WO2002077281A1 - Procede de detection d'acide nucleique relatif a une maladie - Google Patents

Procede de detection d'acide nucleique relatif a une maladie Download PDF

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WO2002077281A1
WO2002077281A1 PCT/JP2002/002030 JP0202030W WO02077281A1 WO 2002077281 A1 WO2002077281 A1 WO 2002077281A1 JP 0202030 W JP0202030 W JP 0202030W WO 02077281 A1 WO02077281 A1 WO 02077281A1
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Koji Hashimoto
Michie Hashimoto
Shunji Mishiro
Yasuhiko Oota
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Kabushiki Kaisha Toshiba
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining information about a nucleic acid associated with a disease obtained from an individual.
  • the present invention relates to a method for obtaining information on an individual's nucleic acid and information on a nucleic acid obtained about a disease, particularly information on a nucleic acid of a pathogenic microorganism associated with a disease.
  • the present invention also relates to a probe-immobilized substrate, particularly to a probe-immobilized chip for use in the above method.
  • the DNA chip is a glass-silicon chip of several cm square on which multiple types of DNA probes having different sequences are immobilized.
  • the DNA probe on such a chip is reacted with a sample nucleic acid labeled with a fluorescent dye or a radioisotope (RI), or a mixture of an unlabeled sample nucleic acid and a labeled oligonucleotide.
  • a sequence complementary to the DNA probe immobilized on the chip is present in the sample, a signal derived from the label used at a specific site on the chip is obtained. Therefore, if the sequence (sequence) and position of the immobilized DNA probe are known in advance, it is possible to examine the base sequence (sequence) present in the sample nucleic acid (Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5022 (1994), Parinov et al., Nucleic Acids Res., 24, 2998 (1996). .
  • a nucleic acid unique to the patient By obtaining a sample substance such as blood obtained from a patient, and extracting nucleic acid from the sample substance, a nucleic acid unique to the patient can be obtained. Further subjecting the patient's unique nucleic acid to genetic analysis can provide information related to the patient's constitution, such as the susceptibility to a disease, the efficacy of a drug, and the likelihood of Z or side effects. It is possible to obtain. As a result, it is possible to obtain information specific to the patient. Therapies specifically designed for individual patients are called “tailor-made medicine”.
  • a method for obtaining first information about nucleic acid of an individual exposed to a specific disease and second information about nucleic acid from a pathogenic microorganism present in the individual, wherein the pathogenic microorganism is associated with the specific disease comprising:
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a DNA chip according to the present embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the PNA chip according to the present embodiment.
  • FIG. 3 is a flowchart showing a method according to the present embodiment.
  • the present invention relates to a method for obtaining information about nucleic acids from an individual exposed to a disease.
  • the individual may be an individual at an early or late stage of the disease. Further, the individual may be an individual suspected of suffering from the disease or an individual suspected of suffering from the disease in the future.
  • the present invention relates to a correlation between nucleic acid information from both the individual and the disease.
  • the individual has been exposed to a disease associated with a pathogenic microorganism such as, for example, a virus, pateria, yeast, or mycoplasma.
  • the present invention also relates to a correlation between nucleic acid information obtained from pathogenic microorganisms present in the individual and nucleic acids from the individual.
  • the present invention provides:
  • nucleic acids associated with the specific disease derived from pathogenic microorganisms present in the individual is also provided.
  • the present invention relates to a specific nucleic acid probe used in identification of a nucleic acid from the individual and a nucleic acid from the pathogenic microorganism.
  • the nucleic acid probe is immobilized on a substrate, such as a chip.
  • a probe-immobilized substrate for example, a probe-immobilized chip, for use in the method.
  • Other substrates such as DNA cavitation electrophoresis devices, beads, membrane-based arrays, microtiter plates, electrodes, semiconductor-based devices, and other waveguide-based materials
  • SPR DNA cavitation electrophoresis devices
  • QCM quartz crystal microbalance
  • mass spectroscopy mass spectroscopy
  • allele-specific oligohyperidization restriction methods (microcloth titer array, dia konanore, genore, turtle 5 ⁇ swimming; microtitierarray diagonal gel electrophoresis), ligature yoyo Method (padlock probe), oligonucleotide probe assay, dye-labeled oligonucleotide probe probe, nucleic acid probe Leo Doin Co., Ltd. (mini sequencing, template, direct, die, min. (Template-directed dye-termination assay) and invader assay (invader assay) can also be used in the present invention.
  • amplification methods polymerase chain reaction; PCR), ligase chain Reactions (LCR), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), strand displacement amplification (SDA), norep-measurement Diet's isothermal amplification: loop-mediated isothermal amplification (LAMP), isothermal nucleic acid primers for nucleic acids 1) starting i3 ⁇ 4 width (isothermal and chimeric primer-initiated amplification of Nucleic acids (ICAN), branched DNA that can be used to detect the nucleic acids of the solid and the disease-causing microorganism, and the like can be used.
  • the sample substance containing nucleic acid collected from the individual may be whole blood, blood, serum, leukocytes, urine, stool, semen, saliva, biopsy tissue, cultured cells, sputum, or the like.
  • the preferred sample is blood.
  • the sample substance preferably contains both a nucleic acid derived from the individual associated with susceptibility to treatment for a disease and a nucleic acid associated with a pathogenic microorganism present in the individual.
  • the pathogenic microorganism is associated with the disease.
  • the sample may have been subjected to any necessary pretreatment such as homogenization and extraction, if necessary. Such a pretreatment could be selected by one skilled in the art depending on the biological sample of interest.
  • the illustrative embodiment disclosed here first, Take a whole blood sample. Next, from the collected whole blood sample, using a commercially available kit for extracting a human genome such as QIA amp DNA Blood Midi Kid (registered trademark, QIAGEN, Tokyo, Japan). A human genome and a virus genome-derived nucleic acid present in the human are both extracted.
  • the nucleic acid containing the sequence of interest is amplified.
  • the obtained amplification product is hybridized to a probe-immobilized chip, and nucleic acids that bind to the probe-immobilized chip are detected. Then, the obtained amplified product is analyzed. In this way, information on the nucleic acid associated with the specific disease from the individual is obtained together with information on the nucleic acid associated with the specific disease obtained from the pathogenic microorganisms present in the individual.
  • examples of an "individual" of interest include any mammal, including a human, dog, cat, cat, goat, pig, sheep, or monkey. possible. However, humans are the most preferred individuals.
  • the individual may be a healthy individual or an individual suffering from any disease. Strength, but generally, by acting on pathogenic microorganisms and on individuals suffering from diseases caused by the type of nucleic acid they possess. Thus, the method according to the invention will be used more effectively.
  • the term "certain disease” refers to a pathogenic microorganism, such as a virus, a nocteria, a yeast, or a mycoplasma.
  • Diseases associated with Kursa and oncological disorders preferably those associated with pathogenic microorganisms, and more preferably the type and type of nucleic acid contained in individuals suffering from the disease.
  • a disease whose onset and therapeutic effect depend on the presence / absence of expression of such a nucleus-containing gene.
  • the present invention is not particularly limited to these diseases.
  • target nucleic acid refers to a nucleic acid containing the sequence to be detected and detected or analyzed.
  • the nucleic acid derived from an individual to be extracted may be a nucleic acid derived from an individual, and may be DNA, RNA, or genomic DNA.
  • the nucleic acid derived from the pathogenic microorganism to be extracted may be any nucleic acid derived from the target pathogenic microorganism, and may be DNA or RNA.
