KR20210133218A - 볼텍스 믹서 및 연계된 방법, 시스템 및 이의 장치 - Google Patents

볼텍스 믹서 및 연계된 방법, 시스템 및 이의 장치 Download PDF

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KR20210133218A
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스테파니 커비
벤자민 겔드호프
카엘린 빅
브리 스키너
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모더나티엑스, 인크.
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Abstract

와류 혼합기(400)는 제1 벽(451), 제2 벽(452), 및 제1 벽과 제2 벽을 연결하는 측면 벽(453)을 갖는 와류 혼합 챔버(450)를 가질 수 있다. 적어도 2개의 입구 포트(405, 410, 415, 520)는 측면 벽을 따라 구성될 수 있으며, 각각의 입구 포트는 이에 연결된 입구 채널을 갖는다. 적어도 2개의 입구 포트는 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격될 수 있고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성될 수 있다. 출구 포트(455)는 이에 연결된 출구 채널을 가질 수 있다. 출구 포트는 제2 벽의 반경방향 중심에 구성될 수 있고, 출구 채널은 출구 포트로부터 와류 혼합 챔버로부터 이격되게 연장될 수 있다.

Description

와류 혼합기 및 이의 관련 방법, 시스템 및 장치
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 1월 31일자로 출원된 "와류 혼합기 및 이의 관련 방법, 시스템 및 장치"라는 명칭의 미국 가출원 번호 62/799,636 및 2019년 8월 14일자로 출원되고 "와류 혼합기 및 이의 관련 방법, 시스템 및 장치"라는 명칭의 미국 가출원 번호 62/886,592에 대한 우선권 및 이익을 주장하고, 그 개시 내용은 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.
서열 목록의 참조에 의한 통합
2020년 1월 30일에 생성되고 크기가 688b인 "MRNA-064001WO_Sequence_Listing.txt"라는 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.
본 개시는 와류 혼합기 및 이의 관련 방법, 시스템 및 장치에 관한 것이다.
와류 혼합기는 유체를 빠르게 회전시켜 유체를 변화시킨다. 와류 혼합기는 여러 유체를 수용할 수 있고 여러 유체를 함께 혼합하는 데 사용될 수 있다. 다수의 입구를 갖는 와류 혼합기에서 와류 혼합기는 하나 초과의 유체를 수용할 수 있고, 유체를 함께 혼합하는 데 사용될 수 있다.
본 개시의 일부 실시예는 와류 혼합기 및 이의 연계된 방법, 시스템 및 장치를 제시한다.
일부 실시예에서, 와류 혼합기는 제1 벽, 제2 벽, 및 제1 벽과 제2 벽을 연결하는 측면 벽을 갖는 와류 혼합 챔버를 가질 수 있다. 2개 이상의 입구 포트는 측면 벽을 따라 구성될 수 있고 각각의 입구 포트는 이에 연결된 입구 채널을 가질 수 있다. 상기 2개 이상의 입구 포트는 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격될 수 있고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성될 수 있다. 출구 채널이 연결된 출구 포트는 제2 벽의 반경방향 중심에 구성될 수 있다. 출구 채널은 출구 포트로부터 와류 혼합 챔버로부터 이격되는 방향으로 연장될 수 있다.
일부 실시예에서, 와류 혼합 챔버는 둥글 수 있고 측면 벽은 제1 벽과 제2 벽의 둘레 주위에서 연장될 수 있다.
각각의 입구 채널은 단일의 소스로부터 유체를 수용할 수 있거나 또는 각각의 입구 채널은 상이한 소스로부터 유체를 수용할 수 있다.
일부 구현에서, 와류 혼합기는 4개의 입구 포트를 가질 수 있다. 4개의 입구 포트들 중 2개의 제1 입구 포트는 제1 유체를 수용할 수 있고 4개의 입구 포트들 중 2개의 제2 입구 포트는 제2 유체를 수용할 수 있다. 2개의 제1 입구 포트가 서로 마주보게 구성될 수 있고 2개의 제2 입구 포트는 서로 마주보게 구성될 수 있어서 2개의 제1 입구 포트는 약 180도로 이격되고 2개의 제2 입구 포트는 약 180도로 이격되며, 각각의 2개의 제1 입구 포트는 각각의 2개의 제2 입구 포트로부터 약 90도이다. 대안으로, 4개의 입구 포트 각각은 개별 소스로부터 유체를 수용할 수 있다. 4개의 입구 포트들 중 2개의 제1 입구 포트는 제1 유체를 수용할 수 있고, 4개의 입구 포트들 중 2개의 제2 입구 포트는 제2 유체를 수용할 수 있다. 2개의 제1 입구 포트가 서로 마주보게 구성될 수 있고 2개의 제2 입구 포트는 서로 마주보게 구성될 수 있어서 2개의 제1 입구 포트는 약 180도로 이격되고 2개의 제2 입구 포트는 약 180도로 이격되며, 각각의 2개의 제1 입구 포트는 각각의 2개의 제2 입구 포트로부터 약 90도이다.
출구 포트 및 출구 채널은 제2 벽으로부터 대략 90도의 각도일 수 있다.
일부 실시예에서, 측면 벽의 높이는 2개 이상의 입구 포트의 높이와 동일할 수 있다. 다른 구현에서, 측면 벽의 높이는 2개 이상의 입구 포트의 높이보다 클 수 있다.
일부 실시예에서, 출구 포트는 x의 직경을 가질 수 있고, 제1 벽 및 제2 벽은 5*x의 직경을 가질 수 있고, 측면 벽은 1.75*x의 높이를 가질 수 있고, 2개 이상의 입구 포트는 0.75*x의 높이를 가질 수 있다. 다양한 구현에서, x의 값은 1mm, 2mm, 4mm, 5mm, 또는 0.5mm일 수 있다.
혼합 시스템은 초기 와류 혼합기 및 후속 와류 혼합기를 가질 수 있다. 초기 와류 혼합기는 제1 벽, 제2 벽, 및 제1 벽과 제2 벽을 연결하는 측면 벽을 갖는 와류 혼합 챔버를 가질 수 있다. 2개 이상의 입구 포트는 측면 벽을 따라 구성될 수 있고, 각각의 입구 포트는 이에 연결된 입구 채널을 갖는다. 상기 2개 이상의 입구 포트는 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격될 수 있고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성될 수 있다. 출구 채널이 연결된 출구 포트는 제2 벽의 반경방향 중심에 구성될 수 있다. 채널은 출구 포트로부터 와류 혼합 챔버로부터 이격되는 방향으로 연장될 수 있다.
후속 와류 혼합기는 제1 벽, 제2 벽, 및 제1 벽과 제2 벽을 연결하는 측면 벽을 갖는 와류 혼합 챔버를 가질 수 있다. 2개 이상의 입구 포트는 측면 벽을 따라 구성될 수 있고 각각의 입구 포트는 이에 연결된 입구 채널을 가질 수 있다. 상기 2개 이상의 입구 포트는 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격될 수 있고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성될 수 있다. 후속 와류 혼합기는 또한 추가 입구 포트, 및 출구 채널이 연결된 출구 포트를 가질 수 있다. 상기 출구 포트는 제2 벽의 중심에 구성될 수 있고, 채널은 출구 포트로부터 와류 혼합 챔버로부터 이격되는 방향으로 연장될 수 있다.
일부 실시예에서, 추가 입구 포트는 후속 와류 혼합기의 제1 벽의 반경방향 중심에 구성될 수 있다. 추가 입구 포트는 초기 와류 혼합기 출구 포트로부터 연장되는 채널에 연결될 수 있다.
스플리터는 초기 와류 혼합기 출구 포트로부터 연장되는 출구 채널의 단부에 구성될 수 있고 스플리터는 제1 출구 및 제2 출구를 가질 수 있다. 제1 출구는 2개 이상의 입구 포트 중 제1 입구 포트에 연결될 수 있고, 제2 출구는 2개 이상의 입구 포트 중 제2 입구 포트에 연결될 수 있다. 추가 입구 포트는 추가 입구 채널에 연결될 수 있다.
일부 실시예에서, 후속 와류 혼합기는 제2 추가 입구 포트를 포함할 수 있다. 추가 입구 포트 및 제2 추가 입구 포트는 측면 벽을 따라 구성될 수 있고, 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격되고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 후속 와류 혼합기는 입구 포트가 대략 90도로 각각 이격되도록 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 각각 이격되는 2개의 입구 포트, 추가 입구 포트, 및 제2 추가 입구 포트를 갖는다. 일부 구현은 또한 제2 스플리터를 포함하고, 제2 스플리터는 추가 입구 포트에 연결된 제1 출구 및 제2 추가 입구 포트에 연결된 제2 출구를 갖는다.
초기 와류 혼합기 출구 포트는 x의 직경을 가질 수 있고, 초기 와류 제1 벽 및 초기 와류 제2 벽은 5*x의 직경을 가질 수 있고, 초기 와류 측면 벽은 1.75*x의 높이를 가질 수 있고, 2개 이상의 초기 와류 입구 포트는 0.75*x의 높이를 각각 갖는다. 후속 와류 혼합기 출구 포트는 y의 직경을 가질 수 있고, 후속 와류 혼합기 제1 벽 및 후속 와류 혼합기 제2 벽은 5*y의 직경을 가질 수 있고, 후속 와류 혼합기 측면 벽은 1.75*y의 높이를 가질 수 있고, 2개 이상의 후속 와류 혼합기 입구 포트는 0.75*y의 높이를 각각 가질 수 있다. 일부 실시예에서 x와 y는 정확히 또는 대략 동일할 수 있고, 다른 실시예에서, x는 y보다 클 수 있다.
초기 와류 혼합기 및 후속 와류 혼합기는 스테인레스 스틸, PEEK, LFEM, 아크릴, 3-D 인쇄 미디어 및 첨가 제조 재료 중 하나 이상으로 제조될 수 있다. 초기 와류 혼합기 및 후속 와류 혼합기는 동일한 재료로 제조될 수 있다.
초기 와류 혼합기 출구 포트 및 초기 와류 출구 채널은 초기 와류 제2 벽으로부터 대략 90도의 각도일 수 있고, 후속 와류 혼합기 출구 포트 및 후속 와류 출구 채널은 후속 와류 제2 벽으로부터 대략 90도의 각도일 수 있다.
혼합 방법은 제1 와류 혼합 챔버 및 2개 이상의 입구 포트로부터 제1 유체를 수용하는 단계 및 제1 와류 혼합 챔버에서 2개 이상의 입구 포트로부터 제2 유체를 수용하는 단계를 포함할 수 있다. 제1 유체 및 제2 유체는 제1 유출 유체를 형성하기 위해 혼합될 수 있고, 제1 유출 유체를 제1 출구 채널로 흐를 수 있다. 제1 유출 유체는 스플리터에 의해 2개 이상의 채널로 분할될 수 있다. 제1 유출 유체는 2개 이상의 채널에 연결된 2개 이상의 입구 포트로부터 제2 와류 혼합 챔버에서 수용될 수 있다. 제3 유체는 제2 와류 혼합 챔버에 수용될 수 있고, 유출 유체 및 제3 유체는 제2 유출 유체를 형성하기 위하여 제2 와류 혼합 챔버에서 혼합될 수 있다. 제2 유출 유체는 제2 출구 채널 내로 흐를 수 있다.
일부 구현에서, 제1 유체는 완충액을 포함할 수 있고 제2 유체는 지질 혼합물을 포함할 수 있고, 제1 유출 유체는 빈 나노입자를 포함할 수 있다. 제3 유체는 핵산(예를 들어, RNA)을 포함할 수 있고, 제2 유출 유체는 핵산-보유 나노입자를 포함할 수 있다. 핵산은 소수성 상호작용 및/또는 하전 상호작용 중 적어도 하나에 의해 나노입자에 통합될 수 있다. 핵산이 제2 와류 혼합 챔버에 수용되기 전에 초기 와류 혼합 챔버에서 빈 나노입자의 형성은 핵산이 지질 혼합물과 혼합되기 전에 완충액에 대한 핵산의 직접 노출을 방지할 수 있다. 완충액에 대한 핵산의 직접 노출을 방지하는 단계는 핵산의 산성화 및 분해 중 적어도 하나를 방지할 수 있다.
특허 또는 출원 파일에는 색상으로 수행된 하나 이상의 도면이 포함한다. 색상 도면(들)이 있는 이 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 비용의 지불 시 사무소에서 제공한다.
도 1a 내지 도 1e는 일부 실시예에 따른 와류 혼합기를 도시한다.
도 2는 일부 실시예에 따른 와류 혼합기를 도시한다.
도 3a 내지 3b는 일부 실시예에 따른 와류 혼합기를 도시한다.
도 4a 내지 도 4c는 일부 실시예에 따른 와류 혼합기를 도시한다.
도 5는 일부 실시예에 따른 2 스테이지 와류 혼합기를 도시한다.
도 6a 내지 6b는 일부 실시예에 따른 2 스테이지 와류 혼합기를 도시한다.
도 7a 내지 7b는 일부 실시예에 따른 2 스테이지 와류 혼합기를 도시한다.
도 8은 일부 실시예에 따른 2 스테이지 혼합기를 도시한다.
도 9a 내지 9b는 일부 실시예에 따른 2 스테이지 와류 혼합기를 도시한다.
도 10은 일부 실시예에 따른 2 스테이지 와류 혼합기를 도시한다.
도 11a 내지 11d는 일부 실시예에 따른 와류 혼합기의 시스템을 도시한다.
도 12는 일부 실시예에 따른 와류 혼합기의 시스템을 도시한다.
도 13a는 일부 실시예에 따른 와류 혼합기를 도시한다.
도 13b는 일부 실시예에 따른 시간 대 압력 플롯을 도시한다.
도 13c는 일부 실시예에 따른 와류 혼합기의 중간 챔버 및 제1 및 제2 벽에서의 질량 분율을 도시한다.
도 14a 내지 14b는 일부 실시예에 따른 와류 혼합기를 도시한다.
도 14c는 도 13a-13b의 와류 혼합기의 시간 대 압력 플롯을 도시한다.
도 14d 내지 도 14f는 일부 실시예에 따른 와류 혼합기를 도시한다.
도 15a 내지 도 15c는 일부 실시예에 따른 다양한 스케일에서 와류 혼합 챔버 내의 혼합을 도시한다.
도 15d는 일부 실시예에 따라 도 15a 내지 도 15c에 도시된 바와 같이 발생하는 혼합 및 입구 속도의 함수로서 혼합 타임스케일을 그래프를 도시한다.
도 15e는 도 14a 내지 14b의 와류 혼합기의 질량 분율을 도시한다.
도 16a 내지 도 16n은 일부 실시예에 따른 다양한 표 및 그래프를 도시한다.
도 17a 내지 도 17d는 이중 스테이지 혼합기의 일부 실시예의 성능 특성을 도시한다.
도 18a 내지 도 18b는 와류 혼합기에서의 예시적인 유체 흐름 경로를 도시한다.
도 19a-19b는 시간의 함수로서 혼합비를 도시한다.
도 1a는 와류 혼합기(100)의 예시적인 실시예를 도시한다. 와류 혼합기(100)는 제1 벽(151), 제2 벽(152), 및 제1 벽(151)과 제2 벽(151)을 연결하는 측면 벽(153)을 갖는 와류 혼합 챔버(150)를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 와류 혼합 챔버(150)는 원형이고; 제1 벽(151)과 제2 벽(152)은 원형이고, 측면 벽(153)은 원의 둘레를 따라 연장되어 제1 벽(151)과 제2 벽(152)의 외부 에지를 연결한다. 도 1a의 와류 혼합기(100)는 4개의 입구 채널(105, 110, 115, 120)을 갖는다. 다른 구현에서, 와류 혼합기(100)는 더 많은 입구 채널 또는 더 적은 입구 채널을 가질 수 있다. 입구 채널(105, 110, 115, 120)은 입구 포트(125, 130, 135, 140)를 통해 와류 혼합 챔버(150)의 측면 벽(152)에 연결된다. 입구 채널(105, 110, 115, 120)을 통해 흐르는 유체가 접선 방향으로 와류 혼합 챔버(150)에 유입하도록 입구 포트(125, 130, 135, 140)가 와류 혼합 챔버(150) 주위에서 정확히 또는 대략 동일하게 이격될 수 있다. 다른 실시예에서, 입구 포트(125, 130, 135, 140) 및 입구 채널(105, 110, 115, 120)은 비-접선방향으로 구성될 수 있다. 입구 포트(125, 130, 135, 140) 및 입구 채널(105, 110, 115, 120)은 와류 혼합 챔버(150)에 접선 방향으로, 와류 혼합 챔버(150)에 대해 수직으로, 또는 그 사이의 임의의 각도로 구성될 수 있다. 와류 혼합 챔버(150)의 제2 벽(152)에는 출구 채널(160)이 연결된 출구 포트(미도시)가 연결된다. 출구 포트는 반경방향 중심과 같은 제2 벽(152)의 중심에 구성될 수 있다. 유체는 와류 혼합 챔버(150)로부터 출구 포트를 통해 유동하고 출구 채널(160)을 통해 배출된다. 출구 채널(160)은 제2 벽(152)의 평면으로부터 직각 - 즉, 약 90도 - 에 있도록 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 입구 포트(125)는 제1 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(130)는 제2 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(135)는 제3 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(140)는 제4 유체를 수용할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 유체는 제3 유체와 동일하거나 실질적으로 유사하다. 일부 실시예에서, 제2 유체는 제4 유체와 동일하거나 실질적으로 유사하다.
일부 실시예에서, 입구 채널(105, 110, 115, 120)은 단일 소스로부터 유체를 수용할 수 있다. 다른 실시예에서, 입구 채널(105, 110, 115, 120)은 다른 소스로부터 유체를 수용할 수 있다. 예를 들어, 입구 채널(105, 110, 115, 120)은 각각 상이한 소스에서 유체를 수용하거나 또는 일부 입구 채널은 동일한 소스에서 유체를 수용하는 반면 다른 입구 채널은 상이한 소스에서 유체를 수용할 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서, 입구 채널 중 2개는 제1 소스로부터 유체를 수용할 수 있고 다른 2개 입구 채널은 제2 소스로부터 유체를 수용할 수 있다. 대안적으로, 입구 채널 중 3개는 제1 소스로부터 유체를 수용할 수 있고 제4 입구 채널은 제2 소스로부터 유체를 수용할 수 있거나, 또는 2개의 입구 채널은 제1 소스로부터 유체를 수용할 수 있고, 제3 입구 채널은 제2 소스로부터 유체를 수용할 수 있고 제4 입구 채널은 제3 소스로부터 유체를 수용할 수 있다.
예시적인 실시예에서, 2개의 채널은 제1 소스로부터 유체를 수용하고 2개의 채널은 제2 소스로부터 유체를 수용한다. 이러한 실시예에서, 제1 소스로부터 유체를 수용하는 2개의 채널은 서로 옆에 있거나 서로 가로지를 수 있다. 이에 따라, 제2 소스로부터 유체를 수용하는 2개의 채널은 서로 옆에 있거나 서로 가로지를 수 있다.
도 1a에 도시된 실시예에서, 입구 채널(105)의 제1 입구 채널 및 입구 채널(115)의 제3 입구 채널은 서로에 가로질러 구성된다. 제1 입구 채널(105) 및 제3 입구 채널(115)은 입구 채널(110) 중 제2 입구 채널 및 입구 채널(120) 중 제4 입구 채널로부터 각각 약 90도이다. 제1 입구 채널(105) 및 제3 입구 채널(115)은 와류 혼합 챔버(150)를 향해 제1 유체를 운반하고, 제2 입구 채널(110) 및 제4 입구 채널(120)은 와류 혼합 챔버(150)를 향해 제2 유체를 운반한다. 제1 입구 채널(105) 및 제3 입구 채널(115)은 공통의 제1 유체 소스 또는 제1 유체의 상이한 소스로부터 제1 유체를 수용할 수 있다. 유사하게, 제2 입구 채널(110) 및 제4 입구 채널(120)은 공통의 제2 유체 소스 또는 제2 유체의 다른 소스로부터 제2 유체를 수용할 수 있다.
제1 유체 및 제2 유체는 와류 혼합 챔버(150) 내로 수용된다. 일부 실시예에서, 적어도 부분적으로 유체가 입구 포트(125, 130, 135, 140)를 통해 접선 방향(150)으로 와류 혼합 챔버에 들어가기 때문에, 와류 혼합 챔버(150) 내에서 제1 유체 및 제2 유체가 회전한다. 와류 혼합 챔버(150) 내에서 제1 유체 및 제2 유체가 혼합되면, 혼합 유체는 출구 포트를 통해 출구 채널(160) 내로 흐른다.
도 1b는 와류 혼합기(100)의 실시예의 분해도를 도시한다. 도 1b에 도시된 바와 같이, 와류 혼합기(100)는 커버(165) 및 혼합기 구성요소(170)의 두 부분으로 구성된다. 커버(165)는 입구 채널(105, 110, 115, 120)에 대응하는 흡입 포트(166, 167, 168, 169)를 갖는다. 흡입 포트(166, 167, 168, 169)는 도 1a와 관련하여 전술한 바와 같은 임의의 구성으로 유체 소스로부터 유체를 수용하도록 구성된다.
도 1c는 흡입 포트(166, 168)가 제1 소스로부터 유체를 수용하고 흡입 포트(167, 169)가 제2 소스로부터 유체를 수용하는 예시적인 구성을 도시한다. 제1 소스로부터의 유체는 제1 유체 스플리터(171)를 통과하여 흡입 포트(166, 168)로 들어가는 반면, 제2 소스로부터의 유체는 제2 유체 스플리터(173)를 통과하여 흡입 포트(167, 169)로 유입된다.
유체는 흡입 포트(166, 167, 168, 169)로부터 입구 채널(105, 110, 115, 120) 내로 통과한 후, 입구 채널(105, 110, 115, 120)을 통하여, 입구 포트(125, 130, 135, 140)를 통해 및 와류 혼합 챔버(150) 내로 이동한다. 도 1b의 조립된 구성이 도 1d에 도시되어 있다. 도 1d는 또한 와류 혼합 챔버(150) 내의 출구 포트(155)를 도시한다. 도 1e는 도 1d의 상면도를 도시한다.
도 2는 와류 혼합기(200)의 대안적인 실시예를 도시한다. 이 실시예에서, 와류 혼합기(200)는 내부 스플리터(271, 273)를 포함한다. 내부 스플리터(271, 273)는 도 1c에 도시된 외부 스플리터 대신에 사용될 수 있다. 이 실시예에서, 커버(265)는 2개의 흡입 포트(266, 267)를 갖는다. 흡입 포트(266)로부터의 제1 유체는 내부 스플리터(271)의 스플리터 채널(272)로 유입된다. 스플리터 채널(272)은 제1 유체를 분할하고 제1 유체를 입구 채널(205, 215)로 보낸다. 동시에 흡입 포트(667)로부터의 제2 유체는 내부 스플리터(273)의 스플리터 채널(274)로 유입된다. 스플리터 채널(274)은 제2 유체를 분할하고 제2 유체를 입구 채널(210, 220)로 보낸다. 일단 제1 유체와 제2 유체가 혼합기 구성요소(270)의 입구 채널(205, 210, 215, 220)에 들어가면, 와류 혼합기(200)는 도 1a-1e와 관련하여 위에서 언급된 바와 같이 작동한다.
도 3a는 도 2의 대안적인 실시예의 분해도를 도시한다. 도 3a의 실시예에서, 내부 스플리터(371, 373) 및 혼합기 구성요소(370)는 도 2의 실시예와 유사하게 작동한다. 커버(365)는 그러나 흡입 포트(366, 367)에서 유체를 수용한다. 제1 유체는 흡입 포트(366)로 유입되고 내부 유체 채널을 통해 내부 스플리터(371)로 이송되고; 유사하게, 제2 유체는 흡입 포트(367)로 유입되고 내부 유체 채널을 통해 내부 스플리터(373)로 이송된다. 일단 유체가 각각 스플리터 채널(372, 374)을 통해 내부 스플리터(371, 373)로 유입되면, 유체는 전술된 바와 같이 분할되어 입구 채널(305, 310, 315, 320)로 유입된다. 와류 혼합 챔버(350) 및 출구 포트(355)가 또한 도시되어 있고 외부 출구 포트(399)에 유체적으로 결합되어 있다. 도 3b는 커버(365), 내부 스플리터(371, 373) 및 혼합기 구성요소(370)가 조립된 도 3a의 실시예를 도시한다.
도 4a는 와류 혼합기(400)의 예시적인 실시예를 도시한다. 와류 혼합기(400)는 제1 벽(451), 제2 벽(452), 및 제1 벽(451)과 제2 벽(452)을 연결하는 측면 벽(453)을 갖는 와류 혼합 챔버(450)를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 와류 혼합 챔버(450)는 원형이고; 제1 벽(451)과 제2 벽(452)은 원형이고 측면 벽(453)은 원의 둘레를 따라 연장되어 제1 벽(451)과 제2 벽(452)의 외부 가장자리를 연결한다. 도 4a의 와류 혼합기(400)는 4개의 입구 채널(405, 410, 415, 420)을 갖는다. 다른 구현에서, 와류 혼합기(400)는 더 많은 입구 채널 또는 더 적은 입구 채널을 가질 수 있다. 입구 채널(405, 410, 415, 420)은 입구 포트(425, 430, 435, 440)를 통해 와류 혼합 챔버(450)의 측면 벽(452)에 연결된다. 입구 채널(405, 410, 415, 420)을 통해 흐르는 유체가 접선 방향으로 와류 혼합 챔버(450)에 유입하도록 입구 포트(425, 430, 435, 440)가 와류 혼합 챔버(450) 주위에 정확히 또는 대략 동일하게 이격될 수 있다. 다른 실시예에서, 입구 포트(425, 430, 435, 440) 및 입구 채널(405, 410, 415, 420)은 비-접선방향으로 구성될 있다. 입구 포트(425, 430, 435, 440) 및 입구 채널(405, 410, 415, 420)은 와류 혼합 챔버(450)에 접선 방향으로, 와류 혼합 챔버(450)에 대해 수직으로, 또는 그 사이의 임의의 각도로 구성될 수 있다. 와류 혼합 챔버(450)의 제2 벽(452)에는 출구 채널(460)이 연결된 출구 포트(미도시)가 연결된다. 출구 포트는 반경방향 중심과 같은 제2 벽(452)의 중심에 구성될 수 있다. 유체는 와류 혼합 챔버(450)로부터 출구 포트를 통해 유동하고 출구 채널(460)을 통해 배출된다. 출구 채널(460)은 제2 벽(452)의 평면으로부터 직각 - 즉, 약 90도 - 에 있도록 구성될 수 있다.
제5 입구 채널(478)은 제5 유체를 수용하도록 구성될 수 있다. 제3 입구 채널(478)은 제5 입구 포트(458)를 통해 와류 혼합 챔버(450)에 유체적으로 연결될 수 있다. 제5 입구 포트(458)는 와류 혼합 챔버(450)의 제1 벽(451)에 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 제5 입구 포트(458)는 제1 벽(451)의 반경방향 중심과 같은 제1 벽(451)의 중심에 구성될 수 있다. 제3 입구 포트(458)는 와류 혼합 챔버(450)의 제2 벽(452)에 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 제5 입구 포트(458)는 제2 벽(452)의 반경방향 중심과 같은 제2 벽(452)의 중심에 구성될 수 있다. 제1 벽(451)과 제2 벽(452)은 측면 벽(453)에 의해 연결된다. 일부 실시예에서, 제5 입구 챔버(478)는 와류 혼합기(400)의 직경 x 약 0.1의 직경을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 출구 포트(455)는 와류 혼합기(400)의 직경 x 약 0.2의 직경을 가질 수 있다.
도 4b 및 도 4c는 와류 혼합기(400)의 실시예 및 와류 혼합기의 분해도를 각각 도시한다. 와류 혼합기(400)는 제1 벽(451), 제2 벽(452), 및 제1 벽(451)과 제2 벽(452)을 연결하는 측면 벽(453)을 갖는 와류 혼합 챔버(450)를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 와류 혼합 챔버(450)는 원형이고; 제1 벽(451)과 제2 벽(452)은 원형이고 측면 벽(453)은 원의 둘레를 따라 연장되어 제1 벽(451)과 제2 벽(452)의 외부 가장자리를 연결한다. 도 4a의 와류 혼합기(400)는 4개의 입구 채널(405, 410, 415, 420)을 갖는다. 다른 구현에서, 와류 혼합기(400)는 더 많은 입구 채널 또는 더 적은 입구 채널을 가질 수 있다. 입구 채널(405, 410, 415, 420)은 입구 포트(425, 430, 435, 440)를 통해 와류 혼합 챔버(450)의 측면 벽(452)에 연결된다. 입구 채널(405, 410, 415, 420)을 통해 흐르는 유체가 접선 방향으로 와류 혼합 챔버(450)에 유입하도록 입구 포트(425, 430, 435, 440)가 와류 혼합 챔버(450) 주위에 정확히 또는 대략 동일하게 이격될 수 있다. 다른 실시예에서, 입구 포트(425, 430, 435, 440) 및 입구 채널(405, 410, 415, 420)은 비-접선방향으로 구성될 있다. 입구 포트(425, 430, 435, 440) 및 입구 채널(405, 410, 415, 420)은 와류 혼합 챔버(450)에 접선 방향으로, 와류 혼합 챔버(450)에 대해 수직으로, 또는 그 사이의 임의의 각도로 구성될 수 있다. 와류 혼합 챔버(450)의 제2 벽(452)에는 출구 채널(460)이 연결된 출구 포트(455)가 연결된다. 출구 포트(455)는 반경방향 중심과 같은 제2 벽(452)의 중심에 구성될 수 있다. 유체는 와류 혼합 챔버(450)로부터 출구 포트(455)를 통해 유동하고 출구 채널(460)을 통해 배출된다. 출구 채널(460)은 제2 벽(452)의 평면으로부터 직각 - 즉, 약 90도 - 에 있도록 구성될 수 있다.
제5 입구 채널(478)은 제5 유체를 수용하도록 구성될 수 있다. 제3 입구 채널(478)은 제5 입구 포트(458)를 통해 와류 혼합 챔버(450)에 유체적으로 연결될 수 있다. 제5 입구 포트(458)는 와류 혼합 챔버(450)의 제1 벽(451)에 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 제5 입구 포트(458)는 제1 벽(451)의 반경방향 중심과 같은 제1 벽(451)의 중심에 구성될 수 있다. 제3 입구 포트(458)는 와류 혼합 챔버(450)의 제2 벽(452)에 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 제5 입구 포트(458)는 제2 벽(452)의 반경방향 중심과 같은 제2 벽(452)의 중심에 구성될 수 있다. 제1 벽(451)과 제2 벽(452)은 측면 벽(453)에 의해 연결된다. 일부 실시예에서, 제5 입구 챔버(478)는 와류 혼합기(400)의 직경 x 약 0.1의 직경을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 출구 포트(455)는 와류 혼합기(400)의 직경 x 약 0.2의 직경을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 입구 포트(425)는 제1 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(430)는 제2 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(435)는 제3 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(440)는 제4 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(458)는 제5 유체를 수용할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 유체는 제3 유체와 동일하거나 실질적으로 유사하다. 일부 실시예에서, 제2 유체는 제4 유체와 동일하거나 실질적으로 유사하다. 일부 실시예에서, 제1 유체 및 제3 유체는 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 유체 및 제3 유체는 에탄올을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 및 제3 유체는 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 및 제4 유체는 핵산(예를 들어, RNA)을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 및 제4 유체는 에탄올을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 및 제4 유체는 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제5 유체는 핵산을 포함할 수 있다.
