CN103454433B - 一种新型检测内外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及内源性胰岛素、外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒及制备方法，属于蛋白质检测技术领域，该试剂盒包括一小管含C¹⁴同位素标记的内、外源性胰岛素的标准品；一小管含抗胰岛素抗体的磁珠；一小管缓冲液；一小管洗脱液；一小管能量吸收分子饱和溶液，上述各小管置于4℃冷藏盒中。本发明可用于体外样品检测和预后判断的免疫质谱试剂盒。本方法精确、方便且快捷。

Description

一种新型检测内外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒

技术领域

本发明涉及一种非侵入性检测、评估糖尿病病人试剂盒的新方法，其特征是采用质谱

法对样品中已被特异性抗体捕获的胰岛素进行精确地鉴别、检测。

背景技术

不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本的筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析；用抗体-质谱联合可克服这一技术缺点。

胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的激动而分泌的一种蛋白质激素。先分泌的是由84个氨基酸组成的长链多肽-胰岛素原(pro-insulin)，经专一性蛋白酶——胰岛素原转化酶(PC1和PC2)和羧肽脢E的作用，将胰岛素原中间部分(C链)切下，而胰岛素原的羧基端部分(A链)和氨基端部分(B链)通过二硫键结合在一起形成胰岛素，人类内源性胰岛素分子量为5807.6460。成熟的胰岛素储存在胰岛β细胞内的分泌囊泡中，以与锌离子配位的六聚体方式存在。在外界刺激下胰岛素随分泌囊泡释放至血液中，并发挥其生理作用。胰岛素的分泌分成两部分，一部分帮助维持空腹血糖正常而分泌的胰岛素，称为基础胰岛素；基础胰岛素是胰岛细胞24小时持续脉冲式分泌的胰岛素，主要用于维持空腹血糖水平的正常；另一部分则是为了降低餐后血糖升高、维持餐后血糖正常而分泌的胰岛素，称为餐时胰岛素。餐时胰岛素的早时相分泌控制了餐后血糖升高的幅度和持续时间，其主要的作用是抑制肝脏内源性葡萄糖的生成。通过该作用机制，血糖在任何时间均被控制在接近空腹状态的水平；餐后血糖的峰值在7.0mmol/L以下，并且血糖水平高于5.5mmol/L的时间不超过30分钟。1型糖尿病患者在确诊糖尿病之前，大部分患者胰岛β细胞发生自身免疫性破坏，导致餐时和基础胰岛素分泌均减少。2型糖尿病患者胰岛β细胞功能异常进展缓慢，常常表现为外周胰岛素抵抗，但是也同时存在胰岛素一相分泌减少，因而可以出现空腹血糖正常而餐后血糖升高的情况。最终，餐后血糖水平可达到非糖尿病的生理状态时的4倍，并且在进餐后血糖升高持续数小时，以至于在下一餐前仍然显著升高。

目前弥补餐时胰岛素分泌不足的外源性胰岛素制剂有牛胰岛素(分子量为5733.5666)、猪胰岛素(分子量为5777.6197)、InsulinGlargine(分子量为6064.1110)等。

美国糖尿病学会(ADA)与欧洲糖尿病学会(EASD)指南均建议，在生活方式干预和口服糖尿病治疗后，如果血糖控制仍不满意，应尽早开始胰岛素治疗，且首选基础胰岛素与口服降糖药合用。若此疗法仍不能控制血糖，根据该指南的治疗线路图，建议在此基础上在就餐时再加用速效胰岛素。目前用于弥补基础胰岛素不足的制剂主要有基础胰岛素类似物地特胰岛素等。胰岛素由胰岛素降解酶(insulindegradingenzyme，IDE)降解。胰淀素和β淀粉样多肽也是IDE的底物。

传统用于胰岛素检测试剂盒及制备方法为ELISA等传统免疫分析技术，ELISA等传统免疫分析技术主要依靠间接的化学或放射测定法。举例讲，胰岛素的检测试剂盒制备方法为先将抗胰岛素抗体(第一个抗体)结合至固相表面(如玻璃)，然后将含胰岛素的样品(如血清)，加至这个已标有抗胰岛素抗体的容器中；这样，胰岛素就会结合至抗体上，然后洗脱未结合的物质；再加上已标有酶、放射性或化学发光性的抗胰岛素抗体(第二个抗体)，这样就可以检测出胰岛素的总含量。这种方法学的缺点是无法测出胰岛素的单个氨基酸变异(如胰岛素的N或C端丢失了一个或数个氨基酸，胰岛素被甲基，酰基等修饰，胰岛素的异构体)；即通常被用于传统检测胰岛素试验是检测所谓的总胰岛素量。

