CN111351880A - 基于免疫亲和的重组人胰岛素生物分析的质谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种基于免疫亲和的重组人胰岛素生物分析的质谱检测方法，其采用抗体亲和富集生物样品中的重组人胰岛素，通过高分辨质谱仪定量生物样品中完整重组人胰岛素的含量，适用于临床前和临床的血清/血浆样品的定量分析，具有灵敏度高和特异性强的优点。

Description

基于免疫亲和的重组人胰岛素生物分析的质谱检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于免疫亲和的重组人胰岛素生物分析的质谱检测方法。
背景技术
胰岛素由胰岛β细胞分泌的内源性激素，由A链和B链通过链间二硫键连接，共含有51个氨基酸。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，缺乏会导致糖尿病，外源性胰岛素可用于糖尿病的治疗。胰岛素的含量对糖尿病的诊断和治疗监测很重要，因此需要建立可靠而且准确的定量胰岛素的检测方法。
发明内容
基于现有技术存在上述问题，本发明的目的是提供一种基于免疫亲和的重组人胰岛素生物分析的质谱检测方法，其采用抗体亲和富集生物样品中的重组人胰岛素，通过高分辨质谱仪定量生物样品中完整重组人胰岛素的含量，适用于临床前和临床的血清/血浆样品的定量分析，具有灵敏度高和特异性强的优点。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于免疫亲和的重组人胰岛素生物分析的质谱检测方法，包括如下步骤：
步骤S1，采用空白基质配制系列浓度梯度的重组人胰岛素标准品溶液；
步骤S2，采用内标稀释液配制门冬胰岛素溶液，作为内标工作溶液；
步骤S3，分别取相同体积的空白样品、系列浓度中的各浓度的重组人胰岛素标准品溶液和待检测样品，重组人胰岛素标准品溶液和待检测样品分别加入内标工作溶液，空白样品加入与内标工作液体积相同的内标稀释液；
步骤S4，活化预包被有胰岛素抗体的载体，并承载空白样品、系列浓度中的各浓度的重组人胰岛素标准品溶液和待检测样品，富集重组人胰岛素，再使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)和水对载体进行多次清洗，最后使用含15μg/mL促肾上腺皮质激素(ACTH1-24)，33％乙腈和0.4％三氟乙酸(TFA)的水溶液洗脱，收集洗脱液；
步骤S5，将步骤S4中获得的各样品进行色谱-质谱分析，并对质谱数据进行分析，定量分析重组人胰岛素。
根据以上方案，所述的步骤S1中的系列浓度梯度的范围是0.2ng/mL-20ng/mL。
根据以上方案，所述的内标稀释液为含150mM的辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NOG)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，所述内标工作溶液的浓度为20ng/mL。
根据以上方案，所述的步骤S4中的载体为预包被有胰岛素抗体的移液枪枪头，所述的载体活化、富集重组人胰岛素、清洗和洗脱采用多通道电子移液器进行，电子移液器程序设定如下：
Figure BDA0002436024730000021
所述的Wash buffer是磷酸缓冲盐溶液(PBS)，所述的Elution buffer是含15μg/mL促肾上腺皮质激素，33％乙腈和0.4％三氟乙酸(TFA)的水溶液。
本发明的有益效果是：
1)本方法采用预装了胰岛素抗体的试剂盒亲和富集生物样品中的胰岛素，并采用高分辨质谱仪进行检测分析，亲和富集显著提高质谱法的灵敏度并减少内源性物质干扰，本方法定量下限是200pg/mL；
2)采用高分辨质谱SIM模式采集：Thermo Q ExactiveTM Plus具有超高分辨率，显著提高方法的特异性；胰岛素碎片响应很低，采用SIM模式提高方法的灵敏度。
附图说明
图1是实施例中定量下限样品中重组人胰岛素色谱图谱；
图2是实施例中重组人胰岛素的校准曲线图；
图3是实施例中空白犬血清专属性考察色谱图谱，其中(A)重组人胰岛素和(B)内标。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明的技术方案进行说明。
一种基于免疫亲和的重组人胰岛素生物分析的质谱检测方法，本次实施例中用于检测犬血清中的重组人胰岛素，包括如下步骤：
步骤S1，采用犬空白血清配制系列浓度梯度的重组人胰岛素标准品溶液，包括0.20,0.50,1.00,2.00,5.00,10.0,15.0和20.0ng/mL的浓度的标准品溶液；
步骤S2，采用含150mM的辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NOG)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)配制浓度为20ng/mL的门冬胰岛素溶液，作为内标工作溶液；
步骤S3，分别取500μL的空白样品、系列浓度中的各浓度的重组人胰岛素标准品溶液和待检测犬血清样品置于2ml深孔板中，重组人胰岛素标准品溶液和待检测样品分别加入250μL内标工作溶液，空白样品加入250μL含150mM的辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NOG)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)；
步骤S4，在2mL深孔板中另取两孔分别加入200μL磷酸缓冲盐溶液(PBS)和200μL水溶液，一个样品分别对应2个孔的PBS溶液和水溶液；
将预包被有胰岛素抗体的移液枪枪头安装到多通道电子移液器上，多通道电子移液器上的设定如下：
Figure BDA0002436024730000031
收集洗脱液，并分别加入25μL水溶液稀释，将稀释后的样品用于步骤S5的分析，所述的Wash buffer是磷酸缓冲盐溶液(PBS)，所述的Elution buffer是含15μg/mL ACTH1-24，33％乙腈和0.4％三氟乙酸(TFA)的水溶液。
步骤S5，将步骤S4中获得的各样品进行色谱-质谱分析，液相系统为WatersACQUITY UPLC I-Class系统；色谱柱为Waters ACQUITY Peptide BEH C18 Column,
Figure BDA0002436024730000032
1.7μm,2.1mm*50mm；色谱柱柱温：35℃；流动相分别是A液：含0.1％乙酸的水溶液和B液：含0.1％乙酸的乙腈溶液；流速：0.3mL/min；进样体积：20μL；梯度如下：
时间(min) A(％) B(％) Curve
0.0 80 20 6
4.0 65 35 6
5.0 10 90 6
7.0 10 90 6
7.1 80 20 6
8.0 80 20 6
色谱分析结果如图1，经色谱系统分离的样品直接进入质谱分析，采用的质谱系统是Thermo Q ExactiveTM Plus组合型四极杆OrbitrapTM质谱仪；正离子SIM模式进行检测；源参数如下：Resolution:70000；AGC Target:1e5；MAX IT:200ms；MAX count:1；Isolationwindow:2.0m/z；Isolation offset:0m/z；Scan range:150-2000m/z。重组人胰岛素和门冬胰岛素定量和定性通道如下：
蛋白 定量离子(m/z) 定性离子(m/z)
重组人胰岛素 1162.537 968.7811
门冬胰岛素 1165.9320 971.7710
采用XcarliburTM软件采集质谱数据，TraceFinderTM软件提取色谱峰面积以及保留时间。标准曲线以不同浓度的校准品的峰面积的比值(y)对标示浓度(x)进行线性回归，权重是1/X，获得回归方程y＝a+bx，并计算相关系数R2，标准曲线样品准确度偏差为≤15％，定量下限是±20％，标准曲线结果见表1和图2：
表1标准曲线结果
Figure BDA0002436024730000041
Figure BDA0002436024730000051
考察犬空白血清对胰岛素检测的干扰，接受标准为空白基质样品中干扰物质的响应≤定量下限样品中胰岛素响应的20％，空白基质样品中干扰物质的响应≤定量下限样品中内标响应的5％；结果见表2和图3。
表2专属性结果
Figure BDA0002436024730000052
以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (4)