도 5는 2 스테이지 혼합기(500)의 예시적인 실시예를 도시한다. 제1 스테이지 혼합기(501)는 위에서 언급된 임의의 와류 혼합기와 유사하게 구성될 수 있다. 도시된 바와 같이, 제1 스테이지 혼합기(501)는 제1 벽(551) 및 제2 벽(552) 및 제1 벽(551)과 제2 벽(552)을 연결하는 측면 벽(553)을 갖는 와류 혼합 챔버(550)를 갖는다. 와류 혼합 챔버(550)는 측면 벽(553)을 따라 구성된 4개의 입구 포트(525, 530, 535, 540)를 가질 수 있다. 4개의 입구 포트(525, 530, 535, 540) 각각은 대응하는 입구 채널(505, 510, 515, 520)로부터 유체를 수용할 수 있다. 제1 입구 채널(505) 및 제3 입구 채널(515)은 제1 유체를 수용할 수 있고, 제2 입구 채널(510) 및 제4 입구 채널(520)은 제2 유체를 수용할 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 입구 채널(505, 510, 515, 520)은 별도의 유체 소스로부터 유체를 수용할 수 있다. 다른 구현에서, 제1 입구 채널(505) 및 제3 입구 채널(515)은 제1 유체 소스로부터 제1 유체를 수용할 수 있고; 제1 유체는 제1 유체를 제1 입구 채널(505) 및 제3 입구 채널(515) 쪽으로 향하게 하는 제1 유체 스플리터를 통과할 수 있다. 상응하게, 제2 입구 채널(510) 및 제4 입구 채널(520)은 제2 유체 소스로부터 제2 유체를 수용할 수 있고, 제2 유체는 제2 유체를 제2 입구 채널(510) 및 제4 입구 채널(520)을 향하게 하는 제2 유체 스플리터를 통과할 수 있다. 제1 유체 스플리터 및 제2 유체 스플리터는 위에서 언급된 바와 같이 내부 스플리터 또는 외부 스플리터일 수 있다.
제1 유체는 제1 입구 채널(505)을 통해 그리고 제1 입구 포트(525)를 통해 와류 혼합 챔버(550) 내로 흐르고 제3 입구 채널(515)을 통해 그리고 제3 입구 포트(535)를 통해 와류 혼합 챔버(550) 내로 흐른다. 제1 입구 포트(525) 및 제3 입구 포트(535)는 서로 정확히 또는 대략 180도일 수 있고, 제1 유체가 접선 방향으로 와류 혼합 챔버(550)에 유입하도록 제1 유체를 안내할 수 있다. 다른 실시예에서, 제1 입구 포트(525) 및 제3 입구 포트(535)는 제1 유체가 수직으로 또는 접선과 수직 사이의 각도로 와류 혼합 챔버(550)에 유입하도록 제1 유체를 안내할 수 있다. 유사하게, 제2 유체는 제2 입구 채널(510)을 통해 그리고 제2 입구 포트(530)를 통해 와류 혼합 챔버(550) 내로 유동하고 제4 입구 채널(520)을 통해 그리고 제4 입구 포트(540)를 통해 와류 혼합 챔버(550) 내로 유동한다. 제2 입구 포트(530) 및 제4 입구 포트(540)는 서로 정확히 또는 대략 180도일 수 있고 제1 입구 포트(525) 및 제3 입구 포트(535)로부터 정확히 또는 대략 90도일 수 있다. 제2 입구 포트(530) 및 제4 입구 포트(540)는 제2 유체가 접선방향, 수직 또는 이들 사이의 임의의 각도로 와류 혼합 챔버(550)에 유입되도록 제2 유체를 안내한다. 일부 실시예에서, 입구 포트(525)는 제1 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(530)는 제2 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(535)는 제3 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(540)는 제4 유체를 수용할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 유체는 제3 유체와 동일하거나 실질적으로 유사하다. 일부 실시예에서, 제2 유체는 제4 유체와 동일하거나 실질적으로 유사하다. 일부 실시예에서, 제1 유체 및 제3 유체는 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 유체 및 제3 유체는 에탄올을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 및 제4 유체는 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 유체 및 제4 유체는 에탄올을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 유체 및 제4 유체는 산성 완충액을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 및 제4 유체는 핵산(예를 들어, RNA)을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 및 제4 유체는 에탄올을 포함할 수 있다.
와류 혼합 챔버(550)는 출구 채널(560)이 연결된 출구 포트(555)를 가질 수 있다. 출구 포트는 와류 혼합 챔버(550)의 제2 벽(552) 상에 구성될 수 있다. 출구 포트는 반경방향 중심과 같은 제2 벽(552)의 중심에 구성될 수 있다. 제1 스테이지 혼합기(501)로부터의 유출 유체는 와류 혼합 챔버(550)로부터 출구 포트(555)를 통해 유동하고 출구 채널(560)을 통해 배출된다.
제1 스테이지 혼합기 유출 유체는 제1 스테이지 와류 혼합 챔버(550)에서 출구 채널(560)을 통해 스플리터(561)로 흐른다. 스플리터(561)는 제1 스테이지 혼합기 유출 유체를 분할하고, 제1 스테이지 혼합기 유출 유체를 제1 입구 채널(575) 내로 흡입 포트(562)를 통하여 안내하고 제2 스테이지 혼합기(502)의 흡입 포트(563)를 통하여 제2 입구 채널(577)로 안내한다. 제1 입구 채널(575) 및 제2 입구 채널(577)은 각각 제1 입구 포트(585) 및 제2 입구 포트(586)를 통하여 각각 제2 스테이지 와류 혼합 챔버(580)에 연결된다. 제1 입구 포트(585) 및 제2 입구 포트(586)는 정확히 또는 대략 180도 떨어져서 구성될 수 있고, 제1 스테이지 혼합기 유출 유체가 각 포트(585, 586)로부터 접선 방향으로 와류 혼합 챔버(580)에 유입하도록 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 입구 포트(585) 및 제2 입구 포트(586)는 제1 스테이지 혼합기 유출 유체가 와류 혼합 챔버(580)에 수직으로, 또는 와류 혼합 챔버(580)에 대해 접선 방향과 수직 각도와 사이의 임의의 각도로 와류 혼합 챔버(580)에 유입되도록 구성될 수 있다. 제3 입구 채널(578)은 제2 스테이지 입구 유체를 수용하도록 구성될 수 있다. 제3 입구 채널(578)은 제3 입구 포트(588)를 통해 제2 스테이지 와류 혼합 챔버(580)에 유체적으로 연결될 수 있다. 제3 입구 포트(588)는 와류 혼합 챔버(580)의 제1 벽(581)에 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 제3 입구 포트(588)는 제1 벽(581)의 반경방향 중심과 같은 제1 벽(581)의 중심에 구성될 수 있다. 제3 입구 포트(588)는 와류 혼합 챔버(580)의 제2 벽(582)에 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 제3 입구 포트(588)는 제2 벽(582)의 반경방향 중심과 같은 제2 벽(582)의 중심에 구성될 수 있다. 제1 벽(581) 및 제2 벽(582)은 측면 벽(583)에 의해 연결된다. 일부 실시예에서, 제3 입구 포트(588)는 제5 유체를 수용할 수 있다. 일부 실시예에서, 제5 유체는 핵산을 포함할 수 있다.
와류 혼합 챔버(580)는 그에 연결된 제2 스테이지 혼합기 출구 채널(590)을 갖는 제2 스테이지 혼합기 출구 포트(589)를 가질 수 있다. 제2 스테이지 혼합기 출구 포트는 반경방향 중심과 같은 제2 벽(582)의 중심에 구성될 수 있다. 제2 스테이지 혼합기(502)로부터의 유출 유체는 와류 혼합 챔버(580)로부터 제2 스테이지 혼합기 출구 포트(589)를 통해 흐르고 제2 스테이지 혼합기 출구 채널(590)을 통해 배출된다.
일부 실시예에서, 제2 스테이지 혼합기(502)는 4개의 입구 채널을 갖는 도 4a에 설명된 실시예와 동일하거나 실질적으로 유사한 기하학적 구조를 가질 수 있다. 즉, 제2 스테이지 혼합기(502)는 제1 입구 포트(585), 제2 입구 포트(586), 제3 입구 포트(미도시) 및 제4 입구 포트(미도시)를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 제3 입구 포트는 제3 입구 채널(미도시)에 유체적으로 결합될 수 있고, 제4 입구 포트는 제4 입구 채널(미도시)에 유체적으로 결합될 수 있다. 일부 실시예에서, 제3 및 제4 입구 채널은 입구 포트를 포함할 수 있으며, 유체는 제2 스테이지 혼합기에 추가될 수 있다. 일부 실시예에서, 제3 및 제4 입구 채널은 스플리터(561)에 유체적으로 결합될 수 있으며, 이 경우 스플리터(561)는 4-웨이 스플리터가 될 것이다.
도 6a 및 도 6b는 2-스테이지 와류 혼합 시스템(600)의 실시예를 도시한다. 이 실시예에서, 제1 와류 혼합기(601)는 도 3a-3b의 와류 혼합기(300)와 유사하게 작동할 수 있다. 이 제1 와류 혼합기(601)는 내부 스플리터(671, 673)를 수용한다. 내부 스플리터(671, 673)는 도 6b에 도시된 외부 스플리터 대신에 사용될 수 있다. 이 실시예에서, 커버(665)는 2개의 흡입 포트(666, 667)를 갖는다. 흡입 포트(666)로부터의 제1 유체는 내부 스플리터(671)의 스플리터 채널(672)로 유입된다. 스플리터 채널(672)은 제1 유체를 분할하고 제1 유체를 입구 채널(605, 615)로 보낸다. 동시에 흡입 포트(267)로부터의 제2 유체는 내부 스플리터(673)의 스플리터 채널(674)로 유입된다. 스플리터 채널(674)은 제2 유체를 분할하고 제2 유체를 입구 채널(610, 620)로 보낸다. 일단 제1 유체와 제2 유체가 혼합기 구성요소(670)의 입구 채널(605, 610, 615, 620)에 들어가면, 제1 와류 혼합기(601)는 도 1a-2와 관련하여 위에서 언급된 바와 같이 작동한다. 초기 와류 혼합 챔버(650) 내에서 혼합이 발생한 후, 혼합 유체는 초기 와류 혼합기 출구 포트(655)를 통해 초기 와류 혼합 챔버(650)를 빠져나간 다음 초기 와류 혼합기 출구 채널(660)을 통해 배출된다. 그 뒤 제1 스테이지 혼합기 유출 유체는 스플리터(661)로 유입된다. 스플리터(661)는 제1 스테이지 혼합기 유출 유체를 분할하고 커버(663) 상에 2개의 흡입 포트(662, 664)를 통해 제1 스테이지 혼합기 유출 유체를 제2 와류 혼합기(602)로 향하게 한다. 흡입 포트(662, 664)는 각각 혼합기 구성요소(676) 상에 위치된 제2 스테이지 유체 입구 채널(675, 677)로 혼합 유체를 공급한다. 제2 스테이지 유체 입구 채널(675, 677)은 유체를 제2 스테이지 와류 혼합 챔버(680)에 공급한다. 제3 입구 채널(678)은 제2 스테이지 입구 유체를 수용하도록 구성될 수 있다. 제3 입구 채널(678)은 제3 입구 포트(688)를 통해 제2 스테이지 와류 혼합 챔버(680)에 유체적으로 연결될 수 있다. 혼합이 제2 스테이지 와류 혼합 챔버(680) 내에서 발생한 후, 생성물 유체는 제2 스테이지 혼합기 출구 포트(689)를 통해 제2 스테이지 혼합기 출구 채널(690)을 통해 제2 스테이지 와류이 혼합 챔버(680)에서 배출될 수 있다. 일부 실시예에서, 흡입 포트(666)는 제1 유체를 수용할 수 있고, 흡입 포트(667)는 제2 유체를 수용할 수 있으며, 입구 포트(688)는 제3 유체를 수용할 수 있다.
도 7a는 도 6a의 대안적인 실시예인 혼합 시스템(700)의 분해도를 도시한다. 도 7a의 실시예에서, 내부 스플리터(771, 773) 및 혼합기 구성요소(770)는 도 6의 실시예와 유사하게 작동한다. 그러나 커버(765)는 흡입 포트(766, 767)에서 유체를 수용한다. 제1 유체는 흡입 포트(766)에 유입되고, 내부 스플리터(771)에 내부 유체 채널을 통하여 이송되고, 유사히게 제2 유체는 흡입 포트(767)에 유입되고 내부 유체 채널을 통하여 내부 스플리터(773)에 이송된다. 일단 유체가 스플리터 채널(772, 774)을 통해 각각 내부 스플리터(771, 773)에 유입되면, 유체는 분할되어 도 6a에 관해 전술된 바와 같이 입구 채널(705, 710, 715, 720)로 유입된다. 초기 와류 혼합 챔버(750) 및 출구 포트(755)도 또한 도시되어 있다. 제1 스테이지 혼합기 유출 유체는 그 다음 스플리터 채널(759)을 통해 스플리터(761)로 유입된다. 스플리터(761)는 제1 스테이지 혼합기 유출 유체를 분할하고 제1 스테이지 혼합기 유출 유체를 혼합기 구성요소(776)에 위치한 제2 스테이지 유체 입구 채널(775, 777)로 안내한다. 제2 스테이지 유체 입구 채널(775, 777)은 제2 스테이지 와류 혼합 챔버(780)로 공급된다. 제3 입구 채널(778)은 제2 스테이지 입구 유체를 수용하도록 구성될 수 있다. 제3 입구 채널(778)은 제3 입구 포트(788)를 통해 제2 스테이지 와류 혼합 챔버(780)에 유체적으로 연결될 수 있다. 제3 입구 채널(778)은 제3 흡입 포트(798)에 유체적으로 연결된다. 제3 흡입 포트(798)는 혼합기 구성요소(770)에 연결될 수 있다. 제2 스테이지 와류 혼합 챔버(780)는 제2 스테이지 와류 혼합 챔버 출구 채널(790)에 결합된 제2 스테이지 와류 혼합 챔버 출구 포트(789)를 갖는다. 제2 스테이지 와류 혼합 챔버 출구 채널(790)은 외부 출구 포트(799)에 유체적으로 결합된다. 도 7b는 커버(765), 내부 스플리터(771, 773, 761) 및 혼합기 구성요소(770, 776)가 조립된 상태를 도 7a의 실시예를 도시한다.
이들 실시예 각각에서, 와류 혼합기의 크기는 변할 수 있다. 일부 실시예에서, 와류 혼합기의 모든 치수는 선형 및/또는 비례적으로 스케일링될 수 있다.
추가로, 이들 각각의 실시예에서, 다양한 층(커버, 스플리터(들), 혼합기 구성요소(들) 등을 포함하나 이에 제한되지 않음)은 층들을 서로 나사체결하거나, 연성 결합(예를 들어, 압력을 사용하여 함께 융합될 수 있는 재료를 사용함)에 의해 또는 다른 연결 수단에 의해 연결될 수 있다. 대안적으로, 각각의 실시예의 다양한 층은 3-D 프린팅과 같은 적층 제조에 의해 형성될 수 있고, 따라서 층으로서 및/또는 단일 부분으로서 형성될 수 있다.
예시적인 실시예에서, 제1 유체는 에탄올 중 지질일 수 있고(본원에서 지질 마스터믹스로도 지칭됨), 제2 유체는 완충액 중 핵산일 수 있다. 완충액 중 지질 마스터믹스와 핵산은 교대 입구 포트를 통해 와류 혼합 챔버에 유입될 수 있다. 따라서, 4개의 입구 채널/입구 포트를 갖는 실시예에서, 지질 마스터믹스는 제1 입구 채널을 통해 제1 입구 포트를 통해 와류 혼합 챔버로 흐를 수 있고; 완충액 내의 핵산은 제2 입구 채널을 통해 제2 입구 포트를 통해 와류 혼합 챔버로 흐를 수 있고; 지질 마스터믹스는 제3 입구 채널을 통해 제3 입구 포트를 통해 와류 혼합 챔버로 흐를 수 있고; 완충액 내의 핵산은 제4 입구 포트를 통해 와류 혼합 챔버로 제4 입구 채널을 통해 흐를 수 있다. 제1 입구 포트는 정확히 또는 대략 0도에서 와류 혼합 챔버에 유입될 수 있고; 제2 입구 포트는 정확히 또는 대략 90도일 수 있고; 제3 입구 포트는 정확히 또는 대략 180도일 수 있고; 제4 입구 포트는 정확히 또는 대략 270도일 수 있다. 와류 혼합 챔버에서 이 두 유체를 혼합함으로써 핵산이 포함된 지질 나노입자가 형성된다.
도 8는 2 스테이지 혼합기(800)의 예시적인 실시예를 도시한다. 제1 스테이지 혼합기(801)는 위에서 언급된 임의의 와류 혼합기와 유사하게 구성될 수 있다. 도시된 바와 같이, 제1 스테이지 혼합기(801)는 제1 벽(851) 및 제2 벽(852) 및 제1 벽(851)과 제2 벽(852)을 연결하는 측면 벽(853)을 갖는 와류 혼합 챔버(850)를 갖는다. 와류 혼합 챔버(850)는 측면 벽(853)을 따라 구성된 4개의 입구 포트(825, 830, 835, 840)를 가질 수 있다. 4개의 입구 포트(825, 830, 835, 840) 각각은 대응하는 입구 채널(805, 810, 815, 820)로부터 유체를 수용할 수 있다. 제1 입구 채널(805) 및 제3 입구 채널(815)은 제1 유체를 수용할 수 있고, 제2 입구 채널(810) 및 제4 입구 채널(820)은 제2 유체를 수용할 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 입구 채널(805, 810, 815, 820)은 별도의 유체 소스로부터 유체를 수용할 수 있다. 다른 구현에서, 제1 입구 채널(805) 및 제3 입구 채널(815)은 제1 유체 소스로부터 제1 유체를 수용할 수 있고; 제1 유체는 제1 유체를 제1 입구 채널(805) 및 제3 입구 채널(815) 쪽으로 향하게 하는 제1 유체 스플리터를 통과할 수 있다. 상응하게, 제2 입구 채널(810) 및 제4 입구 채널(820)은 제2 유체 소스로부터 제2 유체를 수용할 수 있고, 제2 유체는 제2 유체를 제2 입구 채널(810) 및 제4 입구 채널(820)을 향하게 하는 제2 유체 스플리터를 통과할 수 있다. 제1 유체 스플리터 및 제2 유체 스플리터는 위에서 언급된 바와 같이 내부 스플리터 또는 외부 스플리터일 수 있다.
제1 유체는 제1 입구 채널(805)을 통해 그리고 제1 입구 포트(525)를 통해 와류 혼합 챔버(850) 내로 흐르고 제3 입구 채널(815)을 통해 그리고 제3 입구 포트(835)를 통해 와류 혼합 챔버(850) 내로 흐른다. 제1 입구 포트(825) 및 제3 입구 포트(835)는 서로 정확히 또는 대략 180도일 수 있고, 제1 유체가 접선 방향으로 와류 혼합 챔버(850)에 유입하도록 제1 유체를 안내할 수 있다. 다른 실시예에서, 제1 입구 포트(825) 및 제3 입구 포트(835)는 제1 유체가 수직으로 또는 접선과 수직 사이의 각도로 와류 혼합 챔버(850)에 유입하도록 제1 유체를 안내할 수 있다. 유사하게, 제2 유체는 제2 입구 채널(810)을 통해 그리고 제2 입구 포트(830)를 통해 와류 혼합 챔버(850) 내로 유동하고 제4 입구 채널(820)을 통해 그리고 제4 입구 포트(840)를 통해 와류 혼합 챔버(850) 내로 유동한다. 제2 입구 포트(830) 및 제4 입구 포트(840)는 서로 정확히 또는 대략 180도일 수 있고 제1 입구 포트(825) 및 제3 입구 포트(835)로부터 정확히 또는 대략 90도일 수 있다. 제2 입구 포트(830) 및 제4 입구 포트(840)는 제2 유체가 접선방향, 수직 또는 이들 사이의 임의의 각도로 와류 혼합 챔버(850)에 유입되도록 제2 유체를 안내한다.
와류 혼합 챔버(850)는 출구 채널(860)이 연결된 출구 포트(도시되지 않음)를 가질 수 있다. 출구 포트는 와류 혼합 챔버(850)의 제2 벽(852) 상에 구성될 수 있다. 출구 포트는 반경방향 중심과 같은 제2 벽(852)의 중심에 구성될 수 있다. 제1 스테이지 혼합기(801)로부터의 유출 유체는 와류 혼합 챔버(850)로부터 출구 포트를 통해 유동하고 출구 채널(860)을 통해 배출된다.
제1 스테이지 혼합기 유출 유체는 출구 채널(860)을 통해 제2 스테이지 혼합기(802)로 흐른다. 도 8에 도시된 실시예에서, 제2 스테이지 혼합기(802)는 와류 혼합 챔버(880)를 갖는다. 와류 혼합 챔버(880)는 제1 벽(881), 제2 벽(882), 및 제1 벽(881)과 제2 벽(882)을 연결하는 측면 벽(883)을 갖는다. 제1 스테이지 혼합기 유출 유체는 출구 채널(860)로부터 제2 스테이지 혼합기 입구 포트(875)를 통해 와류 혼합 챔버(880) 내로 흐른다. 제2 스테이지 혼합기 입구 포트(875)는 와류 혼합 챔버(880)의 제1 벽(881)에 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 스테이지 혼합기 입구 포트(875)는 제1 벽(881)의 반경방향 중심과 같은 제1 벽(881)의 중심에 구성될 수 있다.
와류 혼합 챔버(880)는 추가 입구 포트를 가질 수 있다. 도 8에 도시된 실시예에서, 와류 혼합 챔버(880)는 2개의 추가 입구 포트(876, 877)를 갖는다. 2개의 추가 입구 포트(876, 877)는 2개의 입구 채널(878, 879)로부터 제2 스테이지 입구 유체를 수용하도록 구성될 수 있다. 2개의 추가 입구 포트(876, 877)는 서로 정확히 또는 대략 180도로 구성될 수 있고 유체가 접선 방향으로 와류 혼합 챔버(880)에 유입되게 지시하도록 구성될 수 있다. 다른 실시예에서, 2개의 추가 입구 포트(876, 877)는 수직으로 또는 수직과 접선방향 사이의 임의의 각도에서와 같이 비접선방향으로 유체가 와류 혼합 챔버(880)에 유입하게 안내되도록 구성될 수 있다. 제2 스테이지 입구 유체는 2개의 개별 유체 소스로부터 수용될 수 있거나 또는 전술된 바와 같이 단일 유체 소스로부터 수용될 수 있고 내부 또는 외부 스플리터를 통해 분할될 수 있다. 일부 실시예에서, 입구 포트(825)는 제1 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(830)는 제2 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(835)는 제3 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(840)는 제4 유체를 수용할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 유체는 제3 유체와 동일하거나 실질적으로 유사하다. 일부 실시예에서, 제2 유체는 제4 유체와 동일하거나 실질적으로 유사하다. 일부 실시예에서, 제1 유체 및 제3 유체는 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 유체 및 제3 유체는 에탄올을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 및 제4 유체는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 및 제4 유체는 에탄올을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 입구 포트(876)는 제5 유체를 수용할 수 있고 입구 포트(877)는 제6 유체를 수용할 수 있다. 일부 실시예에서, 제5 유체는 제6 유체와 동일하거나 실질적으로 유사할 수 있다. 일부 실시예에서, 제5 유체 및 제6 유체는 핵산을 포함할 수 있다.
와류 혼합 챔버(880)는 그에 연결된 제2 스테이지 혼합기 출구 채널(890)을 갖는 제2 스테이지 혼합기 출구 포트(889)를 가질 수 있다. 제2 스테이지 혼합기 출구 포트는 반경방향 중심과 같은 제2 벽(882)의 중심에 구성될 수 있다. 제2 스테이지 혼합기(802)로부터의 유출 유체는 와류 혼합 챔버(880)로부터 출구 포트를 통해 흐르고 제2 스테이지 혼합기 출구 채널(890)을 통해 배출된다.
도 9a-9b는 2 스테이지 혼합기(900)의 예시적인 실시예를 도시한다. 제1 스테이지 혼합기(901)는 도 8의 제1 스테이지 혼합기(801)와 유사하게 구성될 수 있다. 도시된 바와 같이, 제1 스테이지 혼합기(901)는 제1 벽(951) 및 제2 벽(952) 및 제1 벽(951)과 제2 벽(952)을 연결하는 측면 벽(953)을 갖는 와류 혼합 챔버(950)를 갖는다. 와류 혼합 챔버(590)는 측면 벽(953)을 따라 구성된 4개의 입구 포트(925, 930, 935, 940)를 가질 수 있다. 4개의 입구 포트(925, 930, 935, 940) 각각은 대응하는 입구 채널(905, 910, 915, 920)로부터 유체를 수용할 수 있다. 제1 입구 채널(905) 및 제3 입구 채널(915)은 제1 유체를 수용할 수 있고, 제2 입구 채널(910) 및 제4 입구 채널(920)은 제2 유체를 수용할 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 입구 채널(905, 910, 915, 920)은 별도의 유체 소스로부터 유체를 수용할 수 있다. 다른 구현에서, 제1 입구 채널(905) 및 제3 입구 채널(915)은 제1 유체 소스로부터 제1 유체를 수용할 수 있고; 제1 유체는 제1 유체를 제1 입구 채널(905) 및 제3 입구 채널(915) 쪽으로 향하게 하는 제1 유체 스플리터를 통과할 수 있다. 상응하게, 제2 입구 채널(910) 및 제4 입구 채널(920)은 제2 유체 소스로부터 제2 유체를 수용할 수 있고, 제2 유체는 제2 유체를 제2 입구 채널(910) 및 제4 입구 채널(920)을 향하게 하는 제2 유체 스플리터를 통과할 수 있다. 제1 유체 스플리터 및 제2 유체 스플리터는 위에서 언급된 바와 같이 내부 스플리터 또는 외부 스플리터일 수 있다. 그러나, 도 9a-9b의 실시예에서, 제2 스테이지 혼합기(902)는 제1 스테이지 혼합기(901)로부터의 출구 채널(960)이 와류 혼합 챔버(980)의 측면 벽(983)을 따라 구성된 제2 스테이지 혼합기 입구 포트(975)를 통하여 제2 스테이지 와류 혼합 챔버(980)로 유입되게 구성되도록 그 측면에서 회전한다. 포트(975)는 제1 스테이지 혼합기 유출 유체가 접선 방향으로 제2 스테이지 혼합 챔버(980)에 유입하도록 구성된다. 다른 실시예에서, 제2 스테이지 혼합기 입구 포트(975)는 제1 스테이지 혼합기 유출 유체가 와류 혼합 챔버(980)에 수직으로 또는 수직과 접선방향 사이의 임의의 각도에서와 같이 비접선방향으로 제2 스테이지 와류 혼합 챔버(980)에 유입하도록 구성될 수 있다. 도 9a에서, 제2 스테이지 혼합 챔버(980)는 또한 혼합 챔버(980)의 측면 벽(983)을 따라 구성된 제2 입구 포트(976)를 갖는다. 제2 입구 포트(976)는 그에 연결된 입구 채널(978)을 갖는다. 제2 입구 채널(978)은 제2 스테이지 입구 유체를 수용한다. 제2 스테이지 입구 유체는 입구 채널(978)로부터 제2 입구 포트(976)를 통해 혼합 챔버(980) 내로 흐른다. 제2 입구 포트(976)는 유체가 접선 방향으로 혼합 챔버(980) 내로 흐르도록 구성된다. 도 9b의 실시예에서, 제2 입구 포트(976)는 혼합 챔버(980)에 수직으로 구성되고, 제2 입구 채널(978)은 제2 입구 포트(976)에 연결된다. 다른 실시예에서, 제2 입구 포트(976)는 유체가 수직과 접선 각도 사이의 임의의 각도에서 혼합 챔버(980)로 흐르도록 구성될 수 있다. 제2 입구 포트(976)는 입구 포트(975)로부터 정확히 또는 대략 180도 구성될 수 있다. 제2 스테이지 혼합기(902)는 제2 스테이지 유출 유체를 제2 스테이지 출구 채널(990)로 향하게 하는 제2 스테이지 배출 포트(미도시)를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 입구 포트(925)는 제1 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(930)는 제2 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(935)는 제3 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(940)는 제4 유체를 수용할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 유체는 제3 유체와 동일하거나 실질적으로 유사하다. 일부 실시예에서, 제2 유체는 제4 유체와 동일하거나 실질적으로 유사하다. 일부 실시예에서, 제1 유체 및 제3 유체는 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 유체 및 제3 유체는 에탄올을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 및 제4 유체는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 및 제4 유체는 에탄올을 포함할 수 있다.
도 10은 2 스테이지 혼합기(1000)의 대안의 실시예를 도시한다. 제1 스테이지 혼합기(1001) 및 제2 스테이지 혼합기(1002)는 도 8의 제1 스테이지 혼합기(801)와 유사하게 구성될 수 있다. 도시된 바와 같이, 제1 스테이지 혼합기(1001)는 제1 벽(1051) 및 제2 벽(1052) 및 제1 벽(1051)과 제2 벽(1052)을 연결하는 측면 벽(1053)을 갖는 와류 혼합 챔버(1050)를 갖는다. 와류 혼합 챔버(1050)는 측면 벽(1053)을 따라 구성된 4개의 입구 포트(1025, 1030, 1035, 1040)를 가질 수 있다. 4개의 입구 포트(1025, 1030, 1035, 1040) 각각은 대응하는 입구 채널(1005, 1010, 1015, 1020)로부터 유체를 수용할 수 있다. 제1 입구 채널(1005) 및 제3 입구 채널(1015)은 제1 유체를 수용할 수 있고, 제2 입구 채널(1010) 및 제4 입구 채널(1020)은 제2 유체를 수용할 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 입구 채널(1005, 1010, 1015, 1020)은 별도의 유체 소스로부터 유체를 수용할 수 있다. 다른 구현에서, 제1 입구 채널(1005) 및 제3 입구 채널(1015)은 제1 유체 소스로부터 제1 유체를 수용할 수 있고; 제1 유체는 제1 유체를 제1 입구 채널(1005) 및 제3 입구 채널(1015) 쪽으로 향하게 하는 제1 유체 스플리터를 통과할 수 있다. 상응하게, 제2 입구 채널(1010) 및 제4 입구 채널(1020)은 제2 유체 소스로부터 제2 유체를 수용할 수 있고, 제2 유체는 제2 유체를 제2 입구 채널(1010) 및 제4 입구 채널(1020)을 향하게 하는 제2 유체 스플리터를 통과할 수 있다. 제1 유체 스플리터 및 제2 유체 스플리터는 위에서 언급된 바와 같이 내부 스플리터 또는 외부 스플리터일 수 있다. 또한 제1 스테이지 혼합기 유출 유체는 제1 스테이지 와류 혼합 챔버(1050)로부터 출구 채널(1060)을 통해 스플리터(1061)로 흐른다. 스플리터(1061)는 제1 스테이지 혼합기 유출 유체를 분할하고 제1 입구 채널(1075) 및 제2 스테이지 혼합기(1002)의 제3 입구 채널(1077) 내로 안내한다. 제2 스테이지 유입 유체는 제2 입구 채널(1076) 및 제4 입구 채널(1078) 내로 흐른다. 제2 스테이지 유입 유체는 2개의 개별 유체 소스로부터 수용될 수 있거나 또는 전술된 바와 같이 내일 유체 소스로부터 수용될 수 있고 내부 또는 외부 스플리터를 통해 분할될 수 있다.