  • the method is not particularly limited, and a liquid-liquid extraction method such as a phenol-cloth-holm method or a solid-liquid extraction method using a carrier can also be used.
  • a nucleic acid extraction method QIA amp (manufactured by QIAGEN), a genomic DNA purification kit (manufactured by Promega), and a smite test (manufactured by Sumitomo Metals), etc. It is possible to use commercially available kits. Subsequently, amplification operations such as PCR may or may not be performed.
  • HCV-RNA When the extracted nucleic acid component is RNA, HCV-RNA may be used directly as the sample nucleic acid, or cDNA may be prepared from the RNA using a reverse transcriptase and then used as the sample nucleic acid. Good No. In this case as well, the nucleic acid derived from the individual and the nucleic acid derived from the pathogenic microorganism may be carried out without separation.For example, in the above-described method, after the extraction using QIA amp DNABlo Photocopying may be performed followed by PCR amplification.
  • Amplification according to the embodiment of the present invention may be performed by any means for amplifying a nucleic acid known per se, and may be performed by a polymerase chain reaction (hereinafter, referred to as PCR). Preference is preferred. If the sample substance contains a sufficient amount of nucleic acid, amplification may be omitted.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a probe-immobilized substrate such as a probe-immobilized chip that can be used according to the embodiment of the present invention is a probe-immobilized substrate obtained by immobilizing a first probe and a second probe having mutually different base sequences on a substrate. This is a chip.
  • the first probe is a probe for detecting the presence of a specific nucleic acid sequence derived from a pathogenic microorganism associated with a specific disease.
  • the second probe is a probe for detecting the presence of a specific nucleic acid sequence derived from an individual, which is associated with the specific disease.
  • Such a probe-immobilized substrate can be analyzed simultaneously by using the same substrate for nucleic acids obtained from two different sources such as an individual and a pathogenic microorganism. It is possible.
  • a probe-immobilizing chip is disclosed for the first time by the present applicant. According to the present invention, such a probe-immobilized substrate is also provided as one aspect of the present invention.
  • the first The probe detects, for example, the presence of a nucleic acid sequence derived from a pathogenic microorganism contained in a sample substance such as whole blood from a human patient.
  • a nucleic acid sequence derived from a pathogenic microorganism contained in a sample substance such as whole blood from a human patient.
  • Such probes have nucleotide sequences corresponding to chromosomal DNA or genes (RNA) derived from pathogenic microorganisms that may infect the target individual (eg, a human patient).
  • RNA genes
  • it may have a base sequence corresponding to a fragment of cDNA or cRNA, chromosomal DNA, RNA, cDNA and cRNA thereof, or a complementary sequence thereof.
  • the amount of the pathogenic microorganism in the sample substance is measured using the above-described first probe, that is, a probe having a nucleotide sequence corresponding to a nucleic acid sequence derived from the pathogenic microorganism, a fragment thereof, or a complementary sequence thereof. It is possible to measure.
  • the first probe is a probe that detects not only the presence of the pathogenic microorganism in the sample substance but also a gene mutation of the pathogenic microorganism.
  • RNA nucleic acid expressed by a pathogenic microorganism in a sample substance
  • the first probe described above that is, a probe having a nucleotide sequence corresponding to a nucleic acid sequence derived from a pathogenic microorganism, a fragment thereof, or a complementary sequence thereof.
  • the nucleic acid chain can detect or quantify RNA, cDNA, or cRNA.
  • the pathogenic microorganism is a virus
  • a specific gene is expressed in large amounts during the growth phase of the virus, so that its efficacy can be predicted by measuring its expression pattern (quantity, quality).
  • the second probe may be a chromosomal DNA sequence, a gene (RNA), a cDNA or cRNA thereof, a fragment thereof, or a chromosomal DNA sequence of the individual, which is involved in the disease.
  • RNA gene
  • a cDNA or cRNA thereof a fragment thereof
  • a chromosomal DNA sequence of the individual which is involved in the disease.
  • nucleic acid sequence associated with a disease possessed by an individual is a nucleic acid sequence present in a chromosome in the cells of the individual, which is a nucleic acid sequence that can predict the response to treatment. More specifically, the nucleic acid sequence is, for example, a nucleic acid sequence that predicts the response of an individual to a disease, or determines the efficacy of a drug to be administered and / or the likelihood of occurrence of side effects.
  • the second probe makes it possible to detect the presence of a specific nucleic acid sequence in an individual, the expression level of a specific gene, the gene expression pattern in an individual, and the like.
  • the first probe or the second probe according to the invention may have at least 11 bases, preferably at least 12 bases, more preferably at least 13 and 1 4, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, and 30 bases It is desirable that the DNA has a nucleotide sequence of length. If the length of the base sequence to be immobilized on the substrate is too long, it is difficult to distinguish a single base difference. On the other hand, if the length of the base sequence immobilized on the substrate is too short, it will be difficult to determine the base sequence of the base sequence contained in the sample.
  • the first probe or the second probe includes ribonucleic acid (RNA), deoxyribonucleic acid (DNA), peptide nucleic acid (PNA), methylphosphonate nucleic acid, and S-oligonucleotide.
  • RNA ribonucleic acid
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • S-oligonucleotide S-oligonucleotide
  • the probe-immobilized substrate includes a substrate, a porous body (Beattie et al., Clin. Chem., 41, 700 (1995)), and a microtype. Rate (Kawai et al., Anal. Biochem., 209, 63 (1993)), beads (Mirkin et al "Nature, 382, 607 (1996)), spherical substances, particulate substances, magnetic substances, magnetic beads (Miller et al., J. Magnet. Magn. Mater., 225, 138 (2001), DNA capillary electrophoresis chip (Chou et al., Proc. Natl. Acd.
  • the probe can be prepared by immobilizing a first probe and a second probe each having the above-mentioned nucleotide sequence on the formed base material, size, and shape of the base on which nucleic acid is to be immobilized.
  • the probe is not particularly limited, and any substrate capable of immobilizing the nucleic acid may be used.
  • the sequence of the nucleic acid in the sample substance using the probe-immobilized substrate may be used.
  • the sample nucleic acid is contacted with a probe-immobilized substrate such as a probe-immobilized chip, and the probe-immobilized substrate is contacted.
  • the present invention provides a method for detecting a hybridization reaction between a probe on the probe-immobilized chip and a nucleic acid component in a sample, which is preferably a method for detecting a hybridization reaction with a sample nucleic acid.
  • a method for detecting a hybridization reaction with a sample nucleic acid two types may be included: (1) a method using a labeling substance, and (2) an electrochemical method.
  • the sample nucleic acid is a fluorescent dye such as FITC, Cy3, Cy5 or rhodamine, or biotin, hapten, oxidase or bosfaffin. It is labeled with an enzyme such as an enzyme or an electrochemically active substance such as phenol or quinones. Alternatively, detection is performed by using a second probe labeled with the aforementioned substance. Multiple labeling substances may be used simultaneously.
  • a conductive substance is used as a substrate for immobilizing a probe, and a probe-immobilized tip is used as an electrode.
  • Detection of the presence of a high predidation reaction using this electrode uses a counter electrode and a reference electrode in addition to this electrode in the same way as other general electrochemical detection methods.
  • a common reference electrode such as a silver / silver chloride electrode or a mercury Z mercury chloride electrode can be used.
