CN113710353A - 涡流混合器及其相关方法、系统和装置 - Google Patents

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CN113710353A CN202080026449.9A CN202080026449A CN113710353A CN 113710353 A CN113710353 A CN 113710353A CN 202080026449 A CN202080026449 A CN 202080026449A CN 113710353 A CN113710353 A CN 113710353A
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Abstract

一种涡流混合器(400)可具有涡流混合室(450)，所述涡流混合室(450)具有第一壁(451)、第二壁(452)以及连接所述第一壁和所述第二壁的侧壁(453)。至少两个入口端口(405、410、415、520)可沿所述侧壁配置，每个入口端口具有与其连接的入口通道。所述至少两个入口端口可围绕所述涡流混合室大致等距间隔开，并与所述涡流混合室切向配置。出口端口(455)可具有与其连接的出口通道。所述出口端口可配置在所述第二壁的径向中心处，且所述出口通道可从所述出口端口并远离所述涡流混合室延伸。

Description

涡流混合器及其相关方法、系统和装置
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年1月31日提交的标题为“VORTEX MIXERS AND ASSOCIATEDMETHODS,SYSTEMS,AND APPARATUSES THEREOF”的62/799,636号美国临时申请和2019年8月14日提交的标题为“VORTEX MIXERS AND ASSOCIATED METHODS,SYSTEMS,AND APPARATUSESTHEREOF”的62/886,592号美国临时申请的优先权和权益，上述申请的公开内容特此以引用的方式全文并入。
以引用的方式并入序列表
名称为“MRNA-064001WO_Sequence_Listing.txt”的文本文件的内容创建于2020年1月30日，大小为688B，特此以引用的方式全文并入。
技术领域
本公开涉及涡流混合器及其相关方法、系统和装置。
背景技术
涡流混合器快速旋转流体，以便引起流体的变化。涡流混合器可接收多种流体，并且可用于将多种流体混合在一起。在具有多个入口的涡流混合器中，涡流混合器可接收一种以上流体，并且可用于将流体混合在一起。
发明内容
本公开的一些实施方案提供涡流混合器及其相关方法、系统和装置。
在一些实施方案中，涡流混合器可具有涡流混合室，所述涡流混合室具有第一壁、第二壁以及连接第一壁和第二壁的侧壁。至少两个入口端口可沿侧壁配置，且每个入口端口可具有与其连接的入口通道。至少两个入口端口可围绕涡流混合室大致等距间隔开，并且可与涡流混合室切向配置。出口端口具有与其连接的出口通道，出口端口可配置在第二壁的径向中心处。出口通道可从出口端口并远离涡流混合室延伸。
在一些实施方案中，涡流混合室可以是圆形的，且侧壁可围绕第一壁和第二壁的圆周延伸。
每个入口通道可接收来自单个源的流体，或者每个入口通道可接收来自不同源的流体。
在一些实施方式中，涡流混合器可具有四个入口端口。四个入口端口中的第一两个可接收来自第一源的流体，而四个入口端口中的第二两个接收来自第二源的流体。第一两个入口端口可彼此相对配置，且第二两个入口端口可彼此相对配置，使得第一两个入口端口分开约180度，且第二两个入口端口分开约180度，而第一两个入口端口中的每一个与第二两个入口端口中的每一个成约90度。或者，四个入口端口中的每一个可从单独的源接收流体。四个入口端口中的第一两个可接收第一流体，且四个入口端口中的第二两个可接收第二流体。第一两个入口端口彼此相对配置，且第二两个入口端口彼此相对配置，使得第一两个入口端口分开约180度，且第二两个入口端口分开约180度，并且第一两个入口端口中的每一个与第二两个入口端口中的每一个成约90度。
出口端口和出口通道可与第二壁呈约90度角。
在一些实施方案中，侧壁的高度可与至少两个入口端口的高度相同。在其它实施方式中，侧壁的高度可大于至少两个入口端口的高度。
在一些实施方案中，出口端口的直径可以是x，第一壁和第二壁的直径可以是5*x，侧壁的高度可以是1.75*x，且至少两个入口端口的高度可以是0.75*x。在各种实施方式中，x的值可以是1mm、2mm、4mm、5mm或0.5mm。
混合系统可具有初始涡流混合器和后续涡流混合器。初始涡流混合器可具有涡流混合室，所述涡流混合室具有第一壁、第二壁以及连接第一壁和第二壁的侧壁。至少两个入口端口可沿侧壁配置，每个入口端口具有与其连接的入口通道。至少两个入口端口可围绕涡流混合室等距间隔开，并与涡流混合室切向配置。出口端口具有与其连接的出口通道，出口端口可以配置在第二壁的径向中心处。通道可从出口端口并远离涡流混合室延伸。
后续涡流混合器可具有涡流混合室，所述涡流混合室具有第一壁、第二壁以及连接第一壁和第二壁的侧壁。至少两个入口端口可沿侧壁配置，且每个入口端口可具有与其连接的入口通道。至少两个入口端口可围绕涡流混合室大致等距间隔开，并与涡流混合室切向配置。后续涡流混合器还可具有附加入口端口和出口端口，所述出口端口具有与其连接的出口通道。出口端口可配置在第二壁的中心处，并且通道可从出口端口并远离涡流混合室延伸。
在一些实施方案中，附加入口端口可配置在后续涡流混合器的第一壁的径向中心处。附加入口端口可与从初始涡流混合器出口端口延伸的通道连接。
分流器可配置在从初始涡流混合器出口端口延伸的出口通道的端部，并且分流器可具有第一出口和第二出口。第一出口可与至少两个入口端口中的第一个连接，且第二出口可与至少两个入口端口中的第二个连接。附加入口端口可与附加入口通道连接。
在一些实施方案中，后续涡流混合器可包括第二附加入口端口。附加入口端口和第二附加入口端口可沿侧壁配置，并且可围绕涡流混合室大致等距间隔开，并与涡流混合室切向配置。在一些实施方案中，后续涡流混合器具有两个入口端口、附加入口端口和第二附加入口端口，其中的每一者围绕涡流混合室间隔开，使得入口端口各自分开约90度。一些实施方式还包括第二分流器，其中第二分流器具有与附加入口端口连接的第一出口和与第二附加入口端口连接的第二出口。
初始涡流混合器出口端口的直径可以是x，初始涡流第一壁和初始涡流第二壁的直径可以是5*x，初始涡流侧壁的高度可以是1.75*x，且至少两个初始涡流入口端口各自的高度为0.75*x。后续涡流混合器出口端口的直径可以是y，其中后续涡流混合器第一壁和后续涡流混合器第二壁的直径可以是5*y，后续涡流混合器侧壁的高度可以是1.75*y，且至少两个后续涡流混合器入口端口各自的高度可以是0.75*y。在一些实施方案中，x和y可精确或近似地相等；在其它实施方案中，x可大于y。
初始涡流混合器和后续涡流混合器可由不锈钢、PEEK、LFEM、丙烯酸、3-D打印介质和增材制造材料中的至少一者制成。初始涡流混合器和后续涡流混合器可由相同材料制成。
初始涡流混合器出口端口和初始涡流出口通道可与初始涡流第二壁呈大约90度角，且后续涡流混合器出口端口和后续涡流出口通道可与后续涡流第二壁呈大约90度角。
一种混合方法可包括在第一涡流混合室处从至少两个入口端口接收第一流体，并在第一涡流混合室处从至少两个入口端口接收第二流体。第一流体和第二流体可在第一涡流混合室中混合以形成第一流出流体，且第一流出流体可流入第一出口通道。第一流出流体可通过分流器分流到至少两个通道中。第一流出流体可以在第二涡流混合室处从与至少两个通道连接的至少两个入口端口被接收。第三流体可以在第二涡流混合室处被接收，且流出流体和第三流体可以在第二涡流混合室中混合以形成第二流出流体。第二流出流体可流入第二出口通道。
在一些实施方式中，第一流体可包含缓冲液，且第二流体可包含脂质混合物，并且第一流出流体包含空纳米颗粒。第三流体可包含核酸(例如，RNA)，且第二流出流体可包含保持核酸的纳米颗粒。核酸可通过疏水相互作用和/或带电相互作用结合到纳米颗粒中。在核酸被接收在第二涡流混合室中之前在初始涡流混合室中形成空纳米颗粒可防止核酸在缓冲液与脂质混合物混合前直接暴露于缓冲液。防止核酸直接暴露于缓冲液可防止核酸的酸化和/或降解。
一些实施方案的概述
本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将根据要求并在支付必要费用后由专利局提供。
图1A-1E显示根据一些实施方案的涡流混合器。
图2显示根据一些实施方案的涡流混合器。
图3A-3B显示根据一些实施方案的涡流混合器。
图4A-4C显示根据一些实施方案的涡流混合器。
图5显示根据一些实施方案的两级涡流混合器。
图6A-6B显示根据一些实施方案的两级涡流混合器。
图7A-7B显示根据一些实施方案的两级涡流混合器。
图8显示根据一些实施方案的两级混合器。
图9A-9B显示根据一些实施方案的两级涡流混合器。
图10显示根据一些实施方案的两级涡流混合器。
图11A-D显示根据一些实施方案的涡流混合器的系统。
图12显示根据一些实施方案的涡流混合器的系统。
图13A显示根据一些实施方案的涡流混合器。
图13B显示根据一些实施方案的时间-压力图。
图13C显示根据一些实施方案在涡流混合器的中间室以及第一和第二壁处的质量分数。
图14A-14B显示根据一些实施方案的涡流混合器。
图14C显示图13A-13B的涡流混合器的时间-压力图。
图14D-F显示根据一些实施方案的涡流混合器。
图15A-15C显示根据一些实施方案在不同比例的涡流混合室内的混合。
图15D显示根据一些实施方案作为入口速度的函数的混合时间量程和结果如图15A-15C中所示的混合的图示。
图15E显示图14A-14B的涡流混合器的质量分数。
图16A-16N显示根据一些实施方案的各种表格和图示。
图17A-17D显示双级混合器的一些实施方案的性能特征。
图18A-18B显示涡流混合器中的示例性流体流动路径。
图19A-19B显示作为时间的函数的混合比。
一些实施方案的详述
图1A显示涡流混合器100的示例性实施方案。涡流混合器100可具有涡流混合室150，涡流混合室150具有第一壁151、第二壁152以及连接第一壁151和第二壁152的侧壁153。在一些实施方案中，涡流混合室150是圆形的；第一壁151和第二壁152是圆形的，并且侧壁153围绕圆的圆周延伸并连接第一壁151和第二壁152的外边缘。图1A的涡流混合器100具有四个入口通道105、110、115、120。在其它实施方式中，涡流混合器100可具有更多的入口通道或更少的入口通道。入口通道105、110、115、120经由入口端口125、130、135、140与涡流混合室150的侧壁152连接。入口端口125、130、135、140可围绕涡流混合室150精确或大致等距间隔开，使得流过入口通道105、110、115、120的流体切向进入涡流混合室150。在其它实施方案中，入口端口125、130、135、140和入口通道105、110、115、120可以是非切向配置的。入口端口125、130、135、140和入口通道105、110、115、120可与涡流混合室150切向配置、与涡流混合室150正交配置或呈其间的任何角度配置。具有与其连接的出口通道160的出口端口(未显示)与涡流混合室150的第二壁152连接。出口端口可配置在第二壁152的中心处，如径向中心处。流体从涡流混合室150流过出口端口，并经由出口通道160离开。出口通道160可配置成与第二壁152的平面呈直角，即约90度。在一些实施方案中，入口端口125可接收第一流体，入口端口130可接收第二流体，入口端口135可接收第三流体，且入口端口140可接收第四流体。在一些实施方案中，第一流体与第三流体相同或基本上相似。在一些实施方案中，第二流体与第四流体相同或基本上相似。
在一些实施方案中，入口通道105、110、115、120可接收来自单个源的流体。在其它实施方案中，入口通道105、110、115、120可接收来自不同源的流体。例如，入口通道105、110、115、120可各自接收来自不同源的流体，或者一些入口通道可接收来自相同源的流体，而其它入口通道接收来自不同源的流体。因此，在一些实施方案中，入口通道中的两个可接收来自第一源的流体，且另外两个入口通道可接收来自第二源的流体。或者，入口通道中的三个可接收来自第一源的流体，且第四入口通道可接收来自第二源的流体，或者两个入口通道可接收来自第一源的流体，第三入口通道可接收来自第二源的流体，且第四入口通道可接收来自第三源的流体。
在示例性实施方案中，两个通道接收来自第一源的流体，且两个通道接收来自第二源的流体。在这种实施方案中，接收来自第一源的流体的两个通道可彼此相邻或彼此交叉。相应地，接收来自第二源的流体的两个通道可彼此相邻或彼此交叉。
在图1A中所示的实施方案中，入口通道中的第一个105和入口通道中的第三个115彼此交叉配置。第一105和第三115入口通道各自与入口通道中的第二个110和入口通道中的第四个120成约90度。第一入口通道105和第三入口通道115向涡流混合室150运送第一流体，且第二入口通道110和第四入口通道120向涡流混合室150运送第二流体。第一105和第三115入口通道可接收来自共同第一流体源或来自第一流体的不同源的第一流体。类似地，第二110和第四120入口通道可接收来自共同第二流体源或来自第二流体的不同源的第二流体。
第一流体和第二流体被接收到涡流混合室150中。在一些实施方案中，至少部分地因为流体经由入口端口125、130、135、140切向进入涡流混合室150，所以第一流体和第二流体在涡流混合室150内旋转。一旦第一流体和第二流体在涡流混合室150内混合，混合流体就流过出口端口并进入出口通道160。
图1B显示涡流混合器100的实施方案的分解图。如图1B中所示，涡流混合器100由两个部件组成：盖165和混合器部件170。盖165具有对应于入口通道105、110、115、120的进口端口166、167、168、169。进口端口166、167、168、169配置成接收来自如上面针对图1A所述的任何配置的流体源的流体。
图1C显示其中进口端口166和168接收来自第一源的流体且进口端口167和169接收来自第二源的流体的示例性配置。来自第一源的流体穿过第一流体分流器171并进入进口端口166、168，而来自第二源的流体穿过第二流体分流器173并进入进口端口167、169。
流体从进口端口166、167、168、169穿过并进入入口通道105、110、115、120，此后其经过入口通道105、110、115、120，经过入口端口125、130、135、140并进入涡流混合室150。图1B的组装配置显示为图1D。图1D还显示了涡流混合室150内的出口端口155。图1E显示了图1D的顶视图。
图2显示涡流混合器200的替代实施方案。在此实施方案中，涡流混合器200包含内部分流器271、273。可使用内部分流器271、273代替图1C中所示的外部分流器。在此实施方案中，盖265具有两个进口端口266、267。来自进口端口266的第一流体进入内部分流器271的分流器通道272。分流器通道272将第一流体分开，并将第一流体运送到入口通道205、215。同时，来自进口端口267的第二流体进入内部分流器273的分流器通道274。分流器通道274将第二流体分开，并将第二流体运送到入口通道210、220。一旦第一流体和第二流体进入混合器部件270的入口通道205、210、215、220，涡流混合器200就如上面针对图1A-1E所讨论的那样操作。
图3A显示图2的替代实施方案的分解图。在图3A的实施方案中，内部分流器371、373和混合器部件370的操作类似于图2的实施方案。然而，盖365在进口端口366、367处接收流体。第一流体进入进口端口366，并经由内部流体通道输送到内部分流器371；类似地，第二流体进入进口端口367，并经由内部流体通道输送到内部分流器373。一旦流体分别经由分流器通道372和374进入内部分流器371和373，流体就被分开，并进入入口通道305、310、315、320，如上面所讨论的那样。涡流混合室350和出口端口355也被显示，并且与外部出口端口399流体联接。图3B显示组装了盖365、内部分流器371、373和混合器部件370的图3A的实施方案。
图4A显示涡流混合器400的示例性实施方案。涡流混合器400可具有涡流混合室450，涡流混合室450具有第一壁451、第二壁452以及连接第一壁451和第二壁452的侧壁453。在一些实施方案中，涡流混合室450是圆形的；第一壁451和第二壁452是圆形的，并且侧壁453围绕圆的圆周延伸并连接第一壁451和第二壁452的外边缘。图4A的涡流混合器400具有四个入口通道405、410、415、420。在其它实施方式中，涡流混合器400可具有更多的入口通道或更少的入口通道。入口通道405、410、415、420经由入口端口425、430、435、440与涡流混合室450的侧壁452连接。入口端口425、430、435、440可围绕涡流混合室450精确或大致等距间隔开，使得流过入口通道405、410、415、420的流体切向进入涡流混合室450。在其它实施方案中，入口端口425、430、435、440和入口通道405、410、415、420可非切向配置。入口端口425、430、435、440和入口通道405、410、415、420可与涡流混合室450切向配置、与涡流混合室450正交配置或呈其间的任何角度配置。具有与其连接的出口通道460的出口端口(未显示)与涡流混合室450的第二壁452连接。出口端口可配置在第二壁452的中心处，如径向中心处。流体从涡流混合室450流过出口端口，并经由出口通道460离开。出口通道460可配置成与第二壁452的平面呈直角，即约90度。
第五入口通道478可配置成接收第五流体。第三入口通道478可经由第五入口端口458与涡流混合室450流体连接。第五入口端口458可配置在涡流混合室450的第一壁451中。在一些实施方案中，第五入口端口458可配置在第一壁451的中心，如第一壁451的径向中心。第三入口端口458可配置在涡流混合室450的第二壁452中。在一些实施方案中，第五入口端口458可配置在第二壁452的中心，如第二壁452的径向中心。第一壁451和第二壁452通过侧壁453连接。在一些实施方案中，第五入口室478的直径可以为涡流混合器400的直径的约0.1x。在一些实施方案中，出口端口455的直径可以为涡流混合器400的直径的约0.2x。
图4B和4C分别显示涡流混合器400的实施方案和涡流混合器的分解图。涡流混合器400可具有涡流混合室450，涡流混合室450具有第一壁451、第二壁452以及连接第一壁451和第二壁452的侧壁453。在一些实施方案中，涡流混合室450是圆形的；第一壁451和第二壁452是圆形的，并且侧壁453围绕圆的圆周延伸并连接第一壁451和第二壁452的外边缘。图4A的涡流混合器400具有四个入口通道405、410、415、420。在其它实施方式中，涡流混合器400可具有更多的入口通道或更少的入口通道。入口通道405、410、415、420经由入口端口425、430、435、440与涡流混合室450的侧壁452连接。入口端口425、430、435、440可围绕涡流混合室450精确或大致等距间隔开，使得流过入口通道405、410、415、420的流体切向进入涡流混合室450。在其它实施方案中，入口端口425、430、435、440和入口通道405、410、415、420可非切向配置。入口端口425、430、435、440和入口通道405、410、415、420可与涡流混合室450切向配置、与涡流混合室450正交配置或呈其间的任何角度配置。具有与其连接的出口通道460的出口端口455与涡流混合室450的第二壁452连接。出口端口455可配置在第二壁452的中心处，如径向中心处。流体从涡流混合室450流过出口端口455，并经由出口通道460离开。出口通道460可配置成与第二壁452的平面呈直角，即约90度。
第五入口通道478可配置成接收第五流体。第三入口通道478可经由第五入口端口458与涡流混合室450流体连接。第五入口端口458可配置在涡流混合室450的第一壁451中。在一些实施方案中，第五入口端口458可配置在第一壁451的中心，如第一壁451的径向中心。第五入口端口458可配置在涡流混合室450的第二壁452中。在一些实施方案中，第五入口端口458可配置在第二壁452的中心，如第二壁452的径向中心。第一壁451和第二壁452通过侧壁453连接。在一些实施方案中，第五入口室478的直径可以为涡流混合器400的直径的约0.1x。在一些实施方案中，出口端口455的直径可以为涡流混合器400的直径的约0.2x。在一些实施方案中，入口端口425可接收第一流体，入口端口430可接收第二流体，入口端口435可接收第三流体，入口端口440可接收第四流体，且入口端口458可接收第五流体。在一些实施方案中，第一流体与第三流体相同或基本上相似。在一些实施方案中，第二流体与第四流体相同或基本上相似。在一些实施方案中，第一流体和第三流体可包括脂质。在一些实施方案中，第一流体和第三流体可包括乙醇。在一些实施方案中，第一和第三流体可包括脂质。在一些实施方案中，第二和第四流体可包括核酸。(例如，RNA)。在一些实施方案中，第二和第四流体可包括乙醇。在一些实施方案中，第二和第四流体可包括脂质。在一些实施方案中，第五流体可包括核酸。
图5显示两级混合器500的示例性实施方案。第一级混合器501可配置成类似于任何上面讨论的涡流混合器。如图所示，第一级混合器501具有涡流混合室550，涡流混合室550具有第一壁551和第二壁552以及连接第一壁551和第二壁552的侧壁553。涡流混合室550可具有沿侧壁553配置的四个入口端口525、530、535、540。四个入口端口525、530、535、540中的每一个可接收来自相应入口通道505、510、515、520的流体。第一入口通道505和第三入口通道515可接收第一流体，且第二入口通道510和第四入口通道520可接收第二流体。在一些实施方案中，每个入口通道505、510、515、520可从单独的流体源接收流体。在其它实施方式中，第一入口通道505和第三入口通道515可接收来自第一流体源的第一流体；第一流体可穿过将第一流体导向第一入口通道505和第三入口通道515的第一流体分流器。相应地，第二入口通道510和第四入口通道520可接收来自第二流体源的第二流体；第二流体可穿过将第二流体导向第二入口通道510和第四入口通道520的第二流体分流器。如上面所讨论的那样，第一流体分流器和第二流体分流器可以是内部分流器或外部分流器。
第一流体流过第一入口通道505并经由第一入口端口525进入涡流混合室550，并且流过第三入口通道515并经由第三入口端口535进入涡流混合室550。第一入口端口525和第三入口端口535可彼此精确或大致成180度，并且可引导第一流体，使得第一流体切向进入涡流混合室550。在其它实施方案中，第一入口端口525和第三入口端口535可引导第一流体，使得第一流体正交或以切向与正交之间的角度进入涡流混合室550。类似地，第二流体流过第二入口通道510并经由第二入口端口530进入涡流混合室550，并且流过第四入口通道520并经由第四入口端口540进入涡流混合室550。第二入口端口530和第四入口端口540可彼此精确或大致成180度，并且可与第一入口端口525和第三入口端口535精确或大致成90度。第二入口端口530和第四入口端口540引导第二流体，使得第二流体切向、正交或以其间的任何角度进入涡流混合室550。在一些实施方案中，入口端口525可接收第一流体，入口端口530可接收第二流体，入口端口535可接收第三流体，且入口端口540可接收第四流体。在一些实施方案中，第一流体与第三流体相同或基本上相似。在一些实施方案中，第二流体与第四流体相同或基本上相似。在一些实施方案中，第一流体和第三流体可包括脂质。在一些实施方案中，第一流体和第三流体可包括乙醇。在一些实施方案中，第二和第四流体可包括脂质。在一些实施方案中，第二和第四流体可包括酸性缓冲液。在一些实施方案中，第二和第四流体可包括核酸。(例如，RNA)。在一些实施方案中，第二和第四流体可包括乙醇。
涡流混合室550可具有出口端口555，出口端口555具有与其连接的出口通道560。出口端口可配置在涡流混合室550的第二壁552上。出口端口可配置在第二壁552的中心处，如径向中心处。来自第一级混合器501的流出流体从涡流混合室550流过出口端口555，并经由出口通道560离开。