제1 입구 채널(1075), 제2 입구 채널(1076), 제3 입구 채널(1077), 및 제4 입구 채널(1078)은 각각 제1 입구 포트(1085), 제2 입구 포트(1086), 제3 입구 포트(1087) 및 제4 입구 포트(1088)를 통해 제2 스테이지 와류 혼합 챔버(1080)에 유체적으로 연결될 수 있다. 제1 입구 채널(1075)은 와류 혼합 챔버(1080)의 측면 벽(1081)에 구성될 수 있다. 제1, 제2, 제3, 및 제4 입구 포트(1085, 1086, 1087, 1088)는 측면 벽(1083)의 주변 주위에서 서로 약 90도 이격될 수 있다. 제1 입구 포트(1085) 및 제3 입구 포트(1087)는 서로 가로질러 있을 수 있고, 즉, 대략 또는 정확히 180도 이격될 수 있고, 제2 입구 포트(1086) 및 제4 입구 포트(1088)는 서로 가로질러 있을 수 있고, 즉, 대략 또는 정확히 180도 이격될 수 있다. 제1 입구 포트(1085), 제2 입구 포트(1086), 제3 입구 포트(1087), 및 제4 입구 포트(1088)는 각각 와류 혼합 챔버(1080)의 측면 벽(1083)에 대해 접선 방향으로 유체를 안내하도록 구성될 수 있다. 대안적인 실시예에서, 입구 포트(1085, 1086, 1087, 1088)는 측면 벽(1083)에 대해 수직 각도로 유체를 안내하도록 구성될 수 있거나, 또는 입구 포트(1085, 1086, 1087, 1088)는 측면 벽(1083)에 대해 수직 및 접선 방향 사이의 임의의 각도로 유체를 안내하도록 구성될 수 있다. 제2 스테이지 와류 혼합 챔버(1080)는 제2 스테이지 혼합기 출구 채널(1090)이 연결된 제2 스테이지 혼합기 출구 포트(1089)를 가질 수 있다. 제2 스테이지 혼합기 출구 포트는 반경방향 중심과 같은 제2 벽(1082)의 중심에 구성될 수 있다. 제2 스테이지 혼합기(1002)로부터의 유출 유체는 와류 혼합 챔버(1080)로부터 출구 포트를 통해 흐르고 제2 스테이지 혼합기 출구 채널(1090)을 통해 배출된다. 일부 실시예에서, 입구 포트(1025)는 제1 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(1030)는 제2 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(1035)는 제3 유체를 수용할 수 있고, 입구 포트(1040)는 제4 유체를 수용할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 유체는 제3 유체와 동일하거나 실질적으로 유사하다. 일부 실시예에서, 제2 유체는 제4 유체와 동일하거나 실질적으로 유사하다. 일부 실시예에서, 제1 유체 및 제3 유체는 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 유체 및 제3 유체는 에탄올을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 및 제4 유체는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 및 제4 유체는 에탄올을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 입구 포트(1076)는 제5 유체를 수용할 수 있고 입구 포트(1077)는 제6 유체를 수용할 수 있다. 일부 실시예에서, 제5 유체는 제6 유체와 동일하거나 실질적으로 유사할 수 있다. 일부 실시예에서, 제5 유체 및 제6 유체는 핵산을 포함할 수 있다.
위에서 언급된 바와 같이, 도 5, 8, 9 및 10에 도시된 각각의 실시예에 대한 일부 구현에서, 제1 스테이지 혼합기는 에탄올(지질 마스터믹스) 및 산성 완충액 중의 지질을 수용한다. 제1 스테이지 와류 혼합 챔버에서 혼합한 후, 제1 스테이지 혼합기 유출 유체는 빈 지질 나노입자이다. 빈 지질 나노입자의 크기는 난류 운동 에너지 및 혼합 시간(
Figure pct00001
)과 같은 여러 혼합 매개변수에 따라 달라진다. 빈 지질 나노입자를 수용하는 유체는 제1 스테이지 혼합기 출구 채널을 통과한다. 이렇게 되면 제1 스테이지 혼합기 유출 유체가 제2 스테이지 혼합기로 유입되기까지 시간(
Figure pct00002
)이 경과하게 된다. 빈 지질 나노입자는 도 5, 8, 9 및 10 각각에 대해 위에서 언급된 바와 같이 제2 스테이지 혼합기로 유입되고; 핵산은 또한 도 5, 8, 9 및 10 각각에 대해 설명된 바와 같이 제2 스테이지 혼합기로 도입된다. 따라서, 빈 지질 나노입자는 제2 스테이지 혼합기에서 핵산과 혼합된다. 핵산은 빈 지질 나노입자에 통합되고 핵산 보유 나노 입자가 형성된다. 핵산-보유 나노입자를 함유하는 유체는 그 뒤에 제2 스테이지 혼합기 출구 포트를 통해 제2 스테이지 혼합기 출구 채널로 제2 스테이지 혼합기에서 배출된다. 혼합기가 확장되면 벽 효과와 입구 흐름 영역이 변경될 수 있지만 속도를 조절하면 원하는 혼합 특성을 회복할 수 있다.
도 11a, 도 11b, 도 11c, 및 도 11d는 일 실시예에 따른 혼합 시스템(1100)을 도시한다. 일부 실시예에서, 혼합 시스템(1100)은 복수의 단일 스테이지 혼합기 또는 다중 스테이지 혼합 시스템을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 혼합기는 도 1a-1e, 도 2, 도 3a-3b 및/또는 도 4a-4c를 참조하여 본 명세서에 기재된 혼합기와 동일하거나 실질적으로 유사한 특성을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 다중 스테이지 혼합 시스템은 도 5, 도 6a-6b, 도 7a-7b, 도 8, 도 9a-9b 및 /또는 도 10을 참조하여 본 명세서에 기재된 다중 스테이지 혼합 시스템과 동일하거나 실질적으로 유사한 특성을 가질 수 있다. 이 실시예에서, 흡입 포트(1166, 1167, 1168, 1169)는 각각 입구 채널(1105, 1110, 1115, 1120)에 공급된다. 입구 채널(1105, 1110, 1115, 1120)은 와류 혼합 챔버(1150)로 공급되고 출구 포트(1155) 및 출구 채널(1160)을 통해 배출된다. 이 실시예에서, 흡입 포트(1166, 1167, 1168, 1169)는 혼합기 플레이트(1121)에 연결된 피펫이다. 혼합 플레이트(1121)는 d x w 구성으로 혼합기 플레이트(1121)의 평면에 나란히 배열된 n개의 반응기를 포함하며, 여기서 n, d, 및 w는 정수이다. 도 11a 및 도 11b에 도시된 실시예에서, n = 24, d = 6 및 w = 4이다. 이 실시예에서 사용된 피펫의 수는 96개이며 각 와류 혼합기에 4개의 흡입 포트가 있기 때문이다. 일부 실시예에서, 혼합 시스템(1100)은 도 1a 내지 도 1e에서 전술한 바와 같이 모든 단일 스테이지 혼합기를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 혼합 시스템(1100)은 도 5에 기재된 바와 같이 모든 다중 스테이지 혼합 시스템을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, d 및/또는 w는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상일 수 있다.
도 12는 일 실시예에 따른 혼합 플레이트(1221)를 갖는 혼합 시스템(1200)을 도시한다. 일부 실시예에서, 혼합 플레이트(1221)은 도 11에 설명된 바와 같이 혼합 플레이트(1121)과 동일하거나 실질적으로 유사할 수 있으며 도 11을 참조하여 전술된 바와 같이 혼합 시스템(1100)과 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 혼합 시스템을 형성하기 위하여 복수의 피펫(도시되지 않음)에 부착될 수 있다. 혼합 플레이트(1221)는 컨베이어 스탠드(1220)에 대해 고정된 위치에 있을 수 있다. 혼합 시스템(1200)은 복수의 생성물 용기(1222)를 포함할 수 있다. 혼합 플레이트(1221) 내의 단일 스테이지 또는 다중 스테이지 와류 혼합기 시스템을 통하여 혼합된 유체가 이동한 후에, 혼합된 유체는 생성물 용기(1222)에 증착될 수 있다. 생성물 용기(1222)는 혼합 플레이트(1221) 상의 단일 스테이지 또는 다중 스테이지 와류 혼합기의 수에 대응하는 다수의 공동을 가질 수 있다. 혼합 플레이트(1221)는 단일 스테이지 또는 다중 스테이지 와류 혼합기 각각으로부터 생성물을 한번에 하나씩 생성물 용기(1222)로 분배할 수 있다. 단일 생성물 용기(1222a)가 원하는 양의 생성물 유체를 수용하면, 단일 생성물 용기(1222a)로의 유체 흐름은 일시적으로 중단될 수 있는 반면, 컨베이어 스탠드(1220)는 후속 생성물 용기(1222b)가 생성물을 수용할 수 있도록 하는 생성물로 후속 생성물 용기(1222b)를 이동시킨다. 이 공정은 n개의 생성물 용기(1222)에 대해 계속될 수 있으며, 여기서 n은 정수이다. 일부 실시예에서, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 이 초과일 수 있다. 일부 실시예에서, 혼합 시스템(1200)은 자동화될 수 있다.
그러나, 일부 구현에서, 오염이 발생하고 오염물이 와류 혼합 챔버에 축적된다. 이로 인해 오염물 축적이 출구 포트를 막을 때 압력 상승 및 스파이킹이 발생할 수 있다. 오염물은 측면 벽 또는 그 근처에 축적될 수도 있다. 혼합 시간이 길면 오염물이 축적되어 압력 차동 도시기(PDI)가 증가하고 혼합 효율이 감소한다. 이는 추가로 와류 혼합 챔버의 측면 벽에서 또는 그 근처에서 혼합 품질을 감소시킨다. 이는 도 13a-13c에 도시되어 있다. 도 13a는 와류 혼합기(1300)의 와류 혼합 챔버(1350)에 축적된 오염물을 도시한다. 도 13b는 시간이 지남에 따라 오염이 발생함에 따라 압력 상승을 도시하는 차트이다. 도 13c는 와류 혼합 챔버(1350)의 중간 챔버와 제1 및/또는 제2 벽 모두에서 오염물 축적의 결과로서 와류 혼합 챔버의 측면 벽 근처에서 압력 상승을 도시한다.
이러한 일부 실시예에서, 와류 혼합 챔버의 높이는 입구 포트 및/또는 입구 채널의 높이와 동일할 수 있다. 이 스케일링은 도 14a에 도시된다. 그러나 와류 혼합 챔버의 높이가 증가하면 오염이 감소하고 혼합 품질이 증가한다는 것이 발견되었다. 따라서, 도 14b는 와류 혼합기(1400)의 다른 상대 치수가 동일하게 유지되는 동안 와류 혼합 챔버의 높이가 증가되는 대안적인 실시예를 도시한다. 따라서, 와류 혼합 챔버의 높이는 입구 포트 및/또는 입구 채널의 높이보다 더 크다. 이러한 일 실시예에서, 도 14b에 도시된 바와 같이, 와류 혼합 챔버(1450)의 측면 벽(1453)은 입구 포트(1425, 1430, 1435, 1440)의 상부 위로 연장될 수 있고 입구 포트(1425, 1430, 1435, 1440)의 하부 아래로 연장될 수 있다. 따라서, 와류 혼합 챔버의 제1 벽(1451)과 제2 벽(1452) 사이의 거리는 입구 포트(1425, 1430, 1435, 1440)의 높이보다 더 크다. 일부 실시예에서, 입구 포트(1425, 1430, 1435, 1440)은 측면 벽(1453)의 높이 내에서 중심에 위치할 수 있다. 도 14a 및 도 14b의 실시예에서 시간에 따른 압력의 비교는 도 14c의 차트에 도시되어 있다. 베이스선 압력은 감소하고 압력 상승 이전의 작동 시간은 증가한다.
도 14d-f는 다양한 스케일을 갖는 예시적인 와류 혼합기를 도시하고: 도 14d는 대략 0.3 mm 출구 포트/출구 채널 직경을 갖는 예시적인 와류 혼합기를 도시하고; 도 14e는 대략 1.0 mm 출구 포트/출구 채널 직경을 갖는 예시적인 와류 혼합기를 도시하고, 도 14f는 대략 4.0 mm 출구 포트/출구 채널 직경을 갖는 예시적인 와류 혼합기를 도시한다. 다른 모든 치수는 그에 따라 스케일링된다.
예를 들어, 초기 실시예에서, 출구 포트/출구 채널 직경은 약 1.0mm일 수 있고 치수는 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00003
와류 혼합기의 크기는 확대 또는 축소될 수 있다. 예를 들어, 치수는 0.25x, 0.5x, 0.75x, 1x, 2x, 2.5x, 3x, 4x, 5x, 및/또는 임의의 다른 스케일일 수 있다. 예시적인 치수는 아래 표에 나와 있다:
Figure pct00004
치수를 변경함으로써, 입구 채널/입구 포트 및 출구 채널/출구 포트를 통한 유속은 비례적으로 변할 수 있다. 예시적인 실시예에서, 제1 유체는 제1 입구 채널(1405)을 통해 제1 입구 포트(1425)로, 제3 입구 채널(1415)을 통해 제3 입구 포트(1435)로 흐르고, 제2 유체는 제2 입구 채널(1410)을 통해 제2 입구 포트(1430)로 및 제4 입구 채널(1420)을 통해 제4 입구 포트(1440)로 흐른다. 제1 유체 및 제2 유체는 개별 유체 유입 선(도시되지 않음)에 의해 또는 위에서 언급된 바와 같은 스플리터를 통해 각각의 대응하는 입구 채널로 안내될 수 있다. 제1 및 제3 입구 포트(1425, 1435)는 제1 유체가 직접적으로 또는 대략적으로 서로를 가로질러 와류 혼합 챔버(1450)에 유입하도록 할 수 있다. 유사하게, 제2 및 제4 입구 포트(1430, 1440)는 제2 유체가 직접적으로 또는 대략적으로 서로를 가로질러 와류 혼합 챔버(1450)에 유입하도록 할 수 있다. 제1, 제2, 제3, 및 제4 입구 포트(1425, 1430, 1435, 1440) 각각은 유체가 다른 입구 포트로부터 정확히 또는 대략 90°로 와류 혼합 챔버에 유입하도록 할 수 있다. 위에서 언급된 바와 같이, 입구 포트(1425, 1430, 1435, 1440) 및 입구 채널(1405, 1410, 1415, 1420)은 와류 혼합 챔버(1450)에 접선 방향으로, 와류 혼합 챔버(1450)에 대해 수직으로, 또는 이 사이의 임의의 각도로 각도로 구성될 수 있다.
일부 구현에서, 위에서 언급된 1x 스케일을 사용할 때, 제1 유체의 유속은 제1 및 제3 입구 채널(1405, 1415) 각각을 통한 15 ml/분일 수 있고 제2 유체의 유속은 제2 및 제4 입구 채널(1410, 1420) 각각을 통해 45 ml/분일 수 있다. 출구 채널(1460)을 통한 유속은 120 ml/분일 수 있다. 이러한 속도는 위에서 논의한 바와 같이 와류 혼합기가 확대 또는 축소될 때 변경될 수 있다. 따라서 예를 들어 유속은 다음과 같이 달라질 수 있다:
Figure pct00005
도 14a 내지 도 14b와 관련하여 위에서 언급된 바와 같이 와류 혼합 챔버의 높이를 증가시킴으로써, 등가 혼합 에너지를 유지하기 위해 유속의 증가가 필요할 수 있다. 도 15a-15c는 진한 청색이 혼합되지 않고(또는 최소 혼합) 녹색이 완전히 혼합(또는 대략적으로 완전히 혼합)된 챔버에서의 혼합을 도시한다. 도 15a는 설정된 입구 속도에서 1x 스케일 와류 혼합기에서의 혼합을 도시하는 반면, 도 15b는 동일한 설정된 입구 속도에서 4x 스케일 와류 혼합기에서의 혼합을 도시한다. 도 15a의 1x 스케일 와류 혼합기는 동일한 설정 입구 속도에서 도 15b의 4x 스케일 와류 혼합기보다 상당히 더 많은 혼합을 초래한다. 따라서, 더 큰 스케일의 와류 혼합기가 더 많은 혼합을 야기하기 위해 도 15c에 도시된 바와 같이 입구 속도가 증가된다. 도 15d는 도 15a-15c와 함께 입구 속도(m/s)의 함수로서 혼합 시간 스케일(ms)를 도시하는 그래프이다.
게다가, 와류 혼합 챔버 높이가 입구 암 및 입구 포트의 높이보다 더 크도록 와류 혼합 챔버의 높이를 증가함에 따라 - 예를 들어, 도 14a에 도시된 실시예에서 도 14b에 도시된 실시예까지 - 중심 혼합 패턴을 유지하면서 변동 계수가 감소를 야기한다. 변동 계수(CoV)는 출구 포트 및/또는 출구 채널에서 위상의 특수 분포일 수 있으며 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00006
예시적인 실시예에서, 와류 혼합 챔버의 높이를 증가시키면 변동 계수가 61에서 35로 감소된다. 상응하는 변화는 수평 중간 평면, 수직 중간 평면 및 와류 혼합 챔버의 제1 벽에서 도 15e에 도시된다. 도 15e의 좌측 칼럼은 도 14a에서 상기 언급된 실시예의 혼합 동안 제1 유체의 질량 분율을 도시하고; 도 15e의 우측 칼럼은 도 14b와 관련하여 위에서 언급된 실시예의 혼합 동안 제1 유체의 질량 분율을 나타낸다. 위에서 언급된 예시적인 실시예에서, 도 15e는 와류 혼합기에서 에탄올의 질량 분율을 나타낼 수 있다.
도 16a는 다양한 출구 채널/출구 포트 직경에 대한 예시적인 최소 유속 및 최소 및 최대 배치 크기를 도시한다. 와류 혼합기의 다른 치수는 위의 차트와 그에 따라 비례적으로 조절될 수 있다. 도 16b는 0.3mm 출구 채널/출구 포트 직경, 0.5mm 출구 채널/출구 포트 직경 및 1.0mm 출구 채널/배출 포트 직경에 대한 총 유속(ml/분)의 함수로서 형성되는 나노입자의 직경(nm)을 보여주는 차트이다. 도 16c는 0.3mm 출구 채널/출구 포트 직경, 0.5mm 출구 채널/출구 포트 직경, 및 1.0mm 출구 채널/출구 포트 직경에 대한 입구 속도(m/s)의 함수로서 형성되는 나노입자의 직경(nm)을 도시한다. 도 16d는 1.0mm 출구 채널/출구 포트 직경, 2.0mm 출구 채널/출구 포트 직경 및 4.0mm 출구 채널/출구 포트 직경에 대해 입구 속도(m/s)의 함수로서 형성되는 입자의 직경(nm)을 도시한다.
도 16d의 데이터에 기초하여, 더 큰 스케일의 혼합기에서 동일한 입자 직경을 달성하기 위해 더 빠른 입구 속도가 필요하다. 즉, 동일한 입자 직경을 달성하기 위해 입구 속도는 1.0mm의 출구 채널/출구 포트 직경을 갖는 혼합기 및 2.0mm의 출구 채널/출구 포트 직경을 갖는 혼합기와 비교하여 4.0mm의 출구 채널/출구 포트 직경을 갖는 혼합기에서 더 빠르고, 2.0mm의 출구 채널/출구 포트 직경을 갖는 혼합기에 대해 입구 속도는 4.0m/s 출구 포트/출구 직경을 갖는 혼합기에 비해 더 느리고 1.0m/s 출구 포트/출구 직경을 갖는 혼합기보다 더 빠르다. 입자 직경을 달성하는 데 필요한 속도를 비교하여 유효 속도 조절이 적용될 수 있다. 더 큰 혼합기의 에너지 손실 때문에 2.0mm 출구 포트/출구 직경 혼합기는 1.0mm 출구 포트/출구 직경 혼합기에 비해 대략 또는 정확히 10%의 에너지를 잃고 4.0mm 출구 포트/출구 직경 혼합기는 1.0mm 출구 포트/출구 직경 혼합기에 비해 대략 또는 정확히 30%의 에너지를 잃는다. 이 에너지 손실을 설명하기 위해 1.0mm 출구 포트/출구 직경 혼합기에 대하여 조절된 입구 속도를 결정하기 위해 유효 속도 조절이 입구 속도에 적용될 수 있고, 2.0mm 출구 포트/출구 직경 혼합기에 대하여 유효 속도 조절은 100%이고, 유효 속도 조절은 90%이고(10% 에너지 손실의 설명하기 위해), 4.0mm 출구 포트/출구 직경 혼합기의 경우 유효 속도 조절은 70%이다(30% 에너지 손실을 설명하기 위해). 이러한 값은 도 16e의 표에 도시된다.
도 16f는 도 16e의 유효 속도 조절을 적용한 후의 도 16d의 플롯을 도시한다. 따라서, 도 16f는 조절된 입구 속도(m/s)의 함수로서 입자 직경(nm)을 도시한다. 도 16g는 조절된 입구 속도(m/s)의 함수로서 와류 혼합기 내의 압력(psi)을 도시한다. 이는 입자 직경(nm)이 입구 속도를 변경하여 조절할 수 있지만 입구 속도가 증가하면 작동 압력이 높아진다는 것을 도시한다.
도 16h는 0.3mm 출구 채널/출구 포트 직경, 0.5mm 출구 채널/출구 포트 직경 및 1.0mm 출구 채널/출구 포트 직경에 대한 난류 운동 에너지(TKE)(J/kg)의 함수로서 형성되는 나노입자의 직경(nm)을 도시한다. TKE는 흐름의 난류 와류와 관련된 질량당 평균 운동 에너지일 수 있다.
도 16i는 0.3mm 출구 채널/출구 포트 직경, 0.5mm 출구 포트 채널/출구 직경 및 1.0mm 출구 채널/출구 포트 직경에 대해 최소 혼합 시간(ms)의 함수로 형성되는 나노입자의 직경(nm)을 도시한다. 도시된 바와 같이, 직경은 난류 운동 에너지와 최소 혼합 시간(
Figure pct00007
) 모두에 따라 스케일링된다. 충분히 혼합된 상태에 도달하는 시간은 다음과 같이 정의된다:
Figure pct00008
Figure pct00009
유체가 와류 혼합 챔버에 남아 있는 시간은 마이크로혼합 타임스케일보다 커야 한다. 그렇지 않으면 유체가 완전히 혼합되기 전에 혼합기에서 배출된다. 따라서 유체가 챔버에 남아 있는 평균 체류 시간은 다음과 같아야 한다:
Figure pct00010
Q = 부피 유속 [m3/s]
V = 혼합기 부피[m3]
도 16h-16i의 차트 데이터에 기초하여, 난류 운동 에너지 TKE > 2 J/kg일 때 혼합 시간
Figure pct00011
< 5 ms인 것으로 밝혀졌다. 위에서 논의한 것처럼 더 큰 기하학적 형상을 사용할 때 일정한 속도로 TKE의 증가와
Figure pct00012
의 감소는 와류 혼합 챔버에서 완전한 난류 흐름 프로파일을 달성하기 위해 필요할 수 있다. 0.5mm 출구 채널/출구 포트 직경, 1.0mm 출구 채널/출구 포트 직경, 2.0mm 출구 채널/출구 포트 직경 및 4.0mm 출구 채널/출구 포트 직경에 대한 입구 속도(m/s)의 함수로서의 TKE(J/kg)는 도 16j에 도시된다. 이러한 동일한 기하학적 형상에 대한 입구 속도(m/s)의 함수로서 최소 혼합 시간(ms)이 도 16k에 도시된다.
도 16l은 다양한 혼합기 스케일(출구 포트/출구 채널 직경의 mm)에 대해 충분한 혼합을 달성하기 위한 최소 총 유속(ml/분)을 도시한다. 도 16m은 0.3mm 출구 포트/출구 채널 직경, 0.5mm 출구 포트/출구 채널 직경, 1.0mm 출구 포트/출구 채널 직경, 2.0mm 출구 포트/출구 채널 직경 및 4.0mm 출구 포트/출구 채널 직경을 갖는 혼합기의 최소 총 유속을 도시하는 표이다.
도 16n은 0.5mm 출구 채널/출구 포트 직경, 1.0mm 출구 채널/출구 포트 직경, 2.0mm 출구 채널/출구 포트 직경 및 4.0mm 출구 채널/출구 포트 직경에 대한 입구 속도(m/s)의 함수로서 입구 레이놀즈를 도시한다.
일부 구현에서, 핵산이 조기에 혼합되고 핵산이 에탄올과 상호작용할 때 침전이 발생하는 것으로 밝혀졌다. 핵산의 조기 혼합은 지질 나노입자의 효율적인 조립에 영향을 미치고 침전은 오염을 초래한다. 따라서, 상기 예시적인 실시예에서 언급된 바와 같이, 내부에 포함된 핵산으로 지질 나노입자를 단일 스테이지로 형성하는 대신에, 2 스테이지 와류 혼합기가 사용될 수 있다. 2 스테이지 와류 혼합기는 1 스테이지 와류 혼합기와 2 스테이지 와류 혼합기의 직렬로 연결된 2개의 혼합기를 가질 수 있다. 제1 스테이지의 와류 혼합기는 에탄올(즉, 지질 마스터믹스)과 산성 완충액의 지질을 혼합하여 빈 나노입자를 형성할 수 있고, 제2 스테이지의 와류 혼합기는 제1 스테이지의 와류 혼합기에서 형성된 빈 나노입자를 핵산과 혼합하여 핵산-보유 나노입자를 형성할 수 있다. 이러한 방식으로, 빈 나노입자의 형성과 핵산 보유 나노입자를 형성하기 위한 핵산의 첨가 사이에는 시간적 차이가 있다. 이와 같이 핵산이 도입되기 전에 빈 나노입자가 완전히 형성된다. 핵산은 유화되지 않은 완충액에 노출되지 않으므로 산성화 완충액에 노출되어 핵산이 분해되는 것을 방지한다. 대신에, 빈 지질 나노입자가 형성되고, 핵산이 제2 스테이지 와류 혼합기에 도입되고, 핵산이 소수성 상호작용 및/또는 하전 상호작용에 의해 빈 지질 나노입자에 통합된다. 이는 지질 나노입자에 핵산을 더 잘 캡슐화하여 결과적으로 더 통일된 입자를 생성한다.
도 17a는 시간(분)에 따른 기준 압력(psi)으로부터의 압력 변화의 그래프를 도시한다. 녹색 플롯은 단일 스테이지 혼합기의 압력 변화를 보여주는 반면 주황색 플롯 선은 도 10에 도시된 이중 스테이지 혼합기의 압력 변화를 보여준다. 도 17b는 시간(분)에 따른 기준 압력(psi)으로부터의 압력 변화 그래프이다. 도 17b는 도 17a와 동일한 플롯을 나타내며, 여기서 녹색 플롯 선은 단일 스테이지 혼합기의 압력 변화를 나타내고 주황색 선은 도 10의 이중 스테이지 혼합기의 압력 변화를 나타내지만 여기에서는 도 5의 이중 스테이지 혼합기의 압력 변화는 적색으로 도시된다. 이는 압력 변화 및 압력 스파이크가 도 10의 단일 스테이지 혼합기 및 이중 스테이지 혼합기와 비교하여 도 5의 실시예에서 크게 감소되었음을 보여준다. 이는 적어도 부분적으로 도 5의 실시예가 도 10의 단일 스테이지 혼합기 및 이중 스테이지 혼합기보다 오염이 훨씬 적다.
도 17c는 도 10의 실시예의 샘플 테스트 실행 후의 제2 스테이지 혼합기(1002)를 도시한다. 도 17d는 도 5의 실시예의 샘플 테스트 실행 후의 제2 스테이지 혼합기(502)를 도시한다. 도 17d는 침전물이 없거나 최소인 것을 도시하며 이는 오염이 발생하지 않았거나 최소임을 의미하는 반면, 도 17c는 침전물의 축적을 나타내며, 이는 오염이 발생했음을 의미하고 도 17a-17b의 녹색 및 주황색 플롯 선에 도시된 증가된 압력 및 압력 스파이크를 설명한다.
도 18a는 와류 혼합 챔버(1850)의 측면 벽(1853)을 따라 입구 포트/채널을 통해 2개의 유체를 수용하는 예시적인 와류 혼합기의 유체 경로 선을 도시한다. 제1 유체는 제1 입구 채널(1805)/입구 포트(1825) 및 제3 입구 채널(1815)/입구 포트(1835)를 통해 와류 혼합 챔버(1850)로 유입되고, 제2 유체는 제2 입구 채널(1810)/입구 포트(1830) 및 제4 입구 채널(1820)/입구 포트(1840)를 통해 와류 혼합 챔버(1850)에 유입된다. 도 18a는 청색의 제1 유체를 도시하며, 이 제1 유체는 제1 입구 채널(1805)/입구 포트(1825)를 통해 와류 혼합 챔버(1850)에 유입되고, 제2 유체는 제2 입구 채널(1810)/입구 포트(1830)를 통해 와류 혼합 챔버(1850)에 들어간 후 적색으로 도시된다. 가시의 용이성을 위해 색상은 제3 및 제4 입구 채널/입구 포트와 관련하여 도시되지 않는다. 청색과 적색 유체가 완전히 혼합되면 유체 경로 선이 황색으로 도시된다. 이 실시예에서, 및 도 18a에서 볼 수 있는 바와 같이, 제1 입구 포트(1825) 이후의 측면 벽을 따라 제1 유체의 농도가 존재하고 제2 입구 포트(1830) 이후의 측면 벽을 따른 제2 유체의 농도가 존재한다. 따라서 혼합은 와류 혼합 챔버(1850)의 측면 벽(1853)을 따라 시작되고, 완전히 혼합된 유체는 혼합 유체가 출구 포트에 도달하고 출구 채널(1860)을 통해 배출될 때까지 챔버의 중심을 향해 와류 혼합 챔버(1850)를 순환한다. 많은 혼합이 측면 벽(1850)에서 발생하고 제1 및 제3 입구 포트(1825, 1835) 이후에 제1 유체 및 제2 및 제4 입구 포트(1830, 1840) 이후에 제2 유체가 과포화되기 때문에 심각한 오염이 발생할 수 있다.
도 18b는 도 5의 제2 스테이지 혼합기(502)에 도시된 구성(및 도 17b 및 17d에 대해 위에서 논의됨)과 같은 와류 혼합기의 대안적인 구성의 유체 라인을 도시한다. 여기서, 제1 유체는 적어도 제1 입구 채널(1875)/입구 포트(1885) 및 제2 입구 채널(1877)/입구 포트(1886)를 통해 와류 혼합 챔버(1880)로 유입될 수 있고, 제2 유체는 제3 입구 입구 채널(1878)/입구 포트(1888)를 통하여 와류 혼합 챔버(1880)에 유입될 수 있다. 제1 및 제2 입구 포트(1885, 1886)는 와류 혼합 챔버(1880)의 측면 벽(1883)을 따라 구성될 수 있는 반면, 제3 입구 포트(1888)는 와류 혼합 챔버(1880)의 제1 벽(1881)에 구성될 수 있다. 와류 혼합 챔버(1880)의 제1 벽(1881)은 와류 혼합 챔버(1880)의 제2 벽(1882)의 반대편에 구성될 수 있으며, 여기서 제1 벽(1881) 및 제2 벽(1882)은 서로 평행(또는 대략 평행)하고 측면 벽(1883)을 통해 연결된다. 일부 실시예에서, 제3 입구 포트(1888)는 제1 벽(1881)의 반경방향 중심에 또는 그 근처에 구성될 수 있고, 제2 벽(1882)의 반경방향 중심에 또는 근처에 구성되는 출구 포트(1889)의 반개편에 있을 수 있고 제1 벽(1881)의 반경방향 중심에 또는 그 근처에 구성될 수 있다. 출구 포트(1889)는 출구 채널(1890)에 연결될 수 있다.