因为传统胰岛素检测常常是针对病人胰岛素总体水平，无法直接鉴定内源性胰岛素与外源性胰岛素水平，这样就增加了胰岛素个体化活性水平控制的难度。

目前在进行蛋白质质谱分析时还没有发现一个用于临床直接鉴定内源性胰岛素与外源性胰岛素检测的标准化免疫质谱试剂盒。

发明内容

本发明的目的是克服已有技术的不足之处，提出一种用于检测内源性胰岛素与外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒及制备方法，该试剂盒为内源性胰岛素与外源性胰岛素检测提供了新的途径，并为进一步发现新的内源性胰岛素生物标志提供了基础。

本发明提出的用于检测内源性胰岛素与外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

一小管含C¹⁴同位素标记的内、外源性胰岛素的标准品，10～30μl；

一小管含抗胰岛素抗体的磁珠，30～50μl；

一小管缓冲液，300～500μl，该缓冲液为50～100mMPBS，pH值为7.0～8.0；

一小管洗脱液，10～50μl，该洗脱液为1～5％三氟乙酸的水溶液；

一小管能量吸收分子饱和溶液，5～10μL，该溶液由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于4℃冷藏盒中。

本发明提出的上述免疫质谱试剂盒制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)含内、外源性胰岛素的标准品的制备：

用重组DNA技术，将载内源性人胰岛素的基因系列寡核苷酸注入大肠杆菌内，合成时，加入C¹⁴同位素-精氨酸，使合成的内源性人胰岛素带有C¹⁴同位素；用质谱测试C¹⁴同位素标记的内源性胰岛素的标准品分子量为5809.6460；

所述人胰岛素其化学结构为：

A链：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN

B链：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER^(C14)GFFYTPKT

注：B链22位合成中加入了同位素C¹⁴-精氨酸(R^(C14))

同理，用重组DNA技术，将载外源性猪胰岛素的基因系列寡核苷酸注入大肠杆菌内，合成时，加入C¹⁴同位素-精氨酸，使合成的外源性猪胰岛素带有C¹⁴同位素；用质谱测试C¹⁴同位素标记的外源性猪胰岛素的标准品分子量为5779.6197；

2)制备含抗胰岛素抗体的磁珠：基质是任何能与抗体选择性或特异性结合的物质。举例说明，ProteinA、ProteinG可选择性或特异性结合抗体的Fc位点。洗去基质未吸附的物质；用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)将带有羧酸基团标记的磁性珠上基质与抗胰岛素抗体的氨基基团结合(GunnDL，etal.PreparationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972；1(4)：381-389.)，或用streptavidin标记的磁性珠上基质与biotin标记的抗胰岛素抗体结合；置磁性处理器上，15～25℃孵育20～40分钟，除去液体；

3)配制50～100mMPBS(Phosphate-BufferedSaline)，pH值为7.0～8.0缓冲液、配制1～5％三氟乙酸的洗脱液，分别分装成300～500μl小管和10～50μl小管；

4)将能量吸收分子溶解于30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中，制成能量吸收分子饱和溶液，并分装成5～10μl小管，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；

5)将上述分装好的各小管置于4℃冷藏箱中。

免疫质谱试剂盒检测胰岛素的应用实验步骤包括：

1.稀释：将生物样品先用缓冲液稀释30～50倍，将样品充分混匀；

2.结合：将上述标本100μl加至标有特异性抗体的磁珠的PCR管中，置磁性处理器上，15～25℃孵育20～40分钟，除去液体；

3.洗去非特异结合：加100μl缓冲液至已装好磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育1～5分钟，除去液体，重复上述操作两次；

4.洗脱：加10μl洗脱液1～5分钟，洗脱标本至上清液；

5.离子化：取5μl上清液移至另一个PCR管中，加入5μl能量吸收分子饱和溶液充分混匀；

6.取1μl混合溶液加样至质谱专用金属片(有3x3mm圆孔)上，自然干燥金属片；

7.将上述金属片加入质谱仪中，就会生成质谱；

8.外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性，所有样本均进行双份检测以减少实验误差。

上述的生物标志是利用一台质谱仪来检测的；该设备的质量精确度约为0.001％。

用统计学方法，通过分析血清蛋白指纹峰，发现下述生物标志可以用于区分内、外源性人胰岛素变异表达(表一)。

表一、区分内、外源性人胰岛素

A组.100例正常人对照组的血清；B组.100例糖尿病病人的血清；C组.100例正常人对照组的血清加入C¹⁴同位素内源性胰岛素(5809.6460)；D组.100例正常人对照组的血清加入C¹⁴同位素外源性胰岛素(5779.6197)。

