CN104458890B - 一种同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,包括如下步骤:(1)合成同位素标记的胰岛素B链并配制成溶液作为内标;(2)制备胰岛素标准和胰岛素样品溶液;(3)取胰岛素标准溶液和样品溶液并分别加入同位素标记的胰岛素B链;(4)将所述预处理后的胰岛素标准溶液和胰岛素样品进行质谱分析;(5)计算所述胰岛素样品溶液中胰岛素含量。本发明同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法具有准确度高,结果可靠的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定胰岛素含量的方法,尤其涉及一种同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法。
背景技术
目前,胰岛素的定量检测方法有电化学发光免疫分析法、化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附法、流式免疫微球技术、高效液相色谱法、质谱方法等。其中,电化学发光免疫分析法由于其并非开放性试剂系统,因此试剂价格过高;化学发光免疫分析法在分析过程中工作曲线会随时间飘移;酶联免疫吸附法对操作要求较高,每一步操作环节都会对实验结果产生影响;流式免疫微球技术对免疫试剂要求高、试剂制备难度大;高效液相色谱法的仪器成本高,分析时间较长;质谱方法的检测时间较快,特别是与液相色谱法相比较,大大节省了液相分离的时间,并且具有高灵敏度和准确度。
同位素稀释质谱法是一种权威的利用同位素丰度比来检测推算化合物含量的方法,主要是利用质谱测定加入了同位素标记的待测物的样品中标记及非标记待测物峰面积或峰高的比值来推算待测物在样品中的浓度。该方法具有绝对测量、灵敏度高、准确性好、分析的准确度在±2%左右、动态测量范围宽、样品制备没有定量分离的严格要求并且其测量值的溯源性好的特点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种安全可靠的胰岛素含量的方法,本发明方法可以对样品中的胰岛素含量直接进行测定。
一种同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,包括如下步骤:
(1)合成同位素标记的胰岛素B链肽段并配制成同位素标记的胰岛素B链肽段溶液作为内标;
(2)制备胰岛素标准溶液和胰岛素样品溶液;
(3)将所述胰岛素标准溶液和所述胰岛素样品溶液进行预处理:取所述胰岛素样品溶液1mL并称重,加入1mL所述同位素标记的胰岛素B链肽段溶液并称重,混匀得到加标溶液,然后还原,得到还原后的胰岛素样品溶液,根据所述胰岛素样品溶液中胰岛素的质量分数进行预处理;所述预处理步骤如下:将所述还原后的胰岛素样品溶液进行固相萃取后用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;当所述胰岛素样品溶液中胰岛素质量分数≥10-7g/g时,将所述还原后的胰岛素样品溶液用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;或将其进行固相萃取后用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;取所述胰岛素标准溶液1mL按照与上述步骤同样的步骤进行预处理;
(4)将预处理后的所述胰岛素标准溶液和所述胰岛素样品溶液进行质谱分析;
(5)计算所述胰岛素样品溶液中胰岛素含量。
本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其中,所述步骤(1)具体包括如下步骤:以氘标记的两个缬氨酸合成胰岛素B链FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT形成同位素标记的胰岛素B链肽段,准确称取1mg所述同位素标记的胰岛素B链,溶解于0.1%甲酸水中,准确配制成质量分数为1mg/g的所述同位素标记的胰岛素B链母液并分装至0.2mL的离心管中,每管分装10μL,所述分装好的同位素标记的胰岛素B链母液在-80℃冰箱中保存,将所述分装好的同位素标记的胰岛素B链母液移入15mL的离心管中并用浓度为0.1mg/mL的BSA溶液稀释至10-8~10-6g/g,得到作为内标的同位素标记的胰岛素B链肽段溶液,现用现配,在定量中作为内标。
本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其中,所述步骤(2)具体包括如下步骤:
准确称取1mg人胰岛素,溶解于0.1%甲酸水中,准确配制成人胰岛素质量分数为1mg/g的人胰岛素母液并分装至0.2mL的离心管中,每管分装10μL,分装好的人胰岛素母液在-80℃冰箱中保存,将所述分装好的人胰岛素母液移入15mL的离心管中并用浓度为0.1mg/mL的BSA溶液稀释至10-8~10-6g/g,得到所述胰岛素标准溶液,现用现配;制备所述胰岛素样品溶液的步骤与制备所述胰岛素标准溶液的步骤相同。