  • Probes having different base sequences may be immobilized on different conductive substrates, respectively, to constitute a chip disposed on the same substrate or the like. As a result, highly accurate measurement can be performed. In that case, it detects which electrochemical signal obtained from each electrode corresponds to which probe.
  • the nucleic acid component extracted from the sample material The hybridization reaction between the probe and the probe immobilized on the probe-immobilized chip is performed, for example, as follows. That is, the hybridization reaction solution is performed in a buffer having an ionic strength in the range of 0.01 to 5 and a pH in the range of 5 to 10. This solution may contain dextran sulfate, a hybridization promoter, salmon sperm DNA, bovine thymus DNA, EDTA, and a surfactant. Add the extracted nucleic acid components and heat denature at 90 ° C or higher. The probe-immobilized chip may be inserted immediately after denaturation or after quenching to 0 ° C.
  • reaction rate may be increased by an operation such as stirring or shaking.
  • the reaction temperature may be, for example, in the range of 10 ° C. to 90 ° C., and the reaction time may be 1 minute or more and about 1 ° C.
  • After the high predation reaction take out the electrode and wash it.
  • a buffer solution having an ion intensity of 0:! To 5 and a pH of 5 to 10 is used.
  • the detection of the hybridization reaction is carried out by using an appropriate detection device according to the type of the label, using the labeled base sequence or the secondary probe in the sample. This is done by detecting the sign inside.
  • the label is a fluorescent substance
  • the label may be detected using, for example, a fluorescence detector.
  • the electrochemical method of (2) detection is performed according to the following procedure. After washing the substrate, a double-stranded recognizer that selectively binds to the double-stranded portion formed on the electrode surface is acted on, and the electrochemical measurement is performed.
  • the double-stranded recognizer used here is not particularly limited. However, for example, bis-intercalators such as hex 33,258, acryolirange, quinacrine, donomycin, metal-opening intercalator, bis-atalysine, etc. It is possible to use a trimmer and a trimmer. Furthermore, these intercalators can be modified with an electrochemically active metal complex, for example, phenol or porogen.
  • the concentration of the DNA binding substance varies depending on the type, but is generally used in the range of 1 ng / mL to lrng ZmL. In this case, a buffer having an ion intensity of 0.001 to 5 and a pH of 5 to 10 is used. After the electrode reacts with the double-stranded recognizer, it is washed and electrochemically measured.
  • the reaction current value derived from the double-stranded recognizer is measured.
  • the electric potential can be applied by a force that sweeps at a constant speed, a pulse, or a constant electric potential can be applied.
  • the current and voltage are controlled using devices such as a potentiostat, a digital multimeter, and a function generator.
  • the concentration of the target nucleic acid can be calculated from the calibration curve based on the obtained current value.
  • the base sequence detection device using an electrode includes, for example, a nucleic acid extraction unit, a nucleic acid reaction unit, a double-stranded recognizer reaction unit, an electrochemical measurement unit, a washing unit, and the like.
  • a DNA chip based on an electrochemical method is disclosed in, for example, the following document (Hashimoto eta 1.1.94, W angeta 1.1.988).
  • Hashimoto and colleagues reported sequence-specific gene detection using a gold electrode modified with a DNA probe and an electrochemically active dye. The anodic current from the dye is related to the concentration of the target DNA.
  • Wang and colleagues reported a novel hybridization of the indicator-free electrochemical DNA.
  • This biosensor configuration consists of immobilization of an inosine-substituted probe (not containing guanine) on a carbon paste electrode, and formation of a double-stranded chain due to the presence of the guanine oxidation peak of the label. Includes chronopotentiometric detection of formation.
  • the electrochemical technique does not require labeling of the sample nucleic acid. Detection is performed by measuring electrical signals. Therefore, complicated systems such as those required for fluorescence detection are not required. Therefore, according to the above-described embodiment of the present invention in which the system can be expected to be downsized by such a method, the patient itself can be obtained from a sample substance such as blood collected from an individual such as a patient. It is possible to easily obtain the nucleic acid sequence related to the above-mentioned disease and the nucleic acid sequence of the pathogenic microorganism infected by the patient.
  • the probe-immobilized substrate according to the embodiment of the present invention is used for predicting an appropriate treatment method in an individual exposed to a disease.
  • the probe-immobilized substrate is a probe immobilized on the same substrate. It has two probes and a first probe.
  • the second probe is a probe for obtaining information on a nucleic acid sequence linked to the disease present in chromosomes in the cells of an individual. (A second probe), and the first probe is a probe (a first probe) for obtaining information relating to a nucleic acid sequence of a pathogenic microorganism causing the disease.
  • the methods and probe-immobilized substrates are capable of predicting the therapeutic effect of hepatitis C.
  • Another embodiment is the method and probe-immobilized substrate used to evaluate the treatment of AIDS (eg, HIV quantification and mutation detection, etc.).
  • a further embodiment is the method and probe-immobilized substrate used to evaluate treatment of hepatitis B (eg, quantification of HBV, detection of type and mutation, etc.).
  • IFN therapy that administers interferon
  • IFN ⁇ N and] 3 for treatment.
  • IFN treatment is effective only in about 20 to 30% of Japanese human patients, and even if effective, very strong side effects have been reported.
  • Such differences in the therapeutic effect due to the difference between individuals can be attributed to the genotype (J.C1 in. Microbiol., HCV) of hepatitis C virus (hereinafter referred to as HCV) infected by the individual. 34, 25, 16 (1996)), the amount of virus, and the individual differences in the nucleic acid sequence of the individual.
  • interferon (IFN) J is used as a word indicating the interferon ⁇ , ⁇ and / or ⁇ , for example, IFN therapy is less effective if the infected virus is type 1b (common in Japan) because serum HCV-RNA, HCV antibodies, GOP, and GPT may be affected by IFN therapy. Treatment is more effective for type 2a, which is reduced by serum HCV-RNA, HCV antibodies, G ⁇ P and GPT-powered SIFN therapy In addition, the effect is small even when the amount of virus is as large as 10 6 ⁇ : 0 7 7 111. Therefore, the genotype and viral load of the infected virus are examined at the nucleic acid level. Use the first probe for
  • a probe used for detecting the presence of a nucleic acid sequence of hepatitis C virus (hereinafter also referred to as HCV) in a sample substance a nucleotide corresponding to HCV-RNA, a fragment thereof, or a complementary sequence thereof is used. Sequences.
  • a prop according to an embodiment of the present invention preferably comprises an HCV-RNA genotype or mutation. At least 11 bases, preferably at least 12 bases, more preferably at least 13 bases, at least 13 bases, 14 bases, 15 bases, 16 bases, 17 bases, It has a sequence of 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 and 30 bases.
  • the probe is at least 30 and preferably at least about 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500. Even longer than 1000 bases are preferred for the detection of HCV genomics. Lengths from 11 to 30 are suitable for chip formation, and probes longer than 30 bases are suitable for general hybridization formation. For example, those having a base sequence corresponding to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 shown in the sequence listing or a complementary sequence thereof can be used. These sequences are conserved in all HCV genotypes (Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)).
  • the first probe uses a probe that detects not only the presence of the pathogenic microorganism in the sample substance but also a gene mutation of the pathogenic microorganism.
  • hepatitis C it has been reported that the effects of IFN treatment differ depending on mutations in specific sites in the viral nucleic acid sequence (Nagayama et al., Hepatology, 31, 745 (2000)).
  • An example of the first probe for detecting a mutation at a specific site in the nucleic acid sequence of virus in a sample substance is the HCV described in Hepato 1 ogy, 31, 7445 (2000).