도 18b에서, 청색 유체 라인은 제3 입구 채널(1878)/입구 포트(1888)로부터 와류 혼합 챔버(1880)로 들어가는 제2 유체를 나타낸다. 제2 유체는 와류 혼합 챔버(1880) 주위에서 소용돌이치는 제1 유체(미도시)와 혼합된다. 혼합은 와류 혼합 챔버(1880)의 중심 또는 그 근처에서 발생한다. 혼합의 일부, 대부분 또는 전부는 황색으로 도시된 혼합 유체가 배출 포트(1889)를 통하여 출구 채널(1890) 내로 와류 혼합 챔버(1880)에 유입되기 전에 와류 혼합 챔버(1880)에서 발생한다. 일부 실시예에서, 혼합 유체가 채널(1890)에서 배출되도록 출구 포트(1889)를 통해 와류 혼합 챔버(1880)를 배출되기 전에 혼합의 전부 또는 거의 전부가 와류 혼합 챔버(1880)에서 발생한다. 일부 실시예에서 , 일부 혼합은 와류 혼합 챔버(1880)에서 발생할 수 있고 유체가 출구 포트(1889)를 지나 출구 채널(1890)로 소용돌이치면서 혼합이 계속될 수 있다.
도 18b의 실시예에서, 혼합은 와류 혼합 챔버(1880)의 중심에서 또는 그 근처에서 발생한다. 이러한 구성은 혼합이 와류 혼합 챔버(1880)의 벽으로부터 멀리 떨어져 일어나고, 도 18a에 도시된 바와 같이 교류 유체의 과포화를 방지하기 때문에 감소된 오염 및 감소된 혼합 시간을 초래한다.
도 19a-19b는 시간(들)의 함수로서 혼합비를 도시한다. 혼합비는 와류 혼합기에서 혼합될 제1 유체에서 발견되는 제1 성분 대 와류 혼합기에서 혼합될 제2 유체에서 발견되는 제2 성분의 비율을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 지질과 핵산을 혼합할 때 국부적 N:P 비율이 사용될 수 있으며, 여기서 N은 지질의 질소 그룹을 나타내고 P는 핵산의 인 그룹을 나타냅니다. 도 19a는 도 18a의 실시예에서 시간(초)의 함수로서 혼합비를 도시하는 반면, 도 19b는 도 18b의 실시예에서 시간(초)의 함수로서 혼합비를 도시한다. 따라서, 도 18b의 혼합기에서 평형(예를 들어, 완전히 혼합된 비율)은 도 18a의 혼합기에서보다 훨씬 빠르게 달성된다. 도 18b 및 19b의 실시예에서, N:P 비는 대략 0.002초 내에 평형을 달성하는 반면, 도 18a 및 19a의 실시예에서, N:P 비는 대략 0.025초까지 평형을 달성하지 않는다.
위에서 언급된 예시적인 실시예는 핵산-함유 지질 나노입자를 형성하는 것을 언급하지만, 지질 나노입자는 또한 다른 핵산, 단백질 등을 캡슐화할 수 있음에 유의해야 한다.
본 명세서에 언급된 와류 혼합기(들)의 각각의 실시예는 스테인리스 스틸, LFEM, 아크릴, PEEK, 3-D 인쇄 매체 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 재료로부터 형성될 수 있다.
본 출원에 제시된 특허, 특허 출원, 기사, 웹페이지, 책 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 공보 또는 다른 문서에 대한 임의의 모든 참조는 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
정의
본원에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 일반적으로 명시된 값의 ±10%를 의미하며, 예를 들어 약 90도는 81도 내지 99도를 포함하고, 약 1,000μm은 900μm 내지 1,100μm을 포함할 것이다. 일부 구체예들에서, "약" 또는 "대략"은 일반적으로 명시된 값의 ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2% 또는 ±1%를 의미한다. 일부 구체예들에서, "약" 또는 "대략"이 각도 측정을 나타낼 때 이러한 용어는 일반적으로 명시된 값의 ±10도, ±9도, ±8도, ±7도, ±6도, ±5도, ±4도, ±3도, ± 2도 또는 ±1도를 의미한다. 일부 구체예들에서, "약" 또는 "대략"이 거리를 나타낼 때 이러한 용어는 일반적으로 명시된 값의 ±10mm, ±9mm, ±8mm, ±7mm, ±6mm, ±5mm, ±4mm, ±3mm, ±2mm, ±1mm, ±900μm, ± 800μm, ±700μm, ±600μm, ±500μm, ±400μm, ±300μm, ±200μm, ±100μm, ±90μm, ±80μm, ±70μm, ±60μm, ±50μm, ±40μm, ±30μm, ±20μm 또는 ±10μm을 의미한다.
핵산
일부 구체예들에서, 핵산은 폴리뉴클레오티드 (예: 리보핵산 또는 데옥시리보핵산)이다. 가장 넓은 의미에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 올리고뉴클레오티드 사슬에 통합되거나 통합될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 예시적인 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA), 메신저 mRNA(mRNA)를 포함하는 리보핵산(RNA), 이들의 하이브리드, RNAi-유도제, RNAi 효현제, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 촉매 DNA, 삼중 나선 형성을 유도하는 RNA, 압타머, 벡터 등 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예들에서, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. RNA는 쇼트머, 안타고미어, 안티센스, 리보자임, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), 다이서-기질 RNA(dsRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 전달 RNA(tRNA), 메신저 RNA(mRNA), 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹에서 선택될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예들에서, RNA는 mRNA이다.
일부 구체예들에서, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다. mRNA는 임의의 자연 또는 비-자연 발생 또는 달리 변형된 폴리펩티드를 포함하는 임의의 관심 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. mRNA에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 임의의 크기일 수 있고 임의의 2차 구조 또는 활성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, mRNA에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 세포에서 발현될 때 치료 효과를 가질 수 있다.
일부 구체예들에서, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 siRNA이다. siRNA는 관심 유전자의 발현을 선택적으로 녹다운 또는 하향조절할 수 있다. 예를 들어, siRNA는 siRNA를 포함하는 지질-함유 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여시 특정 질환, 장애 또는 병태와 관련된 유전자를 침묵시키기 위해 선택될 수 있다. siRNA는 관심 유전자 또는 단백질을 인코딩하는 mRNA 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, siRNA는 면역조절 siRNA일 수 있다.
일부 구체예들에서, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 sgRNA 및/또는 cas9 mRNA이다. sgRNA 및/또는 cas9 mRNA는 유전자 편집 툴로 사용될 수 있다. 예를 들어, sgRNA-cas9 복합체는 세포 유전자의 mRNA 번역에 영향을 미칠 수 있다.
일부 구체예들에서, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 shRNA 또는 이를 코딩하는 벡터 또는 플라스미드이다. shRNA는 적절한 구조체를 핵으로 전달시 표적 세포 내부에서 생성될 수 있다. shRNA와 관련된 구조체 및 메커니즘은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다.
본 발명에 유용한 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 연결된 뉴클레오시드의 제1 영역 (예를 들어, 코딩 영역), 제1 영역의 5'-말단에 위치한 제1 연접 영역 (예를 들어, 5' -UTR), 제1 영역의 3'-말단에 위치한 제2 연접 영역 (예를 들어, 3'-UTR), 적어도 하나의 5'-캡 영역, 및 3'-안정화 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 폴리-A 영역 또는 코작 서열 (예를 들어, 5'-UTR에서)을 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드로부터 절단될 수 있는 하나 이상의 인트론 뉴클레오티드 서열들을 함유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 (예를 들어, mRNA)은 5' 캡 구조, 사슬 종결 뉴클레오티드, 스템 루프, 폴리 A 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 핵산 영역들 중 어느 하나는 하나 이상의 대체 성분들 (예를 들어, 대체 뉴클레오시드)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 3'-안정화 영역은 대체 뉴클레오시드, 가령, L-뉴클레오시드, 역 티미딘 (inverted thymidine) 또는 2'-O-메틸 뉴클레오시드 및/또는 코딩 영역을 포함할 수 있으며, 5’-UTR, 3'-UTR 또는 캡 영역은 대체 뉴클레오시드, 가령, 5-치환된 우리딘(예를 들어, 5-메톡시우리딘), 1-치환된 슈도우리딘(예를 들어, 1-메틸-슈도우리딘 또는 1-에틸-슈도우리딘) 및/또는 5-치환된 시티딘(예를 들어, 5-메틸-시티딘)을 포함할 수 있다.
일반적으로, 폴리뉴클레오티드의 최단 길이는 다이펩티드를 인코딩하기에 충분한 폴리뉴클레오티드 서열의 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 길이는 트라이펩티드를 인코딩하기에 충분하다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 길이는 테트라펩티드를 인코딩하기에 충분하다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 길이는 펜타펩티드를 인코딩하기에 충분하다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 길이는 헥사펩티드를 인코딩하기에 충분하다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 길이는 헵타펩티드를 인코딩하기에 충분하다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 길이는 옥타펩티드를 인코딩하기에 충분하다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 길이는 노나펩티드를 인코딩하기에 충분하다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 길이는 데카펩티드를 인코딩하기에 충분하다.
대안적인 폴리뉴클레오티드 서열이 인코딩할 수 있는 다이펩티드의 예는 카르노신 및 세린을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드는 30개 초과의 뉴클레오티드 길이, 35개 초과의 뉴클레오티드 길이, 적어도 40의 뉴클레오티드, 적어도 45개의 뉴클레오티드, 적어도 55개의 뉴클레오티드, 적어도 50개의 뉴클레오티드, 적어도 60개의 뉴클레오티드, 적어도 80개의 뉴클레오티드, 적어도 90개의 뉴클레오티드, 적어도 100개의 뉴클레오티드, 적어도 120개의 뉴클레오티드, 적어도 140개의 뉴클레오티드, 적어도 160개의 뉴클레오티드, 적어도 180개의 뉴클레오티드, 적어도 200개의 뉴클레오티드, 적어도 250개의 뉴클레오티드, 적어도 300개의 뉴클레오티드, 적어도 350개의 뉴클레오티드, 적어도 400개의 뉴클레오티드, 적어도 450개의 뉴클레오티드, 적어도 500개의 뉴클레오티드, 적어도 600개의 뉴클레오티드, 적어도 700개의 뉴클레오티드, 적어도 800개의 뉴클레오티드, 적어도 900개의 뉴클레오티드, 적어도 1000개의 뉴클레오티드, 적어도 1100개의 뉴클레오티드, 적어도 1200개의 뉴클레오티드, 적어도 1300개의 뉴클레오티드 뉴클레오티드, 적어도 1400개 뉴클레오티드, 적어도 1500개 뉴클레오티드, 적어도 1600개 뉴클레오티드, 적어도 1800개 뉴클레오티드, 적어도 2000개 뉴클레오티드, 적어도 2500개 뉴클레오티드, 적어도 3000개 뉴클레오티드, 적어도 4000개의 뉴클레오티드, 적어도 5000개의 뉴클레오티드, 또는 5000개 초과의 뉴클레오티드이다.
핵산 및 폴리뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드 A(아데노신), G(구아노신), C (시토신), U(우리딘) 또는 T(티미딘) 중 어느 하나를 포함하는 하나 이상의 자연 발생 성분을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, (a) 5’-UTR, (b) 오픈 리딩 프레임 (ORF), (c) 3’-UTR, (d) 폴리 A 꼬리, 및 (상기 a, b, c, 또는 d)의 임의의 조합을 포함하는 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드들은 자연 발생 표준 뉴클레오티드 A (아데노신), G (구아노신), C (시토신), U (우리딘) 또는 T (티미딘)을 포함한다.
핵산 및 폴리뉴클레오티드는 증가된 안정성 및/또는 폴리뉴클레오티드가 도입되는 세포의 선천 면역 반응의 실질적인 유도 결여를 비롯하여 유용한 특성을 부여하는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 대체 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 대안적인 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 상응하는 변경되지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 핵산에 비해 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이 도입되는 세포에서 감소된 분해를 나타낸다. 이러한 대체 종들은 단백질 제조의 효율성, 폴리뉴클레오티드의 세포내 잔류 및/또는 접촉된 세포의 생존력을 향상시킬 뿐만 아니라 감소된 면역원성을 보유할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 및 핵산은 자연 또는 비자연 발생일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 핵산은 하나 이상의 변형된 (예를 들어, 변경된 또는 대체) 핵염기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 핵산 및 폴리뉴클레오티는 가령, 핵염기, 당 또는 뉴클레오시드간 연결에 대한 (예를 들어, 연결 포스페이트에 대한 / 포스포다이에스터 연결에 대한 / 포스포다이에스터 백본에 대한) 임의의 유용한 변형 또는 변경을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 변경(예를 들어, 하나 이상의 변경)이 각각의 핵염기, 당 및 뉴클레오시드간 연결에 존재한다. 본 발명에 따른 변경은 리보핵산(RNA)의 데옥시리보핵산(DNA)으로의 변경, 예를 들어 리보푸라노실 고리의 2'-OH에서 2'-H, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 또는 이들의 하이브리드로의 치환일 수 있다. 추가적인 변경들이 본원에 기재되어 있다.
폴리뉴클레오티드 및 핵산은 분자의 전체 길이를 따라 균일하게 변경되거나 변경되지 않을 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 또는 모든 유형의 뉴클레오티드(예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘, 또는 A, G, U, C 중 하나 이상 또는 전부)는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산, 또는 주어진 예정된 그 서열 영역에서 균일하게 변경되거나 변경되지 않을 수 있다. 일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드 (또는 이의 주어진 서열 영역)의 모든 뉴클레오티드 X가 변경되며, 여기서 X는 뉴클레오티드 A, G, U, C 중 하나 또는 조합 A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C 또는 A+G+C 중 하나일 수 있다.
상이한 당 변경 및/또는 뉴클레오시드간 연결(예를 들어, 백본 구조)은 폴리뉴클레오티드의 다양한 위치에 존재할 수 있다. 당업자는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 변경(들)이 폴리뉴클레오티드의 기능이 실질적으로 감소되지 않도록 하는 임의의 폴리뉴클레오티드 위치(들)에 배치될 수 있음을 이해할 것이다. 변경은 5'-또는 3'-말단 변경일 수도 있다. 일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드는 3'-말단에 변경을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 (전체 뉴클레오티드 함량과 관련하여, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 유형들, 즉, A, G, U, 또는 C 중 어느 하나 이상과 관련하여) 약 1% 내지 약 100% 또는 그 사이의 임의의 백분율 (예를 들어, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 50%, 1% 내지 60%, 1% 내지 70%, 1% 내지 80%, 1% 내지 90%, 1% 내지 95%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 100%, 20% 내지 25%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 70%, 20% 내지 80%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 50% 내지 60%, 50% 내지 70%, 50% 내지 80%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 70% 내지 80%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100% 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 및 95% 내지 100%)의 대체 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 임의의 잔부 백분율은 표준 뉴클레오티드 (예를 들어, A, G, U 또는 C)의 존재에 의해 기재됨이 이해될 것이다.
폴리뉴클레오티드는 최고 0 내지 최대 100%의 대체 뉴클레오티드, 그 사이의 임의의 백분율, 가령, 적어도 5% 대체 뉴클레오티드, 적어도 10% 대체 뉴클레오티드, 적어도 25% 대체 뉴클레오티드, 적어도 50% 대체 뉴클레오티드, 적어도 80% 대체 뉴클레오티드, 또는 적어도 90% 대체 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 대체 피리미딘, 가령, 대체 우라실 또는 시토신을 함유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드에서 우라실 중 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%는 대체 우라실 (예를 들어, 5-치환된 우라실)로 대체된다. 대체 우라실은 단일 고유 구조를 갖는 화합물로 대체될 수 있거나, 상이한 구조(예를 들어, 2, 3, 4 또는 그 이상의 고유 구조)를 갖는 복수의 화합물로 대체될 수 있다. 일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드에서 시토신 중 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%는 대체 시토신 (예를 들어, 5-치환된 시토신)으로 대체된다. 대체 시토신은 단일 고유 구조를 갖는 화합물로 대체될 수 있거나, 상이한 구조(예를 들어, 2, 3, 4 또는 그 이상의 고유 구조)를 갖는 복수의 화합물로 대체될 수 있다.
일부 구체예들에서, 핵산은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)가 도입되는 세포의 선천 면역 반응을 실질적으로 유도하지 않는다. 유도된 선천성 면역 반응의 특징은 1) 전염증성 사이토카인의 발현 증가, 2) 세포내 PRR(RIG-I, MDA5 등)의 활성화, 및/또는 3) 단백질 번역의 종료 또는 감소를 포함한다.
핵산은 선택적으로 다른 제제들 (예를 들어, RNAi-유도 제제, RNAi 제제, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 촉매 DNA, tRNA, 삼중 나선 형성을 유도하는 RNA, 압타머, 벡터)을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 핵산은 하나 이상의 대체 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 (즉, 대체 mRNA 분자)를 갖는 하나 이상의 메신저 RNA(mRNA)를 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 핵산 (예를 들어, mRNA)는 WO2002/098443, WO2003/051401, WO2008/052770, WO2009127230, WO2006122828, WO2008/083949, WO2010088927, WO2010/037539, WO2004/004743, WO2005/016376, WO2006/024518, WO2007/095976, WO2008/014979, WO2008/077592, WO2009/030481, WO2009/095226, WO2011069586, WO2011026641, WO2011/144358, WO2012019780, WO2012013326, WO2012089338, WO2012113513, WO2012116811, WO2012116810, WO2013113502, WO2013113501, WO2013113736, WO2013143698, WO2013143699, WO2013143700, WO2013/120626, WO2013120627, WO2013120628, WO2013120629, WO2013174409, WO2014127917, WO2015/024669, WO2015/024668, WO2015/024667, WO2015/024665, WO2015/024666, WO2015/024664, WO2015101415, WO2015101414, WO2015024667, WO2015062738, WO2015101416에 기재된 특징들을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다.
핵염기 대체물
대안적인 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 대안적인 핵염기를 포함할 수 있다. 핵산의 핵염기는 퓨린 또는 피리미딘 또는 이들의 유도체와 같은 유기 염기이다. 핵염기는 표준 염기(예를 들어, 아데닌, 구아닌, 우라실, 티민 및 시토신)일 수 있다. 이들 핵염기는 향상된 특성, 예를 들어, 뉴클레아제에 대한 내성과 같은 증가된 안정성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공하기 위해 변경되거나 완전히 대체될 수 있다. 비-표준 또는 변형된 염기는, 예를 들어, 알킬, 아릴, 할로, 옥소, 하이드록실, 알킬옥시 및/또는 티오 치환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 치환 또는 변형; 하나 이상의 융합 또는 개방 고리; 산화; 및/또는 환원을 포함할 수 있다.
대체 뉴클레오티드 염기쌍은 표준 아데닌티민, 아데닌-우라실 또는 구아닌-시토신 염기 페어링 뿐만 아니라 뉴클레오티드 및/또는 비표준 또는 대체 염기를 포함하는 대체 뉴클레오티드 사이에 형성된 염기 페어링을 포함하며, 여기서 수소 결합 공여체의 배열 및 수소 결합 수용체는 비표준 염기와 표준 염기 사이에 또는 두 개의 상보적인 비표준 염기 구조 사이에 수소 결합을 허용한다. 이러한 비표준 염기 페어링의 한 예는 대체 뉴클레오티드 이노신과 아데닌, 시토신 또는 우라실 간의 염기 페어링이다.
일부 구체예들에서, 대체 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 우리딘이다. 일부 구체예들에서, 대체 우리딘은 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)이다. 일부 구체예들에서,
1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)은 다음 구조를 포함한다:
Figure pct00013
.
폴리뉴클레오티드는 (전체 뉴클레오티드 함량과 관련하여, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 유형들, 즉, A, G, U, 또는 C 중 어느 하나 이상과 관련하여) 약 1% 내지 약 100% 또는 그 사이의 임의의 백분율 (예를 들어, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 50%, 1% 내지 60%, 1% 내지 70%, 1% 내지 80%, 1% 내지 90%, 1% 내지 95%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 100%, 20% 내지 25%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 70%, 20% 내지 80%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 50% 내지 60%, 50% 내지 70%, 50% 내지 80%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 70% 내지 80%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100% 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 및 95% 내지 100%)의 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)을 함유할 수 있다. 임의의 잔부 백분율은 표준 뉴클레오티드 (예를 들어, A, G, U 또는 C)의 존재에 의해 기재됨이 이해될 것이다.
일부 구체예들에서, 우리딘은 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 1%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 5%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 10%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 15%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 20%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 25%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 30%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 35%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 40%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 45%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 50%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 55%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 60%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 65%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 70%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 75%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 80%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 85%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 90%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 95%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다. 일부 구체예들에서, 우리딘의 100%는 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 대체되었다.
가장 넓은 의미에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된 올리고뉴클레오티드 사슬에 통합되거나 통합될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다.
일부 구체예들에서, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된 mRNA이다.
일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드는 30개 초과 뉴클레오티드 길이이며, 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드 분자는 35개 초과 뉴클레오티드 길이이며, 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 40개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 45개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 55개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 50개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 60개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 80개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 90개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 100개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 120개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 140개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 160개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 180개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 200개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 250개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 300개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 350개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 400개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 450개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 500개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 600개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 700개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 800개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 900개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 1000개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 1100개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 1200개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 1300개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 1400개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 1500개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 1600개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 1800개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 2000개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 2500개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 3000개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 4000개 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 5000개 뉴클레오티드, 또는 5000개 초과의 뉴클레오티드이고 우리딘이 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로 염기 변형된다.
폴리뉴클레오티드는 최소 0 및 최대 100% 우리딘의 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로의 염기 변형, 또는 임의의 중간 백분율, 예를 들어, 적어도 5% 우리딘의 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로의 염기 변형, 적어도 10% 우리딘의 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로의 염기 변형, 적어도 25% 우리딘의 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로의 염기 변형, 적어도 50% 우리딘의 1-메틸슈도우리딘(1 mΨ)으로의 염기 변형, 적어도 80% 우리딘의 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로의 염기 변형, 또는 적어도 90% 우리딘의 1-메틸슈도우리딘 (1 mΨ)으로의 염기 변형을 포함할 수 있다. 대체 우라실은 단일 고유 구조를 갖는 화합물로 대체될 수 있거나, 상이한 구조(예를 들어, 2, 3, 4 또는 그 이상의 고유 구조)를 갖는 복수의 화합물로 대체될 수 있다. 일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드에서 시토신 중 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%는 대체 시토신 (예를 들어, 5-치환된 시토신)으로 대체된다. 대체 시토신은 단일 고유 구조를 갖는 화합물로 대체될 수 있거나, 상이한 구조(예를 들어, 2, 3, 4 또는 그 이상의 고유 구조)를 갖는 복수의 화합물로 대체될 수 있다.
일부 구체예들에서, 핵염기는 대체 우라실이다. 대체 우라실을 가지는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드에는, 슈도우리딘 (Ψ), 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드, 5-아자-우라실, 6-아자-우라실, 2-티오-5-아자우라실, 2-티오-우라실 (s2U), 4-티오-우라실 (s4U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우라실 (ho5U), 5-아미노알릴-우라실, 5-할로-우라실 (예를 들어, 5-아이오도-우라실 또는 5-브로모-우라실), 3-메틸-우라실 (m3U), 5-메톡시-우라실 (mo5U), 우라실 5-옥시아세틱 애시드 (cmo5U), 우라실 5-옥시아세틱 애시드 메틸 에스터 (mcmo5U), 5-카르복시메틸-우라실 (cm5U), 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-카르복시하이드록시메틸-우라실 (chm5U), 5-카르복시하이드록시메틸-우라실 메틸 에스터 (mchm5U), 5-메톡시카보닐메틸-우라실 (mcm5U), 5-메톡시카보닐메틸-2-티오-우라실 (mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-우라실 (nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-우라실 (mnm5U), 5-메틸아미노메틸-2-티오-우라실 (mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우라실 (mnm5se2U), 5-카바모일메틸-우라실 (ncm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-우라실 (cmnm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실 (cmnm5s2U), 5-프로피닐-우라실, 1-프로피닐-슈도우라실, 5-타우리노메틸-우라실 (τm5U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우라실(τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘, 5-메틸-우라실 (m5U, 즉, 핵염기 디톡시 티민을 가짐), 1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ), 5-메틸-2-티오-우라실 (m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘 (m1s4Ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘 (m3Ψ). 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자슈도우리딘, 다이하이드로우라실 (D), 다이하이드로슈도우리딘, 5,6-다이하이드로우라실, 5-메틸-다이하이드로우라실 (m5D), 2-티오-다이하이드로우라실, 2-티오-다이하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우라실, 2-메톡시-4-티오-우라실, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우라실 (acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘 (acp3Ψ), 5-(아이소펜테닐아미노메틸)우라실 (inm5U), 5-(아이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우라실 (inm5s2U), 5,2'-O-다이메틸-우리딘 (m5Um), 2-티오-2'-O_메틸-우리딘 (s2Um), 5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘 (mcm5Um), 5-카바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘 (ncm5Um), 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘 (cmnm5Um), 3,2'-O-다이메틸-우리딘 (m3Um), 및 5-(아이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘 (inm5Um), 1-티오-우라실, 옥시티미딘, 5-(2-카르보메톡시비닐)-우라실, 5-(카바모일하이드록시메틸)-우라실, 5-카바모일메틸-2-티오-우라실, 5-카르복시메틸-2-티오-우라실, 5-시아노메틸-우라실, 5-메톡시-2-티오-우라실, 및 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)]우라실이 포함된다.
일부 구체예들에서, 핵염기는 대체 시토신이다. 대체 시토신을 가지는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드에는 5-아자-시토신, 6-아자-시토신, 슈도아이소시티딘, 3-메틸-시토신 (m3C), N4-아세틸-시토신 (ac4C), 5-포르밀-시토신 (f5C), N4-메틸-시토신 (m4C), 5-메틸-시토신 (m5C), 5-할로-시토신 (예를 들어, 5-아이오도-시토신), 5-하이드록시메틸-시토신 (hm5C), 1-메틸-슈도아이소시티딘, 피롤로-시토신, 피롤로-슈도아이소시티딘, 2-티오-시토신 (s2C), 2-티오-5-메틸-시토신, 4-티오-슈도아이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도아이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도아이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도아이소시티딘, 제부라린, 5-아자-제부라린, 5-메틸-제부라린, 5-아자-2-티오-제부라린, 2-티오-제부라린, 2-메톡시-시토신, 2-메톡시-5-메틸-시토신, 4-메톡시-슈도아이소시티딘, 4-메톡시-1-메틸-슈도아이소시티딘, 리시딘 (k2C), 5,2'-O-다이메틸-시티딘 (m5Cm), N4-아세틸-2'-O-메틸-시티딘 (ac4Cm), N4,2'-O-다이메틸-시티딘 (m4Cm), 5-포르밀-2'-O-메틸-시티딘 (f5Cm), N4,N4,2'-O-트라이메틸-시티딘 (m42Cm), 1-티오-시토신, 5-하이드록시-시토신, 5-(3-아지도프로필)-시토신, 및 5-(2-아지도에틸)-시토신이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예들에서, 핵염기는 대체 아데닌을 포함한다. 대체 아데닌을 가지는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드에는, 2-아미노-퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 2-아미노-6-할로-퓨린 (예를 들어, 2-아미노-6-클로로-퓨린), 6-할로-퓨린 (예를 들어, 6-클로로-퓨린), 2-아미노-6-메틸-퓨린, 8-아지도-아데닌, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-2,6-다이아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-다이아미노퓨린, 1-메틸-아데닌 (m1A), 2-메틸-아데닌 (m2A), N6-메틸-아데닌 (m6A), 2-메틸티오-N6-메틸-아데닌 (ms2m6A), N6-아이소펜테닐-아데닌 (i6A), 2-메틸티오-N6-아이소펜테닐-아데닌 (ms2i6A), N6-(시스-하이드록시아이소펜테닐)아데닌 (io6A), 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시아이소펜테닐)아데닌 (ms2io6A), N6-글리시닐카바모일-아데닌 (g6A), N6-트레오닐카바모일-아데닌 (t6A), N6-메틸-N6-트레오닐카바모일-아데닌 (m6t6A), 2-메틸티오-N6-트레오닐카바모일-아데닌 (ms2g6A), N6, N6-다이메틸-아데닌 (m62A), N6-하이드록시노르발릴카바모일-아데닌 (hn6A), 2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴카바모일-아데닌 (ms2hn6A), N6-아세틸-아데닌 (ac6A), 7-메틸-아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, N6,2'-O-다이메틸-아데노신 (m6Am), N6,N6,2'-O-트라이메틸-아데노신 (m62Am), 1,2'-O-다이메틸-아데노신 (m1Am), 2-아미노-N6-메틸-퓨린, 1-티오-아데닌, 8-아지도-아데닌, N6-(19-아미노-펜타옥사노나데실)-아데닌, 2,8-다이메틸-아데닌, N6-포르밀-아데닌, 및 N6-하이드록시메틸-아데닌이 포함된다.
일부 구체예들에서, 핵염기는 대체 구아닌을 포함한다. 대체 구아닌을 가지는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드에는, 이노신 (I), 1-메틸-이노신 (m1l), 와이오신 (imG), 메틸와이오신 (mimG), 4-디메틸-와이오신 (imG-14), 아이소와이오신 (imG2), 와이부토신 (yW), 퍼옥시와이부토신 (o2yW), 하이드록시와이부토신 (OHyW), 변형중인 하이드록시와이부토신 (OHyW*), 7-데아자-구아닌, 쿠에오신 (Q), 에폭시쿠에오신 (oQ), 갈락토실-쿠에오신 (galQ), 만노실-쿠에오신 (manQ), 7-시아노-7-데아자-구아닌 (preQ0), 7-아미노메틸-7-데아자-구아닌 (preQ1), 아캐오신 (G+), 7-데아자-8-아자-구아닌, 6-티오-구아닌, 6-티오-7-데아자-구아닌, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아닌, 7-메틸-구아닌 (m7G), 6-티오-7-메틸-구아닌, 7-메틸-이노신, 6-메톡시-구아닌, 1 -메틸-구아닌 (m1G), N2-메틸-구아닌 (m2G), N2,N2-다이메틸-구아닌 (m22G), N2,7-다이메틸-구아닌 (m2,7G), N2, N2,7-다이메틸-구아닌 (m2,2,7G), 8-옥소-구아닌, 7-메틸-8-옥소-구아닌, 1-메틸-6-티오-구아닌, N2-메틸-6-티오-구아닌, N2,N2-다이메틸-6-티오-구아닌, N2-메틸-2'-O-메틸-구아닌구아노신 (m2Gm), N2,N2-다이메틸-2'-O-메틸-구아노신 (m22Gm), 1-메틸-2'-O-메틸-구아노신 (m1Gm), N2,7-다이메틸-2'-O-메틸-구아노신 (m2,7Gm), 2'-O-메틸-이노신 (Im), 1,2'-O-다이메틸-이노신 (m1Im), 1 -티오-구아닌, 및 O-6-메틸-구아닌이 포함된다.
