛素和C-肽两者。我们研究了表面健康的志愿者组群的空腹血清样本中胰岛素、C-肽和葡萄糖水平之间的关系。
表面健康的对象提供了知情同意(WIRB#20121940),并获得了空腹静脉血样品。使用Olympus AU2700TM化学免疫分析仪(Melville,NY)确定葡萄糖水平;通过多重质谱测定来确定胰岛素和C-肽水平。在血收集时获得拟人化测量值。
该研究包括103名表面健康的志愿者(46.7%男性,中值年龄=35,中值BMI=26.1)。在该群体中的中值胰岛素水平为8.07μIU/ml(IQR 5.38至12.55);在19.4%的对象中,胰岛素升高(≥15μIU/ml)。在分别50%和40%的空腹葡萄糖不良(impaired fastingglucose)或空腹葡萄糖在90和<100mg/dL之间的对象中,胰岛素水平升高;相反,仅9.6%的空腹葡萄糖<90mg/dL的对象的胰岛素水平升高。在10名空腹葡萄糖不良的对象中,中值胰岛素水平为14.78μIU/ml(IQR 6.44至42.29),在20名空腹葡萄糖在90和<100mg/dL之间的对象中,中值胰岛素水平为9.79μIU/ml(8.43至17.70),和73名空腹葡萄糖<90mg/dL的对象中,中值胰岛素水平为7.26μIU/ml(4.49至9.47)(对于中值之间的差异,P=0.0004)。在BMI>26的对象的胰岛素水平(中值=9.17μIU/ml,IQR 6.96至17.33)高于BMI≤26的对象的胰岛素水平(中值=6.92μIU/ml,IQR 4.08至9.09;P=0.0003)。胰岛素和C-肽水平高度相关(r=0.88)。
临床样品收集和样品制备
从表面健康的成年志愿者获得血液(WIRB协议#1085473)。在采样时,获得拟人化测量值。使用无障碍血清制备管(barrier-free serum preparation tube)(红色顶部)获得血液并使其凝结。得到的血清被立即处理并然后在-80℃下储存,直到进行分析。通过在磁珠上固定的2种单克隆抗体进行从患者血清(150μL)富集胰岛素和C-肽。在机器人液体处理器(Microlab STAR,Hamilton,Reno,NV)上处理样品。
测定
利用TurboFlow Aria TLX-4(Thermo-Fisher,San Jose,CA)——完全自动化在线二维液相色谱系统——实现MS之前从剩余基质组分分析分离完整胰岛素和C-肽。具有iFunnel的6490Triple Quadrupole Mass Spectrometer(Agilent,Santa Clara,CA)用作MS/MS检测器。先前描述了LC和MS条件的详细描述9。使用Olympus AU2700TM化学免疫分析仪(Melville,NY)确定葡萄糖水平。
统计分析
通过参数(ANOVA)、非参数(Kruksal-Wallis)检验评估具有低(<90mg/dL)、中(90至<100mg/dL)和高(100至125mg/dL)空腹葡萄糖水平的参与者之间的胰岛素水平的差异。通过未配对t检验评估具有低(<26)和高(>=26)BMI的患者中的胰岛素水平的差异。在针对年龄、性别和空腹葡萄糖水平调整的多变量回归模型中评估BMI与胰岛素的相关性。
在空腹葡萄糖<90mg/dL的73名对象中,中值胰岛素水平为7.26μIU/ml(4.49至9.47),在空腹葡萄糖在90和<100mg/dL之间的20名对象中,中值胰岛素水平为9.79μIU/ml(8.43至17.70),和空腹葡萄糖不良的10名对象中,中值胰岛素水平为14.78μIU/ml(IQR6.44至42.29)(图2)。
在BMI>26的对象中,胰岛素水平(中值=9.17μIU/ml,IQR 6.96至17.33)比BMI≤26的对象中的胰岛素水平(中值=6.92μIU/ml,IQR 4.08至9.09;P=0.0003)高(图3)。
发现,胰岛素和C-肽水平作为空腹葡萄糖的函数增加(图4和5)。