  • HCC hepatocellular carcinoma
  • ASC asymptomatic carrier
  • the first probe may be a nucleotide sequence corresponding to HCV-RNA, a fragment thereof, or their complementary sequence.
  • a probe that specifically detects the genotype of HCV type 1 (SEQ ID NO: 5), type 2 (SEQ ID NO: 6), and type 3 (SEQ ID NO: 7) can be used as the first probe according to the genotype to be detected. It may be used as a probe. That is, a nucleic acid having a sequence corresponding to SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, or their complementary sequence shown in the sequence listing may be used as the first probe.
  • a PCR reaction is performed on the nucleic acid sequence of the pathogenic microorganism in the sample substance in advance using primers characteristic of the genotype. It is then possible to detect all hepatitis C viruses without considering their genotypes with a probe immobilized on a universal probe (Andonov et al.) al "J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995).
  • hepatitis C use the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 as the sense chain, and use SEQ ID NO: 10 or 1 as the antisense strand for type 1a.
  • a PCR reaction was carried out using the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 for type b, SEQ ID NO: 12 for type 2a, and SEQ ID NO: 13 for type 2 b and SEQ ID NO: 14 for type 3a.
  • a universal probe having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 may be used.
  • the amount of the pathogenic microorganism in the sample substance is also measured using a probe having a base sequence corresponding to the first probe, that is, a nucleic acid sequence derived from the pathogenic microorganism, a fragment thereof, or a complementary sequence thereof. It is possible.
  • the concentration is calculated from the fluorescence intensity of the label on the substrate after the probe on the chip and the nucleic acid in the sample substance are hybridized.
  • the probe obtained on the chip is hybridized with the nucleic acid in the sample substance, and then the voltage obtained from the chip To calculate the concentration from the value.
  • the genotype or amount of the virus of the pathogenic microorganism infected by the individual Information such as the amount and quality of mutations and expressed genes can be obtained. If the type of virus is 1b type, which is common in Japanese, IFN therapy is less effective, but if it is 2a type, it will work effectively. In addition, when the virus capacity is as large as S10 6 copy / mL or more, the effect of IFN therapy can be predicted to be small, and thereby, the effectiveness of IFN therapy for the individual can be predicted. You.
  • the present applicant reported another method for predicting the effect of IFN treatment for hepatitis C in Japanese Patent Application No. 200-161-62 and Japanese Patent Application No. 200-162. ing. That is, it is present in the promoter region of the gene encoding the MxA protein of the human gene, that is, at position 88 of the MxA promoter region (hereinafter referred to as MxA-88).
  • MxA-88 the promoter region of the gene encoding the MxA protein of the human gene, that is, at position 88 of the MxA promoter region
  • This is a method for predicting the magnitude of the IFN therapeutic effect by examining the SNP of a specific single nucleotide polymorphism (sing 1 enuc 1 eotidepolymorphism, hereinafter referred to as SNP) in order to determine the magnitude of the IFN therapeutic effect.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the second probe for detecting the nucleic acid of an individual is one that detects SNP in MxA.
  • the IFN therapeutic effect is low, and G / T and T / T
  • the therapeutic effect is high, and in the case where the 1st and 2nd positions of the same region (hereinafter referred to as M x A—123) are C / C type, the IFN therapeutic effect is low, and For A / AZA type, predict the therapeutic effect of IFN based on the high therapeutic effect.
  • the notations “188” and “123” are positions where the transcription start site of the MXA gene is +1.
  • the first probe for detecting the presence of the HCV gene as well as the HCV genotype or gene mutation, and the SNP in the promoter region of the gene encoding the MxA protein of the individual Using a probe-immobilized chip on which a second probe for detecting the type of base is immobilized, the gene diagnosis of HCV in the sample substance collected from the individual and the MxA protein possessed by the individual are coded.
  • the effect of IFN therapy can be easily predicted by performing a genetic diagnosis of the promoter region of any gene.
  • MBL mannose-binding lectin
  • the polymorphic sites of MBL that affect the effect of IFN are located at position -221 in the promoter region of the MBL gene (hereinafter referred to as MBL -221) and at codon 52 of exon 1 of the MBL gene. , 54 and 57.
  • MBL -221 the promoter region of the MBL gene
  • the notation of “1221 position” means that the genotype of MBL-221, which is the position when the transcription start site of the MBL gene is set to +1, is C or G.
  • C is referred to as type X
  • G is referred to as type Y.
  • codons 52, 54 and 5 of exon 1 of the MBL gene And 57 are present in the collagen-like domain, which is a structural gene.
  • the genotype available for codon 52 is CGT or TGT. According to the classification of Madsen et al., The former is type A, and the latter is type D.
  • the possible genotype of codon 54 is GGC or GAC. According to the same classification, the former is type A and the latter is type B.
  • the genotype obtained at codon 57 is GGA or GAA. According to the classification, the former is type A and the latter is type C. In all of these codons, type A is the wild-type allele and the other types 8, C and D are mutant alleles.
  • IFNs if alleles at codons 52, 54 and 57 are all type A, i.e., IFN compared to at least one of the alleles not being type A The effect is high.
  • the second probe In one embodiment in which the disease is hepatitis C and the drug is IFN, hybridization to an individual nucleic acid is performed.
  • the second probe used in the probe (including use on a probe-immobilized chip) is a promoter that detects the SNP of the MxA promoter as described above.
  • the second protein used in hybridization to the nucleic acid of the individual including use on a probe-immobilized chip.
  • the probe is a probe for detecting a polymorphism in MBL related to the effect of IFN.
  • the second probe is a group consisting of: Selected: '
  • modified probes for detecting MBL polymorphisms maintain the ability to hybridize to individual nucleic acids encoding MBL .
  • the hybridization conditions used for the modified probes are different from those of common probes.
  • the modified probes according to the present invention are at least 11 bases, preferably at least 12 bases, more preferably for detecting HCV-RNA genotypes or mutations. At least 13, 14, 15, 16, It has a sequence of 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 and 30 bases.
  • the probe may be at least 30 and preferably about 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, Even longer than 1000 bases is preferred for HCV genomic detection. Lengths of 11 to 30 are appropriate for chip formation, and probes longer than 30 bases are suitable for general hybridization formation.
  • (dt455) a nucleotide sequence comprising the sequence shown at positions 449 to 459 of SEQ ID NO: 16,
  • (et455) a complementary sequence of a base sequence selected from (at455) to (dt455),
  • (ag455) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 in the following sequence listing; (bg455) several nucleotides excluding the nucleotide at position 455 in the nucleotide sequence represented by (ag455) are deleted, substituted, or not less than 1 Modified base sequence to which the base of
  • (aa455) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 in the following sequence listing, (ba455) a modified base sequence in which several bases other than the base at position 455 in the base sequence represented by the above (aa455) are deleted or substituted, or one or more bases are added,
  • (ac455) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 in the following sequence listing; (bc455) several nucleotides excluding the nucleotide at position 455 in the nucleotide sequence represented by (ac455) are deleted, substituted, or 1 or more Modified base sequence to which the base of
  • (ec455) a complementary sequence of a base sequence selected from the above (ac455) to (dc455);
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 40 are human M x A
  • nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 16 to 19 have a common sequence except for the nucleotide at position 455.
  • Position 255 of SEQ ID NO: 16 is thymine
  • position 455 of SEQ ID NO: 17 is guanine. It is adenine at position 45 of SEQ ID NO: 18.