뉴클레오티드의 대체 핵염기는 독립적으로 퓨린, 피리미딘, 퓨린 또는 피리미딘 유사체일 수 있다. 예를 들어, 핵염기는 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실, 또는 하이포잔틴에 대한 대안이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 핵염기는 또한 예를 들어, 피라졸로[3,4-d]피리미딘, 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데?“? 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로 (예를 들어, 8-브로모), 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록시 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히, 5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 데아자구아닌, 7-데아자구아닌, 3-데아자구아닌, 데아자아데닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자아데닌, 피라졸로[3,4-d]피리미딘, 이미다조[1,5-a] 1,3,5 트라이아진온스, 9-데아자퓨린, 이미다조[4,5-d]피라진, 티아졸로[4,5-d]피리미딘, 피라진-2-온스, 1,2,4-트라이아진, 피리다진; 또는 1,3,5 트라이아진을 포함하는, 염기의 자연-발생 및 합성 유도체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드가 약칭 A, G, C, T 또는 U를 사용하여 묘사될 때, 각 문자는 대표적인 염기 및/또는 이의 유도체를 나타내며, 예를 들어 A는 아데닌 또는 아데닌 유사체, 예를 들어 7-데아자 아데닌을 포함한다.
당에 대한 변형
뉴클레오시드는 핵염기와 조합된 당 분자 (예를 들어, 펜토스, 리보스, 아라비노스, 자일로스, 글루코스, 갈락토스, 또는 이들의 데옥시 유도체와 같은 5-탄소 또는 6-탄소 당)를 포함하는 반면, 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 및 포스페이트 그룹 또는 대안 그룹 (예를 들어, 보라노포스페이트, 티오포스페이트, 셀레노포스페이트, 포스포네이트, 알킬 그룹, 아미데이트 및 글리세롤)을 함유하는 뉴클레오시드이다. 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 표준 화학종, 예를 들어, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 표준 핵염기, 당, 그리고 뉴클레오티드의 경우, 포스페이트 그룹을 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 일 수 있으며, 또는 하나 이상의 대체 성분들을 포함하는 대체 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 일 수 있다. 예를 들어, 대체 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 당에서 변경될 수 있다. 일부 구체예들에서, 대체 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 다음 구조를 포함한다:
Figure pct00014
화학식 IV, V, VI 및 VII 각각에서,m 및 n 각각은 독립적으로 0 내지 5의 정수이고, U 및 U’ 각각은 독립적으로 O, S, N(Ru)nu, 또는 C(Ru)nu이고, 이때 nu는 0 내지 2의 정수이고 각 Ru는 독립적으로 H, 할로, 또는 선택적으로 치환된 알킬이고;
R1', R2', R1", R2", R1, R2, R3, R4, 및 R5 각각은, 독립적으로, 존재하는 경우, H, 할로, 하이드록시, 티올, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 아미노알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 선택적으로 치환된 하이드록시 알콕시, 선택적으로 치환된 아미노,아지도, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 아미노알케닐, 선택적으로 치환된 아미노알키닐이거나, 또는 존재하지 않으며; 이때 R1', R1", R2', R2", 또는 R5 중 하나 이상과 R3의 조합 (예를 들어, R1'과 R3의 조합, R1''과 R3의 조합, R2'과 R3의 조합, R2'과 R3의 조합, 또는 R5와 R3의 조합)은 함께 결합되어, 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌을 형성할 수 있으며, 이들이 부착되는 탄소와 함께, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴 (예를 들어, 바이사이클릭, 트라이사이클릭, 또는 테트라사이클릭 헤테로사이클릴)을 제공할 수 있으며; 이때 R1', R1'', R2', 또는 R2'' 중 하나 이상과 R5의 조합(예를 들어, R1'과 R5의 조합, R1''과 R5의 조합, R2'와 R5의 조합, 또는 R2''와 R5의 조합)은 함께 결합하여 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌을 형성하고, 이들이 부착되는 탄소와 함께, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴 (예를 들어, 바이사이클릭, 트라이사이클릭, 또는 테트라사이클릭 헤테로사이클릴)을 제공할 수 있으며; 그리고 이때 R1', R1'', R2', R2'', R3, 또는 R5 중 하나 이상과 R4의 조합은 can 함께 결합하여 선택적으로 치환된 알킬렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌을 형성할 수 있고, 이들이 부착되는 탄소와 함께 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴 (예를 들어, 바이사이클릭, 트라이사이클릭, 또는 테트라사이클릭 헤테로사이클릴)을 제공할 수 있으며; 각 m' 및 m''은 독립적으로, 0 내지 3 (예를 들어, 0 내지 2, 0 내지 1, 1 내지 3, 또는 1 내지 2)의 정수이고;
Y1, Y2, 및 Y3 각각은 독립적으로, O, S, Se, ―NRN1―, 선택적으로 치환된 알킬렌, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이고, 이때 RN1은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴이거나, 존재하지 않으며;
각 Y4 는 독립적으로, H, 하이드록시, 티올, 보라닐, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알케닐옥시, 선택적으로 치환된 알키닐옥시, 선택적으로 치환된 티오알콕시, 선택적으로 치환된 알콕시알콕시, 또는 선택적으로 치환된 아미노이고;
각 Y5는, 독립적으로, O, S, Se, 선택적으로 치환된 알킬렌 (예를 들어, 메틸렌), 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이고; 그리고
B는 변형된 또는 변형되지 않은 핵염기이다. 일부 구체예들에서, 2'-하이드록시 그룹 (OH)은 다수의 상이한 치환기로 변형되거나 대체될 수 있다. 2'-위치에서의 예시적 치환에는, H,아지도, 할로 (예를 들어, 플루오로), 선택적으로 치환된 C1-6 알킬 (예를 들어, 메틸); 선택적으로 치환된 C1-6 알콕시 (예를 들어, 메톡시 또는 에톡시); 선택적으로 치환된 C6-10 아릴옥시; 선택적으로 치환된 C3-8 사이클로알킬; 선택적으로 치환된 C6-10 아릴-C1-6 알콕시, 선택적으로 치환된 C1-12 (헤테로사이클릴)옥시; 당 (예를 들어, 리보스, 펜토스, 또는 본원에 기재된 것들); 폴리에틸렌글리콜 (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR (이때 R은 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이고, n은 0 내지 20 (예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)의 정수이고); 2'-하이드록시가 C1-6알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브릿지에 의해 동일한 리보스 당의 4'-탄소에 연결되는 “잠금” 핵산 (LNA) (이때 예시적인 브릿지에는 메틸렌, 프로필렌, 에터, 또는 아미노 브릿지가 포함되고); 본원에 정의된 아미노알킬; 본원에 정의된 아미노알콕시; 본원에 정의된 아미노; 및 본원에 정의된 아미노산이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
일반적으로 RNA는 산소를 갖는 5원 고리인 당 그룹 리보스를 포함한다. 예시적인 비-제한적 대체 뉴클레오티드는 리보스의 산소의 대체 (예를 들어, S, Se, 또는 알킬렌, 가령, 메틸렌 또는 에틸렌으로); 이중 결합의 추가(예를 들어, 리보스를 사이클로펜테닐 또는 사이클로헥세닐로 대체하기 위해); 리보스의 고리 수축(예를 들어, 사이클로부탄 또는 옥세탄의 4원 고리를 형성하기 위해); 리보스의 고리 확장(예를 들어, 안히드로헥시톨, 알트리톨, 만니톨, 사이클로헥사닐, 사이클로헥세닐 및 모르폴리노(또한 포스포라미데이트 백본을 가짐)에 대해 추가 탄소 또는 헤테로원자를 갖는 6-또는 7-원 고리를 형성하기 위해); 다중고리 형태(예를 들어, 트리사이클로 및 "잠금 해제된" 형태, 예를 들어 글리콜 핵산(GNA)(예를 들어, R-GNA 또는 S-GNA, 여기서 리보스는 포스포다이에스터 결합에 부착된 글리콜 단위로 대체됨), 트레오스 핵산(TNA, 여기서 리보스는 α-트레오푸라노실-(3'->2')로 대체됨) 및 펩티드 핵산(PNA, 여기서 2-아미노-에틸-글리신 연결은 리보스와 포스포다이에스터 백본을 대체함)을 포함한다.
일부 구체예들에서, 당 그룹은 리보스에 있는 해당 탄소의 반대 입체화학적 배열을 갖는 하나 이상의 탄소를 포함합니다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 분자는 당으로서, 예를 들어 아라비노스 또는 L-리보스를 함유하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드는 당이 L-리보스, 2'-O-메틸-리보스, 2'-플루오로-리보스, 아라비노스, 헥시톨, LNA 또는 PNA인 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함한다. 뉴클레오시드간 링키지의 변형
대체 뉴클레오티드는 뉴클레오시드간 연결 (예를 들어, 포스페이트 백본)에서 변경될 수 있다. 본원에서, 폴리뉴클레오티드 백본과 관련하여, "포스페이트" 및 "포스포다이에스터"라는 문구는 상호교환적으로 사용된다. 백본 포스페이트 그룹은 하나 이상의 산소 원자를 다른 치환기로 대체하여 변경될 수 있다.
대체 뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 또 다른 뉴클레오시드간 연결로 변경되지 않은 포스페이트 모이어티의 전면적인 대체를 포함할 수 있다. 대안적인 포스페이트그룹의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노포스페이트, 보라노포스페이트 에스터, 수소 포스포네이트, 포스포라미데이트, 포스포로다이아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트, 및 포스포트라이에스터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 포스포로다이티오에이트는 비-연결 산소들 모두가 황으로 대체되어 있다. 포스페이트 링커는 또한 연결 산소를 질소 (가교된 포스포라미데이트), 황 (가교된 포스포로티오에이트) 및 탄소 (가교된 메틸렌-포스포네이트)로 대체함으로써 변경될 수 있다.
대안적인 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 하나 이상의 비-가교 산소의 보란 모이어티 (BH3), 황 (티오), 메틸, 에틸 및/또는 메톡시로의 대체를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 동일한 위치(예를 들어, 알파(α), 베타(β) 또는 감마(γ) 위치)에 있는 2개의 비-가교 산소는 황(티오) 및 메톡시로 대체될 수 있다.
포스페이트 모이어티 (예를 들어, α-티오 포스페이트)의 위치에서 하나 이상의 산소 원자의 대체는 비자연 포스포로티오에이트 백본 연결을 통해 RNA 및 DNA에 (예를 들어, 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 대한) 안정성을 부여하기 위해 제공된다. 포스포로티오에이트 DNA와 RNA는 뉴클레아제 내성을 증가시켰고, 결과적으로 세포 환경에서 더 긴 반감기를 갖게 되었다.
인 원자를 함유하지 않는 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 뉴클레오시드간 연결이 본원에 기재되어 있다.
내부 리보솜 진입 부위
폴리뉴클레오티드는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함할 수 있다. IRES는 mRNA의 유일한 리보솜 결합 부위로 작용하거나 여러 리보솜 결합 부위 중 하나로 작용할 수 있다. 하나 이상의 기능적 리보솜 결합 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 리보솜에 의해 독립적으로 번역되는 여러 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 멀티시스트론 mRNA)를 인코딩할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 IRES가 제공되는 경우, 선택적으로 제2 번역가능한 영역이 추가로 제공된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 IRES 서열의 예는 비제한적으로 피코마바이러스(예를 들어, FMDV), 해충 바이러스(CFFV), 소아마비 바이러스(PV), 뇌근육염 바이러스(ECMV), 구제역 바이러스(FMDV), C형 간염 바이러스(HCV), 고전 돼지 열병 바이러스(CSFV), 쥐과 백혈병 바이러스(MLV), 원숭이 면역 결핍 바이러스(SIV) 또는 귀뚜라미 마비 바이러스(CrPV)의 것들을 포함한다.
5’-캡 구조
폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)는 5'-캡 구조를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 5'-캡 구조는 핵 수송 및 폴리뉴클레오티드 안정성 증가에 관여하며 mRNA 캡 결합 단백질 (CBP)에 결합하는데, CBP는 세포내 폴리뉴클레오티드 안정성 및 캡 결합 단백질 (CBP)과 폴리-A 결합 단백질의 결합을 통해 성숙 고리형 mRNA 화학종들을 형성하는 번역 능력을 담당한다. 캡은 mRNA 스플라이싱 동안 5'-근위 인트론 제거의 제거를 추가로 보조한다.
내인성 폴리뉴클레오티드 분자들은 5'-말단 캡핑되어, 말단 구아노신 캡 잔기와 폴리뉴클레오티드의 5'-말단 전사된 센스 뉴클레오티드 사이에 5'-ppp-5'-트라이포스페이트 연결을 생성할 수 있다. 그런 다음 이 5'-구아닐레이트 캡을 메틸화하여 N7-메틸-구아닐레이트 잔기를 생성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 말단 및/또는 전말단 (anteterminal) 전사된 뉴클레오티드의 리보스 당은 또한 임의로 2'-O-메틸화될 수 있다. 구아닐레이트 캡 구조의 가수분해 및 절단을 통한 5'-디캡핑은 분해를 위해 mRNA 분자와 같은 폴리뉴클레오티드 분자를 표적할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 변경은 비가수분해성 캡 구조를 생성할 수 있으며, 이는 디캡핑을 방지하여 폴리뉴클레오티드 반감기를 증가시킨다. 캡 구조 가수분해는 5'-ppp-5' 포스포로다이에스터 결합의 절단을 필요로 하기 때문에 캡핑 반응 동안 대체 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 예를 들어, New England Biolabs(Ipswich, MA)의 백시니아 캡핑 효소는 제조업체의 지침에 따라 α-티오-구아노신 뉴클레오티드와 함께 사용되어, 5'-ppp-5' 캡에서 포스포로티오에이트 연결을 생성할 수 있다. α-메틸-포스포네이트 및 셀레노-포스페이트 뉴클레오티드와 같은 추가적인 대안적인 구아노신 뉴클레오티드가 사용될 수 있다.
추가적인 변경에는, 리보스 당의 2'-하이드록시 그룹에서 (상기 언급한) 폴리뉴클레오티드의 5'-말단 및/또는 5'-전말단 뉴클레오티드들의 리보스 당의 2'-O-메틸화가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 다수의 별개 5'-캡 구조를 사용하여 mRNA 분자와 같은 폴리뉴클레오티드의 5'-캡을 생성할 수 있다.
5'-캡 구조는 국제 특허출원 공개공보 제 WO2008127688, WO 2008016473, 및 WO 2011015347에 기재된 것들을 포함하며, 이들 각각의 캡 구조는 참조로서 본원에 포함된다.
본원에서 캡 유사체는 합성 캡 유사체, 화학적 캡, 화학적 캡 유사체 또는 구조적 또는 기능적 캡 유사체로도 지칭되며 화학적 구조면에서 자연 (즉, 내인성, 야생형 또는 생리학적) 5'-캡과 상이하지만, 캡 기능을 유지한다. 캡 유사체는 화학적으로 (즉, 비효소적으로) 또는 효소적으로 합성되고 및/또는 폴리뉴클레오티드에 연결될 수 있다.
예를 들어, 항 역전사 캡 유사체 (ARCA) 캡은 5'-5'-트라이포스페이트 그룹으로 연결된 두 개의 구아노신을 포함하며, 여기서 하나의 구아노신은 N7-메틸 그룹과 3'-O-메틸 그룹을 포함한다 (즉, N7,3 '-O-디메틸-구아노신-5'-트라이포스페이트-5'-구아노신, m7G-3'mppp-G, 이는 동등하게 3' O-Me-m7G(5')ppp(5')G로 표시될 수 있음). 변경되지 않은 다른 구아노신의 3'-O 원자는 캡핑된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 5'-말단 뉴클레오티드에 연결된다. N7-및 3'-O-메틸화 구아노신은 캡핑된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 말단 모이어티를 제공한다.
또 다른 예시적인 캡은 mCAP이며, 이는 ARCA와 유사하지만 구아노신에 2'-O-메틸 그룹을 가진다 (즉, N7,2'-O-다이메틸-구아노신-5'-트라이포스페이트-5'-구아노신, m7Gm-ppp-G).
캡은 다이뉴클레오티드 캡 유사체일 수 있으며, 비제한적인 예로는 그 캡 구조가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제 8,519,110호에 기재된 것들이 포함된다.
대안적으로, 캡 유사체는 당업계에 공지되어 있고 및/또는 본원에 기재된 N7-(4-클로로페녹시에틸) 치환된 다이뉴클레오티드 캡 유사체일 수 있다. N7-(4-클로로페녹시에틸) 치환된 디뉴클레오티드 캡 유사체의 비제한적 예는 N7-(4-클로로페녹시에틸)-G(5')ppp(5')G 및 N7-(4-클로로페녹시에틸)-m3'-OG(5') ppp(5')G 캡 유사체를 포함한다 (예를 들어, Kore 등. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574에 기재된 다양한 캡 유사체 및 캡 유사체 합성 방법 참조; 이의 캡 구조는 본원에 참조로 포함됨). 일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 유용한 캡 유사체는 4-클로로/브로모페녹시 에틸 유사체이다.
캡 유사체는 시험관내 전사 반응에서 폴리뉴클레오티드의 동시 캡핑을 허용하지만 전사체의 최대 20%는 캡핑되지 않은 상태로 남아 있다. 이는 내인성 세포 전사 기작에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드의 내인성 5'-캡 구조와 캡 유사체의 구조적 차이, 뿐만 아니라, 번역 능력 감소 및 세포 안정성 감소를 가져올 수 있다.
대체 폴리뉴클레오티드는 또한 더 확실한 5'-캡 구조를 생성하기 위해 효소를 사용하여 전사 후 캡핑될 수 있다. 본원에 사용되는 "더 확실한"이라는 문구는 내인성 또는 야생형 특징을 구조적으로 또는 기능적으로 근사하게 미러링하거나 모방하는 특징을 지칭한다. 즉, "더 확실한" 특징은 선행 기술의 합성 특징 또는 유사체와 비교하여 내인성, 야생형, 자연적 또는 생리학적 세포 기능 및/또는 구조를 더 우수하게 나타내거나 이것이 하나 이상의 양상들에서 상응하는 내인성, 야생형, 자연적 또는 생리학적 특징을 능가한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 유용한 보다 확실한 5'-캡 구조의 비제한적 예는, 특히, 당업계에 공지된 합성 5'-캡 구조(또는 야생형, 자연 또는 생리학적 5'-캡 구조)와 비교하여, 캡 결합 단백질의 향상된 결합, 증가된 반감기, 5'-엔도뉴클레아제에 대한 감소된 감수성 및 /또는 감소된 5'-디캡핑을 가진다. 예를 들어, 재조합 백시니아 바이러스 캡핑 효소 및 재조합 2'-O-메틸트랜스퍼라제 효소는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단 뉴클레오티드와 구아노신 캡 뉴클레오티드 사이에 표준 5'-5'-트라이포스페이트 연결을 생성할 수 있으며, 여기서 캡 구아노신은 N7-메틸화를 포함하고 폴리뉴클레오티드의 5'-말단 뉴클레오티드는 2'-O-메틸을 포함한다. 이러한 구조를 Cap1 구조라 한다. 이 캡은 예를 들어 당업계에 공지된 다른 5' 캡 유사체 구조와 비교하여 더 높은 번역 능력, 세포 안정성 및 세포 전염증성 사이토카인의 감소된 활성화를 가져온다. 다른 예시적인 캡 구조는 7mG(5')ppp(5')N, pN2p (캡 0), 7mG(5')ppp(5')N1mpNp (캡 1), 7mG(5')-ppp(5')N1mpN2mp (캡 2), 및 m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up (캡 4)를 포함한다.
대체 폴리뉴클레오티드가 전사 후 캡핑될 수 있고 이 과정이 더 효율적이기 때문에 대체 폴리뉴클레오티드의 거의 100%가 캡핑될 수 있다. 이는 시험관내 전사 반응 과정에서 캡 유사체가 폴리뉴클레오티드에 연결되는 경우의 -80%와 대조적이다.
5'-말단 캡은 내인성 캡 또는 캡 유사체를 포함할 수 있다. 5'-말단 캡은 구아노신 유사체를 포함할 수 있다. 유용한 구아노신 유사체는 이노신, N1-메틸구아노신, 2'-플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신, 및 2-아지도-구아노신을 포함한다.
일부 구체예들에서 폴리뉴클레오티드가 변형된 5'-캡을 포함한다. 5'-캡의 변형은 폴리뉴클레오티드의 안정성을 증가시킬수 있고 폴리뉴클레오티드의 반감기를 증가시킬 수 있으며 폴리뉴클레오티드 번역 효율을 증가시킬 수 있다. 변형된 5'-캡은 다음 변형 중 하나 이상을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않습니다: 캡핑된 구아노신 삼인산(GTP)의 2' 및/또는 3' 위치에서의 변형, (카보사이클릭 고리를 생성했던) 당 고리 산소의 메틸렌 모이어티 (CH2)로의 대체, 캡 구조의 트라이포스페이트 가교 모이어티에서의 변형, 또는 핵염기 (G) 모이어티에서의 변형.
5’-UTR
5’-UTR은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)에 연접 영역으로 제공될 수 있다. 5’-UTR은 폴리뉴클레오티드에서 발견되는 코딩 영역에 대해 상동성 또는 이종성일 수 있다. 다수의 5'-UTR이 연접 영역에 포함될 수 있고 동일하거나 상이한 서열일 수 있다. 아무 것도 포함하지 않는 연접 영역의 임의의 부분은 코돈 최적화될 수 있고, 코돈 최적화 전 및/또는 후에 독립적으로 하나 이상의 상이한 구조적 또는 화학적 변경을 포함할 수 있다.
본원에 참조로 포함되는 미국 가출원 제61/775,509호의 표 21 및 미국 가출원 제61/829,372호의 표 21 및 표 22에는 대체 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 시작 및 정지 부위 목록이 제시되어 있다. 표 21에서 각각의 5'-UTR (5'-UTR-005 내지 5'-UTR 68511)은 그 고유의 또는 야생형(상동) 전사체에 대한 시작 및 정지 부위별로 식별되어 있다 (ENST; ENSEMBL에서 사용된 식별자 데이터베이스).
폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 하나 이상의 특성을 변경하기 위해 대체 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 코딩 영역에 이종성인 5'-UTR이 조작될 수 있다. 이어서, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)는 세포, 조직 또는 유기체에 투여될 수 있고, 단백질 수준, 국소화 및/또는 반감기와 같은 결과를 측정하여 이종 5'-UTR가 대체 폴리뉴클레오티드 (mRNA)에 대해 가질 수 있는 유익한 효과를 평가할 수 있다. A, T, C 또는 G를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드가 말단에 추가되거나 제거된 5'-UTR의 변이체가 사용될 수 있다. 5'-UTR은 또한 코돈-최적화되거나 본원에 기재된 임의의 방식으로 변경될 수 있다.
5'-UTR, 3 '-UTR, 및 번역 인핸서 구성요소 (TEE)
폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 5'-UTR은 적어도 하나의 번역 인핸서 구성요소를 포함할 수 있다. 용어 "번역 인핸서 구성요소"는 폴리뉴클레오티드로부터 생성된 폴리펩티드 또는 단백질의 양을 증가시키는 서열을 지칭한다. 비제한적인 예로서, TEE는 전사 프로모터와 시작 코돈 사이에 위치할 수 있다. 5'-UTR에 적어도 하나의 TEE를 갖는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)는 5'-UTR에 캡을 포함할 수 있다. 추가로, 적어도 하나의 TEE는 캡-의존성 또는 캡-비의존성 번역을 거치는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 5'-UTR에 위치할 수 있다.
한 양상에서, TEE는 캡-의존성 또는 캡-비의존성 번역과 같은 (그러나 이에 한정되지 않음) 폴리뉴클레오티드의 번역 활성을 촉진할 수 있는 UTR의 보존된 구성요소이다. 이들 서열들의 보존은 인간을 비롯한 14종에 걸쳐 Panek 등. (핵산s Research, 2013, 1-10)에 의해 이전에 제시된 바 있다.
하나의 비제한적인 예에서, 공지의 TEE는 Gtx 호메오도메인 단백질의 5'-리더에 존재할 수 있다 (Chappell 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004, 이의 TEE는 참조로 본원에 포함됨).
또 다른 비-제한적인 예에서, TEE는 미국 특허 공개공보 제 2009/0226470 및 2013/0177581, 국제 특허출원 공개공보 제 W02009/075886, WO2012/009644, 및 WO1999/024595, 및 미국 특허 제 6,310,197, 및 6,849,405에 개시되어 있으며, 이들 문헌 각각의 TEE 서열들은 본원에 참조로 포함된다.
또한 또 다른 비-제한적 예에서, TEE는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), HCV-IRES 또는 IRES 구성요소, 가령, 미국 특허 제 7,468,275, 미국 특허 공개공보 제 2007/0048776 및 2011/0124100 및 국제 특허출원 공개공보 제 W02007/025008 및 W02001/055369에 기재된 것들 일 수 있으며 (그러나 이에 제한되는 것은 아님), 이들 문헌 각각의 IRES 서열들은 본원에 참조로 포함된다. IRES 요소는 Chappell 등. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004) 및 Zhou 등. (PNAS 102:6273-6278, 2005) 그리고 미국 특허 공개공보 제 2007/0048776 및 2011/0124100 및 국제 특허출원 공개공보 제 W02007/025008에 기재된 Gtx 서열들 (예를 들어, Gtx9-nt, Gtx8-nt, Gtx7-nt)을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이들 문헌 각각의 IRES 서열들은 본원에 참조로 포함된다.
"번역 인핸서 폴리뉴클레오티드"는 본원에 예시되고 및/또는 당업계에 개시된 특정 TEE 중 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (see 예를 들어, 미국 특허 제 6,310,197, 6,849,405, 7,456,273, 7,183,395, 미국 특허 공개공보 제 20090/226470, 2007/0048776, 2011/0124100, 2009/0093049, 2013/0177581, 국제 특허출원 공개공보 제 W02009/075886, W02007/025008, WO1999/024595, 및 유럽 특허 제 2610341 및 2610340 참조; 이들 문헌 각각의 TEE 서열들은 본원에 참조로 포함됨) 또는 이들의 변이체, 상동체 또는 기능적 유도체이다. 특정 TEE의 하나 이상의 사본이 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)에 존재할 수 있다. 번역 인핸서 폴리뉴클레오티드의 TEE는 하나 이상의 서열 세그먼트로 구성될 수 있다. 서열 세그먼트는 본원에 예시된 특정 TEE 중 하나 이상을 보유할 수 있으며, 각 TEE는 하나 이상의 사본으로 존재한다. 번역 인핸서 폴리뉴클레오티드에 다수의 서열 세그먼트가 존재하는 경우 이들은 동종 또는 이종일 수 있다. 따라서, 번역 인핸서 폴리뉴클레오티드의 다수의 서열 세그먼트는 본원에 예시된 특정 TEE들의 동일하거나 상이한 유형, 각각의 특정 TEE의 동일하거나 상이한 수의 사본, 및/또는 각 서열 세그먼트 내 TEE들의 동일하거나 상이한 구성을 보유할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)는 국제 특허출원 공개공보 제 WO 1999/024595, WO2012/009644, W02009/075886, W02007/025008, WO 1999/024595, 유럽 특허 공개공보 제 2610341 및 2610340, 미국 특허 제 6,310,197, 6,849,405, 7,456,273, 7,183,395, 및 미국 특허 공개공보 제 2009/0226470, 2011/0124100, 2007/0048776, 2009/0093049, 및 2013/0177581에 기재된 적어도 하나의 TEE를 포함할 수 있으며, 이들 문헌 각각의 TEE 서열들은 본원에 참조로 포함된다. TEE는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 5'-UTR에 위치할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)는 미국 특허 공개공보 제 2009/0226470, 2007/0048776, 2013/0177581 및 2011/0124100, 국제 특허출원 공개공보 제 WO 1999/024595, WO2012/009644, W02009/075886 및 W02007/025008, 유럽 특허 공개공보 제 2610341 및 2610340, 미국 특허 제 6,310,197, 6,849,405, 7,456,273, 7,183,395에 기재된 TEE들과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 가지는 적어도 하나의 TEE를 포함할 수 있으며, 이들 문헌 각각의 TEE 서열들은 본원에 참조로 포함된다.
폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 5'-UTR은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55개 또는 60개 이상의 TEE 서열들을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 5'-UTR에서 TEE 서열들은 동일하거나 상이한 TEE 서열일 수 있다. TEE 서열은 ABABAB, AABBAABBAABB 또는 ABCABCABC 또는 이의 변이체와 같은 패턴으로 존재할 수 있으며 1회, 2회 또는 3회 이상 반복될 수 있다. 이러한 패턴에서 각 문자 A, B 또는 C는 뉴클레오티드 수준에서 서로 다른 TEE 서열을 나타낸다.
일부 구체예들에서, 5'-UTR은 2개의 TEE 서열들을 분리하는 스페이서를 포함할 수 있다. 비 제한적인 예로서, 스페이서는 15개 뉴클레오티드 스페이서 및/또는 당업계에 공지된 다른 스페이서일 수 있다. 또 다른 비-제한적 예로서, 5'-UTR은 5'-UTR에서 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 또는 9회 이상 반복되는 TEE 서열-스페이서 모듈을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 2개의 TEE 서열을 분리하는 스페이서는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 번역을 조절할 수 있는 당업계에 공지된 다른 서열, 가령, miR 서열 (예를 들어, miR 결합 부위 및 miR 씨드) (그러나 이에 제한되지 않음)을 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 2개의 TEE 서열을 분리하기 위해 사용되는 각각의 스페이서는 상이한 miR 서열 또는 miR 서열의 성분(예를 들어, miR 씨드 서열)을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 5'-UTR의 TEE는 미국 특허 공개공보 제 2009/0226470, 2007/0048776, 2013/0177581 및 2011/0124100, 국제 특허출원 공개공보 제 WO 1999/024595, WO2012/009644, W02009/075886 및 W02007/025008, 유럽 특허 공개공보 제 2610341 및 2610340, 및 미국 특허 제 6,310,197, 6,849,405, 7,456,273, 및 7,183,395에 기재된 TEE 서열들의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 99% 이상을 포함할 수 있으며, 이들 문헌 각각의 TEE 서열들은 본원에 참조로 포함된다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 5'-UTR의 TEE는 미국 특허 공개공보 제 2009/0226470, 2007/0048776, 2013/0177581 및 2011/0124100, 국제 특허출원 공개공보 제 WO 1999/024595, WO2012/009644, W02009/075886 및 W02007/025008, 유럽 특허 공개공보 제 2610341 및 2610340, 및 미국 특허 제 6,310,197, 6,849,405, 7,456,273, 및 7,183,395에 개시된 TEE 서열들의 5-30 뉴클레오티드 단편, 5-25 뉴클레오티드 단편, 5-20 뉴클레오티드 단편, 5-15 뉴클레오티드 단편, 5-10 뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있으며; 이들 문헌 각각의 TEE 서열들은 본원에 참조로 포함된다.