胰岛素首先能够被具有能与胰岛素结合的抗体吸附表面捕获，非吸附物能从基质上洗脱，吸附到底基的胰岛素在质谱仪中被检测。胰岛素通过离子发生源，如激光，被离子化，产生的离子被一个离子感受集合器收集，然后质量分析器分析那些通过的离子。之后，检测器将检测的离子信息转换为质荷比。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至质谱信号强度最大值的50％。胰岛素的检测明显地将与信号强度的检测有关。这样，内、外源性胰岛素的数量与质量都可以被检测出来。

质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子化能量攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了干扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。软件中数据处理主要包括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而减轻高频噪音。

通过对内、外源性胰岛素检测而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分析。该计算机程序分析这些数据以显示检测出的内、外源性胰岛素的数量，并显示信号的强度和确定被检测的每个内、外源性胰岛素的分子量。数据分析还能包括一系列的确定内、外源性胰岛素的信号强度和矫正数据对预定统计分布状态的偏离。例如，通过计算与某些参数相关的每个峰值的高度，可规范观测到的峰。该参数可能是由仪器和类似能量吸收分子等化学成分产生的不重要的干扰，这可以设置调零。

计算机可以将计算结果数据转换成各种形式来表现。其标准谱可以表示，但在一种形式中只有峰高和质量信息可以在谱带中保留，产生一个较清晰的图，并使具有几乎相同分子量的内、外源性胰岛素更易显现。在另一种形式中，两个或更多的谱比较，便于突显独特的内、外源性胰岛素和那些高于或低于校准样本的内、外源性胰岛素。

分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图谱中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选择，软件是可用的，它可自动检测峰。一般情况下，该软件通过鉴定信号具有信噪比高于一个选择阈值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作。在一个有效的程序中，比较许多谱线以认定出现在质谱中某一选定范围内同样的一些峰。该软件的一个版本聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光谱的峰，对所有在质量(质荷比)中值附近的峰指定一个质量(质荷比)簇。

发明中使用的内、外源性胰岛素是特异性抗体所捕获。这些内、外源性胰岛素是进一步通过高精确度的质谱(massspectrometry)测定其不同分子量来知道它们特定的身份。

本发明可用于体外细胞和非侵入性的体外内、外源性胰岛素质谱检测方法的定量控制，如离体体液的内、外源性胰岛素试剂盒用于内、外源性胰岛素的检测方法。

本发明中的试剂盒及方法与其他非侵入性的体外检测方法比较，具有以下的特点：

(1)精确

质谱直接分析有很强的精确性。因为蛋白质是由氨基酸组成的，而氨基酸的平均质量是已知的，如果知道了抗原或生物标志的总分子量，那么抗原的变异(指氨基酸变化)就很容易被推测出来。

(2)方便

基质所用的支持物是磁珠等物质，用磁性分离器分离磁珠及样品，无需离心样品。

(3)快捷

用本发明提供的蛋白指纹法进行检测时，无需对蛋白质进行测序。本发明采用了抗体-质谱分析一次性、同时检测差别性的内、外源性胰岛素。

具体实施方式

本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。

实施例1

本发明提出的内、外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒实施例1，包括：

本发明提出的用于检测内源性胰岛素与外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

一小管含C¹⁴同位素标记的内、外源性胰岛素的标准品，10～30μl；

一小管含抗胰岛素抗体的磁珠，30～50μl；

一小管缓冲液，300～500μl，该缓冲液为50～100mMPBS，pH值为7.0～8.0；

一小管洗脱液，10～50μl，该洗脱液为1～5％三氟乙酸的水溶液；

一小管能量吸收分子饱和溶液，5～10μl，该溶液由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于4℃冷藏盒中。

本发明提出的上述免疫质谱试剂盒制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

2)含内、外源性胰岛素的标准品的制备：

用重组DNA技术，将载内源性人胰岛素的基因系列寡核苷酸注入大肠杆菌内，合成时，加入C¹⁴同位素-精氨酸，使合成的内源性人胰岛素带有C¹⁴同位素；用质谱测试C¹⁴同位素标记的内源性胰岛素的标准品分子量为5809.6460；

所述人胰岛素其化学结构为：

A链：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN

B链：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER^(C14)GFFYTPKT

注：B链22位合成中加入了同位素C¹⁴-精氨酸(R^(C14))

同理，用重组DNA技术，将载外源性猪胰岛素的基因系列寡核苷酸注入大肠杆菌内，合成时，加入C¹⁴同位素-精氨酸，使合成的外源性猪胰岛素带有C¹⁴同位素；用质谱测试C¹⁴同位素标记的外源性猪胰岛素的标准品分子量为5779.6197；

2)制备含抗胰岛素抗体的磁珠：基质是任何能与抗体选择性或特异性结合的物质。举例说明，ProteinA、ProteinG可选择性或特异性结合抗体的Fc位点。洗去基质未吸附的物质；用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)将带有羧酸基团标记的磁性珠上基质与抗胰岛素抗体的氨基基团结合，或用streptavidin标记的磁性珠上基质与biotin标记的抗胰岛素抗体结合；