  • Position 4555 of SEQ ID NO: 19 is cytosine.
  • HCV-infected patients having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 in which the base at position 455 is thymine are effective for IFN therapy, whereas the base at position 455 is thymine HCV-infected individuals without the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 16 are not effective in IFN therapy, meaning that the nucleic acid of SEQ ID NO: 16 whose nucleotide sequence is An HCV-infected person having a heterozygous nucleic acid of SEQ ID NO: 17 having a sequence of guanine (hereinafter, abbreviated as GZT heterologous), or a nucleic acid of SEQ ID NO: 16 having a nucleotide sequence at position 455 being thymine (Hereinafter abbreviated as T / T homozygous).
  • the nucleic acid of SEQ ID NO: 17 having the nucleotide sequence at position 455 is guanine is homozygous (hereinafter G / Abbreviated as G homozygous) IFN therapy is not effective for HCV infected patients.
  • the nucleotide sequence at position 455 is not thymine compared to HCV infected individuals with TZ non-T hetero or TZT homologous.
  • ⁇ HCV-infected individuals homozygous for the promoter region of the XA gene (hereinafter referred to as non- TZ non — abbreviated as T homo) indicated that IFN therapy was not effective.
  • T homo HCV-infected individuals homozygous for the promoter region of the XA gene
  • T homo no ⁇ — ⁇ / ⁇ ⁇ - ⁇ Homo combination is G / G, G / A, G / C, A / A, A / C N CZC are available.
  • TZ non-T combinations include T / G, T / A, and T / C.
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 37 to 40 have a common sequence except for the nucleotide at position 425.
  • Position 425 of SEQ ID NO: 37 is Adeyun.
  • Position 425 of SEQ ID NO: 38 is cytosine.
  • position 425 of SEQ ID NO: 39 is thymine.
  • Position 425 of SEQ ID NO: 40 is guanine.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 containing the above SNP site and having a nucleotide sequence of thymine as the second probe for detecting the nucleotide sequence of the nucleic acid of the individual When the fragment or its complementary sequence ((at455) to (et455)) is used, the SNP site of the base sequence including the promoter region of the human MxA gene possessed by the individual is obtained. Before treatment, it can be determined whether or not thymine is thymine, so that the effectiveness of IFN therapy for the individual can be predicted.
  • IFN therapy can detect the effectiveness.
  • the second probe of the SEQ ID NO: 17 including the SNP site, wherein the base sequence of the SNP site is guanine Nucleotide sequence, its fragment or their complementary sequence ((ag4555) to (eg455)) or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 in which the nucleotide sequence of the SNP site is adenine, a fragment thereof, or a complementary sequence thereof ((aa455) to ( ⁇ ea455)) or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19, wherein the nucleotide sequence of the SNP site is cytosine, a fragment thereof, or a complementary sequence thereof
  • the disease is hepatitis C and the drug is IFN
  • it is used in hybridization to an individual nucleic acid (including use on a probe-immobilized chip).
  • the probe of the following;
  • (aa420) a base sequence represented by SEQ ID NO: 37 in the following sequence listing, (ba420) several bases excluding the base at position 420 in the base sequence represented by (aa420) are deleted, substituted, or 1 or more Modified base sequence to which the base of
  • (da420) a complementary sequence of a base sequence selected from the above (aa420) to (ca420)
  • (ac420) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 38 in the following sequence listing
  • (bc420) a nucleotide at position 420 in the nucleotide sequence represented by (ac420)
  • (dc420) a complementary sequence of a base sequence selected from the above (ac420) to (cc420)
  • (at420) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 39 in the following sequence listing; (bt420) several nucleotides excluding the nucleotide at position 420 in the nucleotide sequence represented by (at420) are deleted, substituted, or Modified base sequence to which the above bases are added,
  • (dt420) a complementary sequence of a base sequence selected from the above (at420) to (ct420)
  • (ag420) a base sequence represented by SEQ ID NO: 40 in the following sequence listing, (bg420) several bases except for the base at position 420 in the base sequence represented by (at420) are deleted, substituted, or Modified base sequence to which the above bases are added,
  • (dg420) a complementary sequence of a base sequence selected from the above (ag420) to (cg420)
  • HCV-infected persons having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 37 in which these bases at positions 425 are adenine are effective for IFN therapy
  • IFN therapy is not effective for HCV-infected patients who do not have the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 37 in which the base at position 425 is adenine. Details regarding sequence and efficacy may be understood as described above for the SNP at position 455.
  • the second probe may be, for example, a sequence such as (i) to (t) described below. Even so. These are suitable nucleic acids for use to determine the genotype of MBL-2221 and the presence of polymorphisms at codons 52, 54 and 57.
  • MBL genes containing the polymorphisms encoded by MBL—221 and codons 52, 54, and 57 are shown in SEQ ID NOs: 41 to 56.
  • MBL — 222 is at position 425 of these sequences.
  • Exon 1 starts at position 646 of these sequences, codon 52 at position 868, at position 870, and codon 54 at position 874. At position 76, codon 57 is at position 885 from position 883. The SNP of codon 52 is located at position 868, the SNP of codon 54 is located at position 875, and the SNP of codon 57 is located at position 885.
  • nucleic acid fragment of SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, or SEQ ID NO: 44 containing the SNP site of MBL—221, wherein SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 A fragment containing a nucleic acid having a sequence corresponding to positions 418 to 432 of SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44;
  • SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: including the SNP site of codons 52, 54 and 57
  • a fragment containing the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 45 to SEQ ID NO: 56 is a fragment containing the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 45 to SEQ ID NO: 56.
  • a fragment of the nucleic acid of 56 which comprises a nucleic acid having a sequence corresponding to positions 8768 to 8876 of these sequences.
  • SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 5 including SNP sites of codons 54 and 57 1, SEQ ID NO: 52 2 SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 56 are fragments of the nucleic acids of SEQ ID NO: 56 A fragment containing a nucleic acid having a sequence corresponding to position 5. For example, a fragment containing the nucleic acid set forth in SEQ ID NOs: 45 to 56.
  • SEQ ID NO: 45 containing the SNP site of codon 54
  • a fragment of the nucleic acid of SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 56 wherein the nucleic acid has a sequence corresponding to the 874 position, etc. of these sequences
  • a fragment containing For example, a fragment containing the nucleic acid shown in SEQ ID NO: 45 to SEQ ID NO: 56. In particular, a fragment containing positions 869 to 880 is desirable.
  • SEQ ID NO: 45 containing the SNP site of codon 52 SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 5 2, SEQ ID NO: 53
  • Fragments containing For example, a fragment containing the nucleic acid shown in SEQ ID NO: 45 to SEQ ID NO: 56. In particular, a fragment containing positions 864 to 873 is desirable.
  • SEQ ID NO: 45 including the SNP site of codon 57 SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52
  • Fragments containing For example, a fragment containing the nucleic acid shown in SEQ ID NO: 45 to SEQ ID NO: 56.
  • SEQ ID NO: 45 containing the SNP site of codon 54.
  • a fragment of the nucleic acid of SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 56, which includes position 875 of the sequence where the SNP of the codon 54 is present A fragment containing a nucleic acid. For example, a fragment containing the nucleic acid shown in SEQ ID NO: 45 to SEQ ID NO: 56.
  • Preferred probe sequences are at least from 420 to 430, from 864 to 874, and from 870 to 870 for the MBL gene. Includes 0th and 879th to 889th.