第一级混合器流出流体通过出口通道560流出第一级涡流混合室550并进入分流器561。分流器561将第一级混合器流出流体分开，并将第一级混合器流出流体经由第二级混合器502的进口端口562导入第一入口通道575和经由第二级混合器502的进口端口563导入第二入口通道577。第一入口通道575和第二入口通道577各自分别经由第一入口端口585和第二入口端口586与第二级涡流混合室580连接。第一入口端口585和第二入口端口586可配置成精确或大致180度分开，并且可配置成使得第一级混合器流出流体从每个端口585、586切向进入涡流混合室580。在一些实施方案中，第一入口端口585和第二入口端口586可以配置成使得第一级混合器流出流体以与涡流混合室580正交的角度或以与涡流混合室580成正交角度与切向之间的任何角度进入涡流混合室580。第三入口通道578可配置成接收第二级流入流体。第三入口通道578可经由第三入口端口588与第二级涡流混合室580流体连接。第三入口端口588可配置在涡流混合室580的第一壁581中。在一些实施方案中，第三入口端口588可配置在第一壁581的中心，如第一壁581的径向中心。第三入口端口588可配置在涡流混合室580的第二壁582中。在一些实施方案中，第三入口端口588可配置在第二壁582的中心，如第二壁582的径向中心。第一壁581和第二壁582通过侧壁583连接。在一些实施方案中，第三入口端口588可接收第五流体。在一些实施方案中，第五流体可包括核酸。
涡流混合室580可具有第二级混合器出口端口589，第二级混合器出口端口589具有与其连接的第二级混合器出口通道590。第二级混合器出口端口可配置在第二壁582的中心，如径向中心。来自第二级混合器502的流出流体从涡流混合室580流过第二级混合器出口端口589，并经由第二级混合器出口通道590离开。
在一些实施方案中，第二级混合器502可具有与图4A中描述的具有四个入口通道的实施方案相同或基本上相似的几何形状。换言之，第二级混合器502可具有第一入口端口585、第二入口端口586、第三入口端口(未显示)和第四入口端口(未显示)。在一些实施方案中，第三入口端口可与第三入口通道(未显示)流体联接，且第四入口端口可与第四入口通道(未显示)流体联接。在一些实施方案中，第三和第四入口通道可包括进口端口，可在该处将流体添加到第二级混合器中。在一些实施方案中，第三和第四入口通道可与分流器561流体联接，在这种情况下，分流器561将是四通分流器。
图6A和图6B显示两级涡流混合系统600的实施方案。在此实施方案中，第一涡流混合器601的操作可类似于图3A-3B的涡流混合器300。此第一涡流混合器601包含内部分流器671、673。可使用内部分流器671、673代替图6B中所示的外部分流器。在此实施方案中，盖665具有两个进口端口666、667。来自进口端口666的第一流体进入内部分流器671的分流器通道672。分流器通道672将第一流体分开，并将第一流体运送到入口通道605、615。同时，来自进口端口667的第二流体进入内部分流器673的分流器通道674。分流器通道674将第二流体分开，并将第二流体运送到入口通道610、620。一旦第一流体和第二流体进入混合器部件670的入口通道605、610、615、620，第一涡流混合器601就如上面针对图1A-2所讨论的那样操作。在初始涡流混合室650内发生混合后，混合流体通过初始涡流混合器出口端口655并然后通过初始涡流混合器出口通道660离开始涡流混合室650。第一级混合器流出流体然后进入分流器661。分流器661将第一级混合器流出流体分开，并通过盖663上的两个进口端口662和664将第一级混合器流出流体引导到第二涡流混合器602。进口端口662和664各自分别将混合流体供料到位于混合器部件676上的第二级流体入口通道675和677。第二级流体入口通道675和677将流体供料到第二级涡流混合室680。第三入口通道678可配置成接收第二级流入流体。第三入口通道678可经由第三入口端口688与第二级涡流混合室680流体连接。在第二级涡流混合室680内发生混合后，产物流体可经由第二级混合器出口端口689通过第二级混合器出口通道690离开第二级涡流混合室680。在一些实施方案中，进口端口666可接收第一流体，进口端口667可接收第二流体，且入口端口688可接收第三流体。
图7A显示作为图6A的替代实施方案的混合系统700的分解图。在图7A的实施方案中，内部分流器771、773和混合器部件770的操作类似于图6的实施方案。然而，盖765在进口端口766、767处接收流体。第一流体进入进口端口766，并经由内部流体通道输送到内部分流器771；类似地，第二流体进入进口端口767，并经由内部流体通道输送到内部分流器773。一旦流体分别经由分流器通道772和774进入内部分流器771和773，流体就被分开，并如上面参考图6A所讨论的那样进入入口通道705、710、715、720。还显示了初始涡流混合室750和出口端口755。第一级混合器流出流体然后经由分流器通道759进入分流器761。分流器761将第一级混合器流出流体分开，并将第一级混合器流出流体引导到位于混合器部件776上的第二级流体入口通道775和777。第二级流体入口通道775和777向第二级涡流混合室780供料。第三入口通道778可配置成接收第二级流入流体。第三入口通道778可经由第三入口端口788与第二级涡流混合室780流体连接。第三入口通道778与第三进口端口798流体联接。第三进口端口798可与混合器部件770联接。第二级涡流混合室780具有第二级涡流混合室出口端口789，其与第二级涡流混合室出口通道790联接。第二级涡流混合室出口通道790与外部出口端口799流体联接。图7B显示组装了盖765、内部分流器771、773、761和混合器部件770、776的图7A的实施方案。
在这些实施方案中的每一者中，涡流混合器的尺寸可变化。在一些实施方案中，涡流混合器的所有尺寸可线性和/或按比例缩放。
另外，在这些实施方案中的每一者中，各层(包括但不限于盖、分流器、混合器部件等)可通过将层旋拧在一起、通过软性粘结(例如，使用可采用压力融合在一起的材料)或通过任何其它连接方式来连接。或者，每个实施方案的各层可通过增材制造(如3-D打印)来形成，并因此可形成为数层和/或单个部件。
在示例性实施方案中，第一流体可以是乙醇中的脂质(在本文中也称为脂质主混合物)，且第二流体可以是缓冲液中的核酸。脂质主混合物和缓冲液中的核酸可经由交替的入口端口进入涡流混合室。因此，在具有四个入口通道/入口端口的实施方案中，脂质主混合物可经由第一入口端口流过第一入口通道到涡流混合室；缓冲液中的核酸可经由第二入口端口流过第二入口通道到涡流混合室；脂质主混合物可经由第三入口端口流过第三入口通道到涡流混合室；且缓冲液中的核酸可经由第四入口端口流过第四入口通道到涡流混合室。第一入口端口可呈精确或大致0度进入涡流混合室；第二入口端口可呈精确或大致约90度；第三入口端口可呈精确或大致180度；且第四入口端口可呈精确或大致270度。通过在涡流混合室中混合这两种流体，形成在其中含有核酸的脂质纳米颗粒。
图8显示两级混合器800的实施方案。第一级混合器801的配置可类似于上面讨论的任何涡流混合器。如图所示，第一级混合器801具有涡流混合室850，涡流混合室850具有第一壁851和第二壁852以及连接第一壁851和第二壁852的侧壁853。涡流混合室850可具有沿侧壁853配置的四个入口端口825、830、835、840。四个入口端口825、830、835、840中的每一个可接收来自相应入口通道805、810、815、820的流体。第一入口通道805和第三入口通道815可接收第一流体，且第二入口通道810和第四入口通道820可接收第二流体。在一些实施方案中，每个入口通道805、810、815、820可从单独的流体源接收流体。在其它实施方式中，第一入口通道805和第三入口通道815可接收来自第一流体源的第一流体；第一流体可穿过将第一流体导向第一入口通道805和第三入口通道815的第一流体分流器。相应地，第二入口通道810和第四入口通道820可接收来自第二流体源的第二流体；第二流体可穿过将第二流体导向第二入口通道810和第四入口通道820的第二流体分流器。如上面所讨论的那样，第一流体分流器和第二流体分流器可以是内部分流器或外部分流器。
第一流体流过第一入口通道805并经由第一入口端口825进入涡流混合室850，并且流过第三入口通道815并经由第三入口端口835进入涡流混合室850。第一入口端口825和第三入口端口835可彼此精确或大致成180度，并且可引导第一流体，使得第一流体切向进入涡流混合室850。在其它实施方案中，第一入口端口825和第三入口端口835可引导第一流体，使得第一流体正交或以切向与正交之间的角度进入涡流混合室850。类似地，第二流体流过第二入口通道810并经由第二入口端口830进入涡流混合室850，并且流过第四入口通道820并经由第四入口端口840进入涡流混合室850。第二入口端口830和第四入口端口840可彼此精确或大致成180度，并且可与第一入口端口825和第三入口端口835精确或大致成约90度。第二入口端口830和第四入口端口840引导第二流体，使得第二流体切向、正交或以其间的任何角度进入涡流混合室850。
涡流混合室850可具有出口端口(未显示)，出口端口具有与其连接的出口通道860。出口端口可配置在涡流混合室850的第二壁852上。出口端口可配置在第二壁852的中心，如径向中心。来自第一级混合器801的流出流体从涡流混合室850流过出口端口，并经由出口通道860离开。
第一级混合器流出流体流过出口通道860并进入第二级混合器802。在图8中所示的实施方案中，第二级混合器802具有涡流混合室880。涡流混合室880具有第一壁881、第二壁882以及连接第一壁881和第二壁882的侧壁883。第一级混合器流出流体从出口通道860流出，并经由第二级混合器入口端口875进入涡流混合室880。第二级混合器入口端口875可配置在涡流混合室880的第一壁881中。在一些实施方案中，第二级混合器入口端口875可配置在第一壁881的中心，如第一壁881的径向中心。
涡流混合室880可具有附加入口端口。在图8中所示的实施方案中，涡流混合室880具有两个附加入口端口876、877。两个附加入口端口876、877可配置成接收来自两个入口通道878、879的第二级流入流体。两个附加入口端口876、877可彼此精确或大致成180度配置，并且可配置成引导流体切向进入涡流混合室880。在其它实施方案中，两个附加入口端口876、877可配置成引导流体非切向进入涡流混合室880，如以正交角度或以正交与切向之间的任何角度进入。第二级流入流体可从两个单独的流体源接收，或者可从单个流体源接收，并经由内部或外部分流器分流，如上面所讨论的那样。在一些实施方案中，入口端口825可接收第一流体，入口端口830可接收第二流体，入口端口835可接收第三流体，且入口端口840可接收第四流体。在一些实施方案中，第一流体与第三流体相同或基本上相似。在一些实施方案中，第二流体与第四流体相同或基本上相似。在一些实施方案中，第一流体和第三流体可包括脂质。在一些实施方案中，第一流体和第三流体可包括乙醇。在一些实施方案中，第二和第四流体可包括核酸。在一些实施方案中，第二和第四流体可包括乙醇。在一些实施方案中，入口端口876可接收第五流体，且入口端口877可接收第六流体。在一些实施方案中，第五流体可与第六流体相同或基本上相似。在一些实施方案中，第五流体和第六流体可包括核酸。
涡流混合室880可具有第二级混合器出口端口889，第二级混合器出口端口889具有与其连接的第二级混合器出口通道890。第二级混合器出口端口可配置在第二壁882的中心处，如径向中心处。来自第二级混合器802的流出流体从涡流混合室880流过出口端口，并经由第二级混合器出口通道890离开。
图9A-9B显示两级混合器900的替代实施方案。第一级混合器901的配置如同图8的第一级混合器801。如图所示，第一级混合器901具有涡流混合室950，涡流混合室950具有第一壁951和第二壁952以及连接第一壁951和第二壁952的侧壁953。涡流混合室950可具有沿侧壁953配置的四个入口925、930、935、940。四个入口端口925、930、935、940中的每一个可接收来自相应入口通道905、910、915、920的流体。第一入口通道905和第三入口通道915可接收第一流体，且第二入口通道910和第四入口通道920可接收第二流体。在一些实施方案中，每个入口通道905、910、915、920可从单独的流体源接收流体。在其它实施方式中，第一入口通道905和第三入口通道915可接收来自第一流体源的第一流体；第一流体可穿过将第一流体导向第一入口通道905和第三入口通道915的第一流体分流器。相应地，第二入口通道910和第四入口通道920可接收来自第二流体源的第二流体；第二流体可穿过将第二流体导向第二入口通道910和第四入口通道920的第二流体分流器。如上面所讨论的那样，第一流体分流器和第二流体分流器可以是内部分流器或外部分流器。然而，在图9A-9B的实施方案中，第二级混合器902侧向转动，使得来自第一级混合器901的出口通道960配置成经由沿涡流混合室980的侧壁983配置的第二级混合器入口端口975进入第二级涡流混合室980。第二级混合器入口端口975配置成使得第一级混合器流出流体切向进入第二级涡流混合室980。在其它实施方案中，第二级混合器入口端口975可配置成使得第一级混合器流出流体非切向进入第二级涡流混合室980，如与涡流混合室980正交或以正交与切向之间的任何角度进入。在图9A中，第二级混合室980还具有沿混合室980的侧壁983配置的第二入口端口976。第二入口端口976具有与其连接的入口通道978。第二入口通道978接收第二级入口流体。第二级入口流体经由第二入口端口976从入口通道978流出并进入混合室980。第二入口端口976配置成使得流体切向流入混合室980。在图9B的实施方案中，第二入口端口976配置成与混合室980正交，第二入口通道978与第二入口端口976连接。在其它实施方案中，第二入口端口976可配置成使得流体以正交与切向角度之间的任何角度流入混合室980。第二入口端口976可配置成与入口端口975精确或大致成180度。第二级混合器902可具有将第二级流出流体引导到第二级出口通道990的第二级出口端口(未显示)。在一些实施方案中，入口端口925可接收第一流体，入口端口930可接收第二流体，入口端口935可接收第三流体，且入口端口940可接收第四流体。在一些实施方案中，第一流体与第三流体相同或基本上相似。在一些实施方案中，第二流体与第四流体相同或基本上相似。在一些实施方案中，第一流体和第三流体可包括脂质。在一些实施方案中，第一流体和第三流体可包括乙醇。在一些实施方案中，第二和第四流体可包括核酸。在一些实施方案中，第二和第四流体可包括乙醇。
图10显示两级混合器1000的另一替代实施方案。第一级混合器1001和第二级混合器1002各自的配置如同图8的第一级混合器801。如图所示，第一级混合器1001具有涡流混合室1050，涡流混合室1050具有第一壁1051和第二壁1052以及连接第一壁1051和第二壁1052的侧壁1053。涡流混合室1050可具有沿侧壁1053配置的四个入口端口1025、1030、1035、1040。四个入口端口1025、1030、1035、1040中的每一个可接收来自相应入口通道1005、1010、1015、1020的流体。第一入口通道1005和第三入口通道1015可接收第一流体，且第二入口通道1010和第四入口通道1020可接收第二流体。在一些实施方案中，每个入口通道1005、1010、1015、1020可从单独的流体源接收流体。在其它实施方式中，第一入口通道1005和第三入口通道1015可接收来自第一流体源的第一流体；第一流体可穿过将第一流体导向第一入口通道1005和第三入口通道1015的第一流体分流器。相应地，第二入口通道1010和第四入口通道1020可接收来自第二流体源的第二流体；第二流体可穿过将第二流体导向第二入口通道1010和第四入口通道1020的第二流体分流器。如上面所讨论的那样，第一流体分流器和第二流体分流器可以是内部分流器或外部分流器。在此，第一级混合器流出流体通过出口通道1060流出第一级涡流混合室1050并进入分流器1061。分流器1061将第一级混合器流出流体分开，并将第一级混合器流出流体引导到第二级混合器1002的第一入口通道1075和第三入口通道1077中。第二级流入流体流入第二入口通道1076和第四入口通道1078。第二级流入流体可从两个单独的流体源接收，或者可从单个流体源接收，并经由内部或外部分流器分流，如上面所讨论的那样。
第一入口通道1075、第二入口通道1076、第三入口通道1077和第四入口通道1078可分别经由第一入口端口1085、第二入口端口1086、第三入口端口1087和第四入口端口1088与第二级涡流混合室1080流体连接。第一入口通道1075可配置在涡流混合室1080的侧壁1081中。第一、第二、第三和第四入口端口1085、1086、1087、1088可各自围绕侧壁1083的圆周彼此分开约90度。第一入口端口1085和第三入口端口1087可彼此交叉，即大致或精确分开180度，且第二入口端口1086和第四入口端口1088可彼此交叉，即大致或精确分开180度。第一入口端口1085、第二入口端口1086、第三入口端口1087和第四入口端口1088可各自配置成相对于涡流混合室1080的侧壁1083切向引导流体。在替代实施方案中，入口端口1085、1086、1087、1088可配置成相对于侧壁1083以正交角度引导流体，或者入口端口1085、1086、1087、1088可配置成以与侧壁1083成正交角度与切向之间的任何角度来引导流体。第二级涡流混合室1080可具有第二级混合器出口端口1089，第二级混合器出口端口1089具有与其连接的第二级混合器出口通道1090。第二级混合器出口端口可配置在第二壁1082的中心，如径向中心。来自第二级混合器1002的流出流体从涡流混合室1080流过出口端口，并经由第二级混合器出口通道1090离开。在一些实施方案中，入口端口1025可接收第一流体，入口端口1030可接收第二流体，入口端口1035可接收第三流体，且入口端口1040可接收第四流体。在一些实施方案中，第一流体与第三流体相同或基本上相似。在一些实施方案中，第二流体与第四流体相同或基本上相似。在一些实施方案中，第一流体和第三流体可包括脂质。在一些实施方案中，第一流体和第三流体可包括乙醇。在一些实施方案中，第二和第四流体可包括核酸。在一些实施方案中，第二和第四流体可包括乙醇。在一些实施方案中，入口端口1076可接收第五流体，且入口端口1077可接收第六流体。在一些实施方案中，第五流体可与第六流体相同或基本上相似。在一些实施方案中，第五流体和第六流体可包括核酸。
如上面所讨论的那样，在图5、8、9和10中所示的每个实施方案的一些实施方式中，第一级混合器接收乙醇中的脂质(脂质主混合物)和酸性缓冲液。在第一级涡流混合室中混合后，第一级混合器流出流体是空脂质纳米颗粒。空脂质纳米颗粒的尺寸取决于多个混合参数，如湍流动能和混合时间(τmix)。含有空脂质纳米颗粒的流体穿过第一级混合器出口通道。在这种情况发生时，经过时间(τres)之后第一级混合器流出流体才进入第二级混合器。如上面针对图5、8、9和10中的每一者所讨论的那样，空脂质纳米颗粒进入第二级混合器；如针对图5、8、9和10中的每一者所描述的那样，还将核酸引入到第二级混合器中。因此，空脂质纳米颗粒在第二级混合器中与核酸混合。核酸结合到空脂质纳米颗粒中，并形成保持核酸的纳米颗粒。含有保持核酸的纳米颗粒的流体然后经由第二级混合器出口端口离开第二级混合器并进入第二级混合器出口通道。当按比例放大混合器时，壁效应和入口流态会发生变化，但调节速度可恢复所需的混合特性。
图11A、图11B、图11C和图11D显示根据实施方案的混合系统1100。在一些实施方案中，混合系统1100可具有多个单级混合器或多级混合系统。在一些实施方案中，混合器可具有与本文参考图1A-1E、图2、图3A-3B和/或图4A-4C描述的混合器相同或基本上相似的特性。在一些实施方案中，多级混合系统可具有与本文参考图5、图6A-6B、图7A-7B、图8、图9A-9B和/或图10描述的多级混合系统相同或基本上相似的特性。在此实施方案中，进口端口1166、1167、1168、1169分别向入口通道1105、1110、1115、1120供料。入口通道1105、1110、1115、1120供料到涡流混合室1150中，并通过出口端口1155和出口通道1160离开。在此实施方案中，进口端口1166、1167、1168、1169是与混合器板1121联接的移液管。混合板1121包括以d x w配置并排布置在混合板1121的平面中的n个反应器，其中n、d和w是整数。在图11A和图11B中描述的实施方案中，n＝24，d＝6，且w＝4。在此实施方案中，使用的移液管的数量是96个，因为在每个涡流混合器上有4个进口端口。在一些实施方案中，混合系统1100可包括如上图1A-1E中所描述的所有单级混合器。在一些实施方案中，混合系统1100可包括如图5中所描述的所有多级混合系统。在一些实施方案中，d和/或w可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。
图12显示根据实施方案的具有混合板1221的混合系统1200。在一些实施方案中，如图11中所描述的那样，混合板1221可与混合板1121相同或基本上相似，并且可与多个移液管(未显示)附接，以形成与上面参考图11描述的混合系统1100相同或基本上相似的混合系统。混合板1221可相对于传送台架1220处于固定位置。混合系统1200可包括多个产物容器1222。在混合流体已经移动通过混合板1221内的单级或多级涡流混合器的系统后，混合流体可沉积到产物容器1222中。产物容器1222可具有对应于混合板1221上的单级或多级涡流混合器的数量的许多空腔。混合板1221可以将来自其单级或多级涡流混合器中的每一者的产物一次一个地分配到产物容器1222中。一旦单个产物容器1222A已经接收了所需量的产物流体，则进入单个产物容器1222A的流体流可暂时停止，同时传送台架1220将后续的产物容器1222B移动到使得后续产物容器1222B可接收产物的位置。对于n个产物容器1222，此过程可以继续，其中n是整数。在一些实施方案中，n可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更大。在一些实施方案中，混合系统1200可以是自动化的。
然而，在一些实施方式中，发生结垢，并且结垢物在涡流混合室中积累。这可能导致压力升高和峰值形成，因为积聚的结垢物堵塞了出口端口。结垢物也可能在侧壁处或附近积聚。在长混合时间下，结垢物积聚导致压差指示器(PDI)增加和混合效率降低。这进一步导致在涡流混合室的侧壁处或附近混合质量降低。这示于图13A-13C中。图13A显示在涡流混合器1300的涡流混合室1350中积累的结垢物。图13B是显示随时间的推移发生结垢时压力积聚的图。图13C显示由于结垢物在涡流混合室1350的中间室和第一和/或第二壁处积累而在涡流混合室的侧壁附近压力积聚。
在一些这类实施方案中，涡流混合室的高度可与入口端口和/或入口通道的高度相同。这种缩放示于图14A中。然而，发现增加涡流混合室的高度会减少结垢并提高混合质量。因此，图14B显示了替代实施方案，其中涡流混合室的高度增加，而涡流混合器1400的其它相对尺寸保持相同。因此，涡流混合室的高度大于入口端口和/或入口通道的高度。在一个这种实施方案中，如图14B中所示，涡流混合室1450的侧壁1453可以在入口端口1425、1430、1435、1440的顶部上方延伸，并且可以在入口端口1425、1430、1435、1440的底部下方延伸。因此，涡流混合室的第一壁1451与第二壁1452之间的距离大于入口端口1425、1430、1435、1440的高度。在一些实施方案中，入口端口1425、1430、1435、1440可在侧壁1453的高度内居中。图14A和图14B的实施方案中压力随时间的比较示于图14C的图中。基线压力降低，并且压力升高之前的操作时间增加。
图14D-F显示比例不同的示例性涡流混合器：图14D显示具有大约0.3mm出口端口/出口通道直径的示例性涡流混合器；图14E显示具有大约1.0mm出口端口/出口通道直径的示例性涡流混合器；且图14F显示具有大约4.0mm出口端口/出口通道直径的示例性涡流混合器。所有其它尺寸相应地缩放。
例如，在初始实施方案中，出口端口/出口通道直径可以为约1.0mm，并且尺寸可如下：
涡流混合器部件 1x比例尺寸
涡流混合室直径 约5.00mm
涡流混合室高度 约1.75mm
入口通道/入口端口高度 约0.75mm
入口通道/入口端口宽度 约0.75mm
入口通道长度 约10.0mm
出口通道/出口端口直径 约1.00mm
出口通道长度 约10.0mm
可以按比例放大或缩小涡流混合器的尺寸。例如，尺寸可以是0.25x、0.5x、0.75x、1x、2x、2.5x、3x、4x、5x和/或任何其它比例。示例性尺寸示于下表中：
Figure BDA0003287551320000261
通过改变尺寸，可以按比例改变通过入口通道/入口端口和出口通道/出口端口的流速。在示例性实施方案中，第一流体通过第一入口通道1405流到第一入口端口1425，并通过第三入口通道1415流到第三入口端口1435，并且第二流体通过第二入口通道1410流到第二入口端口1430，并通过第四入口通道1420流到第四入口端口1440。第一流体和第二流体可通过单独的流体进入管线(未显示)或如上面所讨论的那样经由分流器被引导到每个相应的入口通道。第一和第三入口端口1425、1435可允许第一流体直接或大致彼此交叉地进入涡流混合室1450。类似地，第二和第四入口端口1430、1440可允许第二流体直接或大致彼此交叉地进入涡流混合室1450。第一、第二、第三和第四入口端口1425、1430、1435、1440中的每一者可各自允许流体与其它入口端口精确或大致呈90°进入涡流混合室。如上面所讨论的那样，入口端口1425、1430、1435、1440和入口通道1405、1410、1415、1420可与涡流混合室1450切向、与涡流混合室1450正交或呈以其间的任何角度配置。