在多变量回归模型中,在针对年龄、性别和空腹葡萄糖调整后,BMI与空腹胰岛素相关(P=0.00002)。对于每单位的BMI增加,空腹胰岛素与0.59μIU增加相关联(95%CI,0.33至0.85)(图6)。
讨论
该研究表明,应用基于多重质谱法的测定测量完整胰岛素和C-肽——一种通过校准至WHO胰岛素参考材料83/500标准化的并且SI可追溯的测定。利用通过定量氨基酸分析分配的校准物仔细定量C-肽的测量值。我们的发现指出,(1)在大量表明空腹血糖在正常范围内的个体中观察到胰岛素的升高,(2)在正常范围内较高的葡萄糖水平下,表明胰岛素升高渐进增加的比例。
结论
我们已经采用多重完整胰岛素和C-肽测定以定义对两种分析物的规范范围。
集中这些正常范围的定义以采用具有正常空腹血糖、正常血红蛋白A1C和BMI<26的个体,对于胰岛素得到正常范围为<16μIU/mL,和对于C-肽得到正常范围为0.68至2.16ng/ml。
胰岛素和C-肽的空腹水平随空腹葡萄糖增加而渐进地增加。
空腹胰岛素水平受BMI强影响。
定义具有良好表征胰岛素抵抗性评估的个体中空腹胰岛素和C-肽与空腹葡萄糖和拟人测量的关系可以限定工具,以允许容易评估胰岛素敏感性水平。
实施例7:通过质谱法测量胰岛素和C-肽水平鉴定表面健康的个体中胰岛素抵抗
性
我们确定了包括胰岛素、C-肽、TG/HDL比、肌酸酐和BMI的风险评分可以帮助在具有和不具有代谢综合征的两者对象中鉴定具有胰岛素抵抗性的个体。
所有研究参与者是表面健康的并且没有心血管疾病的病史。空腹葡萄糖≥126mg/dL的个体或在基线时服用降糖药的个体被排除在分析之外。
在病史期间确定人种和种族。体重和身高在个体穿着轻便衣服且没有鞋子的情况下进行测量。身体质量指数是通过将体重(以千克计)除以身高(以米计)的平方来计算的。使用自动血压记录仪测量血压。在进行这些测量之前,使对象安静地坐在椅子上5分钟,脚放在地板上,手臂支撑在心脏水平上。使用适当大小的袖带,以1分钟间隔采集3个血压读数并取平均值。如果存在以下特征中的三个,则存在代谢综合征:BMI>30kg/m2;FG>100mg/dL;高血压(SBP)≥130mmHg或DBP≥85mmHg),低HDL-C(女性,<50mg/dL;男性,<40mg/dL),TG≥150mg/dL。
禁食过夜后,将静脉导管置于每只手臂中。使用一个导管抽取血液样品,而另一个导管被用于施用180分钟输注奥曲肽(0.27μg/m2/min)、胰岛素(32mU/m2/min)和葡萄糖(267mg/m2/min)。从输注的150分钟到180分钟以10分钟间隔对血液进行采样,以确定稳态血浆葡萄糖(SSPG)和稳态血浆胰岛素(SSPI)浓度。由于IST期间所有个体的SSPI浓度均相似,因此SSPG浓度提供了对胰岛素介导输注的葡萄糖负荷的处置的能力的直接测量。因此,SSPG浓度越高,个体越胰岛素抵抗性的。如IST确定的胰岛素介导的葡萄糖处置与通过正常血糖、高胰岛素钳夹技术获得的高度相关。为了本研究的目的,IR被定义为测量的胰岛素抵抗性(SSPG≥198mg/dL)的前三分位数。用于测量胰岛素和C-肽的血清样品源自于IST方案启动前获得的空腹基线样品。
表1.通过胰岛素抵抗性状态研究群体特征
-胰岛素抵抗的被定义为前三分位数(SSPG≥198)内的SSPG水平。
-代谢综合征通过以下定义:存在下面特征中的三个:BMI>30kg/m2;FG>100mg/dL;高血压(SBP≥130mmHg或DBP≥85mmHg),低HDL-C(女性,<50mg/dL;男性,<40mg/dL),TG≥150mg/dL。
-值报道为平均值±标准差,或者n(%),除了甘油三酯,甘油三酯报道为中值(四分位距)。
-缩写:SBP,收缩压;DBP,舒张压;SSPG,稳态血浆葡萄糖。