  • the MxA gene it is preferable to include at least the positions from the 450th position to the 450th position.
  • N and n indicate any base of adenine, thymine, guanine, or cytosine.
  • the measurement of nucleic acid (RNA) expressed by an individual also has a base sequence corresponding to the second probe described above, that is, a nucleic acid sequence derived from the individual, a fragment thereof or a complementary sequence thereof. Measurement is possible using a probe. You.
  • the nucleic acid strand is RNA or cDNA or cRNA, and these can be detected or quantified.
  • the effects of IFN differ depending on the individual's constitution, so measuring the gene expression pattern (quantity, quality) at the time of administration makes it possible to predict the efficacy.
  • the target disease according to the embodiment of the present invention is not particularly limited as long as it is a disease induced by a pathogenic microorganism.
  • the present invention includes diseases relating to pathogenic microorganisms.
  • the invention also includes oncological diseases. For example, when predicting the efficacy of IFN treatment, the therapeutic effect can be similarly predicted for diseases other than hepatitis C, for which the efficacy of IFN treatment has been confirmed.
  • diseases include hepatitis viruses (A, B, CD, E, F, G), HIV, influenza virus, herpes group innores, adeno innoles, and humans.
  • hereditary diseases retinoblastoma, Wilms tumor, familial polyposis coli, hereditary non-polyposis colon cancer, neurofibromatosis, familial breast cancer, xeroderma pigmentosum Disease, brain tumor, oral cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, knee cancer, lung cancer, thyroid tumor, breast tumor, urinary tumor, male organ tumor, female organ tumor, skin tumor, bone and soft tissue
  • neoplastic diseases such as tumors, leukemias, lymphomas and solid tumors.
  • Pathogenic microorganisms that can be detected according to the embodiments of the present invention are not particularly limited. For example, when predicting the efficacy of IFN treatment, a pathogen that induces a disease for which IFN treatment has been confirmed to be effective is predicted. Microorganisms include, for example, HCV, but are not particularly limited as long as they are pathogenic microorganisms associated with diseases for which the effectiveness of IFN treatment has been confirmed. If the pathogenic microorganism is directly or indirectly correlated with the disease or symptoms of the disease, the pathogenic microorganism is associated with the disease.
  • hepatitis viruses types A, B, C, D, E, F, and G
  • HIV influenza virus
  • herpes virus adenovirus
  • human virus Mawinores, Hyperpillomavirus, Hippanorevo Winores, Mumps Wilson, Hypertinores, Centerovirus, Japanese encephalitis virus, Dengue Virus such as Rus, Rubella virus and HTLV, Staphylococcus aureus, Hemolytic streptococci, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Helicobacter pylori, Campi C., cholera, Shigella, Salmonella, Yersinia, Neisseria gonorrhoeae, Listeria, Bacteria, parasites and fungi such as Ptosvira, Legionella, Spirochetes, Mycoplasma pneumonia, Rickettsia, Chlamydia, Malaria, Shigella ameba and pathogenic Virus
  • HIV human immunodeficiency virus
  • RTV ritonavir
  • VZV Varicella Zoster Virus
  • AAT azidothymidine
  • dd1 didanosine
  • VZV Varicella Zoster Virus
  • the analysis of Varicella Zoster Virus (VZV) present in an individual and the gene of the individual results in the detection of varicella or zona. It is possible to predict the nature.
  • the efficacy of an antiviral drug such as aciclovir may be analyzed from the obtained information on nucleic acids.
  • influenza virus (influenza virus) genotypes and copy numbers, as well as individual genotypes, can be analyzed to determine influenza virus The morbidity and efficacy of antiviral drugs such as Tamiflu may be analyzed.
  • HCV-RNA When the extracted nucleic acid component is HCV-RNA, HCV-RNA may be used directly as the sample nucleic acid, or cDNA may be prepared from HCV-RNA using reverse transcriptase and then used as the sample nucleic acid. May be used.
  • Example 1 describes a method for extracting nucleic acids from a human subject 1. Methods for extracting human and viral genomics from patients
  • the HCV genomic RNA When extracting the HCV genomic RNA, serum is usually used instead of whole blood. Furthermore, after removing unnecessary proteins and other contaminants as much as possible, the HCV genomic RNA is extracted using a guanidine buffer or the like. However, in the method according to the embodiment of the present invention, simultaneous extraction with the human genome DNA is performed. Therefore, the extraction efficiency of HCV genomics when human genomic DNA was extracted using a kit for human genomic extraction using whole blood was determined as a standard method. 6 1 ⁇ — 1 (Sanko Junyaku) to extract HCV genomics from 100 ⁇ L of serum and HCV genomics from whole blood using QIA amp DNABlod Midi Kit (QIAGEN) We compared the methods for extracting the system with.
  • Methods for extracting from whole blood include extracting HCV genomics with QIA amp DNABlod Midi Kit and then purifying the resulting extract by ethanol precipitation and ethanol. There was also a comparison of the results obtained when subjected to the reverse transcription reaction when no precipitation was performed.
  • Table 1 shows the results. Table 1 Comparison of each extraction method and HCV genomic extraction efficiency
  • the extraction efficiency of HCVRNA was about 10 times lower in the method using QIAampDNABloodMidKit than in the normal HCVRNA extraction method. Therefore, the extraction method using the QIA amp DNABlod Midi Kit may become unmeasurable when performed on a sample with an extremely low virus content in blood. It was considered difficult to use for applications such as virus quantification using chips. However, conversely, for samples in which the viral load in the conventional method occupies a concentration of 10 copy / m1 or more in whole blood, the QIA amp DNAB It was suggested that simultaneous extraction of the used DNA and RNA was possible. That is, it was suggested that a virus can be qualitatively measured using an extract using QIAampDNABloodMidKit.
  • the samples obtained by performing the reverse transcription reaction as described above were subjected to simultaneous amplification of the human genome and the HCV genome.
  • primers for amplification MXAF01 and MxARO2 were used for human genomics.
  • nc 2 K. C yamata 1., J. G astroenterol. Hepatol. 8, S 40 — 44, 1993, nt 27-45
  • primer 33 Okamotoeta 1., Jpn J. Exp. Med. 60, 2 15-222, 199 0
  • Amplification was performed in one tube.
  • the PCR was performed for 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C, and 1 minute at 72 ° C for 50 total cycles, before 4 minutes at 94 ° C and 7 minutes after.
  • the treatment was performed at 2 ° C for 7 minutes.
  • MxAFOl 5'-ACACACCCGTTTCCACCCTGGAGAGGCCAG-3 'MxAR02: 5'-TGCGCAGTGCTGGAGTGCGGCCTCCGCTCT-3'
  • a treatment method for the disease can be predicted simply and in a short time from a sample substance extracted from an individual. Measurement becomes possible. Further, according to such an embodiment, a plurality of pieces of information can be obtained from one sample obtained from an individual at the same time. Even when dealing with high specimens, the extent of contamination by such samples can be made narrower than before, and the risk of sample contamination Can be kept to a minimum.
  • Example 2 describes a DNA chip to evaluate the effect of IFN therapy.
  • human chromosome DNA and HCV-RNA were collected from the blood of a patient (human).
  • a 135 bp fragment was amplified using the primers of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21.
  • cDNA was prepared using reverse transcriptase.
  • FITC labeling was performed on the nucleic acid sample obtained by the above steps using a kit manufactured by Pharmacia.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the DNA chip of this example.