本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其中,所述还原步骤如下:向所述加标溶液中加入相当于所述加标溶液体积3.5%-6.5%的还原剂溶液,所述还原剂溶液为用50mmol/L的碳酸氢铵溶液溶解二硫苏糖醇得到的溶液,所述还原剂溶液中所述二硫苏糖醇的浓度为1mol/L;涡旋混匀后在55℃-65℃水浴锅中加热13min-17min。
本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其中,所述步骤(3)具体包括如下步骤:
将所述还原后的胰岛素样品溶液冷却至室温,加入相当于所述加标溶液体积3.5%-6.5%的浓度为1mol/L烷基化试剂溶液,所述烷基化试剂为碘乙酰胺,所述烷基化试剂溶液由50mmol/L的碳酸氢铵溶液溶解碘乙酰胺得到,涡旋混匀后暗反应40min,再加入相当于所述加标溶液体积13.5%-16.5%的浓度为1mol/L的所述还原剂溶液来终止烷基化反应,根据所述胰岛素样品溶液中胰岛素的质量分数进行预处理;所述预处理步骤如下:将终止烷基化的所述胰岛素样品溶液进行固相萃取后用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;当所述胰岛素样品溶液中胰岛素质量分数≥10-7g/g时,将所述终止烷基化的胰岛素样品溶液用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;或将其进行固相萃取后用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;所述胰岛素标准溶液按照与上述步骤同样的步骤进行预处理。
本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其中,所述质谱分析参数为:选用反射正离子检测模式,m/z采集范围为600Da-6000Da,每个样品点设激光随机射击39900个点进行叠加,每次射击300次,监测还原后的胰岛素B链的信号强度,即m/z=3429-3433时的信号强度;检测同位素标记的B链的信号强度,即m/z=3445-3449时的信号强度。
本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其中,所述质谱分析参数为:选用线性正离子检测模式,m/z采集范围为600Da-6000Da,每个样品点设激光随机射击39900个点进行叠加,每次射击300次,监测还原后的胰岛素B链的还原烷基化肽段的信号强度,即m/z=3543-3547时的信号强度;检测同位素标记的胰岛素烷基化肽段的信号强度,即m/z=3557-3561时的信号强度。
本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其中,所述计算所述胰岛素样品溶液中胰岛素含量的计算方法如下:
按照公式(1)计算样品溶液中胰岛素的含量:
Rm-std-标准溶液中胰岛素与标记的B链的质量比;
Rh-std-标准溶液中非标记的胰岛素B链还原肽段与标记的B链的峰高比或峰面积比;
Rh-s-样品溶液中非标记的胰岛素B链还原肽段与标记的B链的峰高比或峰面积比;
ms-l-样品溶液中标记的B链的质量(g);
m-样品溶液的质量(g);
ws-样品溶液中胰岛素的含量(g/g)。
公式(1)中当Rh-std取标准溶液中非标记的胰岛素B链还原肽段与标记的B链的峰高比时,Rh-s表示样品溶液中非标记的胰岛素B链还原肽段与标记的B链的峰高比;当Rh-std取标准溶液中非标记的胰岛素B链还原肽段与标记的B链的峰面积比时,Rh-s表示样品溶液中非标记的胰岛素B链还原肽段与标记的B链的峰面积比。
本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其中,所述计算所述胰岛素样品溶液中胰岛素含量的计算方法如下:
按照公式(2)计算样品溶液中胰岛素的含量:
Rm-std-标准溶液中胰岛素与标记的B链的质量比;
Rh-std-标准溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰高比或峰面积比;
Rh-s-样品溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰高比或峰面积比;
ms-l-样品溶液中标记的B链的质量(g);
m-样品溶液的质量(g);
ws-样品溶液中胰岛素的质量分数(g/g)。