在一些实施方式中，当采用上面讨论的1x比例时，第一流体通过第一和第三入口通道1405、1415中的每一者的流速可以为15ml/min，并且第二流体通过第二和第四入口通道1410、1420中的每一者的流速可以为45ml/min。通过出口通道1460的流速可以是120ml/min。如上面所讨论的那样，当涡流混合器按比例放大或缩小时，这些速率可发生变化。因此，例如流速可以如下变化：
Figure BDA0003287551320000271
通过如上面针对图14A-14B所讨论的那样增加涡流混合室的高度，可能需要增加流速，以便保持相当的混合能量。图15A-15C显示室中的混合，其中深蓝色是未混合(或最低限度混合)，且绿色是完全混合(或大致完全混合)。图15A显示在设定入口速度下在1x比例涡流混合器中的混合，而图15B显示在相同设定入口速度下在4x比例涡流混合器中的混合。在相同设定入口速度下，图15A的1x比例涡流混合器比图15B的4x比例涡流混合器产生显著更多的混合。因此，为了使更大比例涡流混合器产生更多的混合，增加入口速度，如图15C中所示。图15D是与图15A-15C一起显示作为入口速度(m/s)的函数的混合时间量程(以ms为单位)的图示。
此外，增加涡流混合室的高度，使得涡流混合室高度大于入口臂和入口端口的高度—从图14A中所示的实施方案到图14B中所示的实施方案—导致变化系数减小，同时保持了中心混合模式。变化系数(CoV)可以是出口端口和/或出口通道处的相位的特殊分布，并且可以是：
Figure BDA0003287551320000272
在示例性实施方案中，增加涡流混合室的高度导致变化系数从61减小到35。图15E中显示了在涡流混合室的水平中平面、垂直中平面和第一壁处的相应变化。图15E的左侧柱显示在上图14A中所讨论的实施方案的混合期间第一流体的质量分数；图15E的右侧柱显示在上面针对图14B所讨论的实施方案的混合期间第一流体的质量分数。在上面讨论的示例性实施方案中，图15E可显示涡流混合器中乙醇的质量分数。
图16A显示各种出口通道/出口端口直径的示例性最小流速以及最小和最大批量大小。涡流混合器的其它尺寸可类似于上图相应并且按比例地缩放。图16B是显示对于0.3mm出口通道/出口端口直径、0.5mm出口通道/出口端口直径和1.0mm出口通道/出口端口直径而言形成的纳米颗粒的直径(nm)作为总流速(ml/min)的函数的图。图16C显示对于0.3mm出口通道/出口端口直径、0.5mm出口通道/出口端口直径和1.0mm出口通道/出口端口直径而言形成的纳米颗粒的直径(nm)作为入口速度(m/s)的函数。图16D显示对于1.0mm出口通道/出口端口直径、2.0mm出口通道/出口端口直径和4.0mm出口通道/出口端口直径而言形成的颗粒的直径(nm)作为入口速度(m/s)的函数。
基于图16D的数据，为了在更大比例混合器中获得相同的颗粒直径，需要更快的入口速度。也就是说，为了获得相同的颗粒直径，与出口通道/出口端口直径为2.0mm的混合器和出口通道/出口端口直径为1.0mm的混合器相比，在具有4.0mm出口通道/出口端口直径的混合器中的入口速度更快。且出口通道/出口端口直径为2.0mm的混合器的入口速度比出口端口/出口直径为4.0m/s的混合器慢，并且比出口端口/出口直径为l.0m/s的混合器快。通过比较获得颗粒直径所需的速度，可以应用有效的速度调节。由于较大混合器中的能量损失原因，与1.0mm出口端口/出口直径混合器相比，2.0mm出口端口/出口直径混合器损失大约或精确地为10％的能量，且与1.0mm出口端口/出口直径混合器相比，4.0mm出口端口/出口直径混合器损失大约或精确地为30％的能量。考虑到这种能量损失，可以对入口速度进行有效的速度调节，以便确定经调解的入口速度-因此对于1.0mm出口端口/出口直径混合器，有效速度调节为100％；对于2.0mm出口端口/出口直径混合器，有效速度调节为90％(考虑10％的能量损失)；且对于4.0mm出口端口/出口直径混合器，有效速度调节为70％(考虑到30％的能量损失)。这些值示于图16E的表中。
图16F显示在应用图16E中的有效速度调节之后的图16D的曲线图。因此，图16F显示了作为经调解的入口速度(m/s)的函数的颗粒直径(nm)。图16G显示涡流混合器内的压力(psi)作为经调解的入口速度(m/s)的函数。这表明尽管可以通过改变入口速度来调节颗粒直径(nm)，但增加的入口速度导致操作压力更高。
图16H显示对于0.3mm出口通道/出口端口直径、0.5mm出口通道/出口端口直径和1.0mm出口通道/出口端口直径而言形成的纳米颗粒的直径(nm)作为湍流动能(TKE)(J/kg)的函数。TKE可以是与流动中的湍流涡流相关的每单位质量的平均动能。图16I显示对于0.3mm出口通道/出口端口直径、0.5mm出口通道/出口端口直径和1.0mm出口通道/出口端口直径而言形成的纳米颗粒的直径(nm)作为最小混合时间(ms)的函数。如图所示，直径根据湍流动能和最小混合时间(τmix)缩放。达到充分混合状态的时间由下式定义：
Figure BDA0003287551320000291
∈＝湍流能量消散速率[J/kg/s]
v＝运动粘度[m2/s]；
Figure BDA0003287551320000292
D＝扩散系数[m2/s]
流体保持在涡流混合室中的时间应大于微混合时间量程。否则，流体会在完全混合之前被从混合器中排出。因此，流体保持在室中的平均停留时间应为：
Q＝体积流速[m3/s]
Figure BDA0003287551320000301
V＝混合器体积[m3]
基于图16H-16I中的图表的数据，发现当湍流动能TKE>2J/kg时，混合时间τmix<5ms。当使用更大的几何形状时，如上面所讨论的那样，在恒定速度下，为了在涡流混合室中实现完全的湍流分布，可能需要增加TKE和减小τmix。图16J中显示了对于0.5mm出口通道/出口端口直径、1.0mm出口通道/出口端口直径、2.0mm出口通道/出口端口直径和4.0mm出口通道/出口端口直径而言作为入口速度(m/s)的函数的TKE(J/kg)。图16K中显示了对于这些相同几何形状而言作为入口速度(m/s)的函数的最小混合时间(ms)。
图16L显示对于各种混合器比例(出口端口/出口通道直径的mm数)而言实现充分混合的最小总流速(ml/min)。图16M是显示具有0.3mm出口端口/出口通道直径、0.5mm出口端口/出口通道直径、1.0mm出口端口/出口通道直径、2.0mm出口端口/出口通道直径和4.0mm出口端口/出口通道直径的混合器的最小总流速的表。
图16N显示对于0.5mm出口通道/出口端口直径、1.0mm出口通道/出口端口直径、2.0mm出口通道/出口端口直径和4.0mm出口通道/出口端口直径而言作为入口速度(m/s)的函数的入口雷诺数。
在一些实施方式中，发现核酸过早混合，并且当核酸与乙醇相互作用时发生沉淀。核酸的过早混合影响脂质纳米颗粒的有效组装，并且沉淀导致结垢。因此，如在上述示例性实施方案中所讨论的那样，代替在单个步骤中形成其中含有核酸的脂质纳米颗粒，可以使用两级涡流混合器。两级涡流混合器可具有两个串联的混合器：第一级涡流混合器和第二级涡流混合器。第一级涡流混合器可将乙醇中的脂质(即，脂质主混合物)和酸性缓冲液混合以形成空纳米颗粒，且第二级涡流混合器可将在第一级涡流混合器中形成的空纳米颗粒与核酸混合以形成保持核酸的纳米颗粒。这样，在形成空纳米颗粒与添加核酸以形成保持核酸的纳米颗粒之间存在时间差别。如此，空纳米颗粒在引入核酸之前完全形成。核酸不会暴露于未乳化的缓冲液，从而避免核酸通过暴露于酸化缓冲液而降解。取而代之的是，空脂质纳米颗粒形成，将核酸引入第二级涡流混合器，并且核酸通过疏水相互作用和/或带电相互作用结合到空脂质纳米颗粒中。这导致核酸更好地包封在脂质纳米颗粒中，进而产生更一致的颗粒。
图17A显示压力从基线压力(psi)随时间(min)推移的变化的图示。绿色图显示单级混合器中的压力变化，而橙色图线显示图10中所示的双级混合器中的压力变化。图17B是压力从基线压力(psi)随时间(min)推移的变化的图示。图17B显示与图17A相同的图，其中绿色图线显示单级混合器中的压力变化，且橙色线显示图10的双级混合器中的压力变化，但这里图5的双级混合器中的压力变化以红色显示。这表明与图10的单级混合器和双级混合器相比，图5的实施方案中的压力变化和压力峰值大幅度降低。这至少部分是因为图5的实施方案导致的结垢比图10的单级混合器和双级混合器少得多。
图17C显示图10中的实施方案的样品测试运行之后的第二级混合器1002。图17D显示图5中的实施方案的样品测试运行之后的第二级混合器502。图17D显示没有沉淀剂或极少沉淀剂，这意味着没有或极少有结垢发生，而图17C显示沉淀剂的积聚，这意味着发生了结垢，并解释了图17A-17B的绿色和橙色图线中所示的增加的压力和压力峰值。
图18A显示经由入口端口/通道沿涡流混合室1850的侧壁1853接收两种流体的示例性涡流混合器中的流体路径线。第一流体经由第一入口通道1805/入口端口1825和经由第三入口通道1815/入口端口1835进入涡流混合室1850，且第二流体经由第二入口通道1810/入口端口1830和经由第四入口通道1820/入口端口1840进入涡流混合室1850。图18A以蓝色显示经由第一入口通道1805/入口端口1825进入涡流混合室1850的第一流体，并且以红色显示经由第二入口通道1810/入口端口1830进入涡流混合室1850之后的第二流体。为了便于查看，未显示涉及第三和第四入口通道/入口端口的颜色。一旦蓝色和红色流体完全混合，以黄色显示流体路径线。在此实施方案中，并且如在图18A中可见，在第一入口端口1825之后沿侧壁存在第一流体的浓度，且在第二入口端口1830之后沿侧壁存在第二流体的浓度。因此，混合沿着涡流混合室1850的侧壁1853开始，并且完全混合的流体环绕涡流混合室1850向着室中心移动，直到混合流体到达出口端口并经由出口通道1860离开。这种配置可能导致显著的结垢，这是因为如此多的混合发生在侧壁1850处，并且因为在第一和第三入口端口1825、1835之后存在第一流体的过饱和，且在第二和第四入口端口1830、1840之后存在第二流体的过饱和。
图18B显示涡流混合器的替代配置中的流体线，如图5的第二级混合器502中所示的配置(以及上面针对图17B和17D所讨论)。在此，第一流体可经由至少第一入口通道1875/入口端口1885和第二入口通道1877/入口端口1886进入涡流混合室1880，并且第二流体可经由第三入口通道1878/入口端口1888进入涡流混合室1880。第一和第二入口端口1885、1886可沿涡流混合室1880的侧壁1883配置，而第三入口端口1888可配置在涡流混合室1880的第一壁1881上。涡流混合室1880的第一壁1881可配置成与涡流混合室1880的第二壁1882相对，其中第一壁1881和第二壁1882彼此平行(或大致平行)，并且经由侧壁1883连接。在一些实施方案中，第三入口端口1888可配置在第一壁1881的径向中心处或附近，并且可与配置在第二壁1882的径向中心处或附近的出口端口1889相对。出口端口1889可与出口通道1890连接。
在图18B中，蓝色流体线代表从第三入口通道1878/入口端口1888进入涡流混合室1880的第二流体。第二流体与围绕涡流混合室1880涡旋的第一流体(未显示)混合。混合发生在涡流混合室1880的中心处或附近。一些、大部分或所有混合在涡流混合室1880中发生，之后以黄色显示的混合流体经由出口端口1889离开涡流混合室1880并进入出口通道1890。在一些实施方案中，所有或几乎所有的混合在涡流混合室1880中发生，之后混合流体经由出口端口1889离开涡流混合室1880到出口通道1890。在一些实施方案中，一些混合可在涡流混合室1880中发生，并且混合可在流体涡旋经过出口端口1889并进入出口通道1890时继续进行。
在图18B的实施方案中，混合发生在涡流混合室1880的中心处或附近。这种配置导致结垢减少并且混合时间减少，因为混合远离涡流混合室1880的壁发生，并且因为其避免了交替流体的过饱和，如图18A中所示。
图19A-19B显示作为时间(s)的函数的混合比。混合比表示要在涡流混合器中混合的第一流体中存在的第一组分与要在涡流混合器中混合的第二流体中存在的第二组分的比率。例如，当混合脂质和核酸时，可以采用局部N:P比，其中N代表脂质中的氮基团，且P代表核酸中的磷基团。图19A显示在图18A的实施方案中作为时间(s)的函数的混合比，而图19B显示在图18B的实施方案中作为时间(s)的函数的混合比。因此，在图18B的混合器中，实现平衡(例如，完全混合的比率)比在图18A的混合器中快得多。在图18B和19B的实施方案中，N:P比在大约0.002秒内达到平衡，而在图18A和19A的实施方案中，N:P比直到大约0.025秒才达到平衡。
尽管上面讨论的示例性实施方案涉及的是形成含核酸的脂质纳米颗粒，但应注意的是，脂质纳米颗粒也可包封其它核酸、蛋白质等。
本文讨论的涡流混合器的每个实施方案可由许多材料形成，包括但不限于不锈钢、LFEM、丙烯酸、PEEK、3-D打印介质等。
在本申请中提供的对出版物或其它文件的任何及所有引用(包括但不限于专利、专利申请、文章、网页、书籍等)以全文引用的方式并入本文。
定义
如本文所用，术语“约”或“大约”通常意指所述值的±10％，例如约90度将包括81度至99度，约1,000μm将包括900μm至1,100μm。在一些实施方案中，“约”或“大约”通常意指所述值的±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％。在一些实施方案中，当“约”或“大约”是指角度测量值时，这些术语通常意指所述值的±10度、±9度、±8度、±7度、±6度、±5度、±4度、±3度、±2度或±1度。在一些实施方案中，当“约”或“大约”是指距离时，这些术语通常意指所述值的±10mm、±9mm、±8mm、±7mm、±6mm、±5mm、±4mm、±3mm、±2mm、±lmm、±900μm、±800μm、±700μm、±600μm、±500μm、±400μm、±300μm、±200μm、±100μm、±90μm、±80μm、±70μm、±60μm、±50μm、±40μm、±30μm、±20μm或±10μm。
核酸
在一些实施方案中，核酸是多核苷酸(例如，核糖核酸或脱氧核糖核酸)。术语“多核苷酸”在其最广泛的意义上包括并入或可并入到寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。根据本公开使用的示例性多核苷酸包括但不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)包括信使mRNA(mRNA)、其杂交体、RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核糖酶、催化性DNA、诱导三股螺旋形成的RNA、适体、载体等中的一者或多者。在一些实施方案中，核酸或多核苷酸是RNA。RNA可选自但不限于由短聚物(shortmer)、安塔够妙(antagomir)、反义物、核糖酶、小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、转移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)及其混合物组成的组。在一些实施方案中，RNA是mRNA。
在一些实施方案中，核酸或多核苷酸是mRNA。mRNA可编码任何所关注的多肽，包括任何天然或非天然存在的或以其它方式修饰的多肽。由mRNA编码的多肽可以是任何大小的，并且可具有任何二级结构或活性。在一些实施方案中，由mRNA编码的多肽在细胞中表达时可具有治疗效果。
在一些实施方案中，核酸或多核苷酸是siRNA。siRNA可以能够选择性地敲低或下调所关注的基因的表达。例如，可以选择siRNA，以在对有需要的受试者施用包括siRNA的含脂质组合物后沉默与特定疾病、病症或疾患相关的基因。siRNA可包含与编码所关注的基因或蛋白质的mRNA序列互补的序列。在一些实施方案中，siRNA可以是免疫调节siRNA。
在一些实施方案中，核酸或多核苷酸是sgRNA和/或cas9 mRNA。sgRNA和/或cas9mRNA可用作基因编辑工具。例如，sgRNA-cas9复合物可影响细胞基因的mRNA翻译。
在一些实施方案中，核酸或多核苷酸是shRNA或编码其的载体或质粒。在将适当的构建体递送至细胞核后，shRNA可在靶细胞内产生。与shRNA有关的构建体和机制是相关领域中熟知的。
可用于本公开的核酸和多核苷酸通常包括编码所关注的多肽的连接核苷的第一区(例如，编码区)、位于第一区的5'-末端的第一侧翼区(例如，5'-UTR)、位于第一区的3'-末端的第二侧翼区(例如，3'-UTR)、至少一个5'-帽区和3'-稳定化区。在一些实施方案中，核酸或多核苷酸还包括聚A区或Kozak序列(例如，在5'-UTR中)。在一些实施方案中，多核苷酸可含有一个或多个能够从多核苷酸中切除的内含子核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸或核酸(例如，mRNA)可包括5’帽结构、链终止核苷酸、茎环、聚A序列和/或聚腺苷酸化信号。核酸的任一区域可包括一种或多种替代组分(例如，替代核苷)。例如，3'-稳定化区可含有替代核苷，如L-核苷、反式胸苷或2’-O-甲基核苷和/或编码区、5'-UTR、3'-UTR，或者帽区可包括替代核苷，如5-取代尿苷(例如，5-甲氧基尿苷)、1-取代假尿苷(例如，1-甲基-假尿苷或1-乙基-假尿苷)和/或5-取代胞苷(例如，5-甲基-胞苷)。
一般地，多核苷酸的最短长度可以是足以编码二肽的多核苷酸序列的长度。在一些实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码三肽。在一些实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码四肽。在一些实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码五肽。在一些实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码六肽。在一些实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码七肽。在一些实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码八肽。在一些实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码九肽。在一些实施方案中，多核苷酸序列的长度足以编码十肽。
替代多核苷酸序列可以编码的二肽的实例包括但不限于肌肽和鹅肌肽。
在一些实施方案中，多核苷酸长度大于30个核苷酸、长度大于35个核苷酸、至少40个核苷酸、至少45个核苷酸、至少55个核苷酸、至少50个核苷酸、至少60个核苷酸、至少80个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少120个核苷酸、至少140个核苷酸、至少160个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少3500个核苷酸、至少400个核苷酸、至少450个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、至少900个核苷酸、至少1000个核苷酸、至少1100个核苷酸、至少1200个核苷酸、至少1300个核苷酸、至少1400个核苷酸、至少1500个核苷酸、至少1600个核苷酸、至少1800个核苷酸、至少2000个核苷酸、至少2500个核苷酸、至少3000个核苷酸、至少4000个核苷酸、至少5000个核苷酸或大于5000个核苷酸。
核酸和多核苷酸可包括一种或多种天然存在的组分，包括规范核苷酸A(腺苷)、G(鸟苷)、C(胞嘧啶)、U(尿苷)或T(胸苷)中的任一者。在一些实施方案中，所有或基本上所有包含(a)5’-UTR、(b)开放阅读框(ORF)、(c)3’-UTR、(d)聚A尾及(上述a、b、c或d)的任何组合的核苷酸包含天然存在的规范核苷酸A(腺苷)、G(鸟苷)、C(胞嘧啶)、U(尿苷)或T(胸苷)。
核酸和多核苷酸可包括一种或多种如本文所述的替代组分，其赋予有用的特性，包括稳定性提高和/或缺乏对引入多核苷酸的细胞的先天免疫反应的实质性诱导。例如，相对于相应的未改变的多核苷酸或核酸，替代的多核苷酸或核酸在引入多核苷酸或核酸的细胞中表现出降解减少。这些替代物质可提高蛋白质产生的效率、多核苷酸的细胞内保留和/或接触的细胞的活力，以及具有降低的免疫原性。
多核苷酸和核酸可以是天然或非天然存在的。多核苷酸和核酸可包括一个或多个修饰的(例如，改变的或替代的)核碱基、核苷、核苷酸或其组合。核酸和多核苷酸可包括任何有用的修饰或改变，如对核碱基、糖或核苷间键(例如，对连接磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)的修饰或改变。在一些实施方案中，改变(例如，一个或多个改变)存在于核碱基、糖和核苷间键中的每一者中。根据本公开的改变可以是核糖核酸(RNA)改变为脱氧核糖核酸(DNA)，例如呋喃核糖基环的2’-OH取代为2’-H、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)或其杂交体。本文描述了另外的改变。
多核苷酸和核酸可以或可以不沿着分子的整个长度均匀地改变。例如，一种或多种或所有类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或者A、G、U、C中的任何一者或多者或全部)可以或可以不在多核苷酸或核酸中或在其给定的预定序列区中均匀地改变。在一些实施方案中，多核苷酸(或其给定的序列区)中的所有核苷酸X都被改变，其中X可以是核苷酸A、G、U、C中的任一者，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一者。
不同的糖改变和/或核苷间键(例如，主链结构)可存在于多核苷酸中的不同位置。本领域普通技术人员将要理解的是，核苷酸类似物或其它改变可位于多核苷酸的任何位置，使得多核苷酸的功能基本上不降低。改变也可以是5’-或3’-末端改变。在一些实施方案中，多核苷酸包括在3’-末端的改变。多核苷酸可含有约1％至约100％的替代核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一者或多者)或任何中间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。将要理解的是，任何剩余的百分比是因为规范核苷酸(例如，A、G、U或C)的存在。
多核苷酸可含有最少零和最多100％的替代核苷酸，或任何中间百分比，如至少5％的替代核苷酸、至少10％的替代核苷酸、至少25％的替代核苷酸、至少50％的替代核苷酸、至少80％的替代核苷酸或至少90％的替代核苷酸。例如，多核苷酸可含有替代的嘧啶，如替代的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶被替代尿嘧啶(例如，5-取代的尿嘧啶)替代。替代尿嘧啶可以被具有单一独特结构的化合物替代，或者可以被具有不同结构(例如，2、3、4或更多种独特结构)的多种化合物替代。在一些实施方案中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶被替代胞嘧啶(例如，5-取代的胞嘧啶)替代。替代胞嘧啶可以被具有单一独特结构的化合物替代，或者可以被具有不同结构(例如，2、3、4或更多种独特结构)的多种化合物替代。
在一些实施方案中，核酸基本上不诱导引入多核苷酸(例如，mRNA)的细胞的先天免疫反应。诱导的先天免疫反应的特征包括1)促炎性细胞因子的表达增加，2)细胞内PRR(RIG-I、MDA5等)的激活，和/或3)蛋白质翻译终止或减少。
核酸可任选包括其它剂(例如，RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核糖酶、催化性DNA、tRNA、诱导三股螺旋形成的RNA、适体、载体)。在一些实施方案中，核酸可包括一种或多种具有一个或多个替代核苷或核苷酸的信使RNA(mRNA)(即，替代mRNA分子)。