  • DNA probes of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 7 as the DNA probe of No.6 and the first probe (The first probe and the second probe in FIG. 1 are indicated by 1 to 5) was spotted by 20 OnL and dried. Thereafter, the probe was immobilized on the substrate 2 by UV irradiation.
  • the nucleotide sequences of 22 to 25 are fragments containing the SNP site at position 45 of the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 16 to 19, respectively.
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 5 to 7 are probes for detecting genotypes 1, 2, and 3 of HCV virus, respectively.
  • the FITC-labeled nucleic acid sample was dissolved in a 2xSSC_lmmo1 / LEDTA solution. This was placed in a 20 L reaction chamber and covered with a probe-immobilized slide glass. After performing the reaction at 50 ° C. for 12 hours, the plate was washed twice with 0.2 ⁇ SSC—Immol ZLEDTA solution, and the fluorescence on the slide glass was measured. '
  • Example 3 describes a PNR chip to evaluate the effect of IFN therapy.
  • human chromosomal DNA and HCV-RNA were collected from the blood of a patient (human).
  • a 135 bp fragment was amplified from the chromosomal DNA using the primer of SEQ ID NO: 221.
  • cDNA is produced using reverse transcriptase.
  • the obtained cDNA was transformed into type III, and SEQ ID NO: 8 (this is a sense), SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 (these Is an antisense)).
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of the PNA chip of this embodiment.
  • SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, PNA probe of SEQ ID NO: 31, and the first probe of SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 PNA probes 7 to: 11 were spotted at 200 nL each, and left for 1 hour.
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 27 to 30 are fragments containing the SNP site at position 45 of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 16 to 19, respectively.
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 32 to 36 are HCV It is a probe that detects the genotypes of la, lb, 2a, 2b, and 3a of Lus.
  • the sample was dissolved in 2 x SSC-lmmo1 / LEDTA solution. This was placed in a reaction chamber with a volume of 20 ⁇ L, and covered with a probe-immobilized tip. 5 0. (: After the reaction for 1 hour, the plate was washed twice with 0.2 x SSC-lmmol / LEDTA solution. Next, 10 ⁇ mo 1 ZL of hexane 333258 solution was added thereto. Separately, a counter electrode and a reference electrode were installed, and the oxidation current from the 332 3 58 when a voltage was applied between the gold electrode and the counter electrode was measured.
  • the genotype of codon 54 in the Lagen-like domain can predict the efficacy of IFN therapy in hepatitis C infected individuals.
  • step 3a the practitioner collects a sample, such as a blood sample, from the individual to whom IFN is to be administered and initiates the prediction.
  • the collected sample is processed, if necessary, for purification and extraction.
  • the virus type, and the MBL and MxA genotypes, ie, the MxA-88 and MxA-123 gene types,] ⁇ 48 1 ⁇ —2 21. Determine the genotype of 1 and the genotype of codon 54 in the collagen-like domain of MBL, and proceed to step 3.
  • step 3b the type of virus determined in step 3a If Type 1 is included in the list, it is determined to proceed to Step 3c. If Type 2 is the only type, it is determined to proceed to (3d).
  • step 3c based on the MBL and MxA genotypes determined in step 3a, a search is made in Table 2 in which genotypes and IFN effects are associated, and the corresponding IFN effects are extracted. Predict the efficacy of IFN therapy and end the entire prediction process.
  • step 3d based on the MBL and MxA genotypes determined in step 3a, Table 3 in which genotypes and IFN effects are associated is searched, and the corresponding IFN effects are extracted. This predicts the effectiveness of IFN therapy and ends the entire prediction process.
  • the tables used here are information that correlates genotypes and IFN susceptibility. Each table is shown as a table, which is a table corresponding to each table number. Each table used in the above method is shown as an example. The tables and tables used here need only correspond to the effects of each genotype and IFN. For example, Table 2 shows the relationship between genotype and the effect of IFN in patients infected with type 1 HCV. On the other hand, Table 3 shows the relationship between the genotype and the effect of IFN in patients infected with type 2 HCV. Further, the table used may be a table containing only any one of the components, or may be a table containing components in other combinations. In the above example, the tables referred to in steps 3c and 3d are shown in Tables 2 and 3 respectively.
  • a single table prepared by combining these may be used.
  • the table may be composed of components of other combinations.
  • the selection of the ingredients can be done, for example, by selecting information in the table used in step 3c that indicates a significant or ineffective association of genotypes with type 1 HCV-infected individuals, Then, information indicating the association between the genotype and the significant or ineffective response in type 2 HCV-infected patients may be selected.
  • the small force S is not limited to this, and the practitioner may arbitrarily select the components.
  • the numerical values of the components described in Tables 2 and 3 used here are one example of a display showing information in which a genotype is associated with IFN sensitivity or IFN effect. It is not limited to the numerical values described in. That is, if it is a notation that can substantially show the correlation between the genotype and the significant or ineffective, for example, even if it is “ ⁇ ”, “X”, “mu”,
  • the score may be a simplified numerical score (eg, 1, 2, 3, 4, 5, etc.).
  • the target nucleic acid information can be easily, quickly, and accurately recovered from the sample substance. It is possible to do so.
  • the above-described embodiment is an example of the present invention, and is not described for the purpose of limiting the present invention. Further benefits or modifications will be readily apparent to those skilled in the art. Accordingly, the invention in its broader aspects is not limited to the details and representative embodiments shown and described herein. Accordingly, various changes may be made without departing from the spirit or scope of the general inventive concept as defined by the appended claims and their equivalents.