특정 예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 5'-UTR의 TEE는 Chappell 등. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004) 및 Zhou 등. (PNAS 102:6273-6278, 2005)에, Wellensiek 등 (Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements, Nature Methods, 2013; DOI: 10.1038/NMETH.2522)에 개시된 보충 표 1 및 보충 표 2에 개시된 TEE 서열들의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 99% 이상을 포함할 수 있으며; 이들 문헌 각각의 TEE 서열들은 본원에 참조로 포함된다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 5'-UTR의 TEE는 Chappell 등. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004) 및 Zhou 등. (PNAS 102:6273-6278, 2005)에, Wellensiek 등 (Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements, Nature Methods, 2013; DOI: 10.1038/NMETH.2522)에 개시된 보충 표 1 및 보충 표 2에 개시된 TEE 서열들의 5-30 뉴클레오티드 단편, 5-25 뉴클레오티드 단편, 5-20 뉴클레오티드 단편, 5-15 뉴클레오티드 단편, 5-10 뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있으며; 이들 문헌 각각의 TEE 서열들은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 5'-UTR에 사용된 TEE는 IRES 서열, 가령, 미국 특허 제 7,468,275 및 국제 특허출원 공개공보 제 W02001/055369에 기재된 것들이나 이에 제한되는 것은 아니며, 이들 문헌 각각의 TEE 서열들은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 5'-UTR에 사용된 TEE는 미국 특허 공개공보 제 2007/0048776 및 2011/0124100 및 국제 특허출원 공개공보 제 W02007/025008 및 WO2012/009644에 기재된 방법들에 의해 확인될 수 있으며, 이들 문헌 각각의 방법들은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 5'-UTR에 사용된 TEE는 미국 특허 제 7,456,273 및 7,183,395, 미국 특허 공개공보 제 2009/0093049, 및 국제 특허출원 공개공보 제 W02001/055371에 기재된 전사 조절 요소일 수 있으며, 이들 문헌의 TEE 서열들은 본원에 참조로 포함된다. 전사 조절 요소들은 해당 분야에 공지된 방법들, 가령, 미국 특허 제 7,456,273 및 7,183,395, 미국 특허 공개공보 제 2009/0093049, 및 국제 특허출원 공개공보 제 W02001/055371에 기재된 방법들 (그러나 이에 제한되는 것은 아님)에 의해 확인될 수 있으며, 이들 문헌 각각의 방법들은 본원에 참조로 포함된다.
또한 일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 5'-UTR에 사용된 TEE는 미국 특허 제 7,456,273 및 7,183,395, 미국 특허 공개공보 제 2009/0093049, 및 국제 특허출원 공개공보 제 W02001/055371에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 일부이며, 이들 문헌 각각의 TEE 서열들은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 적어도 하나의 TEE를 포함하는 5'-UTR은 모노시스트론 서열, 예를 들어 벡터 시스템 또는 폴리뉴클레오티드 벡터 (그러나 이에 제한되는 것은 아님)에 포함될 수 있다. 비-제한적 예로서, 벡터 시스템 및 폴리뉴클레오티드 벡터들은 미국 특허 제 7,456,273 및 7,183,395, 미국 특허 공개공보 제 2007/0048776, 2009/0093049 및 2011/0124100, 및 국제 특허출원 공개공보 제 W02007/025008 및 W02001/055371에 기재된 것들을 포함할 수 있으며, 이들 문헌 각각의 TEE 서열들은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 TEE는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 5'-UTR 및/또는 3'-UTR에 위치할 수 있다. 3'-UTR에 위치한 TEE는 5'-UTR에 위치한 및/또는 이에 포함되는 것으로 기재된 TEE들과 동일 및/또는 상이할 수 있다.
일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 3'-UTR은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55개 또는 60개 이상의 TEE 서열들을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 3'-UTR 내의 TEE 서열들은 동일하거나 상이한 TEE 서열일 수 있다. TEE 서열은 ABABAB, AABBAABBAABB 또는 ABCABCABC 또는 이의 변이체와 같은 패턴으로 존재할 수 있으며 1회, 2회 또는 3회 이상 반복될 수 있다. 이러한 패턴에서 각 문자 A, B 또는 C는 뉴클레오티드 수준에서 서로 다른 TEE 서열을 나타낸다.
한 예에서, 3'-UTR은 2개의 TEE 서열들을 분리하는 스페이서를 포함할 수 있다. 비 제한적인 예로서, 스페이서는 15개 뉴클레오티드 스페이서 및/또는 당업계에 공지된 다른 스페이서일 수 있다. 또 다른 비-제한적 예로서, 3'-UTR은 3'-UTR에서 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 또는 9회 이상 반복되는 TEE 서열-스페이서 모듈을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 2개의 TEE 서열을 분리하는 스페이서는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 번역을 조절할 수 있는 당업계에 공지된 다른 서열, 가령, 본원에 기재된 miR 서열 (예를 들어, miR 결합 부위 및 miR 씨드) (그러나 이에 제한되지 않음)을 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 2개의 TEE 서열을 분리하기 위해 사용되는 각각의 스페이서는 상이한 miR 서열 또는 miR 서열의 성분(예를 들어, miR 씨드 서열)을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, miR 서열 및/또는 TEE 서열의 통합은 번역을 증가 및/또는 감소시키는 스템 루프 영역의 형상을 변화시킨다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 Kedde 등., Nature Cell Biology 2010 12(10): 1014-20을 참조하라.
스템 루프
폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)는 히스톤 스템 루프와 같은 스템 루프를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 스템 루프는 길이가 약 25개 또는 약 26개 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 WO2013/103659 (이는 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 히스톤 스템 루프는 코딩 영역에 대해 3'에 (예를 들어, 코딩 영역의 3'-말단에)에 위치할 수 있다. 비제한적 예로서, 스템 루프는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 위치할 수 있다. 일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)는 하나 이상의 스템 루프 (예를 들어, 두 개의 스템 루프)를 포함한다. 스템 루프 서열의 예는 국제 특허출원 공개공보 제 W02012/019780 및 WO201502667에 기재되어 있으며, 이들 문헌의 스템 루프 서열들은 본원에 참조로 포함된다. 일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드는 스템 루프 서열 CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA (서열 번호: 1)을 포함한다. 기타에서, 폴리뉴클레오티드는 스템 루프 서열 CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA (서열 번호: 2)을 포함한다.
스템 루프는 폴리뉴클레오티드의 제2 말단 영역에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 스템 루프는 제2 말단 영역의 비번역 영역(예를 들어, 3'-UTR) 내에 위치할 수 있다.
일부 구체예들에서, 히스톤 스템 루프를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 가령, mRNA (그러나 이에 제한되지 않음)는 3'-안정화 영역 (예를 들어, 적어도 하나의 사슬 종결 뉴클레오시드를 포함하는 3'-안정화 영역)의 추가에 의해 안정화될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 적어도 하나의 사슬 종결 뉴클레오시드의 첨가는 폴리뉴클레오티드의 분해를 늦출 수 있고 따라서 폴리뉴클레오티드의 반감기를 증가시킬 수 있다.
일부 구체예들에서, 히스톤 스템 루프를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 가령, mRNA (그러나 이에 제한되지 않음)는 올리고(U)의 추가를 방해 및/또는 억제할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 3'-영역에 대한 변경에 의해 안정화될 수 있다 (예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제 WO2013/103659 참조).
또한 일부 구체예들에서, 히스톤 스템 루프를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 가령, mRNA (그러나 이에 제한되지 않음)는 3'-데옥시뉴클레오시드, 2',3'-다이데옥시뉴클레오시드 3-O-메틸뉴클레오시드, 3-O-에틸뉴클레오시드, 3'-아라비노사이드, 및 당업계에 공지되어 있는 및/또는 본원에 기재된 다른 대체 뉴클레오시드에서 종결되는 올리고뉴클레오티드의 첨가에 의해 안정화될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 히스톤 스템 루프, 폴리-A 영역, 및/또는 5'-캡 구조를 포함할 수 있다. 히스톤 스템 루프는 폴리-A 영역 앞 및/또는 뒤에 있을 수 있다. 히스톤 스템 루프 및 폴리-A 영역 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 사슬 종결 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 히스톤 스템 루프 및 5'-캡 구조를 포함할 수 있다. 5'-캡 구조는 본원에 기재된 및/또는 당업계에 공지된 것들을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예들에서, 보존된 스템 루프 영역은 본원에 기재된 miR 서열을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 스템 루프 영역은 본원에 기재된 miR 서열의 씨드 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 스템 루프 영역은 miR-122 씨드 서열을 포함할 수 있다.
특정 예들에서, 보존된 스템 루프 영역은 본원에 기재된 miR 서열을 포함할 수 있고 또한 TEE 서열을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, miR 서열 및/또는 TEE 서열의 통합은 번역을 증가 및/또는 감소시키는 스템 루프 영역의 형상을 변화시킨다. (예를 들어, Kedde 등. A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility. Nature Cell Biology. 2010 참조, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 히스톤 스템-루프 및 폴리-A 영역 또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 히스톤 스템-루프 및 폴리-A 영역 또는 폴리아데닐화 신호를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열들의 비제한적 예들은 국제 특허출원 공개공보 제 WO2013/120497, WO2013/120629, W02013/120500, WO2013/120627, WO2013/120498, WO2013/120626, WO2013/120499 및 WO2013/120628에 기재되어 있으며, 이들 문헌 각각의 서열들은 본원에 참조로 포함된다.
특정 예들에서, 히스톤 스템-루프 및 폴리-A 영역 또는 폴리아데닐화 신호를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 병원체 항원 또는 이의 단편, 가령, 국제 특허출원 공개공보 제 WO2013/120499 및 WO2013/120628에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열들을 코딩할 수 있으며, 이들 두 문헌의 서열들은 본원에 참조로 포함된다. 일부 구체예들에서, 히스톤 스템-루프 및 폴리-A 영역 또는 폴리아데닐화 신호를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 치료 단백질, 가령, 국제 특허출원 공개공보 제 WO2013/120497 및 WO2013/120629에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열들을 코딩할 수 있으며, 이들 두 문헌의 서열들은 본원에 참조로 포함된다. 일부 구체예들에서, 히스톤 스템-루프 및 폴리-A 영역 또는 폴리아데닐화 신호를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 종양 항원 또는 이의 단편, 가령, 국제 특허출원 공개공보 제 W02013/120500 및 WO2013/120627에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열들을 코딩할 수 있으며, 이들 두 문헌의 서열들은 본원에 참조로 포함된다. 일부 구체예들에서, 히스톤 스템-루프 및 폴리-A 영역 또는 폴리아데닐화 신호를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 알러지 항원 또는 자가면역 자가-항원, 가령, 국제 특허출원 공개공보 제 WO2013/120498 및 WO2013/120626에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열들을 코딩할 수 있으며, 이들 두 문헌의 서열들은 본원에 참조로 포함된다.
폴리-A 영역
폴리뉴클레오티드 또는 핵산(예를 들어, mRNA)은 폴리 A 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 폴리A 서열은 전적으로 또는 대부분 아데닌 뉴클레오티드 또는 이의 유사체 또는 유도체로 구성될 수 있다. 폴리A 서열은 핵산의 3’ 비번역 영역에 인접하여 위치한 꼬리일 수 있다.
RNA 가공 중에 긴 사슬의 아데노신 뉴클레오티드 (폴리-A 영역)가 일반적으로 분자의 안정성을 증가시키기 위해 메신저 RNA(mRNA) 분자에 추가된다. 전사 직후, 전사체의 3'-말단은 절단되어 3'-하이드록시를 유리시킨다. 그런 다음 폴리-A 중합효소는 RNA에 아데노신 뉴클레오티드 사슬을 추가한다. 폴리 아데닐화라고 하는 공정은 100 내지 250개 잔기 길이의 폴리-A 영역을 추가한다.
독특한 폴리-A 영역 길이는 본 발명의 다른 폴리뉴클레오티드에 특정 이점을 제공할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 폴리-A 영역의 길이는 적어도 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예들에서, 길이는 적어도 40의 뉴클레오티드, 적어도 50개의 뉴클레오티드, 적어도 60개의 뉴클레오티드, 적어도 70개의 뉴클레오티드, 적어도 80개의 뉴클레오티드, 적어도 90개의 뉴클레오티드, 적어도 100개의 뉴클레오티드, 적어도 120개의 뉴클레오티드, 적어도 140개의 뉴클레오티드, 적어도 160개의 뉴클레오티드, 적어도 180개의 뉴클레오티드, 적어도 200개의 뉴클레오티드, 적어도 250개의 뉴클레오티드, 적어도 300개의 뉴클레오티드, 적어도 350개의 뉴클레오티드, 적어도 400개의 뉴클레오티드, 적어도 450개의 뉴클레오티드, 적어도 500개의 뉴클레오티드, 적어도 600개의 뉴클레오티드, 적어도 700개의 뉴클레오티드, 적어도 800개의 뉴클레오티드, 적어도 900개의 뉴클레오티드, 적어도 1000개의 뉴클레오티드, 적어도 1200개의 뉴클레오티드, 적어도 1400개 뉴클레오티드, 적어도 1600개 뉴클레오티드, 적어도 1800개 뉴클레오티드, 적어도 2000개 뉴클레오티드, 적어도 2500개 뉴클레오티드, 또는 적어도 3000개 뉴클레오티드이다.
일부 구체예들에서, 폴리-A 영역은 본원에 기재된 대체 폴리뉴클레오티드 분자 상의 80개 뉴클레오티드, 120개 뉴클레오티드, 160개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일부 구체예들에서, 폴리-A 영역은 본원에 기재된 대체 폴리뉴클레오티드 분자 상의 20, 40, 80, 100, 120, 140 또는 160개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일부 구체예들에서, 폴리-A 영역은 전체 대체 폴리뉴클레오티드의 길이에 대해 설계된다. 이러한 설계는 대체 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역의 길이, 대체 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 특정 특징부 또는 영역의 길이에 기반으로, 또는 대체 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 최종 생성물의 길이를 기반으로 할 수 있다. 대체 폴리뉴클레오티드의 임의의 특징 (예를 들어, 폴리-A 영역을 포함하는 mRNA 부분 이외)과 관련하여, 폴리-A 영역은 또 다른 특징부 보다 길이가 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 더 길다. 폴리-A 영역은 또한 그것이 속하는 대체 폴리뉴클레오티드의 분율로 설계될 수 있다. 이와 관련하여, 폴리-A 영역은 구조체의 총 길이 또는 구조체의 총 길이에서 폴리-A 영역을 뺀 값의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90% 이상일 수 있다.
특정 예들에서, 폴리-A 결합 단백질에 대한 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 접합 및/또는 조작된 결합 부위는 발현을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 조작된 결합 부위는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 국소 미세환경의 리간드에 대한 결합 부위로서 작동할 수 있는 센서 서열일 수 있다. 비제한적인 예로서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)는 폴리-A 결합 단백질 (PABP) 및 이의 유사체의 결합 친화성을 변경하기 위해 적어도 하나의 조작된 결합 부위를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 조작된 결합 부위의 통합은 PABP 및 이의 유사체의 결합 친화도를 증가시킬 수 있다.
추가로, 다수의 별개의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)는 폴리-A 영역의 3'-말단에서 대체 뉴클레오티드를 사용하여 3'-말단을 통해 PABP (폴리-A 결합 단백질)에 함께 연결될 수 있다. 형질감염 실험은 형질감염 후 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 7일차에 관련 세포주에서 수행될 수 있고 단백질 제조는 ELISA로 검정될 수 있다. 비제한적 예로서, 형질감염 실험은 적어도 하나의 조작된 결합 부위를 추가한 결과로서 PABP 또는 그의 유사체 결합 친화도에 대한 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
특정 예들에서, 폴리-A 영역은 번역 개시를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 이론에 제한되는 것을 원하는 것은 아니지만, 폴리-A 영역은 PABP를 동원하며, 이는 차례로 번역 개시 복합체와 상호작용할 수 있으므로 단백질 합성에 필수적일 수 있다.
일부 구체예들에서, 폴리-A 영역은 또한 본 발명에서 3'-5'-엑소뉴클레아제 소화로부터 보호하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)는 폴리A-G 쿼텟 (Quartet)을 포함할 수 있다. G-쿼텟은 4개의 구아노신 뉴클레오티드의 고리형 수소 결합 어레이로, DNA와 RNA 모두에서 G가 풍부한 서열에 의해 형성될 수 있다. 본 구체예에서, G-쿼텟은 폴리-A 영역의 단부에 통합된다. 생성된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)는 안정성, 단백질 제조 및 다양한 시점에서의 반감기를 포함하는 기타 매개변수에 대해 검정될 수 있다. 폴리A-G 쿼텟이 120개 뉴클레오티드의 폴리-A 영역만을 사용하여 관찰된 것의 적어도 75%에 해당하는 단백질을 제조함이 발견되었다.
일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)는 폴리-A 영역을 포함할 수 있고 3'-안정화 영역의 추가에 의해 안정화될 수 있다. 폴리-A 영역을 갖는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)는 5'-캡 구조를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)는 폴리-A-G 쿼텟 (Quartet)을 포함할 수 있다. 폴리-A-G 쿼텟을 갖는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)는 5'-캡 구조를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 폴리-A 영역 또는 폴리-A-G 쿼텟을 포함하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)를 안정화시키기 위해 사용될 수 있는 3'-안정화 영역은 국제 특허출원 공개공보 제 WO2013/103659에 기재된 것들 일 수 있으며 (그러나 이에 제한되는 것은 아님), 이 문헌의 폴리-A 영역 및 폴리-A-G 쿼텟은 본원에 참조로 포함된다. 일부 구체예들에서, 본 발명과 함께 사용될 수 있는 3'-안정화 영역은 사슬 종결 뉴클레오시드, 가령, 3'-데옥시아데노신(코르디세핀), 3'-데옥시우리딘, 3'-데옥시 시토신, 3'-데옥시 구아노신, 3'-데옥시 티민, 2',3'-다이데옥시뉴클레오시드, 예를 들어 2',3'-다이데옥시아데노신, 2',3'-다이데옥시우리딘, 2',3'-다이데옥시시토신, 2',3'-다이데옥시구아노신, 2',3' -다이데옥시티민, α2'-데옥시뉴클레오시드, 또는 O-메틸뉴클레오시드를 포함한다.
일부 구체예들에서, 폴리 A 영역 또는 폴리-A-G 쿼텟을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 가령, mRNA (그러나 이에 제한되지 않음)는 올리고(U)의 추가를 방해 및/또는 억제할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 3'-영역에 대한 변경에 의해 안정화될 수 있다 (예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제 WO2013/103659 참조).
일부 구체예들에서, 폴리 A 영역 또는 폴리-A-G 쿼텟을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 가령, mRNA (그러나 이에 제한되지 않음)는 3'-데옥시뉴클레오시드, 2',3'-다이데옥시뉴클레오시드 3-O-메틸뉴클레오시드, 3-O-에틸뉴클레오시드, 3'-아라비노사이드, 및 당업계에 공지되어 있는 및/또는 본원에 기재된 다른 대체 뉴클레오시드에서 종결되는 올리고뉴클레오티드의 첨가에 의해 안정화될 수 있다.
사슬 종결 뉴클레오시드
핵산은 사슬 종결 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 사슬 종결 뉴클레오시드는 그 당 그룹의 2’ 및/또는 3’ 위치에 탈산소화된 뉴클레오시드들을 포함할 수 있다. 이러한 종들은 3'-데옥시아데노신 (코르디세핀), 3'-데옥시우리딘, 3'-데옥시시토신, 3'-데옥시구아노신, 3'-데옥시티민, 및 2',3'-다이데옥시뉴클레오시드, 가령, 2',3’-다이데옥시아데노신, 2',3'-다이데옥시우리딘, 2',3'-다이데옥시시토신, 2',3'-다이데옥시구아노신, 및 2',3'-다이데옥시티민을 포함할 수 있다.
지질 및 지질 혼합물
일부 구체예들에서, 지질은 이온화가능한 지질이다.
일부 구체예들에서, 지질은 인지질이다.
일부 구체예들에서, 지질은 PEG 지질이다.
일부 구체예들에서, 지질은 구조적 지질이다.
일부 구체예들에서, 지질 혼합물은 이온화가능한 지질을 포함한다.
일부 구체예들에서, 지질 혼합물은 인지질을 포함한다.
일부 구체예들에서, 지질 혼합물은 PEG 지질을 포함한다.
일부 구체예들에서, 지질 혼합물은 구조적 지질을 포함한다.
일부 구체예들에서, 지질 혼합물은 이온화가능한 지질, 인지질, PEG 지질, 구조적 지질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
이온화가능한 지질
일부 양상들에서, 본 발명의 이온화가능한 지질은 화학식 (IL-I)의 화합물:
Figure pct00015
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체 중 하나 이상일 수 있으며, 이때:
R1은 C5-30 알킬, C5-20 알케닐, -R*YR”, -YR”, 및 -R’M’R’로 구성된 그룹에서 선택되고;
R2 및 R3는 H, C1­14 알킬, C2­14 알케닐, ­R*YR”, ­YR”, 및 ­R*OR”로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되거나, 또는 R2 및 R3는 이들이 부착되는 원자와 함께 헤테로사이클 또는 카보사이클을 형성하며;
R4는 수소, C3-6 카보사이클, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ, -CHQR, -CQ(R)2, -C(O)NQR 및 비치환된 C1-6 알킬로 구성된 그룹에서 선택되고, 이때, Q는 카보사이클, 헤테로사이클, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)R8, -N(R)S(O)2R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, -(CH2)nN(R)2 및 -C(R)N(R)2C(O)OR에서 선택되며, 각각의 o는 1, 2, 3, 및 4에서 독립적으로 선택되고, 그리고 각각의 n은 1, 2, 3, 4, 및 5에서 독립적으로 선택되고;
각각의 R5는 OH, C1­3 알킬, C2­3 알케닐, 및 H로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
각각의 R6는 OH, C1­3 알킬, C2­3 알케닐, 및 H로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
M 및 M’은 -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M”-C(O)O-, -C(O)N(R’)-, -N(R’)C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR’)O-, -S(O)2-, -S-S-, 아릴 그룹, 및 헤테로아릴 그룹에서 독립적으로 선택되고, 여기서 M”은 결합, C1-13 알킬 또는 C2-13 알케닐이고;
R7은 C1­3 알킬, C2­3 알케닐, 및 H로 구성된 그룹에서 선택되고;
R8은 C3-6 카보사이클 및 헤테로사이클로 구성된 그룹에서 선택되고;
R9는 H, CN, NO2, C1-6 알킬, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, C2-6 알케닐, C3-6 카보사이클 및 헤테로사이클로 구성된 그룹에서 선택되고;
R10은 H, OH, C1-3 알킬, 및 C2-3 알케닐로 구성된 그룹에서 선택되고;
각 R은 C1-6 알킬, C1-3 알킬-아릴, C2-3 알케닐, (CH2)qOR*, 및 H로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고, 그리고 각 q는 1, 2, 및 3에서 독립적으로 선택되고;
각각의 R’은 C1­18 알킬, C2­18 알케닐, ­R*YR”, ­YR”, 및 H로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
각각의 R”은 C3-15 알킬 및 C3­15 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
각각의 R*은 C1-12 알킬 및 C2­12 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
각각의 Y는 독립적으로 C3-6 카보사이클이고;
각각의 X는 F, Cl, Br, 및 I로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고; 그리고
m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13에서 선택되고; 이때 R4가 -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, 또는 -CQ(R)2인 경우, (i) n이 1, 2, 3, 4 또는 5일 때 Q는 -N(R)2가 아니고, 또는 (ii) n이 1 또는 2일 때 Q는 5, 6, 또는 7-원 헤테로사이클로알킬이 아니다.
일부 구체예들에서, 화학식 (IL-I)의 화합물들의 부분집합은 화학식 (IL-I A)의 화합물들:
Figure pct00016
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함하고, 이때
l은 1, 2, 3, 4, 및 5에서 선택되고; m은 5, 6, 7, 8, 및 9에서 선택되고; M1은 결합 또는 M’이고; R4는 수소, 비치환된 C1-3 알킬, -(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ, -C(O)NQR 또는 -(CH2)nQ이고, 여기서 Q는 OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -(CH2)nN(R)2, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬이고; M 및 M’은 -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M”-C(O)O-, -C(O)N(R’)-, -P(O)(OR’)O-, -S-S-, 아릴 그룹, 및 헤테로아릴 그룹에서 독립적으로 선택되고; 및 R2 및 R3는 H, C1-14 알킬, 및 C2-14 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다. 예를 들어, m은 5, 7, 또는 9이다. 예를 들어, Q는 OH, -NHC(S)N(R)2, 또는 -NHC(O)N(R)2이다.
일부 구체예들에서, Q는 -N(R)C(O)R, 또는 N(R)S(O)2R이다.
일부 구체예들에서, 화학식 (I)의 화합물의 부분집합은 화학식 (IL-IB)의 화합물:
Figure pct00017
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함하고, 여기서 모든 변수들은 본원에 정의된 바와 같다.
일부 구체예들에서, m은 5, 6, 7, 8, 및 9에서 선택되고; R4는 수소, 비치환된 C1-3 알킬, 또는 -(CH2)nQ이고, 여기서 Q는 -OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬이고; M 및 M’은 -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M”-C(O)O-, -C(O)N(R’)-, -P(O)(OR’)O-, -S-S-, 아릴 그룹, 및 헤테로아릴 그룹에서 독립적으로 선택되고; R2 및 R3는 H, C1-14 알킬, 및 C2-14 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다. 일부 구체예들에서, m은 5, 7, 또는 9이다. 일부 구체예들에서, Q는 OH, -NHC(S)N(R)2, 또는 -NHC(O)N(R)2이다. 일부 구체예들에서, Q는 -N(R)C(O)R, 또는 -N(R)S(O)2R이다.
일부 구체예들에서, 화학식 (IL-I)의 화합물들의 부분집합은 화학식 (IL-II)의 화합물들:
Figure pct00018
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체를 포함하고, 이때 l은 1, 2, 3, 4, 및 5에서 선택되고; M1은 결합 또는 M’이고; R4는 수소, 비치환된 C1-3 알킬, -(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ, -C(O)NQR 또는 -(CH2)nQ이고, 여기서 n은 2, 3, 또는 4이고, 그리고 Q는 OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -(CH2)nN(R)2, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬이고; M 및 M’은 -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M”-C(O)O-, -C(O)N(R’)-, -P(O)(OR’)O-, -S-S-, 아릴 그룹, 및 헤테로아릴 그룹에서 독립적으로 선택되고; 및 R2 및 R3는 H, C1-14 알킬, 및 C2-14 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다.
일부 구체예들에서, 화학식 (IL-I)의 화합물은 화학식 (IL-IIa)의 화합물:
Figure pct00019
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체이고, 이때 R4는 본원에 정의된 바와 같다.
일부 구체예들에서, 화학식 (IL-I)의 화합물은 화학식 (IL-IIb)의 화합물,
Figure pct00020
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체이고, 이때 R4는 본원에 정의된 바와 같다.
일부 구체예들에서, 화학식 (IL-I)의 화합물은 화학식 (IL-IIc) 또는 (IL-IIe)의 화합물:
Figure pct00021
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체이고, 이때 R4는 본원에 정의된 바와 같다.
일부 구체예들에서, 화학식 (IL-I)의 화합물은 화학식 (IL-IIf)의 화합물:
Figure pct00022
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체이며, 이때 M은 -C(O)O-또는 -OC(O)-이고, M”은 C1-6 알킬 또는 C2-6 알케닐이고, R2 및 R3는 C5-14 알킬 및 C5-14 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고, 및 n은 2, 3, 및 4에서 선택된다.
한 추가 구체예에서, 화학식 (IL-I)의 화합물은 화학식 (IL-IId)의 화합물
Figure pct00023
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체이고, 이때 n은 2, 3, 또는 4이고; 그리고 m, R’, R”, 및 R2 내지 R6는 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구체예들에서, R2 및 R3 각각은 C5-14 알킬 및 C5-14 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택될 수 있다.
한 추가 구체예에서, 화학식 (IL-I)의 화합물은 화학식 (IL-IIg)의 화합물
Figure pct00024
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체이고, 이때 l은 1, 2, 3, 4, 및 5에서 선택되고; m은 5, 6, 7, 8, 및 9에서 선택되고; M1은 결합 또는 M’이고; M 및 M’은 -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M”-C(O)O-, -C(O)N(R’)-, -P(O)(OR’)O-, -S-S-, 아릴 그룹, 및 헤테로아릴 그룹에서 독립적으로 선택되고; 그리고 R2 및 R3는 H, C1-14 알킬, 및 C2-14 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다. 일부 구체예들에서, M”은 C1-6 알킬 (예를 들어, C1-4 알킬) 또는 C2-6 알케닐 (예를 들어 C2-4 알케닐)이다. 일부 구체예들에서, R2 및 R3는 C5-14 알킬 및 C5-14 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질들은 미국 특허출원 제 62/220,091, 62/252,316, 62/253,433, 62/266,460, 62/333,557, 62/382,740, 62/393,940, 62/471,937, 62/471,949, 62/475,140, 및 62/475,166, 및 PCT 특허출원 제 PCT/US2016/052352에 기재된 화합물들 중 하나 이상이다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질들은 미국 특허출원 제 62/475,166에 기재된 화합물 1-280에서 선택된다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질은
Figure pct00025
또는 이의 염이다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질은
Figure pct00026
, 또는 이의 염이다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질은
Figure pct00027
, 또는 이의 염이다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질은
Figure pct00028
, 또는 이의 염이다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질은 미국 특허출원 제 62/733,315 및 62/798,874에 기재된 화합물 중 하나 이상이다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질은 화학식 (IL-IIh):
Figure pct00029
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체이고, 이때
R1은 C5-30 알킬, C5-20 알케닐, -R*YR”, -YR”, 및 -R’M’R’로 구성된 그룹에서 선택되고;
R2 및 R3는 H, C1­14 알킬, C2­14 알케닐, ­R*YR”, ­YR”, 및 ­R*OR”로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되거나, 또는 R2 및 R3는 이들이 부착되는 원자와 함께 헤테로사이클 또는 카보사이클을 형성하며;
각각의 R5는 OH, C1­3 알킬, C2­3 알케닐, 및 H로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
각각의 R6는 OH, C1­3 알킬, C2­3 알케닐, 및 H로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
M 및 M’은 -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M”-C(O)O-, -C(O)N(R’)-, -N(R’)C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR’)O-, -S(O)2-, -S-S-, 아릴 그룹, 및 헤테로아릴 그룹에서 독립적으로 선택되고, 여기서 M”은 결합, C1-13 알킬 또는 C2-13 알케닐이고;
R7은 C1­3 알킬, C2­3 알케닐, 및 H로 구성된 그룹에서 선택되고;
각각의 R은 H, C1-3 알킬, 및 C2-3 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고; RN은 H, 또는 C1-3 알킬이고;
각각의 R’은 C1­18 알킬, C2­18 알케닐, ­R*YR”, ­YR”, 및 H로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
각각의 R”은 C3-15 알킬 및 C3­15 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
각각의 R*은 C1-12 알킬 및 C2­12 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
각각의 Y는 독립적으로 C3-6 카보사이클이고;
각각의 X는 F, Cl, Br, 및 I로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
Xa 및 Xb는 각각 독립적으로 O 또는 S이고;
R10은 H, 할로, -OH, R, -N(R)2, -CN, -N3, -C(O)OH, -C(O)OR, -OC(O)R, -OR, -SR, -S(O)R, -S(O)OR, -S(O)2OR, -NO2, -S(O)2N(R)2, -N(R)S(O)2R, -NH(CH2)t1N(R)2, -NH(CH2)P1O(CH2)q1N(R)2, -NH(CH2)s1OR, -N((CH2)s1OR)2, -N(R)-카보사이클, -N(R)-헤테로사이클, -N(R)-아릴, -N(R)-헤테로아릴, -N(R)(CH2)t1-카보사이클, -N(R)(CH2)t1-헤테로사이클, -N(R)(CH2)t1-아릴, N(R)(CH2)t1-헤테로아릴, 카보사이클, 헤테로사이클, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 그룹에서 선택되고;
m은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13에서 선택되고;
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10에서 선택되고;
r은 0 또는 1이고;
t1은 1, 2, 3, 4, 및 5에서 선택되고;
p1은 1, 2, 3, 4, 및 5에서 선택되고;
q1은 1, 2, 3, 4, 및 5에서 선택되고; 그리고
s1은 1, 2, 3, 4, 및 5에서 선택된다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질은 화학식 (IL-IIi):
Figure pct00030
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체이고, 이때
R1a 및 R1b는 C1-14 알킬 및 C2-14 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고; 그리고
R2 및 R3는 C1­14 알킬, C2­14 알케닐, ­R*YR”, ­YR”, 및 ­R*OR”로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되거나, 또는 R2 및 R3는 이들이 부착되는 원자와 함께 헤테로사이클 또는 카보사이클을 형성하며;
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질은 화학식 (IL-IIj):
Figure pct00031
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체이고, 이때
l은 1, 2, 3, 4, 및 5에서 선택되고;
M1은 결합 또는 M’이고; 그리고
R2 및 R3는 H, C1­14 알킬, 및 C2­14 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질은 화학식 (IL-IIk):
Figure pct00032
또는 이의 N-산화물, 또는 이의 염 또는 이성질체이고, 이때
l은 1, 2, 3, 4, 및 5에서 선택되고;
M1은 결합 또는 M’이고; 그리고
Ra 및 Rb는 C1-14 알킬 및 C2-14 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고; 그리고
R2 및 R3는 C1­14 알킬, 및 C2­14 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질은
Figure pct00033
, 또는 이의 염이다.