在一些实施方案中，核酸(例如，mRNA)包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含如WO2002/098443、WO2003/051401、WO2008/052770、WO2009127230、WO2006122828、WO2008/083949、WO2010088927、WO2010/037539、WO2004/004743、WO2005/016376、WO2006/024518、WO2007/095976、WO2008/014979、WO2008/077592、WO2009/030481、WO2009/095226、WO2011069586、WO2011026641、WO2011/144358、WO2012019780、WO2012013326、WO2012089338、WO2012113513、WO2012116811、WO2012116810、WO2013113502、WO2013113501、WO2013113736、WO2013143698、WO2013143699、WO2013143700、WO2013/120626、WO2013120627、WO2013120628、WO2013120629、WO2013174409、WO2014127917、WO2015/024669、WO2015/024668、WO2015/024667、WO2015/024665、WO2015/024666、WO2015/024664、WO2015101415、WO2015101414、WO2015024667、WO2015062738、WO2015101416中所述的特征，上述所有专利文献以引用的方式并入本文。
核碱基替代物
替代核苷和核苷酸可包括替代核碱基。核酸的核碱基是有机碱基，如嘌呤或嘧啶或其衍生物。核碱基可以是规范碱基(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)。这些核碱基可以被改变或完全替代，以提供特性增强的多核苷酸分子，例如稳定性(如对核酸酶的抗性)提高。非规范或修饰的碱基可包括例如一个或多个取代或修饰，包括但不限于烷基、芳基、卤基、氧代、羟基、烷氧基和/或硫代取代；一个或多个稠环或开环；氧化；和/或还原。
替代核苷酸碱基配对不仅涵盖标准的腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-尿嘧啶或鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对，而且还涵盖在核苷酸和/或替代核苷酸之间形成的碱基对，包括非标准或替代碱基，其中氢键供体和氢键受体的排列允许在非标准碱基与标准碱基之间或在两个互补的非标准碱基结构之间形成氢键合。这种非标准碱基配对的一个实例是替代核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。
在一些实施方案中，替代核苷或核苷酸是尿苷。在一些实施方案中，替代尿苷是1-甲基假尿苷(1mΨ)。在一些实施方案中，1-甲基假尿苷(1mΨ)包括结构：
Figure BDA0003287551320000401
多核苷酸可含有约1％至约100％的1-甲基假尿苷(1mΨ)(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一者或多者)或任何中间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。将要理解的是，任何剩余的百分比是因为规范核苷酸(例如，A、G、U或C)的存在。
在一些实施方案中，尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，1％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，5％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，10％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，15％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，20％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，25％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，30％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，35％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，40％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，45％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，50％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，55％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，60％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，65％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，70％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，75％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，80％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，85％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，90％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，95％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。在一些实施方案中，100％的尿苷已被1-甲基假尿苷(1mΨ)替代。
术语“多核苷酸”在其最广泛的意义上包括并入或可并入到具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰的寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。
在一些实施方案中，核酸或多核苷酸是具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰的mRNA。
在一些实施方案中，多核苷酸长度大于30个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，多核苷酸分子长度大于35个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少40个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少45个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少55个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少50个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少60个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少80个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少90个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少100个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少120个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少140个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少160个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少180个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少200个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少250个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少300个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少350个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少400个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少450个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少500个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少600个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少700个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少800个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少900个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少1000个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少1100个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少1200个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少1300个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少1400个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少1500个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少1600个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少1800个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少2000个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少2500个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少3000个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少4000个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。在一些实施方案中，所述长度为至少5000个核苷酸或大于5000个核苷酸，具有尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。
多核苷酸可含有最少零和最多100％的尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰，或任何中间百分比，如至少5％的尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰、至少10％的尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰、至少25％的尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰、至少50％的尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰、至少80％的尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰或至少90％的尿苷至1-甲基假尿苷(1mΨ)碱基修饰。替代尿嘧啶可以被具有单一独特结构的化合物替代，或者可以被具有不同结构(例如，2、3、4或更多种独特结构)的多种化合物替代。在一些实施方案中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶被替代胞嘧啶(例如，5-取代胞嘧啶)替代。替代胞嘧啶可以被具有单一独特结构的化合物替代，或者可以被具有不同结构(例如，2、3、4或更多种独特结构)的多种化合物替代。
在一些实施方案中，核碱基是替代尿嘧啶。具有替代尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括但不限于假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿嘧啶、6-氮杂-尿嘧啶、2-硫代-5-氮杂-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶(s2U)、4-硫代-尿嘧啶(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿嘧啶(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿嘧啶、5-卤-尿嘧啶(例如，5-碘-尿嘧啶或5-溴-尿嘧啶)、3-甲基-尿嘧啶(m3U)、5-甲氧基-尿嘧啶(mo5U)、尿嘧啶5-氧乙酸(cmo5U)、尿嘧啶5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿嘧啶(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿嘧啶(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿嘧啶甲酯(mchm5U)、5-甲氧羰基甲基-尿嘧啶(mcm5U)、5-甲氧羰基甲基-2-硫代-尿嘧啶(mcm5s2U)、5-氨甲基-2-硫代-尿嘧啶(nm5s2U)、5-甲基氨甲基-尿嘧啶(mnm5U)、5-甲基氨甲基-2-硫代-尿嘧啶(mnm5s2U)、5-甲基氨甲基-2-硒代-尿嘧啶(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿嘧啶(ncm5U)、5-羧甲基氨甲基-尿嘧啶(cmnm5U)、5-羧甲基氨甲基-2-硫代-尿嘧啶(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿嘧啶、1-丙炔基-假尿嘧啶、5-牛磺酸甲基-尿嘧啶(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿嘧啶(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿嘧啶(m5U，即具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶(m5s2U)、l-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-l-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-l-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿嘧啶(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基-二氢尿嘧啶(m5D)、2-硫代-二氢尿嘧啶、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿嘧啶、2-甲氧基-4-硫代-尿嘧啶、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、Nl-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧啶(acp3U)、l-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿嘧啶(inm5U)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代-尿嘧啶(inm5s2U)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2-硫代-2′-O_甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m3Um)和5-(异戊烯基氨甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿嘧啶、脱氧胸苷、5-(2-羰基甲氧基乙烯基)-尿嘧啶、5-(氨基甲酰基羟甲基)-尿嘧啶、5-氨基甲酰基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-氰甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-2-硫代-尿嘧啶和5-[3-(l-E-丙烯基氨基)]尿嘧啶。
在一些实施方案中，核碱基是替代胞嘧啶。具有替代胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5-氮杂-胞嘧啶、6-氮杂-胞嘧啶、假异胞苷、3-甲基-胞嘧啶(m3C)、N4-乙酰基-胞嘧啶(ac4C)、5-甲酰基-胞嘧啶(f5C)、N4-甲基-胞嘧啶(m4C)、5-甲基-胞嘧啶(m5C)、5-卤-胞嘧啶(例如，5-碘-胞嘧啶)、5-羟甲基-胞嘧啶(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞嘧啶、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞嘧啶(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞嘧啶、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、折布拉林(zebularine)、5-氮杂-折布拉林、5-甲基-折布拉林、5-氮杂-2-硫代-折布拉林、2-硫代-折布拉林、2-甲氧基-胞嘧啶、2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖西丁(k2C)、5,2'-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2'-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2'-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2'-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2'-O-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫代-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-(3-叠氮基丙基)-胞嘧啶和5-(2-叠氮基乙基)-胞嘧啶。
在一些实施方案中，核碱基是替代腺嘌呤。具有替代腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤-嘌呤(例如，2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺嘌呤(mlA)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺嘌呤(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺嘌呤(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺嘌呤(i6A)、2-甲硫基-N6-异戊烯基-腺嘌呤(ms2i6A)、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺嘌呤(io6A)、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺嘌呤(ms2io6A)、N6-甘氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(g6A)、N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(m6t6A)、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺嘌呤(m62A)、N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(hn6A)、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺嘌呤(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺嘌呤(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、N6,2'-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2'-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1,2'-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺嘌呤、8-叠氮基-腺嘌呤、N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺嘌呤、2,8-二甲基-腺嘌呤、N6-甲酰基-腺嘌呤和N6-羟甲基-腺嘌呤。
在一些实施方案中，核碱基是替代鸟嘌呤。具有替代鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OHyW)、欠修饰羟基怀丁苷(OHyW*)、7-脱氮-鸟嘌呤、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟嘌呤(preQ0)、7-氨甲基-7-脱氮-鸟嘌呤(preQl)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤、6-硫代-鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟嘌呤、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤(m1G)、N2-甲基-鸟嘌呤(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟嘌呤(m22G)、N2,7-二甲基-鸟嘌呤(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鸟嘌呤(m2,2,7G)、8-氧代-鸟嘌呤、7-甲基-8-氧代-鸟嘌呤、l-甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2-甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2-甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m22Gm)、l-甲基-2'-O-甲基-鸟苷(mlGm)、N2,7-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2,7Gm)、2'-O-甲基-肌苷(Im)、1,2'-O-二甲基-肌苷(mlIm)、1-硫代-鸟嘌呤和O-6-甲基-鸟嘌呤。