1.基于免疫亲和的重组人胰岛素生物分析的质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，采用空白基质配制系列浓度梯度的重组人胰岛素标准品溶液；
步骤S2，采用内标稀释液配制门冬胰岛素溶液，作为内标工作溶液；
步骤S3，分别取相同体积的空白样品、系列浓度中的各浓度的重组人胰岛素标准品溶液和待检测样品，重组人胰岛素标准品溶液和待检测样品分别加入内标工作溶液，空白样品加入与内标工作液体积相同的内标稀释液；
步骤S4，活化预包被有胰岛素抗体的载体，并承载空白样品、系列浓度中的各浓度的重组人胰岛素标准品溶液和待检测样品，富集重组人胰岛素，再使用磷酸缓冲盐溶液和水对载体进行多次清洗，最后使用含15μg/mL促肾上腺皮质激素，33％乙腈和0.4％三氟乙酸的水溶液洗脱，收集洗脱液；
步骤S5，将步骤S4中获得的各样品进行色谱-质谱分析，并对质谱数据进行分析，定量分析重组人胰岛素。
2.根据权利要求1所述的基于免疫亲和的重组人胰岛素生物分析的质谱检测方法，其特征在于，所述的步骤S1中的系列浓度梯度的范围是0.2ng/mL-20ng/mL。
3.根据权利要求1所述的基于免疫亲和的重组人胰岛素生物分析的质谱检测方法，其特征在于，所述的内标稀释液为含150mM的辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷的磷酸缓冲盐溶液，所述内标工作溶液的浓度为20ng/mL。
4.根据权利要求1所述的基于免疫亲和的重组人胰岛素生物分析的质谱检测方法，其特征在于，所述的步骤S4中的载体为预包被有胰岛素抗体的移液枪枪头，所述的载体活化、富集重组人胰岛素、清洗和洗脱采用多通道电子移液器进行，电子移液器程序设定如下：
Figure FDA0002436024720000011
所述的Wash buffer是磷酸缓冲盐溶液(PBS)，所述的Elution buffer是含15μg/mLACTH1-24，33％乙腈和0.4％三氟乙酸(TFA)的水溶液。
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