公式(2)中当Rh-std取标准溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰高比时,Rh-s表示样品溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰高比;当Rh-std取标准溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰面积比时,Rh-s表示样品溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰面积比。
与现有技术相比,本发明方法的优点如下:
本发明方法采用同位素稀释质谱基准技术对样品中的胰岛素直接进行定量,定量结果准确可靠;在测定过程中不需要对胰岛素进行酶切,避免了酶切效率的影响;样品不需要分离直接进行测定,分析速度和分析通量显著优于普通方法。
由于胰岛素的还原肽段被烷基化以后可以在质谱上形成三重峰,即一重表示未被烷基化的还原肽段,一重表示一个巯基被烷基化的肽段,还有一重表示两个巯基均被烷基化的肽段。理论上,还原肽段若不进行烷基化而直接检测的话,在质谱上形成的峰强度将是三重烷基化的峰叠加起来的峰强度,从而可以提高检测结果的准确度以及该方法的检出限。
由于胰岛素的还原肽段上有易被氧化的巯基,在还原之后的操作过程中较难稳定存在,因此该方法将还原后的肽段进行烷基化,使之转换为稳定的还原烷基化肽段,从而提高检测结果的准确度以及该方法的检出限。
具体实施方式
实施例1
一种同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,包括如下步骤:
(1)合成同位素标记的胰岛素B链肽段并配制成同位素标记的胰岛素B链肽段溶液作为内标;
(2)制备胰岛素标准溶液和胰岛素样品溶液;
(3)将所述胰岛素标准溶液和所述胰岛素样品溶液进行预处理:取所述胰岛素样品溶液1mL并称重,加入1mL所述同位素标记的胰岛素B链肽段溶液并称重,混匀得到加标溶液,然后还原,得到还原后的胰岛素样品溶液,根据所述胰岛素样品溶液中胰岛素的质量分数进行预处理;所述预处理步骤如下:将所述还原后的胰岛素样品溶液进行固相萃取后用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;当所述胰岛素样品溶液中胰岛素质量分数≥10-7g/g时,将所述还原后的胰岛素样品溶液用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;或将其进行固相萃取后用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;取所述胰岛素标准溶液1mL按照与上述步骤同样的步骤进行预处理;
(4)将预处理后的所述胰岛素标准溶液和所述胰岛素样品溶液进行质谱分析;
(5)计算所述胰岛素样品溶液中胰岛素含量。
实施例2
以氘标记的两个缬氨酸合成胰岛素B链FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT形成同位素标记的胰岛素B链,准确称取1mg同位素标记的胰岛素B链,溶解于0.1%甲酸水中,准确配制成1mg/g的同位素标记的胰岛素B链母液并分装至0.2mL的离心管中,每管分装10μL,分装好的同位素标记的胰岛素B链母液在-80℃冰箱中保存。用0.1mg/mL的BSA溶液稀释同位素标记的胰岛素B链母液至10-6g/g于15mL的离心管中,在定量中作为内标。
标准溶液和样品溶液的配制:准确称取1mg人胰岛素,溶解于0.1%甲酸水中,准确配制成1mg/g的人胰岛素母液并分装至0.2mL的离心管中,每管分装10μL,分装好的溶液样品在-80℃冰箱中保存,用0.1mg/mL的BSA溶液稀释胰岛素母液至10-6g/g于15mL的离心管中。
标准溶液和样品溶液的处理:分别取1mL胰岛素标准溶液和样品溶液并称重,分别加入1mL同位素标记的胰岛素B链溶液并称重,以5%体积比加入1mol/L的二硫苏糖醇溶液作为还原剂,涡旋混匀后在60℃水浴锅中加热15min进行还原;取该溶液于固相萃取柱中,待流过固相萃取柱后用500μL水进行淋洗一次,最后以500μL90%乙腈-水进行洗脱;萃取液与MALDI-TOF基质溶液混匀后进行质谱分析。
质谱分析:选用反射正离子检测模式,m/z采集范围为600Da-6000Da,每个样品点设激光随机射击39900个点进行叠加,每次射击300次,监测还原后的胰岛素B链(m/z=3431)以及同位素标记的B链(m/z=3447)的信号强度。
结果计算:
样品溶液中胰岛素的含量按照公式(1)计算
Rm-std-标准溶液胰岛素与标记的B链的质量比;
Rh-std-标准溶液中非标记的胰岛素B链与标记的B链的峰高比;
Rh-s-样品溶液中非标记的胰岛素B链与标记的B链的峰高比;
ms-l-样品溶液中标记的B链的质量(g);
m-为样品溶液的质量(g);
ws-为样品溶液中胰岛素的含量(g/g)。
计算结果如表1所示。
表1 标准品及样品的数据记录及计算结果
方法学评价
准确度评价:采用回收率对方法准确度进行评价,按照回收率计算公式(3)进行回收率计算。