通过对连续变量进行Wilcoxon秩和检验或t检验,和通过对离散变量进行卡方检验,评估有和没有IR的对象之间在生化和人体测量学测量方面的差异。在逻辑回归模型中评估了研究变量与IR的相关性,该模型针对表中指示的协变量进行了调整。由于非西班牙裔白人(n=335)、西班牙裔(n=42)和其他人(n=158)的SSPG分布直方图看起来有所不同,因此对于这3个组,将种族编码为分类变量。在逐步回归中选择风险评分分量。所有可用变量都有资格进入模型。将满足指定的显著性包含截止值的那些变量中最佳拟合的可用变量添加到模型后,评估模型中的所有候选变量,并且如果其显著性已增加到指定的排除级别以上,则将其移除。重复此过程,直到对于本文中指出的包含和排除截止值不能再添加或移除任何变量。在针对年龄、性别、种族、胰岛素、C-肽、肌酸酐、BMI、TG/HDLC、FG、SBP、DBP、LDL-C和丙氨酸转氨酶(但不包括为风险评分一部分的变量)进行调整的模型中确定风险评分系数。所有P值均为双边的,并给出95%的置信区间。所有分析均使用SAS版本9.2进行。
表1根据胰岛素抵抗性状态显示了研究参与者的生化和人体测量学测量值。胰岛素抵抗的参与者具有较高水平的FG、胰岛素、C-肽、HDL-C、TG、TG/HDL、AAT、BMI和SBP。胰岛素抵抗的参与者具有较低水平的HDL-C和LDL-C。
我们在针对年龄、性别、种族、FG、胰岛素、C-肽、LDL-C、TG/HDL、肌酸酐、AAT、BMI以及SBP和DBP调整时研究了研究变量与胰岛素抵抗性之间的相关性(表2)。在该完全调整的分析中,胰岛素、C-肽、肌酸酐、BMI和TG/HDL与胰岛素抵抗性相关。对于胰岛素每增加10pmol/L,为胰岛素抵抗的优势(SSPG≥198mg/dL)是1.2倍高(95%CI 1.1至1.4),而不管C-肽水平和其他研究变量如何。同样,对于C-肽每增加100pmol/L,为胰岛素抵抗的优势是1.6倍高(95%CI为1.3至2.0)。
由于胰岛素和C-肽高度相关(r=0.85),我们通过胰岛素和C-肽的三分位数对IR的患病率进行检查(图18)。在每个胰岛素三分位数处,IR个体的分数根据C-肽三分位数水平增加。相反,在每个C-肽三分位数处,IR个体的分数根据胰岛素三分位数水平增加。
表2.生化和人体测量学测量值与胰岛素抵抗性的相关性
优势比为按1-标准差。
*针对年龄、性别、民族(西班牙裔、非西班牙裔白人;其他人)、空腹血浆葡萄糖、胰岛素、C-肽、HDL-C、LDL-C、甘油三酯、肌酸酐、丙氨酸转氨酶、身体质量指数、收缩压和舒张压调整。
表3.胰岛素抵抗性标记物与胰岛素抵抗性的相关性
优势比针对变量的前四分位数对不在前三分位数
胰岛素的前四分位数:>71.64pmol/L
C-肽的前四分位数:>652.611pmol/L
HOMA-IR的前四分位数:>53.8667
*针对年龄、性别、种族、胰岛素、C-肽、肌酸酐、BMI、TG/HDLC、FG、SBP、DBP、LDL-C、和丙氨酸转氨酶(除了包括在每个风险评分中的变量)调整
我们使用逐步模型选择程序来在表2中的变量以及年龄和性别中鉴定IR风险模型的变量。当我们使用P<0.001作为模型中变量进入和不移除的标准时,胰岛素、C-肽和肌酸酐被包括在内(以该顺序)。对于包含这些变量的风险评分的前四分位数的个体(对比不在前四分位数的个体),IR的未调整优势比为18.7(95%CI 11.4至30.7,表3)。并且在针对风险评分中未包含的变量进行调整后,优势比为10.8(95%CI 6.2至19.0)。由于可以以单个多重测试测量胰岛素和C-肽,我们还检查了仅包含胰岛素和C-肽的模型,并发现IR的未调整优势比为12.8(95%CI 8.0至20.4)。当使用更加宽松的变量进入和不移除的标准(P<0.05)时,最终模型中包括5个变量:胰岛素、C-肽、肌酸酐、BMI和TG/HDL(以此顺序)。对于包含这些变量的风险评分的前四分位数的个体,IR的未调整优势比是20.0(95%CI 12.1至33.0)。在针对风险评分中未包含的变量进行调整后,优势比为16.1(95%CI 9.5至27.3)。
我们还检查了HOMA-IR——常用的估计胰岛素抵抗性的方法,并发现对于HOMA-IR的前四分位数的个体(对比不在前高四分位数的个体),IR的未调整的优势比是10.3(95%CI 6.6至16.1)。在针对风险评分中未包含的变量进行调整后,优势比是1.5(95%CI为0.8至2.7)。