일부 양상들에서, 본 발명의 이온화가능한 지질은 화학식 (IL-III)의 화합물:
Figure pct00034
또는 이의 염이고, 이때
W는
Figure pct00035
또는
Figure pct00036
이고,
고리 A는
Figure pct00037
또는
Figure pct00038
이고;
t는 1 또는 2이고;
A1 및 A2는 각각 CH 또는 N에서 독립적으로 선택되고;
Z는 CH2이거나 존재하지 않고 이 때 Z가 CH2인 경우, 점선 (1) 및 (2) 각각은 단일 결합을 나타내고; Z가 존재하지 않는 경우, 점선 (1) 및 (2)는 모두 존재하지 않으며;
R1, R2, R3, R4, 및 R5 각각은 C5-20 알킬, C5-20 알케닐, -R”MR’, -R*YR”, -YR”, 및 -R*OR”로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
Rx1 및 Rx2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-3 알킬이고;
각각의 M은 -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -C(O)N(R’)-, -N(R’)C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR’)O-, -S(O)2-, -C(O)S-, -SC(O)-, 아릴 그룹, 및 헤테로아릴 그룹으로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고; M*은 C1-C6 알킬이고,
W1 및 W2는 각각 독립적으로 -O-및 -N(R6)-로 구성된 그룹에서 선택되고; 각 R6는 H 및 C1-5 알킬로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
X1, X2, 및 X3는 결합, -CH2-, -(CH2)2-, -CHR-, -CHY-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -(CH2)n-C(O)-, -C(O)-(CH2)n-, -(CH2)n-C(O)O-, -OC(O)-(CH2)n-, -(CH2)n-OC(O)-, -C(O)O-(CH2)n-, -CH(OH)-, -C(S)-, 및 -CH(SH)-로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
각각의 Y는 독립적으로 C3-6 카보사이클이고;
각각의 R*은 C1-12 알킬 및 C2­12 알케닐로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;각 R은 C1-3 알킬 및 C3-6 카보사이클로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;각 R’은 C1-12 알킬, C2-12 알케닐, 및 H로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고;
각 R”은 C3-12 알킬, C3­12 알케닐, 및 -R*MR’로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되고; 그리고 n은 1-6의 정수이고;
이때 고리 A가
Figure pct00039
이면,
X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 -CH2-가 아니고; 및/또는
R1, R2, R3, R4, 및 R5 중 적어도 하나는 -R”MR’이다.
일부 구체예들에서, 화합물은 화학식 (IL-IIIa1)-(IL-IIIa8) 중 어느 하나이다:
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
또는
Figure pct00043
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질은 미국 특허출원 제 62/271,146,62/338, 474,62/413,345, 및 62/519,826, 및 PCT 특허출원 제 PCT/US2016/068300에 기재된 화합물들 중 하나 이상이다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질들은 미국 특허출원 제 62/519,826에 기재된 화합물 1-156에서 선택된다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질들은 미국 특허출원 제 62/519,826에 기재된 화합물 1-16, 42-66, 68-76, 및 78-156에서 선택된다.
일부 구체예들에서, 이온화가능한 지질은
Figure pct00044
, 또는 이의 염이다.
화학식 (IL-I), (IL-IA), (IL-IB), (IL-II), (IL-IIa), (IL-IIb), (IL-IIc), (IL-IId), (IL-IIe), (IL-IIf), (IL-IIg), (IL-III), (IL-IIIa1), (IL-IIIa2), (IL-IIIa3), (IL-IIIa4), (IL-IIIa5), (IL-IIIa6), (IL-IIIa7), 또는 (IL-IIIa8)에 따른 지질의 중심 아민 모이어티는 생리학적 pH에서 양성자화 될 수 있다. 그러므로, 지질은 생리학적 pH에서 양 또는 부분 양 전하를 가질 수 있다. 이러한 지질은 양이온성 또는 이온화가능한 (아미노)지질로 지칭될 수 있다. 지질은 또한 쯔비터이온성, 즉 양전하와 음전하를 모두 갖는 중성 분자일 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 지질
본원에서 사용되는 용어 “PEG 지질”은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-변형된 지질을 지칭한다. PEG-지질의 비-제한적 예들에는 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딕 애시드, PEG-세라마이드 접합체 (예컨대, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG-변형된 다이알킬아민 및 PEG-변형된 1,2-다이아실옥시프로판-3-아민이 포함된다. 이러한 지질은 또한 페길화 지질로 지칭된다. 일부 구체예들에서, PEG 지질은 PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, 또는 PEG-DSPE 지질일 수 있다.
일부 구체예들에서, PEG 지질에는, 1,2-다이미리스토일-sn-글리세롤 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (PEG-DMG), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)] (PEG-DSPE), PEG-다이스테릴 글리세롤 (PEG-DSG), PEG-다이팔미톨레일, PEG-다이올레일, PEG-다이스테아릴, PEG-다이아실글리카미드 (PEG-DAG), PEG-다이팔미토일 포스파티딜에탄올아민 (PEG-DPPE), 또는 PEG-1,2-다이미리스틸록실프로필-3-아민 (PEG-c-DMA)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, PEG 지질은 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티딕 애시드, PEG-변형된 세라마이드, PEG-변형된 다이알킬아민, PEG-변형된 다이아실글리세롤, PEG-변형된 다이알킬글리세롤, 및 이의 혼합물로 구성된 그룹에서 선택된다.
일부 구체예들에서, PEG 지질의 지질 모이어티는 약 C14 내지 약 C22, 바람직하게는, 약 C14 내지 약 C16 길이를 가지는 모이어티들을 포함한다. 일부 구체예들에서, PEG 모이어티, 예를 들면, mPEG-NH2는 약 1000, 2000, 5000, 10,000, 15,000 또는 20,000 달톤의 크기를 가진다. 일부 구체예들에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다.
일부 구체예들에서, 본원에 기재된 지질 나노입자들은 비-융합성 PEG인 PEG 지질을 포함할 수 있다. 비-융합성 PEG의 비-제한적 예들에는 PEG-DSG 및 PEG-DSPE가 포함된다.
PEG 지질은 해당 분야에 공지이며, 가령, 미국 특허 공보 제 8158601 및 국제 특허 출원 공개 공보 제 WO 2015/130584 A2에 기재된 것들이 있고, 이들 문헌은 본원에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
일반적으로, 본원에 기재된, 다양한 화학식의 다른 지질 성분들 (예컨대, PEG 지질) 중 일부는 2016년 12월 10일에 출원된, 발명의 명칭 “Compositions and Methods for Delivery of Therapeutic Agents”의 국제 특허 출원 제 PCT/US2016/000129에 기재된 바와 같이 합성될 수 있으며, 이 문헌은 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
PEG 지질은 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 지질이다. PEG 지질은 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티딕 애시드, PEG-변형된 세라마이드, PEG-변형된 다이알킬아민, PEG-변형된 다이아실글리세롤, PEG-변형된 다이알킬글리세롤, 및 이의 혼합물을 포함하는 비-제한적 그룹에서 선택될 수 있다. 일부 구체예들에서, PEG 지질은 PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, 또는 PEG-DSPE 지질일 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명에 유용한 PEG 지질은 국제 특허 출원 공개 공보 제 WO2012099755에 기재된 페길화 지질 일 수 있으며, 이 문헌의 내용은 본원에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다. 본원에 기재된 임의의 이러한 예시적인 PEG 지질은 PEG 사슬에 하이드록실 그룹을 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 구체예들에서, PEG 지질은 PEG-OH 지질이다. 본원에 일반적으로 정의되는 “PEG-OH 지질” (또한 본원에서 "하이드록시-페길화 지질”로도 지칭됨)은 지질에 하나 이상의 하이드록실 (-OH) 그룹들을 가지는 페길화 지질이다. 일부 구체예들에서, PEG-OH 지질은 PEG 사슬에 하나 이상의 하이드록실 그룹을 포함한다. 일부 구체예들에서, PEG-OH 또는 하이드록시-페길화 지질은 PEG 사슬의 말단에 -OH 그룹을 포함한다. 각 경우는 본 발명의 별도의 구체예를 나타낸다.
일부 구체예들에서, 본 발명에 유용한 PEG 지질은 화학식 (PL-I)의 화합물이다. 본원은 화학식 (PL-I)의 화합물:
Figure pct00045
또는 이의 염을 제공하며, 이때:
R3는 -ORO이고;
RO는 수소, 선택적으로 치환된 알킬 또는 산소 보호 그룹이고;
r은 1 내지 100 (1과 100 포함)의 정수이고;
L1은 선택적으로 치환된 C1-10 알킬렌이고, 이 때 선택적으로 치환된 C1-10 알킬렌의 적어도 하나의 메틸렌은 선택적으로 치환된 카보사이클릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴렌, 선택적으로 치환된 아릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로아릴렌, O, N(RN), S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O, 또는 NRNC(O)N(RN)으로 독립적으로 대체되고;
D는 클릭 화학에 의해 수득되는 모이어티 또는 생리학적 조건하에서 절단가능한 모이어티이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
A는 화학식:
Figure pct00046
또는
Figure pct00047
이고;
각 경우 L2는 독립적으로 결합 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬렌이고, 이 때 선택적으로 치환된 C1-6 알킬렌의 하나의 메틸렌은 O, N(RN), S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O, 또는 NRNC(O)N(RN)으로 선택적으로 대체되고;
각 경우에 R2는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-30 알킬, 선택적으로 치환된 C1-30 알케닐, 또는 선택적으로 치환된 C1-30 알키닐이고; 선택적으로 이 때 R2의 하나 이상의 메틸렌 단위들은 선택적으로 치환된 카보사이클릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴렌, 선택적으로 치환된 아릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로아릴렌, N(RN), O, S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), NRNC(O)N(RN), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=NRN), C(=NRN)N(RN), NRNC(=NRN), NRNC(=NRN)N(RN), C(S), C(S)N(RN), NRNC(S), -NRNC(S)N(RN), S(O) , -OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O)2, S(O)2O, OS(O)2O, N(RN)S(O), S(O)N(RN), -N(RN)S(O)N(RN), OS(O)N(RN), N(RN)S(O)O, S(O)2, N(RN)S(O)2, S(O)2N(RN), -N(RN)S(O)2N(RN), OS(O)2N(RN), 또는 N(RN)S(O)2O로 독립적으로 대체되고;
각 경우 RN은 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 또는 질소 보호 그룹이고;
고리 B는 선택적으로 치환된 카보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고; 그리고
p는 1 또는 2이다.
일부 구체예들에서, 화학식 (PL-I)의 화합물은 PEG-OH 지질이다 (즉, R3는 -OR°이고, R°는 수소이다). 일부 구체예들에서, 화학식 (PL-I)의 화합물은 화학식 (PL-I-OH)의 화합물:
Figure pct00048
또는 이의 염이다.
일부 구체예들에서, 본 발명에 유용한 PEG 지질은 페길화 지방산이다. 일부 구체예들에서, 본 발명에 유용한 PEG 지질은 화학식 (PL-II)의 화합물이다. 본 발명은 화학식 (PL-II)의 화합물:
Figure pct00049
또는 이의 염을 제공하고, 이때:
R3는-OR°이고;
RO는 수소, 선택적으로 치환된 알킬 또는 산소 보호 그룹이고;
r은 1 내지 100 (1과 100 포함)의 정수이고;
R5는 선택적으로 치환된 C10-40 알킬, 선택적으로 치환된 C10-40 알케닐, 또는 선택적으로 치환된 C10-40 알키닐이고; 그리고 선택적으로 R5 의 하나 이상의 메틸렌 그룹들은 선택적으로 치환된 카르보사이클릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴렌, 선택적으로 치환된 아릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로아릴렌, N(RN), O, S, C(O), C(O)N(RN), -NRNC(O), NRNC(O)N(RN), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O, C(O)S, -SC(O), C(=NRN), C(=NRN)N(RN), NRNC(=NRN), NRNC(=NRN)N(RN), C(S), C(S)N(RN), -NRNC(S), NRNC(S)N(RN), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O)2, S(O)2O, OS(O)2O, -N(RN)S(O), S(O)N(RN), N(RN)S(O)N(RN), OS(O)N(RN), N(RN)S(O)O, S(O)2, N(RN)S(O)2, -S(O)2N(RN), N(RN)S(O)2N(RN), OS(O)2N(RN), 또는 N(RN)S(O)2O로 대체되고; 그리고
각 경우 RN은 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 또는 질소 보호 그룹이다.
일부 구체예들에서, 화학식 (PL-II)의 화합물은 화학식 (PL-II-OH):
Figure pct00050
또는 이의 염이다. 일부 구체예들에서, r은 45이다.
또 다른 구체예들에서 화학식 (PL-II)의 화합물은:
Figure pct00051
또는 이의 염이다.
일부 구체예들에서, 화학식 (PL-II)의 화합물은
Figure pct00052
이다.
일부 구체예들에서, PEG 지질은 미국 특허출원 제 62/520,530에 기재된 PEG 지질 중 하나 이상일 수 있다. 일부 구체예들에서, PEG 지질은 화학식 (PL-III)의 화합물:
Figure pct00053
또는 이의 염 또는 이성질체이고, 이때 s는 1 내지 100의 정수이다.
일부 구체예들에서, PEG 지질은 하기 화학식의 화합물:
Figure pct00054
이다
구조적 지질
본 명세서에서 사용되는 용어 “구조적 지질”은 스테롤을 지칭하며 또한 스테롤 모이어티를 내포하는 지질을 지칭한다.
지질 나노입자에 구조적 지질의 통합은 해당 입자에서 다른 지질의 응집을 완화함에 도움을 줄 수 있다. 구조적 지질은, 콜레스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 토마틴, 우르솔릭 애시드, 알파-토코페롤, 호파노이드, 파이토스테롤, 스테로이드, 및 이의 혼합물을 포함하는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 그룹에서 선택될 수 있다. 일부 구체예들에서, 구조적 지질은 스테롤이다. 본원의서 정의된 “스테롤”은 스테로이드 알콜로 구성된 스테로이드의 하위그룹이다. 일부 구체예들에서, 구조적 지질은 스테로이드이다. 일부 구체예들에서, 구조적 지질은 콜레스테롤이다. 일부 구체예들에서, 구조적 지질은 콜레스테롤의 유사체이다. 일부 구체예들에서, 구조적 지질은 알파-토코페롤이다.
일부 구체예들에서, 구조적 지질은 미국 특허출원 제 62/520,530에 기재된 구조적 지질 중 하나 이상일 수 있다.
인지질
인지질은 하나 이상의 지질 이중층으로 조립될 수 있다. 일반적으로 인지질은 인지질 모이어티와 하나 이상의 지방산 모이어티를 포함한다.
인지질 모이어티는, 예를 들면, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티딕 애시드, 2-라이소포스파티딜 콜린, 및 스핑고미엘린으로 구성된 비-제한적 그룹에서 선택될 수 있다.
지방산 모이어티는, 예를 들면, 라우르산, 미리스트산, 미리스톨레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 에루스산, 파이타노산 (phytanoic acid), 아라키드산, 아라키돈산, 에이코사펜타에노산, 베헨산, 도코사펜타에노산, 및 도코사헥사에노산으로 구성된 비-제한적 그룹에서 선택될 수 있다.
특정 인지질은 막에 대한 융합을 용이하게 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 양이온성 인지질은 막 (예컨대, 세포 또는 세포내 막)의 하나 이상의 음으로 하전된 인지질과 상호작용할 수 있다. 막에 대한 인지질의 융합은 지질-내포 조성물의 하나 이상의 요소들 (예컨대, 치료제)이 막을 통과할 수 있게 하여, 예컨대, 표적 조직에 대한 하나 이상의 요소들의 전달을 가능하게 한다.
분지화, 산화, 고리화, 및 알킨을 포함하는 변형 및 치환된 자연 종들을 비롯한 비-자연 인지질 종들 또한 고려된다. 일부 구체예들에서, 인지질은 하나 이상의 알킨 (예컨대, 하나 이상의 이중 결합이 삼중 결합으로 대체되어 있는 알케닐 그룹)으로 작용기화되거나 이에 교차결합될 수 있다. 적절한 반응 조건하에서, 알킨 그룹은 아자이드에 대한 노출시 구리-촉매화된 고리화첨가가 일어날 수 있다.
인지질에는 글리세로인지질, 가령, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티디 글리세롤, 및 포스파티딕 애시드가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 인지질은 또한 포스포스핑고지질, 가령, 스핑고미엘린을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 발명에 유용한 또는 잠재적으로 유용한 인지질은 DSPC의 유사체 또는 변이체이다. 일부 구체예들에서, 본 발명에 유용한 또는 잠재적으로 유용한 인지질은 화학식 (PL-I)의 화합물:
Figure pct00055
(PL-I),
또는 이의 염이고, 이때:
각 R1은 독립적으로 선택적으로 치환된 알킬이고; 또는 선택적으로 2개의 R1은 개재 원자들과 함께 결합되어 선택적으로 치환된 모노사이클릭 카보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 모노사이클릭 헤테로사이클릴을 형성하고; 또는 선택적으로 3개의 R1은 개재 원자들과 함께 결합되어 선택적으로 치환된 바이사이클릭 카보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 바이사이클릭 헤테로사이클릴을 형성하고;
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
A는 화학식:
Figure pct00056
또는
Figure pct00057
이고;
각 경우 L2는 독립적으로 결합 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬렌이고, 이 때 선택적으로 치환된 C1-6 알킬렌의 하나의 메틸렌은 -O-, -N(RN)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O-, 또는 -NRNC(O)N(RN)-으로 선택적으로 대체되고;
각 경우에 R2는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-30 알킬, 선택적으로 치환된 C1-30 알케닐, 또는 선택적으로 치환된 C1-30 알키닐이고; 선택적으로 이 때 R2의 하나 이상의 메틸렌 단위들은 선택적으로 치환된 카보사이클릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴렌, 선택적으로 치환된 아릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로아릴렌, -N(RN) -, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -NRNC(O)N(RN)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NRN)-, -C(=NRN)N(RN)-, -NRNC(=NRN)-, -NRNC(=NRN)N(RN)-, -C(S)-, -C(S)N(RN)-, -NRNC(S)-, -NRNC(S)N(RN)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(RN)S(O)-, -S(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)N(RN)-, -OS(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)O-, -S(O)2-, -N(RN)S(O)2-, -S(O)2N(RN)-, -N(RN)S(O)2N(RN)-, -OS(O)2N(RN)-, 또는 -N(RN)S(O)2O-로 독립적으로 대체되고;
각 경우 RN은 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 또는 질소 보호 그룹이고;
고리 B는 선택적으로 치환된 카보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고; 그리고
p는 1 또는 2이고;
상기 화합물은 다음 화학식의 화합물은 아니며:
Figure pct00058
,
이 때 각 경우 R2는 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 알케닐, 또는 비치환된 알키닐이다.
일부 구체예들에서, 인지질은 미국 특허출원 제 62/520,530에 기재된 인지질 중 하나 이상일 수 있다.
i) 인지질 머리 변형
일부 구체예들에서, 본 발명에서 유용한 또는 잠재적으로 유용한 인지질은 변형된 인지질 머리 (예컨대, 변형된 콜린 그룹)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 변형된 머리를 보유한 인지질은 DSPC, 또는 이의 유사체이고, 변형된 4차 아민을 가진다. 일부 구체예들에서, 화학식 (PL-I)의 구체예들에서, 적어도 하나의 R1은 메틸이 아니다. 일부 구체예들에서, 적어도 하나의 R1은 수소 또는 메틸이 아니다. 일부 구체예들에서, 화학식 (PL-I)의 화합물은 다음 화학식들 중 하나:
Figure pct00059
또는 이의 염이고, 이때:
각 t는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
각 u는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고; 그리고
각 v는 독립적으로 1, 2, 또는 3이다.
일부 구체예들에서, 화학식 (PL-I)의 화합물은 화학식 (PL-I-a)의 화합물:
Figure pct00060
(PL-I-a),
또는 이의 염이다.
일부 구체예들에서, 본 발명에서 유용한 또는 잠재적으로 유용한 인지질은 글리세라이드 모이어티 대신에 사이클릭 모이어티를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명에서 유용한 인지질은 DSPC, 또는 이의 유사체이고, 글리세라이드 모이어티 대신에 사이클릭 모이어티를 가진다. 일부 구체예들에서, 화학식 (PL-I)의 화합물은 화학식 (PL-I-b)의 화합물:
Figure pct00061
(PL-I-b),
또는 이의 염이다.
(ii) 인지질 꼬리 변형
일부 구체예들에서, 본 발명에서 유용한 또는 잠재적으로 유용한 인지질은 변형된 꼬리를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명에서 유용한 또는 잠재적으로 유용한 인지질은 DSPC, 또는 이의 유사체이고, 변형된 꼬리를 가진다. 본원에 기재된 “변형된 꼬리”는 보다 짧은 또는 보다 긴 지방족 사슬, 분지화 도입된 지방족 사슬, 치환기 도입된 지방족 사슬, 하나 이상의 메틸렌이 사이클릭 또는 헤테로원자 그룹으로 대체된 지방족 사슬, 또는 이의 임의의 조합을 가지는 꼬리일 수 있다. 일부 구체예들에서, 일부 구체예들에서, (PL-I)의 화합물은 화학식 (PL-I-a)의 화합물, 또는 이의 염이고, 이때 R2 중 적어도 하나는 각각의 R2 는 선택적으로 치환된 C1-30 알킬이고, 이 때 R2의 하나 이상의 메틸렌 단위들은 선택적으로 치환된 카보사이클릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴렌, 선택적으로 치환된 아릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로아릴렌, -N(RN)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -NRNC(O)N(RN)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NRN)-, -C(=NRN)N(RN)-, -NRNC(=NRN)-, -NRNC(=NRN)N(RN)-, -C(S)-, -C(S)N(RN)-, -NRNC(S)-, -NRNC(S)N(RN)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(RN)S(O)-, -S(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)N(RN)-, -OS(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)O-, -S(O)2-, -N(RN)S(O)2-, -S(O)2N(RN)-, -N(RN)S(O)2N(RN)-, -OS(O)2N(RN)-, 또는 -N(RN)S(O)2O-로 독립적으로 대체된다.
일부 구체예들에서, 화학식 (PL-I)의 화합물은 화학식 (PL-I-c)의 화합물:
Figure pct00062
또는 이의 염이고, 이때:
각 x는 독립적으로 0-30 사이 (0과 30 포함)의 정수이고; 그리고
각 경우에 G는 선택적으로 치환된 카보사이클릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴렌, 선택적으로 치환된 아릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로아릴렌, -N(RN)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -NRNC(O)N(RN)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NRN)-, -C(=NRN)N(RN)-, -NRNC(=NRN)-, -NRNC(=NRN)N(RN)-, -C(S)-, -C(S)N(RN)-, -NRNC(S)-, -NRNC(S)N(RN)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(RN)S(O)-, -S(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)N(RN)-, -OS(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)O-, -S(O)2-, -N(RN)S(O)2-, -S(O)2N(RN)-, -N(RN)S(O)2N(RN)-, -OS(O)2N(RN)-, 또는 -N(RN)S(O)2O-로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다. 각 경우는 본 발명의 별도의 구체예를 나타낸다.
일부 구체예들에서, 본 발명에서 유용하거나 잠재적으로 유용한 인지질은 변형된 포스포콜린 모이어티를 포함하고, 4차 아민을 포스포릴 그룹에 결합시키는 알킬 사슬은 에틸렌이 아니다 (예컨대, n은 2가 아니다). 그러므로, 일부 구체예들에서, 본 발명에서 유용하거나 잠재적으로 유용한 인지질은 화학식 (PL-I)의 화합물이고, 이 때 n은 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 일부 구체예들에서, 화학식 (PL-I)의 화합물은 다음 화학식들 중 하나:
Figure pct00063
또는 이의 염이다.
대체 지질
일부 구체예들에서, 대체 지질은 본 발명의 인지질 대신 사용된다. 이러한 대체 지질의 비-제한적 예들에는 다음이 포함된다:
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
균등예
장치, 시스템 및 방법의 예시적인 실시예들을 본원에 설명하였다. 다른 부분에서 언급된 바와 같이, 이러한 실시예는 예시 목적으로만 설명되었으며 제한적이지 않다. 다른 실시예가 가능하고 본 발명에 포함되며, 이는 본원에 포함된 기재내용들로부터 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 폭 및 범위는 전술한 실시예 중 어느 것에 의해 제한되어서는 안 되며, 본 발명 및 그 균등물에 의해 뒷받침되는 청구범위에 따라서만 정의되어야 한다. 더욱이, 본 발명의 실시예는 표적 입자 분리, 포커싱/농도에 대응하는 임의의 및 모든 요소를 포함하는 임의의 다른 개시된 방법, 시스템 및 장치로부터의 임의의 및 모든 요소를 추가로 포함할 수 있는 방법, 시스템 및 장치를 포함할 수 있다. 다시 말해서, 하나 또는 또 다른 개시된 실시예들의 구성요소는 기타 개시된 실시예들의 구성요소와 교환가능할 수 있다. 또한, 개시된 실시예들 중 하나 이상의 특징/요소가 제거될 수 있고, 이는 여전히 특허 가능한 발명을 생성할 수 있다 (따라서, 본 발명의 더 많은 구체예들을 생성함). 상응하게, 본 발명의 일부 구체예들은 구체적으로 하나 이상의 요소/특징을 없앰으로써 하나 및/또는 또 다른 참조와 특허상으로 구별될 수 있다. 다시 말해서, 특정 구체예들에 대한 청구범위는 하나 이상의 요소/특징을 구체적으로 배제하기 위한 부정적인 제한을 포함할 수 있으며, 그 결과 이러한 특징/구성요소를 포함하는 선행 기술과 특허법상 구별되는 구체예가 된다.
SEQUENCE LISTING <110> Moderna, Inc. <120> VORTEX MIXERS AND ASSOCIATED METHODS, SYSTEMS, AND APPARATUSES <130> MRNA-064/001WO <150> 62/799,636 <151> 2019-01-31 <150> 62/886,592 <151> 2019-08-14 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Polynucleotide <400> 1 caaaggctct tttcagagcc acca 24 <210> 2 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Polynucleotide <400> 2 caaaggcucu uuucagagcc acca 24

Claims (83)

  1. 와류 혼합기로서, 상기 와류 혼합기는
    제1 벽, 제2 벽, 및 제1 벽과 제2 벽을 연결하는 측면 벽을 갖는 와류 혼합 챔버;
    측면 벽을 따라 구성된 2개 이상의 입구 포트 - 각각의 입구 포트는 이에 연결된 입구 채널을 가지며, 상기 2개 이상의 입구 포트는 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격되고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성됨 - ; 및
    출구 채널이 연결된 출구 포트를 포함하고, 상기 출구 포트는 대략 제2 벽의 반경방향 중심에 구성되고, 출구 채널은 출구 포트로부터 와류 혼합 챔버로부터 이격되는 방향으로 연장되는 와류 혼합기.
  2. 제1항에 있어서, 와류 혼합 챔버는 둥글고 측면 벽은 제1 벽과 제2 벽의 둘레 주위에서 연장되는 와류 혼합기.
  3. 제1항에 있어서, 각각의 입구 채널은 단일의 소스로부터 유체를 수용하는 와류 혼합기.
  4. 제1항에 있어서, 각각의 입구 채널은 상이한 소스로부터 유체를 수용하는 와류 혼합기.
  5. 제1항에 있어서, 와류 혼합기는 4개의 입구 포트를 갖는 와류 혼합기.
  6. 제5항에 있어서, 4개의 입구 포트들 중 2개의 제1 입구 포트는 제1 소스로부터 유체를 수용하고 4개의 입구 포트들 중 2개의 제2 입구 포트는 제2 소스로부터 유체를 수용하는 와류 혼합기.
  7. 제6항에 있어서, 2개의 제1 입구 포트가 서로 마주보게 구성되고, 2개의 제2 입구 포트는 서로 마주보게 구성되어 2개의 제1 입구 포트는 약 180도로 이격되고 2개의 제2 입구 포트는 약 180도로 이격되며, 각각의 2개의 제1 입구 포트는 각각의 2개의 제2 입구 포트로부터 약 90도인 와류 혼합기.
  8. 제5항에 있어서, 각각의 4개의 입구 포트는 개별 소스로부터 유체를 수용하는 와류 혼합기.
  9. 제8항에 있어서, 4개의 입구 포트들 중 2개의 제1 입구 포트는 제1 유체를 수용하고 4개의 입구 포트들 중 2개의 제2 입구 포트는 제2 유체를 수용하고, 2개의 제1 입구 포트가 서로 마주보게 구성되고, 2개의 제2 입구 포트는 서로 마주보게 구성되어 2개의 제1 입구 포트는 약 180도로 이격되고 2개의 제2 입구 포트는 약 180도로 이격되며, 각각의 2개의 제1 입구 포트는 각각의 2개의 제2 입구 포트로부터 약 90도인 와류 혼합기.
  10. 제1항에 있어서, 출구 포트 및 출구 채널은 제2 벽으로부터 대략 90도의 각도인 와류 혼합기.
  11. 제1항에 있어서, 측면 벽의 높이는 2개 이상의 입구 포트의 높이와 동일한 와류 혼합기.
  12. 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 측면 벽의 높이는 2개 이상의 입구 포트의 높이보다 큰 와류 혼합기.
  13. 제1항에 있어서, 출구 포트는 x의 직경을 가지며,
    제1 벽 및 제2 벽은 5*x의 직경을 가지며,
    측면 벽은 1.75*x의 높이를 가지며,
    2개 이상의 입구 포트는 0.75*x의 높이를 각각 갖는 와류 혼합기.
  14. 제13항에 있어서, x는 1mm, 2mm, 4mm, 5mm, 또는 0.5mm일 수 있는 와류 혼합기.
  15. 단일 평면에 d x w 구성으로 나란히 배열된 n개의 와류 혼합기를 포함하는 시스템으로서, n, d, 및 w는 정수이고;
    와류 혼합기 각각은 전항들 중 어느 한 항에 기재된 특성을 포함하는 것인 시스템.