核苷酸的替代核碱基可独立地为嘌呤、嘧啶、嘌呤或嘧啶类似物。例如，核碱基可以是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或次黄嘌呤的替代物。在一些实施方案中，核碱基可以还包括碱基的天然存在的及合成的衍生物，包括吡唑并[3,4-d]嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基及其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶；8-卤(例如，8-溴)、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤特别是5-溴、5-三氟甲基及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、脱氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、脱氮腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、吡唑并[3,4-d]嘧啶、咪唑并[1,5-a]1,3,5三嗪酮、9-脱氮嘌呤、咪唑并[4,5-d]吡嗪、咪唑并[4,5-d]嘧啶、吡嗪-2-酮、1,2,4-三嗪、哒嗪；或1,3,5三嗪。当使用简写A、G、C、T或U来描述核苷酸时，每个字母是指代表性碱基和/或其衍生物，例如，A包括腺嘌呤或腺嘌呤类似物，例如7-脱氮腺嘌呤)。
糖的改变
核苷包括糖分子(例如，5-碳或6-碳糖，如戊糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖或其脱氧衍生物)与核碱基组合，而核苷酸是含有核苷和磷酸酯基团或替代基团(例如，硼代磷酸酯、硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、膦酸酯、烷基、酰胺化物和甘油)的核苷。核苷或核苷酸可以是规范物质，例如包括规范核碱基、糖和(在核苷酸的情况下)磷酸酯基团的核苷或核苷酸，或者可以是包括一种或多种替代组分的替代核苷或核苷酸。例如，替代核苷和核苷酸可以在核苷或核苷酸的糖上改变。在一些实施方案中，替代核苷或核苷酸包括以下结构：
Figure BDA0003287551320000481
在式IV、V、VI和VII中的每一者中，m和n中的每一者独立地为0至5的整数，U和U’中的每一者独立地为O、S、N(RU)nu或C(RU)nu，其中nu是0至2的整数，且每个RU独立地为H、卤基或任选取代的烷基；
R1’、R2’、R1”、R2”、R1、R2、R3、R4和R5中的每一者如果存在的话独立地为H、卤基、羟基、硫醇、任选取代的烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的氨基烷氧基、任选取代的烷氧基烷氧基、任选取代的羟基烷氧基、任选取代的氨基、叠氮基、任选取代的芳基、任选取代的氨基烷基、任选取代的氨基烯基、任选取代的氨基炔基，或者不存在；其中R3与R1’、R1”、R2’、R2”或R5中的一者或多者的组合(例如，R1’和R3的组合、R1”和R3的组合、R2’和R3的组合、R2”和R3的组合或R5和R3的组合)可连接在一起形成任选取代的亚烷基或任选取代的亚杂烷基，并且与它们所连接的碳合起来提供任选取代的杂环基(例如，双环、三环或四环杂环基)；其中R5与R1’、R1”、R2’或R2”中的一者或多者的组合(例如，R1’和R5的组合、R1”和R5的组合、R2’和R5的组合或R2”和R5的组合)可连接在一起形成任选取代的亚烷基或任选取代的亚杂烷基，并且与它们所连接的碳合起来提供任选取代的杂环基(例如，双环、三环或四环杂环基)；且其中R4和R1’、R1”、R2’、R2”、R3或R5中的一者或多者的组合可连接在一起形成任选取代的亚烷基或任选取代的亚杂烷基，并且与它们所连接的碳合起来提供任选取代的杂环基(例如，双环、三环或四环杂环基)；m'和m"中的每一者独立地为0至3的整数(例如，0至2、0至1、1至3或1至2)；
Y1、Y2和Y3中的每一者独立地为O、S、Se、—NRN1—、任选取代的亚烷基或任选取代的亚杂烷基，其中RN1是H、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基，或者不存在；
每个Y4独立地为H、羟基、硫醇、硼烷基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的硫代烷氧基、任选取代的烷氧基烷氧基或任选取代的氨基；
每个Y5独立地为O、S、Se、任选取代的亚烷基(例如，亚甲基)或任选取代的亚杂烷基；且
B是修饰或未修饰的核碱基。在一些实施方案中，2'-羟基(OH)可以被修饰或被许多不同的取代基替代。2'-位置的示例性取代包括但不限于H、叠氮基、卤基(例如，氟基)、任选取代的C1-6烷基(例如，甲基)；任选取代的C1-6烷氧基(例如，甲氧基或乙氧基)；任选取代的C6-10芳氧基；任选取代的C3-8环烷基；任选取代的C6-10芳基-C1-6烷氧基、任选取代的C1-12(杂环基)氧基；糖(例如，核糖、戊糖或本文所述的任何糖)；聚乙二醇(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R是H或任选取代的烷基，且n是0至20的整数(例如，0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16和4至20)；“锁定”核酸(LNA)，其中2'-羟基通过C1-6亚烷基或C1-6亚杂烷基桥与同一核糖的4'-碳连接，其中示例性桥包括亚甲基、亚丙基、醚或氨基桥；如本文所定义的氨基烷基；如本文所定义的氨基烷氧基；如本文所定义的氨基；和如本文所定义的氨基酸。
一般地，RNA包括糖基核糖，其是具有氧的5元环。示例的非限制性替代核苷酸包括核糖中氧的替代(例如，用S、Se或亚烷基，如亚甲基或亚乙基)；双键的添加(例如，用环戊烯基或环己烯基替代核糖)；核糖的环缩(例如，形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的扩环(例如，形成具有另外的碳或杂原子的6或7元环，如脱水己糖醇、阿卓糖醇、甘露糖醇、环己烷基、环己烯基和吗啉代(其也具有氨基磷酸酯主链))；多环形式(例如，三环和“未锁定”形式，如二醇核酸(GNA)(例如，R-GNA或S-GNA，其中核糖被与磷酸二酯键连接的二醇单元替代)、苏糖核酸(TNA，其中核糖被α-L-苏呋喃糖基-(3'→2')替代)和肽核酸(PNA，其中2-氨基-乙基-甘氨酸键替代核糖和磷酸二酯主链)。
在一些实施方案中，糖基团含有一个或多个具有核糖中相应碳的相反立体化学构型的碳。因此，多核苷酸分子可包括含有例如阿拉伯糖或L-核糖作为糖的核苷酸。
在一些实施方案中，多核苷酸包括至少一种核苷，其中糖是L-核糖、2'-O-甲基-核糖、2'-氟-核糖、阿拉伯糖、己糖醇、LNA或PNA。
核苷间键上的改变
可在核苷间键(例如，磷酸酯主链)上改变替代核苷酸。在本文中，在多核苷酸主链的背景下，短语“磷酸酯”和“磷酸二酯”可互换使用。主链磷酸酯基团可通过用不同的取代基替代一个或多个氧原子来改变。
替代核苷酸可包括将未改变的磷酸酯部分用如本文所述的另一核苷间键大批替代。替代磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸酯、硼代磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧均被硫替代。磷酸酯接头也可通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基-膦酸酯)替代连接氧来改变。
替代核苷和核苷酸可包括用硼烷部分(BH3)、硫(硫代)、甲基、乙基和/或甲氧基替代一个或多个非桥连氧。作为非限制性实例，在同一位置(例如，alpha(α)、beta(β)或gamma(γ)位置)的两个非桥连氧可以被硫(硫代)和甲氧基替代。
提供磷酸酯部分(例如，α-硫代磷酸酯)的α位置处的一个或多个氧原子的替代以通过非天然硫代磷酸酯主链键向RNA和DNA赋予稳定性(如针对外切核酸酶和内切核酸酶)。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增加的核酸酶抗性，随后在细胞环境中具有更长的半衰期。
本文描述了根据本公开可以使用的其它核苷间键，包括不含磷原子的核苷间键。
内部核糖体进入位点
多核苷酸可含有内部核糖体进入位点(IRES)。IRES可作为单独的核糖体结合位点，或者可作为mRNA的多个核糖体结合位点之一。含有一个以上功能性核糖体结合位点的多核苷酸可编码由核糖体独立翻译的几种肽或多肽(例如，多顺反子mRNA)。当多核苷酸提供有IRES时，进一步任选提供第二可翻译区。根据本公开可以使用的IRES序列的实例包括但不限于来自小核糖核酸病毒(例如，FMDV)、瘟病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的那些。
5’-帽结构
多核苷酸(例如，mRNA)可包括5'-帽结构。多核苷酸的5'-帽结构参与核输出和增加的多核苷酸稳定性，并且结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，后者负责细胞中的多核苷酸稳定性和通过CBP与聚A结合蛋白缔合以形成成熟环状mRNA物质的翻译能力。帽进一步协助在mRNA剪接期间移除5'-近端内含子。
内源性多核苷酸分子可以是5'-端加帽的，从而在多核苷酸的末端鸟苷帽残基与5'-末端转录的有义核苷酸之间产生5'-ppp-5'-三磷酸酯键。此5'-鸟苷酸帽然后可以被甲基化以产生N7-甲基-鸟苷酸残基。多核苷酸的5'端的末端和/或前末端转录的核苷酸的核糖也可任选被2'-O-甲基化。通过水解和切割鸟苷酸帽结构的5'-脱帽可靶向多核苷酸分子(如mRNA分子)进行降解。
多核苷酸的改变可产生不可水解的帽结构，其防止脱帽并因此增加多核苷酸半衰期。因为帽结构水解需要切割5'-ppp-5'磷酸二酯键，所以在加帽反应期间可以使用替代核苷酸。例如，来自New England Biolabs(Ipswich，MA)的牛痘加帽酶可根据制造商的说明书与α-硫代-鸟苷核苷酸一起使用，以在5'-ppp-5'帽中产生硫代磷酸酯键。可以使用另外的替代鸟苷核苷酸，如α-甲基-膦酸酯和硒代-磷酸酯核苷酸。
另外的改变包括但不限于糖的2'-羟基上的多核苷酸(如上所述)的5'-末端和/或5'-前末端核苷酸的核糖的2'-O-甲基化。多种不同的5'-帽结构可用于产生多核苷酸如mRNA分子的5'-帽。
5'-帽结构包括WO2008127688、WO 2008016473和WO 2011015347号国际专利公布中描述的那些，上述公布中的每一者的帽结构以引用的方式并入本文。
帽类似物在本文中也称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物或结构或功能帽类似物，其在化学结构上不同于天然(即，内源性、野生型或生理学)5'-帽，同时保留帽功能。帽类似物可化学(即，非酶促)或酶促合成和/连接至多核苷酸。
例如，抗反向帽类似物(ARCA)帽含有通过5'-5'-三磷酸酯基团连接的两个鸟苷，其中一个鸟苷含有N7-甲基以及3'-O-甲基(即,N7,3'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸酯-5'-鸟苷，m7G-3'mppp-G，其可等效地称为3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G)。另一未改变的鸟苷的3'-O原子成为与加帽多核苷酸(例如，mRNA)的5'-末端核苷酸连接。N7-和3'-O-甲基化鸟苷提供加帽多核苷酸(例如，mRNA)的末端部分。
另一种示例性帽是mCAP，其类似于ARCA，但在鸟苷上具有2'-O-甲基(即，N7,2'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸酯-5'-鸟苷，m7Gm-ppp-G)。
帽可以是二核苷酸帽类似物，非限制性实例包括8,519,110号美国专利中描述的那些，上述专利中的帽结构以引用的方式并入本文。
或者，帽类似物可以是本领域中已知和/或本文所述的N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物。N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物的非限制性实例包括N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5')ppp(5')G和N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-OG(5')ppp(5')G帽类似物(参见例如Kore等人在Bioorganic&Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574中描述的各种帽类似物及合成帽类似物的方法；上述文献中的帽结构以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，可用于本公开的多核苷酸的帽类似物是4-氯/溴苯氧基乙基类似物。
虽然帽类似物允许在体外转录反应中同时对多核苷酸进行加帽，但仍有多达20％的转录物未加帽。这以及帽类似物与由内源性细胞转录机制产生的多核苷酸的内源性5'-帽结构的结构差异可导致翻译能力降低和细胞稳定性降低。
为了产生更真实的5'-帽结构，也可以使用酶对替代多核苷酸进行转录后加帽。如本文所用，短语“更真实”是指在结构或功能上紧密反映或模拟内源或野生型特征的特征。也就是说，与现有技术的合成特征或类似物相比，“更真实的”特征更能代表内源性的野生型天然或生理细胞功能和/或结构，或者在一个或多个方面优于相应的内源性野生型天然或生理特征。可用于本公开的多核苷酸的更真实的5'-帽结构的非限制性实例尤其是与本领域中已知的合成5'-帽结构(或与野生型天然或生理5'-帽结构)相比帽结合蛋白的结合增强、半衰期增加、对5'-内切核酸酶的敏感性降低和/或5'-脱帽减少的那些。例如，重组痘苗病毒加帽酶和重组2'-O-甲基转移酶可在多核苷酸的5'-末端核苷酸与鸟苷帽核苷酸之间产生规范的5'-5'-三磷酸酯键，其中帽鸟苷含有N7-甲基化，且多核苷酸的5'-末端核苷酸含有2'-O-甲基。这种结构被称为Cap1结构。与例如本领域中已知的其它5'帽类似物结构相比，此帽导致翻译能力、细胞稳定性更高，且细胞促炎性细胞因子的激活降低。其它示例性帽结构包括7mG(5')ppp(5')N,pN2p(Cap 0)、7mG(5')ppp(5')NlmpNp(Cap 1)、7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp(Cap 2)和m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up(Cap4)。
因为替代多核苷酸可进行转录后加帽，并且因为此过程更有效，所以几乎100％的替代多核苷酸可以被加帽。这与当帽类似物在体外转录反应过程中与多核苷酸连接时的～80％形成对比。
5'-末端帽可包括内源帽或帽类似物。5'-末端帽可包括鸟苷类似物。有用的鸟苷类似物包括肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
在一些实施方案中，多核苷酸含有修饰的5'-帽。5'-帽上的修饰可提高多核苷酸的稳定性，增加多核苷酸的半衰期，并且可提高多核苷酸翻译效率。修饰的5'-帽可包括但不限于以下修饰中的一者或多者：在加帽三磷酸鸟苷(GTP)的2'-和/或3'-位置进行修饰、用亚甲基部分(CH2)替代糖环氧(其产生碳环)、在帽结构的三磷酸酯桥部分上进行修饰或在核碱基(G)部分上进行修饰。
5’-UTR
5'-UTR可作为多核苷酸(例如，mRNA)的侧翼区提供。5'-UTR可与多核苷酸中所见的编码区同源或异源。多个5'-UTR可包括在侧翼区中，并且可以是相同或不同的序列。侧翼区的任何部分(包括没有部分)可以是密码子优化的，并且在密码子优化之前和/或之后，任何部分可独立地含有一个或多个不同的结构或化学改变。
以引用的方式并入本文的61/775,509号美国临时申请的表21以及61/829,372号美国临时申请的表21和表22中所示为替代多核苷酸(例如，mRNA)的起始和终止位点的列表。在表21中，每个5'-UTR(5'-UTR-005至5'-UTR 68511)由其起始和终止位点相对于其天然或野生型(同源)转录物(ENST；ENSEMBL数据库中使用的标识符)来标识。
为了改变多核苷酸(例如，mRNA)的一种或多种特性，可以对与替代多核苷酸(例如，mRNA)的编码区异源的5'-UTR进行工程化。然后可以将多核苷酸(例如，mRNA)施用于细胞、组织或生物体，并且可测量诸如蛋白质水平、定位和/或半衰期的结果，以评价异源5'-UTR可能对替代多核苷酸(mRNA)产生的有益效果。可以利用5’-UTR的变体，其中向末端添加或在末端移除一个或多个核苷酸，包括A、T、C或G。5'-UTR也可以被密码子优化或以本文所述的任何方式改变。
5'-UTR、3'-UTR和翻译增强子元件(TEE)
多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR可包括至少一个翻译增强子元件。术语“翻译增强子元件”是指增加由多核苷酸产生的多肽或蛋白质的量的序列。作为非限制性实例，TEE可位于转录启动子与起始密码子之间。在5'-UTR中具有至少一个TEE的多核苷酸(例如，mRNA)可以在5'-UTR处包括帽。进一步地，至少一个TEE可位于经历帽依赖性或帽非依赖性翻译的多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中。
一方面，TEE是UTR中的保守元件，其可促进多核苷酸的翻译活性，如但不限于帽依赖性或帽非依赖性翻译。Panek等人(Nucleic Acids Research,2013,1-10)先前已展示了这些序列在包括人在内的14个物种中的保守性。
在一个非限制性实例中，已知的TEE可位于Gtx同源结构域蛋白的5'-前导序列中(Chappell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:9590-9594,2004，上述文献中的TEE以引用的方式并入本文)。
在另一非限制性实例中，在2009/0226470和2013/0177581号美国专利公布、WO2009/075886、WO2012/009644和WO1999/024595号国际专利公布以及6,310,197和6,849,405号美国专利中公开了TEE，上述专利文献中的每一者的TEE序列以引用的方式并入本文。
在又一非限制性实例中，TEE可以是内部核糖体进入位点(IRES)、HCV-IRES或IRES元件，如但不限于7,468,275号美国专利、2007/0048776和2011/0124100号美国专利公布以及WO2007/025008和WO2001/055369号国际专利公布中描述的那些，上述专利文献中的每一者的IRES序列以引用的方式并入本文。IRES元件可包括但不限于Chappell等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9590-9594,2004)和Zhou等人(PNAS 102:6273-6278,2005)以及在2007/0048776和2011/0124100号美国专利公布及WO2007/025008号国际专利公布中描述的Gtx序列(例如，Gtx9-nt、Gtx8-nt、Gtx7-nt)，上述文献中的每一者的IRES序列以引用的方式并入本文。
“翻译增强子多核苷酸”是包括一种或多种本文中示例和/或本领域中公开(参见例如6,310,197、6,849,405、7,456,273、7,183,395号美国专利、20090/226470、2007/0048776、2011/0124100、2009/0093049、2013/0177581号美国专利公布、WO2009/075886、WO2007/025008、WO2012/009644、WO2001/055371WO 1999/024595号国际专利公布以及2610341和2610340号欧洲专利；上述专利文献中的每一者的TEE序列以引用的方式并入本文)的特定TEE或其变体、同源物或功能衍生物的多核苷酸。特定TEE的一个或多个拷贝可存在于多核苷酸(例如，mRNA)中。翻译增强子多核苷酸中的TEE可以按一个或多个序列区段组织起来。序列区段可包含本文示例的一个或多个特定TEE，每个TEE以一个或多个拷贝存在。当翻译增强子多核苷酸中存在多个序列区段时，它们可以是同源的或异源的。因此，翻译增强子多核苷酸中的多个序列区段可包含相同或不同类型的本文示例的特定TEE、相同或不同拷贝数的每一特定TEE和/或每个序列区段内TEE的相同或不同组织。
多核苷酸(例如，mRNA)可包括至少一个WO 1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886、WO2007/025008、WO 1999/024595号国际专利公布、2610341和2610340号欧洲专利公布、6,310,197、6,849,405、7,456,273、7,183,395号美国专利以及2009/0226470、2011/0124100、2007/0048776、2009/0093049和2013/0177581号美国专利公布中描述的TEE，上述专利文献中的每一者的TEE序列以引用的方式并入本文。TEE可位于多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中。
多核苷酸(例如，mRNA)可包括至少一个TEE，其与2009/0226470、2007/0048776、2013/0177581和2011/0124100号美国专利公布、WO 1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886和WO2007/025008号国际专利公布、2610341和2610340号欧洲专利公布、6,310,197、6,849,405、7,456,273、7,183,395号美国专利中描述的TEE具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性，上述专利文献中的每一者的TEE序列以引用的方式并入本文。
多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR可包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个或多于60个TEE序列。多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中的TEE序列可以是相同或不同的TEE序列。TEE序列可以是诸如ABABAB、AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变体的模式，重复一次、两次或三次以上。在这些模式中，每个字母A、B或C代表在核苷酸水平上的不同TEE序列。
在一些实施方案中，5'-UTR可包括间隔区以分隔两个TEE序列。作为非限制性实例，间隔区可以是15个核苷酸的间隔区和/或本领域中已知的其它间隔区。作为另一非限制性实例，5'-UTR可包括在5'-UTR中重复至少一次、至少两次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次或9次以上的TEE序列-间隔区模块。
在一些实施方案中，分隔两个TEE序列的间隔区可包括本领域中已知的其它序列，其可调节本公开的多核苷酸(例如，mRNA)的翻译，如但不限于miR序列(例如，miR结合位点和miR种子)。作为非限制性实例，用于分隔两个TEE序列的每个间隔区可包括不同的miR序列或miR序列的组成部分(例如，miR种子序列)。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中的TEE可包括至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或超过99％的以下专利文献中公开的TEE序列：2009/0226470、2007/0048776、2013/0177581和2011/0124100号美国专利公布、WO 1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886和WO2007/025008号国际专利公布、2610341和2610340号欧洲专利公布以及6,310,197、6,849,405、7,456,273和7,183,395号美国专利，上述专利文献中的每一者的TEE序列以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中的TEE可包括以下专利文献中公开的TEE序列的5-30个核苷酸片段、5-25个核苷酸片段、5-20个核苷酸片段、5-15个核苷酸片段、5-10个核苷酸片段：2009/0226470、2007/0048776、2013/0177581和2011/0124100号美国专利公布、WO 1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886和WO2007/025008号国际专利公布、2610341和2610340号欧洲专利公布以及6,310,197、6,849,405、7,456,273和7,183,395号美国专利；上述专利文献中的每一者的TEE序列以引用的方式并入本文。