当研究群体限于患有代谢综合征的群体时,在针对不包括在该评分中的变量调整每个评分后,这些风险评分仍与IR相关:对于胰岛素和C-肽评分,OR=9.1(95%CI 4.2至19.5),对于胰岛素、C-肽和肌酸酐评分,OR=13.3(95%CI 5.9至30.1),和对于胰岛素、C-肽、肌酸酐、BMI和TG/HDL评分,OR=13.7(95%CI 6.3至29.9)。
表1显示了被分类研究的患者群体的临床特征,其中根据对象的胰岛素抵抗性状态对其进行分类。具有胰岛素抵抗性的对象中男性比例较高,且具有较高的空腹血浆葡萄糖(FPG)、胰岛素、C-肽、甘油三酯、丙氨酸转氨酶、身体质量指数(BMI)和收缩压。在具有胰岛素抵抗性的对象中HDL-C和LDL-C水平较低。
我们还使用这些风险评分来估计个体具有IR的概率(表4)。因此,可以针对风险的每个百分位数来计算具有IR的概率,而不是根据单个切点(例如,患者是否处于风险评分的前四分位数)来确定是IR的可能性。对于表3和表4中的3个风险评分中的每一个,我们提供了一个方程,该方程可用于根据风险评分分量的测量结果计算为IR的概率。
表2显示了胰岛素抵抗性与生化和人体测量学测量值之间的相关性;在针对年龄、性别和种族调整之后,除肌酸酐以外的所有均与胰岛素抵抗性相关(P≤0.05)。然而,当所有生化和人体测量学测量值都包括在模型中时,只有胰岛素、C-肽、肌酸酐和BMI与胰岛素抵抗性相关。
由于胰岛素、C-肽、肌酸酐和BMI代表了我们建模中最重要的变量,因此我们将这些变量合并为单个风险评分(模型1)。该分析表明,在针对年龄、性别、种族、空腹血浆葡萄糖、LDL-C、HDL-C、甘油三酯、丙氨酸转氨酶以及收缩压和舒张压进行调整的模型中(表3),使用这种方法,与未处于前四分位数的个体相比,处于该风险评分的前四分位数的个体具有胰岛素抵抗性的可能性要>15倍(OR=15.1,95%CI 8.7至26.3)。
认识到将临床变量并入实验室诊断中可能存在操作挑战,我们还检查了仅包括胰岛素、C-肽和肌酸酐(模型2)或仅胰岛素和C-肽(模型3)的风险评分的表现。对于并入胰岛素、C-肽和肌酸酐(模型2)的风险评分,对于风险评分的前四分位数的对象对比不在前四分位数的对象,该评分前四分位数的对象的为IR的优势略微降低13.6(95%CI 7.9至23.6)。最后,仅采用胰岛素和C-肽结果(模型3),处于该风险评分前四分位数的对象比不在前四分位数的对象的胰岛素抵抗性高9倍的优势(OR=9.9,95%CI 5.8至17.0)。
在该研究群体中,我们发现,在针对年龄、性别、种族、LDL-C、肌酸酐、丙氨酸转氨酶、收缩压和舒张压调整的模型中,代谢综合征也与胰岛素抵抗性相关(OR=3.7,95%CI2.4至5.8)。相反,在针对胰岛素和C-肽进一步调整后,代谢综合征不再与胰岛素抵抗性相关(OR=1.1,95%CI 0.6-1.9)(表1)。值得注意的是,无论是否存在代谢综合征,这3个风险评分均与胰岛素抵抗性相关(表4)。并且表4展示了个体在不同百分位数处是胰岛素抵抗的概率。
表4.通过风险评分百分位数的胰岛素抵抗性的概率
值为是胰岛素抵抗的概率(95%CI)
风险评分计算和IR的概率
风险评分1:胰岛素(pmol/L)、C-肽(pmol/L)、肌酸酐(mg/dL)
(1.1)RS=(胰岛素×0.0265)+(C-肽×0.00511)+(肌酸酐×-3.2641)
风险评分2:胰岛素(pmol/L)、C-肽(pmol/L)、肌酸酐(mg/dL)、TG/HDL-C和BMI(kg/m2)
(3.1)RS=(胰岛素×0.0227)+(C-肽×0.0046)+(肌酸酐×-3.5553)+(TG/HDL-C×0.101)+(BMI×0.0711)
风险评分3:胰岛素(pmol/L)和C-肽(pmol/L)
(3.1)RS=(胰岛素×0.0295)+(C-肽×0.00372)
该研究的令人惊讶的发现是如此观察结果:胰岛素和C-肽的测量值均显著有助于准确预测如使用SSPG所测量的胰岛素抵抗性水平的能力。
我们已经证明了并入空腹和C-肽测量值的模型能够以良好准确度预测使用SSPG的胰岛素抵抗性水平的正式测量值。