η-回收率(%);
m1-为根据公式(1)计算出的样品中胰岛素的质量(g);
m2-为实际称取的胰岛素的质量(g)。
在10-6g/g水平,实验结果如表2所示。
表2 各样品的回收率
重复性评价:根据公式(4)计算重复性:
RSD-相对标准偏差(%);
xi-为根据公式(1)计算出的各组样品中胰岛素的质量(g);
x-为根据公式(1)计算出的各组样品中胰岛素的平均质量(g);
n为实验组别。
在10-6g/g水平,实验结果如表3所示。
表3 RSD的计算结果
定量限和检出限:
分别将3倍、10倍信噪比带入非标记FT-30的峰高,用公式(1)计算,所求得胰岛素的浓度即为检出限和定量限的值。
实验结果表明,在10-6g/g水平,该方法的检出限为5.10×10-7g/g、定量限为1.70×10-6g/g。
实施例3
以氘标记的两个缬氨酸合成胰岛素B链FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT形成同位素标记的胰岛素B链,准确称取1mg同位素标记的胰岛素B链,溶解于0.1%甲酸水中,准确配制成1mg/g的同位素标记的胰岛素B链母液并分装至0.2mL的离心管中,每管分装10μL,分装好的同位素标记的胰岛素B链母液在-80℃冰箱中保存。用0.1mg/mL的BSA溶液稀释同位素标记的胰岛素B链母液至10-8g/g于15mL的离心管中,在定量中作为内标。
标准溶液和样品溶液的配制:准确称取1mg人胰岛素,溶解于0.1%甲酸水中,准确配制成1mg/g的人胰岛素母液并分装至0.2mL的离心管中,每管分装10μL,分装好的溶液样品在-80℃冰箱中保存。用0.1mg/mL的BSA溶液稀释胰岛素母液至10-8g/g于15mL的离心管中。
标准溶液和样品溶液的处理:取1mL胰岛素标准溶液或者样品并称重,加入1mL同位素标记的胰岛素B链溶液并称重,以5%体积比加入1mol/L的二硫苏糖醇溶液作为还原剂,涡旋混匀后在60℃水浴锅中加热15min进行还原。待其冷却至室温,以5%的体积比加入1mol/L的碘乙酰胺作为烷基化试剂,涡旋混匀后暗反应40min,再以15%的体积比加入1mol/L的二硫苏糖醇作为还原剂。取该溶液于固相萃取柱中,待流过固相萃取柱后用500μL水进行淋洗一次,最后以500μL90%乙腈-水进行洗脱。萃取液与MALDI-TOF基质溶液混匀后进行质谱分析。
质谱分析:选用线性正离子检测模式,m/z采集范围为600Da-6000Da,每个样品点设激光随机射击39900个点进行叠加,每次射击300次,监测还原后的胰岛素B链的还原烷基化肽段(m/z=3545)以及同位素标记的胰岛素烷基化肽段(m/z=3561)的信号强度。
结果计算:
样品溶液中胰岛素的含量按照公式(2)计算
Rm-std-标准溶液胰岛素与标记的B链的质量比;
Rh-std-标准溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰高比;
Rh-s-样品溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰高比;
ms-l-样品溶液中标记的B链的质量(g);
m-样品溶液的质量(g);
ws-样品溶液中胰岛素的含量(g/g)。
计算结果如表4所示。
表4 在10-8g/g水平,各样品含量的计算
方法学评价
准确度评价:采用回收率对方法准确度进行评价,结果如表5所示。
表5 在10-8g/g水平,该方法的回收率
重复性评价:根据公式(4)计算重复性:
实验结果如表6所示。
表6 各个样品的RSD计算结果
定量限和检出限:
分别将3倍、10倍信噪比带入非标记胰岛素B链的还原烷基化肽段的峰高,用公式(1)计算,所求得胰岛素的浓度即为检出限和定量限的值。
实验结果表明,在10-8g/g水平,该方法的检出限为3.75×10-9g/g、定量限为1.24×10-8g/g。
实施例4
以氘标记的两个缬氨酸合成胰岛素B链FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT形成同位素标记的胰岛素B链,准确称取1mg同位素标记的胰岛素B链,溶解于0.1%甲酸水中,准确配制成1mg/g的同位素标记的胰岛素B链母液并分装至0.2mL的离心管中,每管分装10μL,分装好的同位素标记的胰岛素B链母液在-80℃冰箱中保存。用0.1mg/mL的BSA溶液稀释同位素标记的胰岛素B链母液至10-7g/g于15mL的离心管中,在定量中作为内标。
标准溶液和样品溶液的配制:准确称取1mg人胰岛素,溶解于0.1%甲酸水中,准确配制成1mg/g的人胰岛素母液并分装至0.2mL的离心管中,每管分装10μL,分装好的溶液样品在-80℃冰箱中保存。用0.1mg/mL的BSA溶液稀释胰岛素母液至10-7g/g于15mL的离心管中。