在某些情况下，本公开的多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中的TEE可包括至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或超过99％的以下文献中公开的TEE序列：Chappell等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9590-9594,2004)和Zhou等人(PNAS 102:6273-6278,2005)、Wellensiek等人(Gen ome-wide profiling of human cap-independenttranslation-enhancing elements,Nature Methods,2013；DOI:10.1038/NMETH.2522)公开的补充表1和补充表2；上述文献中的每一者的TEE序列以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，在另一实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中的TEE可包括以下文献中公开的TEE序列的5-30个核苷酸片段、5-25个核苷酸片段、5-20个核苷酸片段、5-15个核苷酸片段、5-10个核苷酸片段：Chappell等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9590-9594,2004)和Zhou等人(PNAS 102:6273-6278,2005)、Wellensiek等人(Genome-wideprofiling of human cap-independent translation-enhancing elements,NatureMethods,2013；DOI:10.1038/NMETH.2522)公开的补充表1和补充表2；上述文献中的每一者的TEE序列以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中使用的TEE是IRES序列，如但不限于7,468,275号美国专利和WO2001/055369号国际专利公布中描述的那些，上述专利文献中的每一者的TEE序列以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中使用的TEE可通过2007/0048776和2011/0124100号美国专利公布以及WO2007/025008和WO2012/009644号国际专利公布中描述的方法来标识，上述专利文献中的每一者的方法以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中使用的TEE可以是7,456,273和7,183,395号美国专利、2009/0093049号美国专利公布和WO2001/055371号国际公布中描述的转录调控元件，上述专利文献中的每一者的TEE序列以引用的方式并入本文。转录调控元件可通过本领域中已知的方法标识，如但不限于7,456,273和7,183,395号美国专利、2009/0093049号美国专利公布和WO2001/055371号国际公布中描述的方法，上述专利文献中的每一者的方法以引用的方式并入本文。
在又一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR中使用的TEE是如7,456,273和7,183,395号美国专利、2009/0093049号美国专利公布和WO2001/055371号国际公布中描述的多核苷酸或其部分，上述专利文献中的每一者的TEE序列以引用的方式并入本文。
包括至少一个本文所述的TEE的5'-UTR可并入单顺反子序列中，如但不限于载体系统或多核苷酸载体。作为非限制性实例，载体系统和多核苷酸载体可包括7,456,273和7,183,395号美国专利、2007/0048776、2009/0093049和2011/0124100号美国专利公布以及WO2007/025008和WO2001/055371号国际专利公布中描述的那些，上述专利文献中的每一者的TEE序列以引用的方式并入本文。
本文所述的TEE可位于多核苷酸(例如，mRNA)的5'-UTR和/或3'-UTR中。位于3'-UTR中的TEE可以与位于和/或描述用于并入5'-UTR中的TEE相同和/或不同。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)的3'-UTR可包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个或超过60个TEE序列。本公开的多核苷酸(例如，mRNA)的3'-UTR中的TEE序列可以是相同或不同的TEE序列。TEE序列可以是诸如ABABAB、AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变体的模式，重复一次、两次或三次以上。在这些模式中，每个字母A、B或C代表在核苷酸水平上的不同TEE序列。
在一种情况下，3'-UTR可包括间隔区以分隔两个TEE序列。作为非限制性实例，间隔区可以是15个核苷酸的间隔区和/或本领域中已知的其它间隔区。作为另一非限制性实例，3'-UTR可包括在3'-UTR中重复至少一次、至少两次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次或9次以上的TEE序列-间隔区模块。
在一些实施方案中，分隔两个TEE序列的间隔区可包括本领域中已知的其它序列，其可调节本公开的多核苷酸(例如，mRNA)的翻译，如但不限于本文所述的miR序列(例如，miR结合位点和miR种子)。作为非限制性实例，用于分隔两个TEE序列的每个间隔区可包括不同的miR序列或miR序列的组成部分(例如，miR种子序列)。
在一些实施方案中，miR序列和/或TEE序列的并入可改变茎环区的形状，这可以增加和/或减少翻译。参见例如Kedde等人，Nature Cell Biology 2010 12(10):1014-20，以全文引用的方式并入本文)。
茎环
多核苷酸(例如，mRNA)可包括茎环，如但不限于组蛋白茎环。茎环可以是长度为约25或约26个核苷酸的核苷酸序列，如但不限于WO2013/103659号国际专利公布中描述的那些，该专利文献以引用的方式并入本文。组蛋白茎环可相对于编码区位于3'(例如，在编码区的3'-末端)。作为非限制性实例，茎环可位于本文所述的多核苷酸的3'-端。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)包括一个以上茎环(例如，两个茎环)。WO2012/019780和WO201502667号国际专利公布中描述了茎环序列的实例，上述专利文献的茎环序列以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，多核苷酸包括茎环序列CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA(SEQ ID NO:1)。在其它实施方案中，多核苷酸包括茎环序列CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA(SEQ ID NO:2)。
茎环可位于多核苷酸的第二末端区中。作为非限制性实例，茎环可位于第二末端区中的非翻译区(例如，3'-UTR)内。
在一些实施方案中，包括组蛋白茎环的多核苷酸(如但不限于mRNA)可通过添加3'-稳定化区(例如，包括至少一个链终止核苷的3'-稳定化区)来稳定。不希望受理论的束缚，添加至少一个链终止核苷可减慢多核苷酸的降解，并因此可增加多核苷酸的半衰期。
在一些实施方案中，包括组蛋白茎环的多核苷酸(如但不限于mRNA)可通过改变多核苷酸的3'-区来稳定，这可防止和/或抑制寡(U)的添加(参见例如WO2013/103659号国际专利公布)。
在又一些实施方案中，包括组蛋白茎环的多核苷酸(如但不限于mRNA)可通过添加以3'-脱氧核苷、2',3'-二脱氧核苷、3'-O-甲基核苷、3-O-乙基核苷、3'-阿拉伯糖苷及本领域中已知和/或本文所述的其它替代核苷终止的寡核苷酸来稳定。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸可包括组蛋白茎环、聚A区和/或5'-帽结构。组蛋白茎环可在聚A区之前和/或之后。包括组蛋白茎环和聚A区序列的多核苷酸可包括本文所述的链终止核苷。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸可包括组蛋白茎环和5'-帽结构。5'-帽结构可包括但不限于本文所述和/或本领域中已知的那些。
在一些实施方案中，保守茎环区可包括本文所述的miR序列。作为非限制性实例，茎环区可包括本文所述的miR序列的种子序列。在另一非限制性实例中，茎环区可包括miR-122种子序列。
在某些情况下，保守茎环区可包括本文所述的miR序列，并且还可包括TEE序列。
在一些实施方案中，miR序列和/或TEE序列的并入会改变茎环区的形状，这可增加和/或减少翻译。(参见例如Kedde等人，A Pumilio-induced RNA structure switch inp27-3'UTR controls miR-221 and miR-22accessibility.Nature Cell Biology.2010，以全文引用的方式并入本文)。
多核苷酸可包括至少一个组蛋白茎环和一个聚A区或聚腺苷酸化信号。WO2013/120497、WO2013/120629、WO2013/120500、WO2013/120627、WO2013/120498、WO2013/120626、WO2013/120499和WO2013/120628号国际专利公布中描述了编码至少一个组蛋白茎环和聚A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸序列的非限制性实例，上述专利文献中的每一者的序列以引用的方式并入本文。在某些情况下，编码组蛋白茎环和聚A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸可编码病原体抗原或其片段，如WO2013/120499和WO2013/120628号国际专利公布中描述的多核苷酸序列，上述两个专利文献的序列以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，编码组蛋白茎环和聚A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸可编码治疗性蛋白质，如WO2013/120497和WO2013/120629号国际专利公布中描述的多核苷酸序列，上述两个专利文献的序列以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，编码组蛋白茎环和聚A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸可编码肿瘤抗原或其片段，如WO2013/120500和WO2013/120627号国际专利公布中描述的多核苷酸序列，上述两个专利文献的序列以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，编码组蛋白茎环和聚A区或聚腺苷酸化信号的多核苷酸可编码变应原性抗原或自身免疫性自体抗原，如WO2013/120498和WO2013/120626号国际专利公布中描述的多核苷酸序列，上述两个专利文献的序列以引用的方式并入本文。
聚A区
多核苷酸或核酸(例如，mRNA)可包括聚A序列和/或聚腺苷酸化信号。聚A序列可完全或大部分由腺嘌呤核苷酸或其类似物或衍生物组成。聚A序列可以是位置邻近核酸的3’非翻译区的尾。
在RNA加工期间，通常将腺苷核苷酸的长链(聚A区)添加到信使RNA(mRNA)中以提高分子的稳定性。转录后立即切割转录物的3'-端以释放3'-羟基。然后聚A聚合酶将腺苷核苷酸链添加到RNA中。该过程被称为聚腺苷酸化，其添加了长度在100与250个残基之间的聚A区。
独特的聚A区长度可以为本公开的替代多核苷酸提供某些优点。
一般地，本公开的聚A区的长度为至少30个核苷酸长。在一些实施方案中，所述长度为至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少60个核苷酸、至少70个核苷酸、至少80个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少120个核苷酸、至少140个核苷酸、至少160个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少400个核苷酸、至少450个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、至少900个核苷酸、至少1000个核苷酸、至少1200个核苷酸、至少1400个核苷酸、至少1600个核苷酸、至少1800个核苷酸、至少2000个核苷酸、至少2500个核苷酸或至少3000个核苷酸。
在一些实施方案中，聚A区在本文所述的替代多核苷酸分子上的长度可以是80个核苷酸、120个核苷酸、160个核苷酸。
在一些实施方案中，聚A区在本文所述的替代多核苷酸分子上的长度可以是20、40、80、100、120、140或160个核苷酸。
在一些实施方案中，相对于总替代多核苷酸的长度来设计聚A区。这种设计可基于替代多核苷酸的编码区的长度、替代多核苷酸(如mRNA)的特定特征或区域的长度或基于由替代多核苷酸表达的最终产物的长度。当相对于替代多核苷酸的任何特征(例如，除了包括聚A区的mRNA部分)时，聚A区的长度可以比另外的特征大10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。聚A区也可以被设计为其所属的替代多核苷酸的一部分。在此背景下，聚A区可以是构建体总长度或构建体减去聚A区的总长度的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。
在某些情况下，用于聚A结合蛋白的工程化结合位点和/或多核苷酸(例如，mRNA)的缀合可用于增强表达。工程化结合位点可以是感应序列，其可作为多核苷酸(例如，mRNA)的局部微环境的配体的结合位点起作用。作为非限制性实例，多核苷酸(例如，mRNA)可包括至少一个工程化结合位点以改变聚A结合蛋白(PABP)及其类似物的结合亲和力。至少一个工程化结合位点的并入可增加PABP及其类似物的结合亲和力。
另外，多个不同的多核苷酸(例如，mRNA)可使用在聚A区的3'-末端的替代核苷酸通过3'-端与PABP(聚A结合蛋白)连接在一起。可在相关细胞系中进行转染实验，并且可以在转染后12小时、24小时、48小时、72小时和第7天通过ELISA测定蛋白质产生。作为非限制性实例，转染实验可用于评价由于添加至少一个工程化结合位点而对PABP或其类似物结合亲和力的影响。
在某些情况下，聚A区可用于调节翻译起始。虽然不希望受理论的束缚，但聚A区募集PABP，PABP又可与翻译起始复合物相互作用，因此可能是蛋白质合成所必需的。
在一些实施方案中，本公开中也可使用聚A区来防止3'-5'-外切核酸酶消化。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)可包括聚A-G四联体(Quartet)。G-四联体是可由DNA和RNA中的富G序列形成的四个鸟苷核苷酸的环状氢键合阵列。在此实施方案中，G-四联体在聚A区的端部并入。可以测定所得多核苷酸(例如，mRNA)的稳定性、蛋白质产生及其它参数，包括在不同时间点的半衰期。已发现聚A-G四联体导致的蛋白质产生相当于单独使用120个核苷酸的聚A区所见的至少75％。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)可包括聚A区，并且可通过添加3'-稳定化区来稳定。具有聚A区的多核苷酸(例如，mRNA)可还包括5'-帽结构。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)可包括聚A-G四联体。具有聚A-G四联体的多核苷酸(例如，mRNA)可还包括5'-帽结构。
在一些实施方案中，可用于稳定包括聚A区或聚A-G四联体的多核苷酸(例如，mRNA)的3'-稳定化区可以是但不限于WO2013/103659号国际专利公布中描述的那些，该专利文献的聚A区和聚A-G四联体以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本公开可使用的3'-稳定化区包括链终止核苷，如3'-脱氧腺苷(虫草素)、3'-脱氧尿苷、3'-脱氧胞嘧啶、3'-脱氧鸟苷、3'-脱氧胸腺嘧啶、2',3'-二脱氧核苷如2',3'-二脱氧腺苷、2',3'-二脱氧尿苷、2',3'-二脱氧胞嘧啶、2',3'-二脱氧鸟苷、2',3'-二脱氧胸腺嘧啶、2'-脱氧核苷或O-甲基核苷。
在一些实施方案中，包括聚A区或聚A-G四联体的多核苷酸(如但不限于mRNA)可通过改变多核苷酸的3'-区来稳定，这可防止和/或抑制寡(U)的添加(参见例如WO2013/103659号国际专利公布)。
在一些实施方案中，包括聚A区或聚A-G四联体的多核苷酸(如但不限于mRNA)可通过添加以3'-脱氧核苷、2',3'-二脱氧核苷3'-O-甲基核苷、3-O-乙基核苷、3'-阿拉伯糖苷及本领域中已知和/或本文所述的其它替代核苷终止的寡核苷酸来稳定。
链终止核苷
核酸可包括链终止核苷。例如，链终止核苷可包括在它们的糖基团的2’和/或3’位置处脱氧产生的那些核苷。这类物质可包括3'-脱氧腺苷(虫草素)、3'-脱氧尿苷、3'-脱氧胞嘧啶、3'-脱氧鸟苷、3'-脱氧胸腺嘧啶和2',3'-二脱氧核苷如2',3’-二脱氧腺苷、2',3'-二脱氧尿苷、2',3'-二脱氧胞嘧啶、2',3'-二脱氧鸟苷和2',3'-二脱氧胸腺嘧啶。
脂质和脂质混合物
在一些实施方案中，所述脂质是可离子化的脂质。
在一些实施方案中，所述脂质是磷脂。
在一些实施方案中，所述脂质是PEG脂质。
在一些实施方案中，所述脂质是结构脂质。
在一些实施方案中，脂质混合物包含可离子化的脂质。
在一些实施方案中，脂质混合物包含磷脂。
在一些实施方案中，脂质混合物包含PEG脂质。
在一些实施方案中，脂质混合物包含结构脂质。
在一些实施方案中，脂质混合物包含可离子化的脂质、磷脂、PEG脂质、结构脂质或其任何组合。
可离子化的脂质
在一些方面，本公开的可离子化的脂质可以是一种或多种式(IL-I)的化合物：
Figure BDA0003287551320000681
或它们的N-氧化物或其盐或异构体，其中：
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ、-CHQR、-CQ(R)2、-C(O)NQR和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR、-(CH2)nN(R)2和-C(R)N(R)2C(O)OR，每个o独立地选自1、2、3和4，且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”是键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
R10选自由H、OH、C1-3烷基和C2-3烯基组成的组；
每个R独立地选自由C1-6烷基、C1-3烷基-芳基、C2-3烯基、(CH2)qOR*和H组成的组，
且每个q独立地选自1、2和3；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且其中当R4是-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n是1、2、3、4或5时，Q不是-N(R)2，或(ii)当n是1或2时，Q不是5、6或7元杂环烷基。
在一些实施方案中，式(IL-I)的化合物的亚组包括式(IL-IA)的化合物：
Figure BDA0003287551320000701
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中：
l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1是键或M’；R4是氢、未取代的C1-3烷基、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ、-C(O)NQR或-(CH2)nQ，其中Q是OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-(CH2)nN(R)2、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。例如，m是5、7或9。例如，Q是OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。
在一些实施方案中，Q是-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，式(I)的化合物的亚组包括式(IL-IB)的化合物：
Figure BDA0003287551320000702
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中所有变量如本文所定义。
在一些实施方案中，m选自5、6、7、8和9；R4是氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q是-OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，m是5、7或9。在一些实施方案中，Q是OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。在一些实施方案中，Q是-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，式(IL-I)的化合物的亚组包括式(IL-II)的化合物：
Figure BDA0003287551320000711
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M1是键或M’；R4是氢、未取代的C1-3烷基、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ、-C(O)NQR或-(CH2)nQ，其中n是2、3或4，且Q是OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-(CH2)nN(R)2、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIa)：
Figure BDA0003287551320000712
或它们的N-氧化物或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
在一些实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIb)，
Figure BDA0003287551320000721
或它们的N-氧化物或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
Figure BDA0003287551320000722
或它们的N-氧化物或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
在一些实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIf)：
Figure BDA0003287551320000723
或它们的N-氧化物或其盐或异构体，其中M是-C(O)O-或-OC(O)-，M”是C1-6烷基或C2-6烯基，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组，且n选自2、3和4。
在进一步的实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IId)，