3)配制50～100mMPBS(Phosphate-BufferedSaline)，pH值为7.0～8.0缓冲液、配制1～5％三氟乙酸的洗脱液，分别分装成300～500μl小管和10～50μl小管；

4)将能量吸收分子溶解于30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中，制成能量吸收分子饱和溶液，并分装成5～10μl小管，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；

5)将上述分装好的各小管置于4℃冷藏箱中。

实施例2

本发明提出的内、外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒实施例2，包括：

一小管含C¹⁴同位素标记的内、外源性胰岛素的标准品，10～30μl；

一小管含抗胰岛素抗体的磁珠，30～50μl；

一小管缓冲液，300～500μl，该缓冲液为50～100mMPBS，pH值为7.0～8.0；

一小管洗脱液，10～50μl，该洗脱液为1～5％三氟乙酸的水溶液；

一小管能量吸收分子饱和溶液，5～10μl，该溶液由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于4℃冷藏盒中。

免疫质谱试剂盒检测胰岛素的应用实验步骤包括：

1.稀释：将生物样品先用缓冲液稀释30～50倍，将样品充分混匀；

2.结合：将上述标本100μl加至标有特异性抗体的磁珠的PCR管中，置磁性处理器上，15～25℃孵育20～40分钟，除去液体；

3.洗去非特异结合：加100μl缓冲液至已装好磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育1～5分钟，除去液体，重复上述操作两次；

4.洗脱：加10μl洗脱液1～5分钟，洗脱标本至上清液；

5.离子化：取5μl上清液移至另一个PCR管中，加入5μl能量吸收分子饱和溶液充分混匀；

6.取1μl混合溶液加样至质谱专用金属片(有3x3mm圆孔)上，自然干燥金属片；

7.将上述金属片加入质谱仪中，就会生成质谱；

8.外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性，所有样本均进行双份检测以减少实验误差。

上述的生物标志是利用一台质谱仪来检测的；该设备的质量精确度约为0.001％。

采用本发明方法制备的试剂盒的应用及效果说明如下：

一、材料

1.标本来源：A.100例正常人对照组的血清；B.100例糖尿病病人的血清；C.100例正常人对照组的血清加入C¹⁴同位素内源性胰岛素；D.100例正常人对照组的血清加入C¹⁴同位素外源性胰岛素。

2.仪器质量控制：A.人标准化质控血清B.质谱激光能量调控：每次测试前，用上述标准化质控血清。

3.磁珠基质含已标记的抗胰岛素的抗体：将蛋白A(ProteinA)用Carbodiimide方法标记在磁珠上(见GunnDL，etal.JImmunolMethods.1：381-389，1972)；蛋白A(ProteinA)可以结合多个标有的抗体。具有吸附剂功能的ProteinA与抗体置磁性处理器上，22℃孵育30分钟，除去液体。加100μl缓冲液(50mMPBS，pH7.0～7.4)至已装好磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作两次。

二、方法

1.样品的收集：全血采集后吸取血清，置于-80℃保存；-80℃冰箱中取出血清样品，置冰盒上融解；以10,000转/分，4℃离心2分钟；取上清液。

2.样品的准备：每个吸附剂支持物点需要血清1μl，将血清用缓冲液稀释，将样品充分混匀。

3.样品检测：上样，将上述标本100μl加至已装好磁珠-ProteinA-抗体的PCR管中，置磁性处理器上，22℃孵育30分钟，除去液体。加100μl缓冲液(50mMPBS，pH7.0～8.0)至已装好磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作两次。加10μl洗国脱液2分钟，洗脱标本至上清液。取5μl上清液移至另一个PCR管中，加入5μl能量吸收分子饱和溶充分混匀，取1μl混合溶液加样至质谱专用金属片(有3x3mm圆孔)上，自然干燥金属片。所有样本均进行双份检测以减少实验误差。

4.将上述样品加入质谱中，就会生成飞行时间质谱。外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性。

实验结果

用统计学方法，通过分析血清蛋白指纹峰，发现下述生物标志可以用于区分内、外源性人胰岛素变异表达(表一)。

表一、区分内、外源性人胰岛素

注：A组.100例正常人对照组的血清；B组.100例糖尿病病人的血清；C组.100例正常人对照组的血清加入C¹⁴同位素内源性胰岛素(5809.6460)；D组.100例正常人对照组的血清加入C¹⁴同位素外源性胰岛素(5779.6197)。

在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式应当同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种用于检测内源性胰岛素、外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒的标准品，其特征在于，被合成的标准品带有C¹⁴同位素，分子量为5809.6460，化学结构为：

A链：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN

B链：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER^(C14)GFFYTPKT

2.如权利要求1所述的标准品，用于检测内源性胰岛素、外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒中的质量控制。