  16. 와류 혼합기로서, 상기 와류 혼합기는
    제1 벽, 제2 벽, 및 제1 벽과 제2 벽을 연결하는 측면 벽을 갖는 와류 혼합 챔버;
    측면 벽을 따라 구성된 2개 이상의 일차 입구 포트 - 각각의 일차 입구 포트는 이에 연결된 일차 입구 채널을 가지며, 상기 2개 이상의 일차 입구 포트는 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격되고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성됨 - ;
    이차 입구 채널이 연결되는 제1 벽의 대략 반경방향 중심에 구성된 이차 입구 포트; 및
    출구 채널이 연결된 출구 포트를 포함하고, 상기 출구 포트는 대략 제2 벽의 반경방향 중심에 구성되고, 출구 채널은 출구 포트로부터 와류 혼합 챔버로부터 이격되는 방향으로 연장되는 와류 혼합기.
  17. 제16항에 있어서, 와류 혼합 챔버는 둥글고 측면 벽은 제1 벽과 제2 벽의 둘레 주위에서 연장되는 와류 혼합기.
  18. 제16항에 있어서, 각각의 입구 채널은 단일의 소스로부터 유체를 수용하는 와류 혼합기.
  19. 제16항에 있어서, 각각의 입구 채널은 상이한 소스로부터 유체를 수용하는 와류 혼합기.
  20. 제16항에 있어서, 와류 혼합기는 4개의 일차 입구 포트를 갖는 와류 혼합기.
  21. 제20항에 있어서, 4개의 일차 입구 포트들 중 2개의 제1 일차 입구 포트는 제1 소스로부터 유체를 수용하고, 4개의 일차 입구 포트들 중 2개의 제2 입구 포트는 제2 소스로부터 유체를 수용하고, 이차 입구 포트는 제3 소스로부터 유체를 수용하는 와류 혼합기.
  22. 제21항에 있어서, 2개의 일차 제1 입구 포트가 서로 마주보게 구성되고, 2개의 이차 제2 입구 포트는 서로 마주보게 구성되어 2개의 일차 제1 입구 포트는 약 180도로 이격되고 2개의 일차 제2 입구 포트는 약 180도로 이격되며, 각각의 2개의 일차 제1 입구 포트는 각각의 2개의 이차 제2 입구 포트로부터 약 90도인 와류 혼합기.
  23. 제20항에 있어서, 각각의 4개의 일차 입구 포트는 개별 소스로부터 유체를 수용하는 와류 혼합기.
  24. 제23항에 있어서, 4개의 입구 포트들 중 2개의 일차 제1 입구 포트는 제1 유체를 수용하고 4개의 입구 포트들 중 2개의 일차 제2 입구 포트는 제2 유체를 수용하고, 2개의 일차 제1 입구 포트가 서로 마주보게 구성되고, 2개의 일차 제2 입구 포트는 서로 마주보게 구성되어 2개의 일차 제1 입구 포트는 약 180도로 이격되고 2개의 일차 제2 입구 포트는 약 180도로 이격되며, 각각의 2개의 일차 제1 입구 포트는 각각의 2개의 일차 제2 입구 포트로부터 약 90도인 와류 혼합기.
  25. 제16항에 있어서, 출구 포트 및 출구 채널은 제2 벽으로부터 대략 90도의 각도인 와류 혼합기.
  26. 제16항에 있어서, 측면 벽의 높이는 2개 이상의 입구 포트의 높이와 동일한 와류 혼합기.
  27. 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 측면 벽의 높이는 2개 이상의 입구 포트의 높이보다 큰 와류 혼합기.
  28. 제16항에 있어서, 출구 포트는 x의 직경을 가지며,
    제1 벽 및 제2 벽은 5*x의 직경을 가지며,
    측면 벽은 1.75*x의 높이를 가지며,
    2개 이상의 일차 입구 포트는 0.75*x의 높이를 각각 가지며,
    이차 입구 포트는 0.5*x의 직경을 갖는 와류 혼합기.
  29. 제28항에 있어서, x는 1mm, 2mm, 4mm, 5mm, 또는 0.5mm일 수 있는 와류 혼합기.
  30. 단일 평면에 d x w 구성으로 나란히 배열된 n개의 와류 혼합기를 포함하는 시스템으로서, n, d, 및 w는 정수이고;
    와류 혼합기 각각은 전항들 중 어느 한 항에 기재된 특성을 포함하는 것인 시스템.
  31. 혼합 시스템으로서,
    초기 와류 혼합기를 포함하고, 초기 와류 혼합기는
    제1 벽, 제2 벽, 및 제1 벽과 제2 벽을 연결하는 측면 벽을 갖는 와류 혼합 챔버;
    측면 벽을 따라 구성된 2개 이상의 입구 포트 - 각각의 입구 포트는 이에 연결된 입구 채널을 가지며, 상기 2개 이상의 입구 포트는 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격되고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성됨 - ;
    출구 채널이 연결된 출구 포트를 포함하고, 상기 출구 포트는 제2 벽의 반경방향 중심에 구성되고, 출구 채널은 출구 포트로부터 와류 혼합 챔버로부터 이격되는 방향으로 연장되고, 및
    후속 와류 혼합기를 포함하고, 상기 후속 와류 혼합기는
    제1 벽, 제2 벽, 및 제1 벽과 제2 벽을 연결하는 측면 벽을 갖는 와류 혼합 챔버;
    측면 벽을 따라 구성된 2개 이상의 입구 포트 - 각각의 입구 포트는 이에 연결된 입구 채널을 가지며, 상기 2개 이상의 입구 포트는 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격되고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성됨 - ;
    추가 입구 포트, 및
    출구 채널이 연결된 출구 포트를 포함하고, 상기 출구 포트는 제2 벽의 반경방향 중심에 구성되고, 출구 채널은 출구 포트로부터 와류 혼합 챔버로부터 이격되는 방향으로 연장되는 혼합 시스템.
  32. 제31항에 있어서, 추가 입구 포트는 후속 와류 혼합기의 제1 벽의 반경방향 중심에 구성되는 혼합 시스템.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 추가 입구 포트는 초기 와류 혼합기 출구 포트로부터 연장되는 출구 채널에 연결되는 혼합 시스템.
  34. 제31항에 있어서, 초기 와류 혼합기 출구 포트로부터 연장되는 출구 채널의 단부에 구성된 스플리터를 추가로 포함하고, 스플리터는 제1 출구 및 제2 출구를 갖는 혼합 시스템.
  35. 제34항에 있어서, 제1 출구는 2개 이상의 입구 포트 중 제1 입구 포트에 연결되고, 제2 출구는 2개 이상의 입구 포트 중 제2 입구 포트에 연결되는 혼합 시스템.
  36. 제35항에 있어서, 2개 이상의 입구 포트 중 제1 입구 포트에 연결된 입구 채널은 제1 출구에 수직이고, 2개 이상의 입구 포트 중 제2 입구 포트에 연결된 입구 채널은 제2 출구에 수직인 혼합 시스템.
  37. 제35항에 있어서, 추가 입구 포트는 추가 입구 채널에 연결되는 혼합 시스템.
  38. 제37항에 있어서, 추가 입구 채널은 제1 섹션 및 제2 섹션을 포함하고, 제2 섹션은 추가 입구 포트에 연결되는 혼합 시스템.
  39. 제38항에 있어서, 제2 섹션은 제1 섹션에 대략 수직인 혼합 시스템.
  40. 제38항에 있어서, 제2 섹션은 2개 이상의 입구 포트들 중 제1 입구 포트에 연결된 입구 채널에 대략 수직이고, 제2 섹션은 2개 이상의 입구 포트들 중 제2 입구 포트에 연결된 입구 채널에 수직인 혼합 시스템.
  41. 제38항에 있어서, 제2 섹션은 후속 와류 혼합기 출구 채널에 대략 평행한 혼합 시스템.
  42. 제36항에 있어서, 후속 와류 혼합기는 제2 추가 입구 포트를 추가로 포함하는 혼합 시스템.
  43. 제20항에 있어서, 추가 입구 포트 및 제2 추가 입구 포트는 측면 벽을 따라 구성되고, 추가 입구 포트 및 제2 추가 입구 포트는 추가 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격되고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성되는 혼합 시스템.
  44. 제21항에 있어서, 후속 와류 혼합기는 입구 포트가 대략 90도로 각각 이격되도록 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 각각 이격되는 2개의 입구 포트, 추가 입구 포트, 및 제2 추가 입구 포트를 갖는 혼합 시스템.
  45. 제22항에 있어서, 제2 스플리터를 추가로 포함하고, 제2 스플리터는 추가 입구 포트에 연결된 제1 출구 및 제2 추가 입구 포트에 연결된 제2 출구를 갖는 혼합 시스템.
  46. 제35항에 있어서, 스플리터는 제3 출구 및 제4 출구를 가지며, 후속 와류 혼합기는 4개의 입구 포트를 가지며, 제1 출구는 4개의 입구 포트들 중 제1 입구 포트에 연결되고, 제2 출구는 4개의 입구 포트들 중 제2 입구 포트에 연결되고, 제3 출구는 4개의 입구 포트들 중 제3 입구 포트에 연결되고, 제4 출구는 4개의 입구 포트들 중 제4 입구 포트에 연결되는 혼합 시스템.
  47. 제35항에 있어서, 후속 와류 혼합기는 4개의 입구 포트를 가지며, 제1 출구는 4개의 입구 포트들 중 제1 입구 포트에 연결되고, 제2 출구는 4개의 입구 포트들 중 제2 입구 포트에 연결되고, 제3 입구 포트는 흡입 포트에 연결되고, 제4 입구 포트는 추가 흡입 포트에 연결되는 연결되는 혼합 시스템.
  48. 제31항에 있어서, 초기 와류 혼합기 출구 포트는 x의 직경을 가지며,
    초기 와류 제1 벽 및 초기 와류 제2 벽은 5*x의 직경을 가지며,
    초기 와류 측면 벽은 1.75*x의 높이를 가지며,
    2개 이상의 초기 와류 입구 포트는 0.75*x의 높이를 각각 갖는 혼합 시스템.
  49. 제31항에 있어서, 후속 와류 혼합기 출구 포트는 y의 직경을 가지며,
    후속 와류 혼합기 제1 벽 및 후속 와류 혼합기 제2 벽은 5*y의 직경을 가지며,
    후속 와류 혼합기 측면 벽은 1.75*y의 높이를 가지며,
    2개 이상의 후속 와류 혼합기 입구 포트는 0.75*y의 높이를 각각 갖는 혼합 시스템.
  50. 제31항에 있어서, 초기 와류 혼합기 출구 포트는 x의 직경을 가지며,
    초기 와류 제1 벽 및 초기 와류 제2 벽은 5*x의 직경을 가지며,
    초기 와류 측면 벽은 1.75*x의 높이를 가지며,
    2개 이상의 초기 와류 입구 포트는 0.75*x의 높이를 각각 가지며,
    후속 와류 혼합기 출구 포트는 y의 직경을 가지며,
    후속 와류 혼합기 제1 벽 및 후속 와류 혼합기 제2 벽은 5*y의 직경을 가지며,
    후속 와류 혼합기 측면 벽은 1.75*y의 높이를 가지며,
    2개 이상의 후속 와류 혼합기 입구 포트는 0.75*y의 높이를 각각 갖는 혼합 시스템.
  51. 제26항에 있어서, x=y인 혼합 시스템.
  52. 제26항에 있어서, x>y인 혼합 시스템.
  53. 제31항에 있어서, 초기 와류 혼합기 및 후속 와류 혼합기는 스테인레스 스틸, PEEK, LFEM, 아크릴, 3-D 인쇄 미디어 및 첨가 제조 재료 중 하나 이상으로 제조되는 혼합 시스템.
  54. 제31항 또는 제53항에 있어서, 초기 와류 혼합기 및 후속 와류 혼합기는 동일한 재료로 제조되는 혼합 시스템.
  55. 제31항에 있어서, 초기 와류 혼합기 출구 포트 및 초기 와류 출구 채널은 초기 와류 제2 벽으로부터 대략 90도의 각도이고, 후속 와류 혼합기 출구 포트 및 후속 와류 출구 채널은 후속 와류 제2 벽으로부터 대략 90도의 각도인 혼합 시스템.
  56. 혼합 시스템으로서,
    초기 와류 혼합기를 포함하고, 초기 와류 혼합기는
    제1 벽, 제2 벽, 및 제1 벽과 제2 벽을 연결하는 측면 벽을 갖는 와류 혼합 챔버;
    측면 벽을 따라 구성된 2개 이상의 입구 포트 - 각각의 입구 포트는 이에 연결된 입구 채널을 가지며, 상기 2개 이상의 입구 포트는 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격되고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성됨 - ;
    출구 채널이 연결된 출구 포트를 포함하고, 상기 출구 포트는 제2 벽의 반경방향 중심에 구성되고, 출구 채널은 출구 포트로부터 와류 혼합 챔버로부터 이격되는 방향으로 연장되고, 및
    후속 와류 혼합기를 포함하고, 상기 후속 와류 혼합기는
    제1 벽, 제2 벽, 및 제1 벽과 제2 벽을 연결하는 측면 벽을 갖는 와류 혼합 챔버;
    2개 이상의 입구 포트 - 2개 이상의 입구 포트들 중 제1 입구 포트는 측면 벽에 연결되고 상기 제1 입구 포트는 초기 와류 혼합기의 출구 채널에 연결됨 - ,
    출구 채널이 연결된 출구 포트를 포함하고, 상기 출구 포트는 제2 벽의 반경방향 중심에 구성되고, 출구 채널은 출구 포트로부터 와류 혼합 챔버로부터 이격되는 방향으로 연장되는 혼합 시스템.
  57. 제56항에 있어서, 후속 와류 혼합기의 2개 이상의 입구 포트들 중 제2 입구 포트는 후속 와류 혼합기의 와류 혼합 챔버의 제1 벽의 반경방향 중심에 구성되는 혼합 시스템.
  58. 제57항에 있어서, 후속 와류 혼합기의 2개 이상의 입구 포트들 중 제2 입구 포트는 후속 와류 혼합기의 와류 혼합 챔버의 제1 벽의 반경방향 중심에 구성되는 혼합 시스템.
  59. 제57항에 있어서, 후속 와류 혼합기의 2개 이상의 입구 포트들 중 제2 입구 포트는 입구 채널에 연결되고, 상기 입구 채널은 후속 와류 혼합기의 출구 채널에 평행한 혼합 시스템.
  60. 제56항에 있어서, 후속 와류 혼합기의 2개 이상의 입구 포트들 중 제2 입구 포트는 후속 와류 혼합기의 와류 혼합 챔버의 측면 벽에 연결되는 혼합 시스템.
  61. d x w 구성으로 단일 평면에 나란히 배열된 n개의 혼합 시스템을 포함하는 혼합 시스템의 네트워크로서, n, d, 및 w는 정수이고;
    각각의 혼합 시스템은 제31항 내지 제60항 중 어느 한 항에 기재된 특성을 포함하는 혼합 시스템의 네트워크.
  62. 혼합 방법으로서,
    제1 와류 혼합 챔버 및 2개 이상의 입구 포트로부터 제1 유체를 수용하는 단계;
    제1 와류 혼합 챔버에서 2개 이상의 입구 포트로부터 제2 유체를 수용하는 단계;
    제1 유출 유체를 형성하기 위해 제1 와류 혼합 챔버에서 제1 유체와 제2 유체를 혼합하는 단계;
    제1 유출 유체를 제1 출구 채널로 유출시키는 단계;
    제1 유출 유체를 스플리터를 통해 2개 이상의 채널로 분할하는 단계;
    제2 와류 혼합 챔버에서 2개 이상의 채널에 연결된 2개 이상의 입구 포트로부터 제1 유출 유체를 수용하는 단계;
    제2 와류 혼합 챔버에서 제3 유체를 수용하는 단계;
    제2 유출 유체를 형성하기 위해 제2 와류 혼합 챔버에서 유출 유체와 제3 유체를 혼합하는 단계; 및
    제2 유출 유체를 제2 출구 채널로 유출시키는 단계를 포함하는 혼합 방법.
  63. 제62항에 있어서, 제1 유체는 완충액을 포함하고 제2 유체는 지질 혼합물을 포함하고, 제1 유출 유체는 빈 나노입자를 포함하는 혼합 방법.
  64. 제63항에 있어서, 제3 유체는 핵산을 포함하고, 제2 유출 유체는 핵산-보유 나노입자를 포함하는 혼합 방법.
  65. 제64항에 있어서, 핵산은 소수성 상호작용 및 하전 상호작용 중 적어도 하나에 의해 나노입자에 통합되는 혼합 방법.
  66. 제64항에 있어서, 핵산이 제2 와류 혼합 챔버에 수용되기 전에 초기 와류 혼합 챔버에서 빈 나노입자의 형성은 핵산이 지질 혼합물과 혼합되기 전에 완충액에 대한 핵산의 직접 노출을 방지하는 혼합 방법.
  67. 제65항에 있어서, 완충액에 대한 핵산의 직접 노출을 방지하는 단계는 핵산의 산성화 및 분해 중 적어도 하나를 방지하는 혼합 방법.
  68. 제66항에 있어서, 핵산은 RNA인 혼합 방법.
  69. 혼합 시스템으로서,
    복수의 와류 혼합기를 포함하고, 각각의 와류 혼합기는
    제1 벽, 제2 벽, 및 제1 벽과 제2 벽을 연결하는 측면 벽을 갖는 와류 혼합 챔버;
    측면 벽을 따라 구성된 2개 이상의 입구 포트 - 각각의 입구 포트는 이에 연결된 입구 채널을 가지며, 상기 2개 이상의 입구 포트는 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격되고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성됨 - ;
    출구 채널이 연결된 출구 포트를 포함하고, 상기 출구 포트는 제2 벽의 반경방향 중심에 구성되고, 출구 채널은 출구 포트로부터 와류 혼합 챔버로부터 이격되는 방향으로 연장되고, 복수의 와류 혼합기는 d x w 구성으로 혼합 플레이트 상의 단일 평면에 나란히 배열된 n개의 와류 혼합기를 포함하고, n, d, 및 w는 정수인 혼합 시스템.
  70. 제69항에 있어서, n = 24, d = 6, 및 w = 4인 혼합 시스템.
  71. 제69항에 있어서, 각각의 와류 혼합기는 4개의 입구 포트를 갖는 혼합 시스템.
  72. 제71항에 있어서, 각각의 입구 포트는 피펫에 유체 결합되는 혼합 시스템.
  73. 제71항에 있어서, 각각의 와류 혼합기의 4개의 입구 포트들 중 2개의 제1 입구 포트는 제1 소스로부터 유체를 수용하고 4개의 입구 포트들 중 2개의 제2 입구 포트는 제2 소스로부터 유체를 수용하는 혼합 시스템.
  74. 제71항에 있어서, 각각의 와류 혼합기의 4개의 입구 포트들 중 3개의 제1 입구 포트는 제1 소스로부터 유체를 수용하고 4개의 입구 포트들 중 제4 입구 포트는 제2 소스로부터 유체를 수용하는 혼합 시스템.
  75. 제72항에 있어서, 각각의 와류 혼합기의 2개의 제1 입구 포트가 서로 마주보게 구성되고, 각각의 와류 혼합기의 2개의 제2 입구 포트는 서로 마주보게 구성되어 2개의 제1 입구 포트는 약 180도로 이격되고 2개의 제2 입구 포트는 약 180도로 이격되며, 각각의 2개의 제1 입구 포트는 각각의 2개의 제2 입구 포트로부터 약 90도인 혼합 시스템.
  76. 혼합 시스템으로서,
    복수의 혼합 서브시스템을 포함하고, 각각의 혼합 서브시스템은
    초기 와류 혼합기를 포함하고, 상기 초기 와류 혼합기는
    제1 벽, 제2 벽, 및 제1 벽과 제2 벽을 연결하는 측면 벽을 갖는 와류 혼합 챔버;
    측면 벽을 따라 구성된 2개 이상의 입구 포트 - 각각의 입구 포트는 이에 연결된 입구 채널을 가지며, 상기 2개 이상의 입구 포트는 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격되고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성됨 - ; 및
    출구 채널이 연결된 출구 포트를 포함하고, 상기 출구 포트는 제2 벽의 반경방향 중심에 구성되고, 출구 채널은 출구 포트로부터 와류 혼합 챔버로부터 이격되는 방향으로 연장되고,
    후속 와류 혼합기를 포함하고, 상기 후속 와류 혼합기는
    제1 벽, 제2 벽, 및 제1 벽과 제2 벽을 연결하는 측면 벽을 갖는 와류 혼합 챔버;
    측면 벽을 따라 구성된 2개 이상의 입구 포트 - 각각의 입구 포트는 이에 연결된 입구 채널을 가지며, 상기 2개 이상의 입구 포트는 와류 혼합 챔버 주위에 대략 균등하게 이격되고 와류 혼합 챔버에 접선 방향으로 구성됨 - ,
    추가 입구 포트 및
    출구 채널이 연결된 출구 포트를 포함하고, 상기 출구 포트는 제2 벽의 반경방향 중심에 구성되고, 출구 채널은 출구 포트로부터 와류 혼합 챔버로부터 이격되는 방향으로 연장되고, 복수의 와류 혼합기는 d x w 구성으로 혼합 플레이트 상의 단일 평면에 나란히 배열된 n개의 혼합 서브시스템을 포함하고, n, d, 및 w는 정수인 혼합 시스템.
  77. 제76항에 있어서, n = 24, d = 6, 및 w = 4인 혼합 시스템.
  78. 제76항에 있어서, 각각의 초기 와류 혼합기는 4개의 입구 포트를 갖는 혼합 시스템.
  79. 제78항에 있어서, 각각의 초기 와류 혼합기 입구 포트는 피펫에 유체 결합되는 혼합 시스템.
  80. 제79항에 있어서, 각각의 초기 와류 혼합기의 4개의 입구 포트들 중 2개의 제1 입구 포트는 제1 소스로부터 유체를 수용하고 4개의 입구 포트들 중 2개의 제2 입구 포트는 제2 소스로부터 유체를 수용하는 혼합 시스템.
  81. 제79항에 있어서, 각각의 와류 혼합기의 4개의 입구 포트들 중 3개의 제1 입구 포트는 제1 소스로부터 유체를 수용하고 4개의 입구 포트들 중 제4 입구 포트는 제2 소스로부터 유체를 수용하는 혼합 시스템.
  82. 제79항에 있어서, 각각의 초기 와류 혼합기의 2개의 제1 입구 포트가 서로 마주보게 구성되고, 각각의 와류 혼합기의 2개의 제2 입구 포트는 서로 마주보게 구성되어 2개의 제1 입구 포트는 약 180도로 이격되고 2개의 제2 입구 포트는 약 180도로 이격되며, 각각의 2개의 제1 입구 포트는 각각의 2개의 제2 입구 포트로부터 약 90도인 혼합 시스템.
  83. 제69항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
    생성물 용기를 이동시키도록 구성된 컨베이어 스탠드, 및
    혼합 플레이트로부터 혼합 생성물을 수용하도록 구성된 복수의 n개의 생성물 용기를 추가로 포함하고,
    혼합 플레이트는 컨베이어 스탠드에 대해 고정된 위치에 있고; 컨베이어 스탠드는 제1 생성물 용기를 혼합 플레이트로부터 생성물을 수용하는 위치로 제1 생성물 용기를 이동시키고, 컨베이어 스탠드는 혼합 시스템으로부터 생성물을 수용하기 위해 후속 n-1개의 생성물 용기를 이동시키고; n은 2 내지 30 사이의 정수인 혼합 시스템.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102340408B1 (ko) * 2020-08-05 2021-12-16 건국대학교 산학협력단 용기 고정 장치
CN113908744A (zh) * 2021-11-08 2022-01-11 常州大学 一种微流控混合器及其应用
WO2023193002A1 (en) * 2022-04-01 2023-10-05 Modernatx, Inc. Cross mixers for lipid nanoparticle production, and methods of operating the same
WO2024091918A2 (en) * 2022-10-25 2024-05-02 Modernatx, Inc. Methods of lipid nanoparticle production in cross-mixers
JP7457194B1 (ja) 2023-08-18 2024-03-27 旭有機材株式会社 渦流式流体混合器
JP7457193B1 (ja) 2023-08-18 2024-03-27 旭有機材株式会社 渦流式流体混合器

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5013497A (en) * 1988-03-03 1991-05-07 Micro-Pak, Inc. Method and apparatus for producing lipid vesicles
US5405497A (en) * 1990-08-28 1995-04-11 Kamyr, Inc. Method of chemically reacting a liquid with a gas in a vortex
GB9320455D0 (en) * 1993-10-05 1993-11-24 Atomic Energy Authority Uk Vortex mixer
US6310197B1 (en) 1997-11-12 2001-10-30 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Translation enhancer element of the human amyloid precursor protein gene
EP1259602A1 (en) 2000-01-28 2002-11-27 The Scripps Research Institute Methods of identifying synthetic transcriptional and translational regulatory elements, and compositions relating to same
US7468275B2 (en) 2000-01-28 2008-12-23 The Scripps Research Institute Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
WO2001089675A2 (en) * 2000-05-24 2001-11-29 Micronics, Inc. Jet vortex mixer
EP2305699B1 (de) 2001-06-05 2014-08-13 CureVac GmbH Stabilisierte mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt und optimierter Codon Usage für die Impfung gegen Schlafkrankheit, Leishmaniose und Toxoplasmose
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
DE10335833A1 (de) 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
DE102005023170A1 (de) 2005-05-19 2006-11-23 Curevac Gmbh Optimierte Formulierung für mRNA
AU2006283077B2 (en) 2005-08-24 2012-06-28 The Scripps Research Institute Translation Enhancer-Element dependent vector systems
DE102006007433A1 (de) 2006-02-17 2007-08-23 Curevac Gmbh Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure
EP2049665A2 (en) 2006-07-28 2009-04-22 Applera Corporation Dinucleotide mrna cap analogs
EP2046954A2 (en) 2006-07-31 2009-04-15 Curevac GmbH NUCLEIC ACID OF FORMULA (I): GIXmGn, OR (II): CIXmCn, IN PARTICULAR AS AN IMMUNE-STIMULATING AGENT/ADJUVANT
JP5030520B2 (ja) 2006-09-29 2012-09-19 富士フイルム株式会社 流体混合方法及びマイクロデバイス
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
DE102006061015A1 (de) 2006-12-22 2008-06-26 Curevac Gmbh Verfahren zur Reinigung von RNA im präparativen Maßstab mittels HPLC
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
WO2008127688A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Hart Communication Foundation Synchronizing timeslots in a wireless communication protocol
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
CA2904904A1 (en) 2007-12-11 2009-06-18 The Scripps Research Institute Compositions and methods related to mrna translational enhancer elements
AU2009210266B2 (en) 2008-01-31 2015-01-29 CureVac SE Nucleic acids comprising formula (NuGlXmGmGnNv)a and derivatives thereof as an immunostimulating agents/adjuvants
DE102008009199A1 (de) * 2008-02-15 2009-08-27 Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh Reaktionsmischersystem zur Vermischung und chemischer Reaktion von mindestens zwei Fluiden
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
JP4798174B2 (ja) * 2008-05-21 2011-10-19 株式会社日立プラントテクノロジー 乳化装置
PL215513B1 (pl) 2008-06-06 2013-12-31 Univ Warszawski Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
WO2010088927A1 (en) 2009-02-09 2010-08-12 Curevac Gmbh Use of pei for the improvement of endosomal release and expression of transfected nucleic acids, complexed with cationic or polycationic compounds
HUE056773T2 (hu) 2009-06-10 2022-03-28 Arbutus Biopharma Corp Továbbfejlesztett lipid készítmény
EP2281579A1 (en) 2009-08-05 2011-02-09 BioNTech AG Vaccine composition comprising 5'-Cap modified RNA
US20110053829A1 (en) 2009-09-03 2011-03-03 Curevac Gmbh Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
KR101148080B1 (ko) * 2009-12-07 2012-06-13 (주)인사이드밸류 유체 혼합장치
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
WO2011127255A1 (en) * 2010-04-08 2011-10-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Preparation of lipid nanoparticles
EP2387999A1 (en) 2010-05-21 2011-11-23 CureVac GmbH Histidine-containing solution for transfection and/or injection of nucleic acids and uses thereof
WO2012009644A2 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Arizona Board Of Regents Methods to identify synthetic and natural rna elements that enhance protein translation
DK2449113T3 (en) 2010-07-30 2016-01-11 Curevac Ag Complex formation of nucleic acids with the disulfide cross-linked cationic components for transfection and immunostimulation
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
WO2012089225A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 Curevac Gmbh Combination of vaccination and inhibition of mhc class i restricted antigen presentation
EP3202760B1 (en) 2011-01-11 2019-08-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pegylated lipids and their use for drug delivery
WO2012116715A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in newborns and infants
WO2012113413A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Curevac Gmbh Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
WO2013103659A1 (en) 2012-01-04 2013-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Stabilizing rna by incorporating chain-terminating nucleosides at the 3'-terminus
EP2623121A1 (en) 2012-01-31 2013-08-07 Bayer Innovation GmbH Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and an antigen
WO2013113325A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Negatively charged nucleic acid comprising complexes for immunostimulation
WO2013113326A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
WO2013120499A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly (a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded pathogenic antigen
WO2013120498A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded allergenic antigen or an autoimmune self-antigen
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
WO2013120500A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
JP6301906B2 (ja) 2012-03-27 2018-03-28 キュアバック アーゲー ５’ｔｏｐｕｔｒを含む人工核酸分子
CN104220599A (zh) 2012-03-27 2014-12-17 库瑞瓦格有限责任公司 人工核酸分子
CA2859452C (en) 2012-03-27 2021-12-21 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules for improved protein or peptide expression
WO2013174409A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Curevac Gmbh Reversible immobilization and/or controlled release of nucleic acid containing nanoparticles by (biodegradable) polymer coatings
SG11201506052PA (en) 2013-02-22 2015-09-29 Curevac Gmbh Combination of vaccination and inhibition of the pd-1 pathway
WO2015002667A1 (en) 2013-07-01 2015-01-08 Myq, Inc. A location regulated point-of-sale system and enhancements
WO2015024668A2 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Curevac Gmbh Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
RU2733424C2 (ru) 2013-08-21 2020-10-01 Куревак Аг Способ повышения экспрессии кодируемых рнк белков
CN105517566A (zh) 2013-08-21 2016-04-20 库瑞瓦格股份公司 用于治疗前列腺癌的组合物和疫苗
WO2015024665A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Curevac Gmbh Rabies vaccine
KR20160042935A (ko) 2013-08-21 2016-04-20 큐어백 아게 폐암 치료를 위한 조성물 및 백신
CA2915730A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Karl-Josef Kallen A combination rsv/influenza a vaccine
ES2806575T3 (es) 2013-11-01 2021-02-18 Curevac Ag ARN modificado con propiedades inmunoestimuladoras disminuidas
US9956532B2 (en) * 2013-11-07 2018-05-01 U.S. Department Of Energy Apparatus and method for generating swirling flow
CN111304231A (zh) 2013-12-30 2020-06-19 库瑞瓦格股份公司 人工核酸分子
WO2015101416A1 (en) 2013-12-30 2015-07-09 Curevac Gmbh Methods for rna analysis
CA2927254C (en) 2013-12-30 2023-10-24 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
EP3110401A4 (en) 2014-02-25 2017-10-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
JP6373749B2 (ja) * 2014-12-19 2018-08-15 富士フイルム株式会社 リポソームの製造方法及びリポソーム製造装置
US10035113B2 (en) * 2015-02-26 2018-07-31 Tokyo Electron Limited Method and system for a spiral mixer
EP3288671A4 (en) 2015-04-28 2019-01-16 The University Of British Columbia DISPOSABLE MICROFLUIDIC CARTRIDGE
JP6925020B2 (ja) 2017-03-22 2021-08-25 国立大学法人横浜国立大学 混合装置及び混合方法

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