Figure BDA0003287551320000724
或它们的N-氧化物或其盐或异构体，其中n是2、3或4；且m、R’、R”和R2至R6如本文所述。在一些实施方案中，R2和R3中的每一者可独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在进一步的实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIg)，
Figure BDA0003287551320000731
或它们的N-氧化物或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1是键或M’；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，M”是C1-6烷基(例如，C1-4烷基)或C2-6烯基(例如，C2-4烯基)。在一些实施方案中，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，可离子化的脂质是62/220,091、62/252,316、62/253,433、62/266,460、62/333,557、62/382,740、62/393,940、62/471,937、62/471,949、62/475,140和62/475,166号美国申请以及PCT/US2016/052352号PCT申请中描述的化合物中的一者或多者。
在一些实施方案中，可离子化的脂质选自62/475,166号美国申请中描述的化合物1-280。
在一些实施方案中，可离子化的脂质是
Figure BDA0003287551320000732
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化的脂质是
Figure BDA0003287551320000733
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化的脂质是
Figure BDA0003287551320000741
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化的脂质是
Figure BDA0003287551320000742
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化的脂质是62/733,315和62/798,874号美国申请中描述的化合物中的一者或多者。
在一些实施方案中，可离子化的脂质具有式(IL-IIh)：
Figure BDA0003287551320000743
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
每个R5独立地选自由OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”是键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R独立地选自由H、C1-3烷基和C2-3烯基组成的组；
RN是H或C1-3烷基；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；
Xa和Xb各自独立地为O或S；
R10选自由H、卤基、-OH、R、-N(R)2、-CN、-N3、-C(O)OH、-C(O)OR、-OC(O)R、-OR、-SR、-S(O)R、-S(O)OR、-S(O)2OR、-NO2、-S(O)2N(R)2、-N(R)S(O)2R、-NH(CH2)tlN(R)2、-NH(CH2)plO(CH2)qlN(R)2、-NH(CH2)slOR、-N((CH2)slOR)2、-N(R)-碳环、-N(R)-杂环、-N(R)-芳基、-N(R)-杂芳基、-N(R)(CH2)tl-碳环、-N(R)(CH2)tl-杂环、-N(R)(CH2)tl-芳基、-N(R)(CH2)tl-杂芳基、碳环、杂环、芳基和杂芳基；
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；
n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
r是0或1；
t1选自1、2、3、4和5；
p1选自1、2、3、4和5；
q1选自1、2、3、4和5；且
s1选自1、2、3、4和5。
在一些实施方案中，可离子化的脂质具有式(IL-IIj)：
Figure BDA0003287551320000761
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中
l选自1、2、3、4和5；
M1是键或M’；且
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，可离子化的脂质具有式(IL-IIk)：
Figure BDA0003287551320000762
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中
l选自1、2、3、4和5；
M1是键或M’；且
Ra’和Rb’独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；且
R2和R3独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，可离子化的脂质是
Figure BDA0003287551320000771
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化的脂质是62/733,315和62/798,874号美国申请中描述的化合物中的一者或多者。
在一些实施方案中，可离子化的脂质具有式(IL-IIh)：
Figure BDA0003287551320000772
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
每个R5独立地选自由OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”是键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R独立地选自由H、C1-3烷基和C2-3烯基组成的组；
RN是H或C1-3烷基；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；
Xa和Xb各自独立地为O或S；
R10选自由H、卤基、-OH、R、-N(R)2、-CN、-N3、-C(O)OH、-C(O)OR、-OC(O)R、-OR、-SR、-S(O)R、-S(O)OR、-S(O)2OR、-NO2、-S(O)2N(R)2、-N(R)S(O)2R、-NH(CH2)tlN(R)2、-NH(CH2)plO(CH2)qlN(R)2、-NH(CH2)slOR、-N((CH2)slOR)2、-N(R)-碳环、-N(R)-杂环、-N(R)-芳基、-N(R)-杂芳基、-N(R)(CH2)tl-碳环、-N(R)(CH2)tl-杂环、-N(R)(CH2)tl-芳基、-N(R)(CH2)tl-杂芳基、碳环、杂环、芳基和杂芳基；
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；
n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
r是0或1；
t1选自1、2、3、4和5；
p1选自1、2、3、4和5；
q1选自1、2、3、4和5；且
s1选自1、2、3、4和5。
在一些实施方案中，可离子化的脂质具有式(IL-IIi)：
Figure BDA0003287551320000791
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中
Rla和R1b独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；且
R2和R3独立地选自由C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环。
在一些实施方案中，可离子化的脂质具有式(IL-IIj)：
Figure BDA0003287551320000792
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中
l选自1、2、3、4和5；
M1是键或M’；且
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，可离子化的脂质具有式(IL-IIk)：
Figure BDA0003287551320000801
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中
l选自1、2、3、4和5；
M1是键或M’；且
Ra’和Rb’独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；且
R2和R3独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，可离子化的脂质是
Figure BDA0003287551320000802
或其盐。
在一些方面，本公开的可离子化的脂质可以是式(IL-III)的化合物中的一者或多者，
Figure BDA0003287551320000803
或其盐或异构体，其中
W是
Figure BDA0003287551320000804
环A是
Figure BDA0003287551320000811
t是1或2；
A1和A2各自独立地选自CH或N；
Z是CH2或不存在，其中当Z是CH2时，虚线(1)和(2)各自代表单键；且当Z不存在时，虚线(1)和(2)都不存在；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由C5-20烷基、C5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组；
RX1和RX2各自独立地为H或C1-3烷基；
每个M独立地选自由-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-C(O)S-、-SC(O)-、芳基和杂芳基组成的组；
M*是C1-C6烷基，
W1和W2各自独立地选自由-O-和-N(R6)-组成的组；
每个R6独立地选自由H和C1-5烷基组成的组；
X1、X2和X3独立地选自由键、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-(CH2)n-C(O)-、-C(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-C(O)O-、-OC(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-OC(O)-、-C(O)O-(CH2)n-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基和C3-6碳环组成的组；
每个R’独立地选自由C1-12烷基、C2-12烯基和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-12烷基、C3-12烯基和-R*MR’组成的组；且
n是1-6的整数；
其中当环A是
Figure BDA0003287551320000821
时，则
i)X1、X2和X3中的至少一者不是-CH2-；和/或
ii)R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者是-R”MR’。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(IL-IIIal)-(IL-IIIa8)中的任一者：
Figure BDA0003287551320000822
Figure BDA0003287551320000831
在一些实施方案中，可离子化的脂质是62/271,146、62/338,474、62/413,345和62/519,826号美国申请以及PCT/US2016/068300号PCT申请中描述的化合物中的一者或多者。
在一些实施方案中，可离子化的脂质选自62/519,826号美国申请中描述的化合物1-156。
在一些实施方案中，可离子化的脂质选自62/519,826号美国申请中描述的化合物1-16、42-66、68-76和78-156。
在一些实施方案中，可离子化的脂质是
Figure BDA0003287551320000832
或其盐。
根据式(IL-I)、(IL-IA)、(IL-IB)、(IL-II)、(IL-IIa)、(IL-IIb)、(IL-IIc)、(IL-IId)、(IL-IIe)、(IL-IIf)、(IL-IIg)、(IL-III)、(IL-IIIal)、(IL-IIIa2)、(IL-IIIa3)、(IL-IIIa4)、(IL-IIIa5)、(IL-IIIa6)、(IL-IIIa7)或(IL-IIIa8)的脂质的中心胺部分可以在生理pH下被质子化。因此，脂质在生理pH下可具有正电荷或部分正电荷。这类脂质可以被称为阳离子或可离子化的(氨基)脂质。脂质也可以是两性离子的，即具有正电荷和负电荷两者的中性分子。
聚乙二醇(PEG)脂质
如本文所用，术语“PEG脂质”是指聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。PEG脂质的非限制性实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺。这类脂质也被称为PEG化脂质。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG脂质包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二硬脂酰基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油酰基、PEG-二硬脂酰基、PEG-二酰基甘氨酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻酰基丙-3-胺(PEG-c-DMA)。
在一些实施方案中，PEG脂质选自由PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油及其混合物组成的组。
在一些实施方案中，PEG脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C22的部分，优选约C14至约C16。在一些实施方案中，PEG部分(例如mPEG-NH2)的大小为约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG脂质是PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可包含为非扩散PEG的PEG脂质。非扩散PEG的非限制性实例包括PEG-DSG和PEG-DSPE。
PEG脂质是本领域中已知的，如8158601号美国专利和WO2015/130584A2号国际公布中描述的那些，上述专利文献以全文引用的方式并入本文。
一般来说，可以如2016年12月10日提交的标题为“Compositions and Methodsfor Delivery of Therapeutic Agents”的PCT/US2016/000129号国际专利申请中所述来合成本文所述的各种化学式的一些其它脂质组分(例如，PEG脂质)，该申请以全文引用的方式并入。
PEG脂质是用聚乙二醇修饰的脂质。PEG脂质可选自包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油及其混合物的非限制性组。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质可以是WO2012099755号国际公布中描述的PEG化脂质，该公布的内容以全文引用的方式并入本文。本文所述的这些示例性PEG脂质中的任一者可以被修饰以在PEG链上包含羟基。在一些实施方案中，PEG脂质是PEG-OH脂质。如本文一般所定义，“PEG-OH脂质”(本文也称为“羟基-PEG化脂质”)是在脂质上具有一个或多个羟基(-OH)基团的PEG化脂质。在一些实施方案中，PEG-OH脂质在PEG链上包括一个或多个羟基。在一些实施方案中，PEG-OH或羟基-PEG化脂质在PEG链的末端包含-OH基团。每种可能性代表本发明单独的实施方案。
在一些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是式(PL-I)的化合物。本文提供了式(PL-I)的化合物：
Figure BDA0003287551320000861
或其盐，其中：
R3是-ORO；
RO是氢、任选取代的烷基或氧保护基团；
r是1与100之间的整数，包括1和100；
L1是任选取代的C1-10亚烷基，其中任选取代的C1-10亚烷基的至少一个亚甲基独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、-OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)替代；
D是通过点击化学获得的部分或在生理条件下可切割的部分；
m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有式：
Figure BDA0003287551320000862
L2的每个实例独立地为键或任选取代的C1-6亚烷基，其中任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选被O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)替代；
R2的每个实例独立地为任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、-NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、-OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、-N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、-N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O替代；
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基团；
环B是任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；且
p是1或2。
在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物是PEG-OH脂质(即，R3是-ORO，且RO是氢)。在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有式(PL-I-OH)：
Figure BDA0003287551320000871
或其盐。
在一些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是PEG化脂肪酸。在一些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是式(PL-II)的化合物。本文提供了式(PL-II)的化合物：
Figure BDA0003287551320000872
或其盐，其中：
R3是-ORo；
RO是氢、任选取代的烷基或氧保护基团；
r是1与100之间的整数，包括1和100；
R5是任选取代的C10-40烷基、任选取代的C10-40烯基或任选取代的C10-40炔基；且任选R5的一个或多个亚甲基被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、-NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、-SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、-NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、-N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、-S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O替代；且
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基团。
在一些实施方案中，式(PL-II)的化合物具有式(PL-II-OH)：
Figure BDA0003287551320000881
或其盐。在一些实施方案中，r是45。
又在其它实施方案中，式(PL-II)的化合物是：
Figure BDA0003287551320000882
或其盐。
在一些实施方案中，式(PL-II)的化合物是
Figure BDA0003287551320000883
在一些实施方案中，PEG脂质可以是62/520,530号美国申请中描述的PEG脂质中的一者或多者。在一些实施方案中，PEG脂质是式(PL-III)的化合物：
Figure BDA0003287551320000891
或其盐或异构体，其中s是1与100之间的整数。
在一些实施方案中，PEG脂质是下式的化合物：
Figure BDA0003287551320000892
结构脂质
如本文所用，术语“结构脂质”是指固醇，并且也指含有固醇部分的脂质。
在脂质纳米颗粒中掺入结构脂质可有助于减轻颗粒中其它脂质的聚集。结构脂质可选自包括但不限于胆固醇、粪固醇(fecosterol)、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、番茄素、乌索酸、α-生育酚、藿烷、植物固醇、类固醇及其混合物的组。在一些实施方案中，结构脂质是固醇。如本文所定义，“固醇”是由类固醇的醇类组成的类固醇的亚组。在一些实施方案中，结构脂质是类固醇。在一些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在一些实施方案中，结构脂类是胆固醇的类似物。在一些实施方案中，结构脂质是α-生育酚。
在一些实施方案中，结构脂质可以是62/520,530号美国申请中描述的结构脂质中的一者或多者。
磷脂
磷脂可组装成一个或多个脂质双层。一般来说，磷脂包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。
磷脂部分可选自例如由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂组成的非限制性组。
脂肪酸部分可选自例如由月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山萮酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸组成的非限制性组。
特定的磷脂可促进与膜的融合。在一些实施方案中，阳离子磷脂可与膜(例如，细胞膜或细胞内膜)的一种或多种带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可允许含脂质的组合物的一种或多种要素(例如，治疗剂)穿过膜，从而允许例如将一种或多种要素递送至靶组织。
也考虑了非天然磷脂物质，包括具有修饰和取代(包括支化、氧化、环化和炔烃)的天然物质。在一些实施方案中，磷脂可用一种或多种炔烃(例如，其中一个或多个双键被三键替代的烯基)官能化或交联。在适当的反应条件下，炔烃基团在暴露于叠氮化物时可经历铜催化的环加成。
磷脂包括但不限于甘油磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括鞘磷脂(phosphosphingolipid)，如鞘磷脂(sphingomyelin)。
在一些实施方案中，可用于或可能用于本发明的磷脂是DSPC的类似物或变体。在一些实施方案中，可用于或可能用于本发明的磷脂是式(PL-I)的化合物：
Figure BDA0003287551320000911
(PL-I)，
或其盐，其中：
每个R1独立地为任选取代的烷基；或者任选两个R1与居间原子连接在一起形成任选取代的单环碳环基或任选取代的单环杂环基；或者任选三个R1与居间原子连接在一起形成任选取代的双环碳环基或任选取代的双环杂环基；