与不在前四分位数中的个体相比,处于包括胰岛素、C-肽、肌酸酐和BMI的风险评分的前四分位数中的个体更有可能是IR(OR=15.1,95%CI 8.7 26.3)。并且,在有代谢综合征(OR=17.7,95%CI 7.8至40.5)和没有代谢综合征(OR=16.9 95%CI 7.3至39.2)的个体中均观察到这种相关性。
本文提及或引用的文章、专利和专利申请以及所有其它文件和可电子获取的信息的内容由此通过引用以其全部并入,其程度如同每个单独的出版物被具体地和单独地指示通过引用并入。申请人保留将来自任何这样的文章、专利、专利申请或其它物理和电子文件的任何和所有材料与信息物理地并入本申请的权利。
本文说明性描述的方法可以适合在不存在本文未明确地公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下实践。因而,例如,应当广义地和非限制性地理解术语“包含”、“包括”、“含有”等。另外,已经将本文采用的术语和表述用作描述而非限制的术语,并且不意欲使用排除显示和描述的特征的任何等价物或其部分的这样的术语和表述。应当认识到多种修改在要求保护的发明的范围内是可能的。因而,应当理解虽然已经通过优选的实施方式和任选的特征具体地公开了本发明,但是本领域的技术人员可以采取本文公开的其中体现的本发明的修改和变化,并且这样的修改和变化被认为在本发明范围内。
本文已经宽泛地和一般地描述了本发明。落入一般公开内容内的较窄种类和下位分组中的每种也形成方法的一部分。这包括使用限制性条款或否定限定——其从种类去除任何主题——对方法的一般描述,而不管被除去的材料是否在本文被明确地陈述。
其它实施方式在所附权利要求的范围内。另外,在按照马库什群组描述方法的特征或方面时,本领域技术人员将认识到还从而按照马库什群组的任何单个成员或亚群成员来描述本发明。
Claims (44)
1.用于测量糖尿病和糖尿病前期患者中胰岛素抵抗性的方法,所述方法包括:
(a)在适于产生通过质谱法可检测的一种或多种胰岛素和C-肽离子的条件下使来自样品的胰岛素和C-肽经受电离源;和
(b)通过质谱法确定一种或多种胰岛素和C-肽的量。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括测量肌酸酐水平。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括测量身体质量指数(BMI)。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括测量甘油三酯(TG)水平。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括测量高密度脂蛋白C(HDL-C)水平。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括测量BMI、TG和HDL-C水平。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法提供胰岛素抵抗性评分。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法提供发展胰岛素抵抗性的概率。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述生物样品包括血浆或血清样品。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述电离源是电喷雾(ESI)电离源。
11.根据权利要求1所述的方法,其中在质谱法之前使所述样品经受酸性条件。
12.根据权利要求11所述的方法,其中使所述样品经受酸性条件包括使所述样品经受甲酸。
13.根据权利要求1所述的方法,其中在质谱法之前使所述样品经受碱性条件。
14.根据权利要求13所述的方法,其中使所述样品经受碱性条件包括使所述样品经受缓血酸胺和/或乙醇。
15.根据权利要求1所述的方法,其中所述一种或多种离子包括质荷比(m/z)为968.9±0.5的胰岛素先驱离子。