标准溶液和样品溶液的处理:取1mL胰岛素标准溶液或者样品并称重,加入1mL同位素标记的胰岛素B链溶液并称重,以5%体积比加入1mol/L的二硫苏糖醇溶液作为还原剂,涡旋混匀后在60℃水浴锅中加热15min进行还原;待其冷却至室温,以5%的体积比加入1mol/L的碘乙酰胺作为烷基化试剂,涡旋混匀后暗反应40min,再以15%的体积比加入1mol/L的二硫苏糖醇作为还原剂,最后与MALDI-TOF基质溶液混匀,进行质谱分析。
质谱分析:选用线性正离子检测模式,m/z采集范围为600Da-6000Da,每个样品点设激光随机射击39900个点进行叠加,每次射击300次,监测还原后的胰岛素B链的还原烷基化肽段(m/z=3545)以及同位素标记的胰岛素烷基化肽段(m/z=3561)的信号强度。
结果计算:
样品溶液中胰岛素的含量按照公式(2)计算
Rm-std-标准溶液中胰岛素与标记的B链的质量比;
Rh-std-标准溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰面积比;
Rh-s-样品溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰面积比;
ms-l-样品溶液中标记的B链的质量(g);
m-样品溶液的质量(g);
ws-样品溶液中胰岛素的含量(g/g)。
计算结果如表7所示。
表7 在10-7g/g水平,各样品含量的计算
方法学评价
准确度评价:采用回收率对方法准确度进行评价。
实验结果如表8所示。
表8 在10-7g/g水平,该方法的回收率
重复性评价:根据公式(4)计算重复性:
实验结果如表9所示。
表9 各个样品的RSD计算结果
定量限和检出限:
分别将3倍、10倍信噪比带入非标记胰岛素B链的还原烷基化肽段的峰高,用公式(2)计算,所求得胰岛素的浓度即为检出限和定量限的值。
Rm-std-标准溶液中胰岛素与标记的B链的质量比;
Rh-std-标准溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰面积比;
Rh-s-样品溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰面积比;
ms-l-样品溶液中标记的B链的质量(g);
ms-样品溶液中胰岛素的质量(g)。
实验结果表明,在10-7g/g水平,该方法的检出限为2.42×10-8g/g、定量限为8.08×10-8g/g。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)合成同位素标记的胰岛素B链肽段并配制成同位素标记的胰岛素B链肽段溶液作为内标;
(2)制备胰岛素标准溶液和胰岛素样品溶液;
(3)将所述胰岛素标准溶液和所述胰岛素样品溶液进行预处理:取所述胰岛素样品溶液1mL并称重,加入1mL所述同位素标记的胰岛素B链肽段溶液并称重,混匀得到加标溶液,然后还原,得到还原后的胰岛素样品溶液,根据所述胰岛素样品溶液中胰岛素的质量分数进行预处理;所述预处理步骤如下:
a.当胰岛素样品溶液中胰岛素质量分数为10-8g/g时,将所述还原后的胰岛素样品溶液进行固相萃取后,再用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;
b.当胰岛素样品溶液中胰岛素质量分数≥10-7g/g时,将所述还原后的胰岛素样品溶液用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;或将其进行固相萃取后用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;
取所述胰岛素标准溶液1mL按照与上述步骤同样的步骤进行预处理;
(4)将预处理后的所述胰岛素标准溶液和所述胰岛素样品溶液进行质谱分析;
(5)计算所述胰岛素样品溶液中胰岛素含量。
2.根据权利要求1所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其特征在于,所述步骤(1)具体包括如下步骤:以氘标记的两个缬氨酸合成胰岛素B链形成同位素标记的胰岛素B链肽段,准确称取1mg所述同位素标记的胰岛素B链,溶解于0.1%甲酸水中,准确配制成质量分数为1mg/g的所述同位素标记的胰岛素B链母液并分装至0.2mL的离心管中,每管分装10μL,所述分装好的同位素标记的胰岛素B链母液在-80℃冰箱中保存,将所述分装好的同位素标记的胰岛素B链母液移入15mL的离心管中并用浓度为0.1mg/mL的BSA溶液稀释至10-8~10-6g/g,得到作为内标的同位素标记的胰岛素B链肽段溶液,现用现配,在定量中作为内标。
3.根据权利要求1所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其特征在于,所述步骤(2)具体包括如下步骤:
准确称取1mg人胰岛素,溶解于0.1%甲酸水中,准确配制成人胰岛素质量分数为1mg/g的人胰岛素母液并分装至0.2mL的离心管中,每管分装10μL,分装好的人胰岛素母液在-80℃冰箱中保存,将所述分装好的人胰岛素母液移入15mL的离心管中并用浓度为0.1mg/mL的BSA溶液稀释至10-8~10-6g/g,得到所述胰岛素标准溶液,现用现配;制备所述胰岛素样品溶液的步骤与制备所述胰岛素标准溶液的步骤相同。
4.根据权利要求1所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其特征在于,所述还原步骤如下:向所述加标溶液中加入相当于所述加标溶液体积3.5%-6.5%的还原剂溶液,所述还原剂溶液为用50mmol/L的碳酸氢铵溶液溶解二硫苏糖醇得到的溶液,所述还原剂溶液中所述二硫苏糖醇的浓度为1mol/L;涡旋混匀后在55℃-65℃水浴锅中加热13min-17min。
5.根据权利要求4所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其特征在于,所述步骤(3)具体包括如下步骤:
将所述还原后的胰岛素样品溶液冷却至室温,加入相当于所述加标溶液体积3.5%-6.5%的浓度为1mol/L烷基化试剂溶液,所述烷基化试剂为碘乙酰胺,所述烷基化试剂溶液由50mmol/L的碳酸氢铵溶液溶解碘乙酰胺得到,涡旋混匀后暗反应40min,再加入相当于所述加标溶液体积13.5%-16.5%的浓度为1mol/L的所述还原剂溶液来终止烷基化反应,根据所述胰岛素样品溶液中胰岛素的质量分数进行预处理;所述预处理步骤如下:
a.当胰岛素样品溶液中胰岛素质量分数为10-8g/g时,将终止烷基化的所述胰岛素样品溶液进行固相萃取后,再用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;
b.当胰岛素样品溶液中胰岛素质量分数≥10-7g/g时,将所述终止烷基化的胰岛素样品溶液用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;或将其进行固相萃取后用MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上,自然晾干;
所述胰岛素标准溶液按照与上述步骤同样的步骤进行预处理。
6.根据权利要求4所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其特征在于,所述质谱分析参数为:选用反射正离子检测模式,m/z采集范围为600Da-6000Da,每个样品点设激光随机射击39900个点进行叠加,每次射击300次,监测还原后的胰岛素B链的信号强度,即m/z=3429-3433时的信号强度;检测同位素标记的B链的信号强度,即m/z=3445-3449时的信号强度;所述m/z为质荷比。
7.根据权利要求5所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其特征在于,所述质谱分析参数为:选用线性正离子检测模式,m/z采集范围为600Da-6000Da,每个样品点设激光随机射击39900个点进行叠加,每次射击300次,监测还原后的胰岛素B链的还原烷基化肽段的信号强度,即m/z=3543-3547时的信号强度;检测同位素标记的胰岛素烷基化肽段的信号强度,即m/z=3557-3561时的信号强度;所述m/z为质荷比。
8.根据权利要求6所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其特征在于,所述计算所述胰岛素样品溶液中胰岛素含量的计算方法如下:
按照公式(1)计算样品溶液中胰岛素的含量:
Rm-std-标准溶液中胰岛素与标记的B链的质量比;
Rh-std-标准溶液中非标记的胰岛素B链还原肽段与标记的B链的峰高比或峰面积比;
Rh-s-样品溶液中非标记的胰岛素B链还原肽段与标记的B链的峰高比或峰面积比;
ms-l-样品溶液中标记的B链的质量(g);
m-样品溶液的质量(g);
ws-样品溶液中胰岛素的含量(g/g)。
9.根据权利要求7所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法,其特征在于,所述计算所述胰岛素样品溶液中胰岛素含量的计算方法如下:
按照公式(2)计算样品溶液中胰岛素的含量:
Rm-std-标准溶液中胰岛素与标记的B链的质量比;
Rh-std-标准溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰高比或峰面积比;
Rh-s-样品溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的峰高比或峰面积比;
ms-l-样品溶液中标记的B链的质量(g);
m-样品溶液的质量(g);
ws-样品溶液中胰岛素的质量分数(g/g)。
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