n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有式：
Figure BDA0003287551320000912
L2的每个实例独立地为键或任选取代的C1-6亚烷基，其中任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选被-O-、-N(RN)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-或-NRNC(O)N(RN)-替代；
R2的每个实例独立地为任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-替代；
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基团；
环B是任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；且
p是1或2；
条件是所述化合物不具有下式：
Figure BDA0003287551320000921
其中R2的每个实例独立地为未取代的烷基、未取代的烯基或未取代的炔基。
在一些实施方案中，磷脂可以是62/520,530号美国申请中描述的磷脂中的一者或多者。
i)磷脂头修饰
在一些实施方案中，可用于或可能用于本发明的磷脂包含修饰的磷脂头(例如，修饰的胆碱基团)。在一些实施方案中，具有修饰头的磷脂是具有修饰的季胺的DSPC或其类似物。在一些实施方案中，在式(PL-I)的实施方案中，R1中的至少一者不是甲基。在一些实施方案中，R1中的至少一者不是氢或甲基。在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有下式之一：
Figure BDA0003287551320000931
或其盐，其中：
每个t独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
每个u独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；且
每个v独立地为1、2或3。
在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有式(PL-I-a)：
Figure BDA0003287551320000932
(PL-I-a)，
或其盐。
在一些实施方案中，可用于或可能用于本发明的磷脂包含环状部分代替甘油酯部分。在一些实施方案中，可用于本发明的磷脂是具有代替甘油酯部分的环状部分的DSPC或其类似物。在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有式(PL-I-b)：
Figure BDA0003287551320000933
(PL-I-b)，
或其盐。
(ii)磷脂尾修饰
在一些实施方案中，可用于或可能用于本发明的磷脂包含修饰的尾。在一些实施方案中，可用于或可能用于本发明的磷脂是具有修饰的尾的DSPC或其类似物。如本文所述，“修饰的尾”可以是具有更短或更长的脂族链、引入了分支的脂族链、引入了取代基的脂族链、其中一个或多个亚甲基被环状或杂原子基团替代的脂族链或其任何组合的尾。在一些实施方案中，在一些实施方案中，(PL-I)的化合物具有式(PL-I-a)，或其盐，其中R2的至少一个实例为R2的每个实例是任选取代的C1-30烷基，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-替代。
在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有式(PL-I-c)：
Figure BDA0003287551320000941
或其盐，其中：
每个x独立地为0-30之间的整数，包括0和30；且
G的每个实例独立地选自由以下组成的组：任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-。每种可能性代表本发明单独的实施方案。
在一些实施方案中，可用于或可能用于本发明的磷脂包含修饰的磷酸胆碱部分，其中连接季胺与磷酰基的烷基链不是亚乙基(例如，n不是2)。因此，在一些实施方案中，可用于或可能用于本发明的磷脂是式(PL-I)的化合物，其中n是1、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有下式中的一者：
Figure BDA0003287551320000951
或其盐。
替代的脂质
在一些实施方案中，使用替代的脂质代替本公开的磷脂。这类替代脂质的非限制性实例包括以下：
Figure BDA0003287551320000952
Figure BDA0003287551320000961
等效方案
本文已经描述了装置、系统和方法的示例实施方案。如别处所指出的那样，这些实施方案只是为了说明的目的而描述的，并不具有限制意义。其它实施方案也是可能的，并且被本公开所涵盖，这将从本文包含的教导中显而易见。因此，本公开的广度和范围不应受任何上述实施方案的限制，而应仅根据由本公开及其等效方案所支持的权利要求来限定。此外，本公开的实施方案可包括方法、系统和装置，其可还包括来自任何其它公开的方法、系统和装置的任何及所有要素，包括对应于目标颗粒分离、聚焦/浓缩的任何及所有要素。换言之，来自一个或另一个公开的实施方案的要素可与来自其它公开的实施方案的要素互换。此外，可以删除公开的实施方案的一个或多个特征/要素，并且仍然导致主题具有可专利性(并因此产生本公开更多的实施方案)。相应地，本公开的一些实施方案可通过明确地缺少一个或多个要素/特征而在可专利性方面与一个和/或另一个参考文献不同。换言之，请求保护某些实施方案可包含负面限制以明确排除一个或多个要素/特征，从而产生在可专利性方面与包括这类特征/要素的现有技术不同的实施方案。
Figure IDA0003287551380000011

Claims (83)

1.一种涡流混合器，所述涡流混合器包括：
涡流混合室，所述涡流混合室具有第一壁、第二壁以及连接所述第一壁和所述第二壁的侧壁；
沿所述侧壁配置的至少两个入口端口，每个入口端口具有与其连接的入口通道，所述至少两个入口端口围绕所述涡流混合室大致等距间隔开，并与所述涡流混合室切向配置；和
出口端口，所述出口端口具有与其连接的出口通道，所述出口端口大致配置在所述第二壁的径向中心处，所述出口通道从所述出口端口并远离所述涡流混合室延伸。
2.如权利要求1所述的涡流混合器，其中所述涡流混合室是圆形的，且所述侧壁围绕所述第一壁和所述第二壁的圆周延伸。
3.如权利要求1所述的涡流混合器，其中每个入口通道接收来自单个源的流体。
4.如权利要求1所述的涡流混合器，其中每个入口通道接收来自不同源的流体。
5.如权利要求1所述的涡流混合器，其中所述涡流混合器具有四个入口端口。
6.如权利要求5所述的涡流混合器，其中所述四个入口端口中的第一两个接收来自第一源的流体，且所述四个入口端口中的第二两个接收来自第二源的流体。
7.如权利要求6所述的涡流混合器，其中所述第一两个入口端口彼此相对配置，且所述第二两个入口端口彼此相对配置，使得所述第一两个入口端口分开约180度，且所述第二两个入口端口分开约180度，并且所述第一两个入口端口中的每一个与所述第二两个入口端口中的每一个成约90度。
8.如权利要求5所述的涡流混合器，其中所述四个入口端口中的每一个从单独的源接收流体。
9.如权利要求8所述的涡流混合器，其中所述四个入口端口中的第一两个接收第一流体，且所述四个入口端口中的第二两个接收第二流体，其中所述第一两个入口端口彼此相对配置，且所述第二两个入口端口彼此相对配置，使得所述第一两个入口端口分开约180度，且所述第二两个入口端口分开约180度，并且所述第一两个入口端口中的每一个与所述第二两个入口端口中的每一个成约90度。
10.如权利要求1所述的涡流混合器，其中所述出口端口和所述出口通道与所述第二壁呈大约90度角。
11.如权利要求1所述的涡流混合器，其中所述侧壁的高度与所述至少两个入口端口的高度相同。
12.如前述权利要求中任一项所述的涡流混合器，其中所述侧壁的高度大于所述至少两个入口端口的高度。
13.如权利要求1所述的涡流混合器，其中所述出口端口的直径为x，且其中：
所述第一壁和所述第二壁的直径为5*x；
所述侧壁的高度为1.75*x；
所述至少两个入口端口各自的高度为0.75*x。
14.如权利要求13所述的涡流混合器，其中x可以是1mm、2mm、4mm、5mm或0.5mm。
15.一种系统，其包括以d x w配置并排布置在单个平面中的n个涡流混合器，其中n、d和w是整数；
其中所述涡流混合器中的每一个包括前述权利要求中任一项叙述的特性。
16.一种涡流混合器，所述涡流混合器包括：
涡流混合室，所述涡流混合室具有第一壁、第二壁以及连接所述第一壁和所述第二壁的侧壁；
沿所述侧壁配置的至少两个主入口端口，每个主入口端口具有与其连接的主入口通道，所述至少两个主入口端口围绕所述涡流混合室大致等距间隔开，并与所述涡流混合室切向配置
大致配置在所述第一壁的径向中心处的次入口端口，所述次入口端口具有与其连接的次入口通道；和
出口端口，所述出口端口具有与其连接的出口通道，所述出口端口大致配置在所述第二壁的径向中心处，所述出口通道从所述出口端口并远离所述涡流混合室延伸。
17.如权利要求16所述的涡流混合器，其中所述涡流混合室是圆形的，且所述侧壁围绕所述第一壁和所述第二壁的圆周延伸。
18.如权利要求16所述的涡流混合器，其中每个入口通道接收来自单个源的流体。
19.如权利要求16所述的涡流混合器，其中每个入口通道接收来自不同源的流体。
20.如权利要求16所述的涡流混合器，其中所述涡流混合器具有四个主入口端口。
21.如权利要求20所述的涡流混合器，其中所述四个主入口端口中的第一两个接收来自第一源的流体，所述四个主入口端口中的第二两个接收来自第二源的流体，且所述次入口端口接收来自第三源的流体。
22.如权利要求21所述的涡流混合器，其中所述第一两个主入口端口彼此相对配置，且所述第二两个主入口端口彼此相对配置，使得所述第一两个主入口端口分开约180度，且所述第二两个主入口端口分开约180度，并且所述第一两个主入口端口中的每一个与所述第二两个主入口端口中的每一个成约90度。
23.如权利要求20所述的涡流混合器，其中所述四个主入口端口中的每一个从单独的源接收流体。
24.如权利要求23所述的涡流混合器，其中所述四个主入口端口中的第一两个接收第一流体，且所述四个主入口端口中的第二两个接收第二流体，其中所述第一两个主入口端口彼此相对配置，且所述第二两个主入口端口彼此相对配置，使得所述第一两个主入口端口分开约180度，且所述第二两个主入口端口分开约180度，并且所述第一两个主入口端口中的每一个与所述第二两个主入口端口中的每一个成约90度。
25.如权利要求16所述的涡流混合器，其中所述出口端口和所述出口通道与所述第二壁呈大约90度角。
26.如权利要求16所述的涡流混合器，其中所述侧壁的高度与所述至少两个入口端口的高度相同。
27.如前述权利要求中任一项所述的涡流混合器，其中所述侧壁的高度大于所述至少两个入口端口的高度。
28.如权利要求16所述的涡流混合器，其中所述出口端口的直径为x，且其中：
所述第一壁和所述第二壁的直径为5*x；
所述侧壁的高度为1.75*x；
所述至少两个主入口端口各自的高度为0.75*x；且
所述次入口端口的直径为0.5x。
29.如权利要求28所述的涡流混合器，其中x可以是1mm、2mm、4mm、5mm或0.5mm。
30.一种系统，其包括以d x w配置并排布置在单个平面中的n个涡流混合器，其中n、d和w是整数；
其中所述涡流混合器中的每一个包括前述权利要求中任一项叙述的特性。
31.一种混合系统，其包括：
初始涡流混合器，所述初始涡流混合器包括：
涡流混合室，所述涡流混合室具有第一壁、第二壁以及连接所述第一壁和所述第二壁的侧壁；
沿所述侧壁配置的至少两个入口端口，每个入口端口具有与其连接的入口通道，所述至少两个入口端口围绕所述涡流混合室大致等距间隔开，并与所述涡流混合室切向配置；和
出口端口，所述出口端口具有与其连接的出口通道，所述出口端口配置在所述第二壁的径向中心处，所述出口通道从所述出口端口并远离所述涡流混合室延伸；和
后续涡流混合器，所述后续涡流混合器包括：
涡流混合室，所述涡流混合室具有第一壁、第二壁以及连接所述第一壁和所述第二壁的侧壁；
沿所述侧壁配置的至少两个入口端口，每个入口端口具有与其连接的入口通道，所述至少两个入口端口围绕所述涡流混合室大致等距间隔开，并与所述涡流混合室切向配置；
附加入口端口；和
出口端口，所述出口端口具有与其连接的出口通道，所述出口端口配置在所述第二壁的径向中心处，所述出口通道从所述出口端口并远离所述涡流混合室延伸。
32.如权利要求31所述的混合系统，其中所述附加入口端口配置在所述后续涡流混合器的所述第一壁的径向中心处。
33.如权利要求31或权利要求32所述的混合系统，其中所述附加入口端口与从所述初始涡流混合器出口端口延伸的所述出口通道连接。
34.如权利要求31所述的混合系统，其还包括配置在从所述初始涡流混合器出口端口延伸的所述出口通道的端部的分流器，所述分流器具有第一出口和第二出口。
35.如权利要求34所述的混合系统，其中所述第一出口与所述至少两个入口端口中的第一个连接，且所述第二出口与所述至少两个入口端口中的第二个连接。
36.如权利要求35所述的混合系统，其中与所述至少两个入口端口中的所述第一个连接的入口通道垂直于所述第一出口，且与所述至少两个入口端口中的所述第二个连接的入口通道垂直于所述第二出口。
37.如权利要求35所述的混合系统，其中所述附加入口端口与附加入口通道连接。
38.如权利要求37所述的混合系统，其中所述附加入口通道包括第一段和第二段，所述第二段与所述附加入口端口连接。
39.如权利要求38所述的混合系统，其中所述第二段大致垂直于所述第一段。
40.如权利要求38所述的混合系统，其中所述第二段大致垂直于与所述至少两个入口端口中的所述第一个连接的入口通道，且所述第二段垂直于与所述至少两个入口端口中的所述第二个连接的入口通道。
41.如权利要求38所述的混合系统，其中所述第二段大致平行于所述后续涡流混合器出口通道。
42.如权利要求36所述的混合系统，其中所述后续涡流混合器还包括第二附加入口端口。
43.如权利要求20所述的混合系统，其中所述附加入口端口和所述第二附加入口端口沿所述侧壁配置，所述附加入口端口和所述第二附加入口端口围绕所述后续涡流混合室大致等距间隔开，并与所述涡流混合室切向配置。
44.如权利要求21所述的混合系统，其中所述后续涡流混合器具有两个入口端口、所述附加入口端口和所述第二附加入口端口，其中的每一者围绕所述涡流混合室大致等距间隔开，使得所述入口端口各自分开约90度。
45.如权利要求22所述的混合系统，其还包括第二分流器，所述第二分流器具有与所述附加入口端口连接的第一出口和与所述第二附加入口端口连接的第二出口。
46.如权利要求35所述的混合系统，其中：
所述分流器具有第三出口和第四出口，
所述后续涡流混合器具有四个入口端口，
所述第一出口与所述四个入口端口中的第一个连接，
所述第二出口与所述四个入口端口中的第二个连接，
所述第三出口与所述四个入口端口中的第三个连接，且
所述第四出口与所述四个入口端口中的第四个连接。
47.如权利要求35所述的混合系统，其中：
所述后续涡流混合器具有四个入口端口，
所述第一出口与所述四个入口端口中的第一个连接，
所述第二出口与所述四个入口端口中的第二个连接，
所述第三入口端口与进口端口连接，且
所述第四入口端口与附加进口端口连接。
48.如权利要求31所述的混合系统，其中所述初始涡流混合器出口端口的直径为x，且其中：
所述初始涡流第一壁和所述初始涡流第二壁的直径为5*x；
所述初始涡流侧壁的高度为1.75*x；
所述至少两个初始涡流入口端口各自的高度为0.75*x。
49.如权利要求31所述的混合系统，其中所述后续涡流混合器出口端口的直径为y，且其中：
所述后续涡流混合器第一壁和所述后续涡流混合器第二壁的直径为5*y；
所述后续涡流混合器侧壁的高度为1.75*y；
所述至少两个后续涡流混合器入口端口各自的高度为0.75*y。
50.如权利要求31所述的混合系统，其中：
所述初始涡流混合器出口端口的直径为x，且其中：
所述初始涡流第一壁和所述初始涡流第二壁的直径为5*x；
所述初始涡流侧壁的高度为1.75*x；
所述至少两个初始涡流入口端口各自的高度为0.75*x；且
所述后续涡流混合器出口端口的直径为y，且其中：
所述后续涡流混合器第一壁和所述后续涡流混合器第二壁的直径为5*y；
所述后续涡流混合器侧壁的高度为1.75*y；
所述至少两个后续涡流混合器入口端口各自的高度为0.75*y。
51.如权利要求26所述的混合系统，其中x＝y。
52.如权利要求26所述的混合系统，其中x>y。
53.如权利要求31所述的混合系统，其中所述初始涡流混合器和所述后续涡流混合器由不锈钢、PEEK、LFEM、丙烯酸、3-D打印介质和增材制造材料中的至少一者制成。
54.如权利要求31或权利要求53所述的混合系统，其中所述初始涡流混合器和所述后续涡流混合器由相同材料制成。
55.如权利要求31所述的混合系统，其中所述初始涡流混合器出口端口和所述初始涡流出口通道与所述初始涡流第二壁呈大约90度角，且其中所述后续涡流混合器出口端口和所述后续涡流出口通道与所述后续涡流第二壁呈大约90度角。
56.一种混合系统，其包括：
初始涡流混合器，所述初始涡流混合器包括：
涡流混合室，所述涡流混合室具有第一壁、第二壁以及连接所述第一壁和所述第二壁的侧壁；
沿所述侧壁配置的至少两个入口端口，每个入口端口具有与其连接的入口通道，所述至少两个入口端口围绕所述涡流混合室大致等距间隔开，并与所述涡流混合室切向配置；和
出口端口，所述出口端口具有与其连接的出口通道，所述出口端口配置在所述第二壁的径向中心处，所述出口通道从所述出口端口并远离所述涡流混合室延伸；和
后续涡流混合器，所述后续涡流混合器包括：
涡流混合室，所述涡流混合室具有第一壁、第二壁以及连接所述第一壁和所述第二壁的侧壁；
至少两个入口端口，所述至少两个入口端口中的第一入口端口与所述侧壁连接，所述第一入口端口与所述初始涡流混合器的所述出口通道连接；
出口端口，所述出口端口具有与其连接的出口通道，所述出口端口配置在所述第二壁的径向中心处，所述出口通道从所述出口端口并远离所述涡流混合室延伸。
57.如权利要求56所述的混合系统，其中所述后续涡流混合器的所述至少两个入口端口中的第二入口端口与所述后续涡流混合器的所述涡流混合室的所述第一壁连接。
58.如权利要求57所述的混合系统，其中所述后续涡流混合器的所述至少两个入口端口中的第二入口端口配置在所述后续涡流混合器的所述涡流混合室的所述第一壁的径向中心处。
59.如权利要求57所述的混合系统，其中所述后续涡流混合器的所述至少两个入口端口中的第二入口端口与入口通道连接，所述入口通道平行于所述后续涡流混合器的所述出口通道。
60.如权利要求56所述的混合系统，其中所述后续涡流混合器的所述至少两个入口端口中的第二入口端口与所述后续涡流混合器的所述涡流混合室的所述侧壁连接。
61.一种混合系统的网络，其包括以d x w配置并排布置在单个平面中的n个混合系统，其中n、d和w是整数；
其中所述混合系统中的每一个包括权利要求31-60中任一项叙述的特性。
62.一种混合方法，包括：
在第一涡流混合室处并从至少两个入口端口接收第一流体；
在所述第一涡流混合室处并从至少两个入口端口接收第二流体；
在所述第一涡流混合室中混合所述第一流体和所述第二流体以形成第一流出流体；
使所述第一流出流体流出到第一出口通道中；
经由分流器使所述第一流出流体分流到至少两个通道中；
在第二涡流混合室处接收来自与所述至少两个通道连接的至少两个入口端口的所述第一流出流体；
在所述第二涡流混合室处接收第三流体；
在所述第二涡流混合室中混合所述流出流体和所述第三流体以形成第二流出流体；并
使所述第二流出流体流出到第二出口通道中。
63.如权利要求62所述的混合方法，其中所述第一流体包含缓冲液，且所述第二流体包含脂质混合物，并且其中所述第一流出流体包含空纳米颗粒。
64.如权利要求63所述的混合方法，其中所述第三流体包含核酸，且其中所述第二流出流体包含保持核酸的纳米颗粒。
65.如权利要求64所述的混合方法，其中所述核酸通过疏水相互作用和带电相互作用中的至少一者结合到所述纳米颗粒中。
66.如权利要求64所述的混合方法，其中在所述核酸被接收在所述第二涡流混合室中之前在所述初始涡流混合室中形成空纳米颗粒防止所述核酸在其与所述脂质混合物混合前直接暴露于所述缓冲液。
67.如权利要求65所述的混合方法，其中防止所述核酸直接暴露于所述缓冲液防止了所述核酸的酸化和降解中的至少一者。
68.如权利要求66所述的混合方法，其中所述核酸是RNA。
69.一种混合系统，其包括：
多个涡流混合器，每个涡流混合器包括：
涡流混合室，所述涡流混合室具有第一壁、第二壁以及连接所述第一壁和所述第二壁的侧壁；
沿所述侧壁配置的至少两个入口端口，每个入口端口具有与其连接的入口通道，所述至少两个入口端口围绕所述涡流混合室大致等距间隔开，并与所述涡流混合室切向配置；和
出口端口，所述出口端口具有与其连接的出口通道，所述出口端口配置在所述第二壁的径向中心处，所述出口通道从所述出口端口并远离所述涡流混合室延伸，其中所述多个涡流混合器包括以d x w配置并排布置在混合板上的单个平面中的n个涡流混合器，其中n、d和w是整数。
70.如权利要求69所述的混合系统，其中n＝24，d＝6，且w＝4。
71.如权利要求69所述的混合系统，其中每个涡流混合器具有四个入口端口。
72.如权利要求71所述的混合系统，其中每个入口端口与移液管流体联接。
73.如权利要求71所述的混合系统，其中每个涡流混合器的所述四个入口端口中的第一两个接收来自第一源的流体，且所述四个入口端口中的第二两个接收来自第二源的流体。
74.如权利要求71所述的混合系统，其中每个涡流混合器的所述四个入口端口中的第一三个接收来自第一源的流体，且所述四个入口端口中的第四个接收来自第二源的流体。
75.如权利要求72所述的混合系统，其中每个涡流混合器的第一两个入口端口彼此相对配置，且每个涡流混合器的第二两个入口端口彼此相对配置，使得所述第一两个入口端口分开约180度，且所述第二两个入口端口分开约180度，并且所述第一两个入口端口中的每一个与所述第二两个入口端口中的每一个成约90度。
76.一种混合系统，其包括：
多个混合子系统，每个混合子系统包括：
初始涡流混合器，所述初始涡流混合器包括：
涡流混合室，所述涡流混合室具有第一壁、第二壁以及连接所述第一壁和所述第二壁的侧壁；
沿所述侧壁配置的至少两个入口端口，每个入口端口具有与其连接的入口通道，所述至少两个入口端口围绕所述涡流混合室大致等距间隔开，并与所述涡流混合室切向配置；和
出口端口，所述出口端口具有与其连接的出口通道，所述出口端口配置在所述第二壁的径向中心处，所述出口通道从所述出口端口并远离所述涡流混合室延伸；和
后续涡流混合器，所述后续涡流系统包括：
涡流混合室，所述涡流混合室具有第一壁、第二壁以及连接所述第一壁和所述第二壁的侧壁；
沿所述侧壁配置的至少两个入口端口，每个入口端口具有与其连接的入口通道，所述至少两个入口端口围绕所述涡流混合室大致等距间隔开，并与所述涡流混合室切向配置；
附加入口端口；和
出口端口，所述出口端口具有与其连接的出口通道，所述出口端口配置在所述第二壁的径向中心处，所述出口通道从所述出口端口并远离所述涡流混合室延伸，其中所述多个涡流混合器包括以d x w配置并排配置布置在混合板上的单个平面中的n个混合子系统，其中n、d和w是整数。
77.如权利要求76所述的混合系统，其中n＝24，d＝6，且w＝4。
78.如权利要求76所述的混合系统，其中每个初始涡流混合器具有四个入口端口。
79.如权利要求78所述的混合系统，其中每个初始涡流混合器入口端口与移液管流体联接。
80.如权利要求79所述的混合系统，其中每个初始涡流混合器的所述四个入口端口中的第一两个接收来自第一源的流体，且所述四个入口端口中的第二两个接收来自第二源的流体。
81.如权利要求79所述的混合系统，其中每个初始涡流混合器的所述四个入口端口中的第一三个接收来自第一源的流体，且所述四个入口端口中的第四个接收来自第二源的流体。
82.如权利要求79所述的混合系统，其中每个初始涡流混合器的第一两个入口端口彼此相对配置，且每个涡流混合器的第二两个入口端口彼此相对配置，使得所述第一两个入口端口分开约180度，且所述第二两个入口端口分开约180度，并且所述第一两个入口端口中的每一个与所述第二两个入口端口中的每一个成约90度。
83.如权利要求69至82中任一项所述的混合系统，其还包括：
配置成移动产物容器的传送台架，和
配置成接收来自所述混合板的混合产物的n多个产物容器，
其中所述混合板相对于所述传送台架处于固定位置；且所述传送台架将第一产物容器移动到所述第一产物容器接收来自所述混合板的产物的位置，且所述传送台架移动随后的n-1个产物容器以接收来自所述混合系统的所述产物；
其中n是2与30之间的整数。
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