16.根据权利要求1所述的方法,其中所述一种或多种离子包括选自m/z为136.0±0.5、226.1±0.5和345.2±0.5的离子的一种或多种胰岛素碎片离子。
17.根据权利要求1所述的方法,其中所述一种或多种离子包括质荷比(m/z)为1007.7±0.5的C-肽先驱离子。
18.根据权利要求1所述的方法,其中所述一种或多种离子包括选自m/z为533.3±0.5、646.4±0.5和927.5±0.5的离子的一种或多种C-肽碎片离子。
19.根据权利要求1所述的方法,其中在通过质谱法进行定量之前将所述样品去脂。
20.根据权利要求1所述的方法,进一步包括在质谱法之前纯化所述样品。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述纯化包括使所述样品经受液相色谱法。
22.根据权利要求21所述的方法,其中液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)或高湍流液相色谱法(HTLC)。
23.根据权利要求20所述的方法,其中所述纯化包括使样品经受固相提取(SPE)。
24.根据权利要求1所述的方法,其中所述质谱法是串联质谱法、高分辨质谱法、或高分辨/高准确度质谱法。
25.根据权利要求1所述的方法,其中电离是电喷雾电离(ESI)。
26.根据权利要求1所述的方法,其中电离处于正离子模式。
27.根据权利要求1所述的方法,其中向所述样品添加胰岛素和C-肽的内标。
28.根据权利要求27所述的方法,其中胰岛素的所述内标是牛胰岛素。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述牛胰岛素包括质荷比(m/z)为956.8±0.5的先驱离子和选自m/z为136.0±0.5、226.1±0.5和315.2±0.5的离子的碎片离子。
30.根据权利要求27所述的方法,其中C-肽的所述内标是C-肽重内标。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述C-肽重内标包括质荷比(m/z)为1009.5±0.5的先驱离子和选自m/z为540.3±0.5、653.4±0.5和934.5±0.5的离子的碎片离子。
32.根据权利要求1所述的方法,其中确定的所述一种或多种离子的量被用于确定所述样品中胰岛素和C-肽的量。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述样品中胰岛素和C肽的量被用于确定胰岛素与C-肽的比。
34.根据权利要求1所述的方法,进一步包括使样品经受富集过程,以获得胰岛素和C-肽富集的级分。
35.根据权利要求34所述的方法,其中所述富集过程包括免疫捕获胰岛素和C-肽。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述免疫捕获包括使用抗-胰岛素抗体和抗-C-肽抗体。
37.根据权利要求36所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
38.根据权利要求37所述的方法,其中所述抗体是IgG。
39.根据权利要求36所述的方法,其中所述抗-胰岛素抗体和抗-C-肽抗体被固定在磁珠上。
40.根据权利要求35所述的方法,其中洗涤和洗脱免疫捕获在磁珠上的胰岛素和C-肽。
41.根据权利要求35所述的方法,其中所述质谱法是串联质谱法、高分辨质谱法或高分辨/高准确度质谱法。
42.根据权利要求1所述的方法,其中如果C-肽值大于或等于2.4ng/mL,则诊断胰岛素抵抗性。
43.根据权利要求1所述的方法,其中如果胰岛素值大于或等于15μIU/mL,则诊断胰岛素抵抗性。
44.根据权利要求1所述的方法,其中如果C-肽值大于或等于2.4ng/mL和胰岛素值大于或等于15μIU/mL,则诊断胰岛素抵抗性。
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