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Description

明 細 書
疾患に関連する核酸を検出する方法
技術分野
本発明は、 個体から得た疾患に関連する核酸についての情 報を得る方法に関する。 本発明は、 個体の核酸に関する情報、 並びに疾患に関して得られる核酸の情報、 特に疾患に関連す る病原微生物の核酸に付いての情報を得る方法に関する。
また、 本発明はプローブ固定化基体、 特に前記方法に使用 するためのプローブ固定化チップに関する。
背景技術
D N Aチップによ る遺伝子検査技術が注目 は（Beattie et al., Clin Chem 39: 719-22, Fodor et al., Science, 251, 767 (1991), Khrapko et al., FEBS Lett, 256， 118 (1989), and Southern et al., Nucleic Acids Res., 22, 1368 ( 1994))に開示されている。 D N Aチップは、 配列の異なる複数種類の D N Aプローブを固定 化した数 c m角のガラスゃシリ コ ンのチップである。 このよ う なチップ上の D N Aプローブに対して、 蛍光色素や放射線 同位元素 （ R I ) 等で標識した試料核酸、 あるいは未標識の 試料核酸と標識オリ ゴヌ ク レオチ ドの混合物を反応させる。 チップ上に固定化された D N Aプローブに対して相捕的な配 列が試料中に存在する と 、 チップ上の特定部位において使用 された標識に由来する信号が得られる。 従って、 固定化され た D N Aプローブの配列 （ s e q u e n c e ) と位置が予め 分っていれば、 試料核酸中に存在する塩基配列 （ s e q u e n c e ) を調べる こ と 力 Sでき る（Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5022 (1994), Parinov et al., Nucleic Acids Res., 24, 2998 (1996)。 。
患者から得た血液な どの試料物質を得、 その試料物質から核 酸を抽出する こ と によ り 、 その患者固有の核酸が得られる。 その患者固有の核酸を、 更に、 遺伝子解析に供すれば、 ある 疾病に対する罹患しやすさ、 薬の効きやすさ、 および Zまた は副作用の生じやすさな ど、 患者の体質に関係する情報を得 る こ と が可能である。 その結果、 その患者に特異的な情報を 得る こ と が可能である。 個々 の患者に特異的に設計された治 療法を 「テーラーメイ ド医療」 とい う。
テーラーメ イ ド医療を行 う に際しては、 患者から抽出 した 試料物質から、 よ り 正確かつ簡便にその疾病に対する治療法 を予測する方法の開発が求め られている。
こ こにおいて開示される全ての引用文献および特許公報は 引用する こ と によ り こ こに組み込まれる。 '
発明の開示
特定疾病に曝された個体の核酸についての第 1 の情報と前 記個体に存在する病原微生物からの核酸についての第 2 の情 報と を得る方法であって、 前記病原微生物が当該特定疾患に 関連し、 以下を具備する方法 ；
( a ) 当該個体からの核酸の抽出物と、 第 1 のプローブと 第 2 のプローブと を具備するプローブ固定化基体と を反応さ せる こ と と 、 こ こで、 前記第 1 のプロ ーブは当該病原微生物 の特定の核酸配列の存在を検出 し、 前記病原微生物は前記特 定疾患に関連し、 および前記第 2 のプローブは前記個体の特 定の核酸の存在を検出する ； 並びに
( b ) ( a ) の前記反応の結果、 も しあれば、 前記第 1 の プローブに対 して結合 した核酸の存在を検出する こ と に よ り 前記第 1 の情報を得る こ と と 、 およびも しあれば、 前記第 2 のプローブに対 して結合 した核酸の存在を検出する こ と によ り 第 2 の情報を得る こ と。
図面の簡単な説明
図 1 は、 本実施例に係る D N Aチッ プの概略図である。 図 2 は、 本実施例に係る P N Aチップの概略図である。 図 3 は、 本実施例に係る方法を示すフ ロ ーチャー トである 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 疾患に曝されている個体か ら の核酸についての 情報を得る方法に関する。 当該個体は、 前記疾患の初期また は後期段階にある個体であっ て も よい。 また、 当該個体は、 前記疾患に対する罹患が疑われる個体または将来罹患する こ と が疑われる個体であって も よい。
本発明は、 当該個体と 当該疾患の両者からの核酸情報の相 関関係に関する。 こ こで開示 される態様において、 当該個体 は、 例えば、 ウィルス、 パク テ リ ア、 酵母またはマイ コプラ ズマな どの病原微生物に関連する疾患に曝されている。 また 本発明は、 前記個体に存在する病原微生物から得られた核酸 情報と 、 前記個体からの核酸と の相関関係に関する。
従って、 1 側面において、 本発明は、
個体の特定の疾患に関連する核酸についての情報、 特に 前記個体の疾患の治療に対する感受性と 関連する核酸につい ての情報と 、
前記個体に存在する病原微生物に由来する前記特的疾患 に関連する核酸について も情報と
を得るための方法を提供する。
また、 本発明 は、 前記個体からの核酸お よび前記病原微生 物か らの核酸の同定において使用 される特異的核酸プローブ に関連する。
幾つかの態様において、 当該核酸プロ ーブは、 チップの よ う な基体に固定化されてい る 。 また、 本発明は、 当該方法に おいて使用する ため の、 プロ ーブ固定化基体、 例えば、 プロ ーブ固定化チッ プ、 に関する。 その他の基体、 例えば、 D N Aキヤ ビラ リ 電気泳動装置、 ビーズな ど、 メ ンブ ラ ンベース ア レイ 、 マイ ク ロ タイ タープ レー ト 、 電極、 半導体を基礎と する デバイ ス な ど、 導波性物質な ど、 表面プラ スモ ン共鳴 (Surface plasmon resonance; 以下 SPR と 記す）、 ク ォーツ ク リ ス タ ルマ イ ク ロ ノ ラ ンス （Quartz crystal microbalance; 以 下 QCM と記す）、 および質量分析（Mass-spectroscopy)も本発 明に使用 され得る。 更に、 対立遺伝子特異的オ リ ゴハイ プ リ ダイ ゼーシ ヨ ン、 制限方法 （マイ ク ロ タイ ターア レイ . ダイ ア コ ナ ノレ · ゲ ノレ 亀 5¾ 泳 動 ； microtitierarray diagonal gel electrophoresis) 、 ラ イ ゲー シ ヨ ン法 ( ノヽ ッ ド ロ ッ ク プロ一 ブ（padlock probe)、 オ リ ゴヌ ク レオチ ド ラ イ ゲー シ ョ ンア ツ セィ 、 色素標識オ リ ゴヌ ク レオチ ドラ イ ゲーシ ヨ ン） 、 ヌ ク レオチ ドイ ン コ ーポ レー シ ョ ン （ ミ ニシーケ ン シ ング、 テ ン プレー ト 一ディ レク テ ツ ト · ダイ 一タ一 ミ ネーシ ヨ ンア ツセ ィ (template-directed dye-termination assay)) 、 お よぴイ ンべ ーダーア ツセィ （invader assay)も 、 本発明で使用する こ と が 可能である。 他の一般的な溶液中でのハイ プ リ ダィ ゼーシ ョ ン技術も本発明において使用する こ と が可能であ り 、 例えば、 増幅法 （ポ リ メ ラーゼ連鎖反応； PCR) 、 リ ガーゼ連鎖反応 ( L C R ) 、 核酸酉己歹 (Jベー ス増幅 ( nucleic acid sequence- based amplification;NASBA) 、 ス ト ラ ン ドディ ス プレース メ ン 卜増 Ψ§ ( strand displacement amplification; SD A) 、 ノレープ — メ デ ィ エ イ ト ' イ ソ サ ー マ ノレ ： t曽 幅 ( loop-mediated isothermal amplification;LAMP ) 、 核酸の等温キ メ ラプ ラ イ マ ー 1¾ 始 i¾ 巾虽 ( isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids; IC AN)、 当該固体および当 亥病 原微生物の核酸を検出するために使用でき る枝分かれした D N Aな どが使用でき得る。
前記個体から採取される核酸を含む試料物質は、 全血、 血 液、 血清、 白血球、 尿、 便、 精液、 唾液、 生検組織、 培養細 胞、 喀痰等を用いて も よ い。 好ま しい試料は血液である。 ま た、 試料物質は、 疾患の治療に対する感受性と 関連する前記 個体に由来する核酸と 、 前記個体に存在する病原微生物に関 連する核酸と を共に含むこ と が好ま しい。 こ こで、 前記病原 微生物は前記疾患と 関連 している。 また、 試料は、 必要に応 じて、 ホモジネー トおよび抽出等の必要な任意の前処理を行 つた も のであっても よい。 こ の よ う な前処理は、 対象と なる 生物試料に応 じて当業者によっ て選択され得るであろ う 。
こ こで開示する実例 と な る態様においては、 まず、 ヒ ト か ら全血試料 ( w h o l e b l o o d s a m p l e ) を採 取する。 次に、 こ の採取された全血試料から、 例えば、 Q I A a m p D N A B l o o d M i d i K i d (登録商 標、 Q I A G E N、 東京、 日本） な どの市販の ヒ トゲノ ム抽 出用キ ッ ト を用いて ヒ ト ゲノ ム 由来と 、 前記ヒ ト に存在する ウィ ルスゲノ ム 由来の核酸を共に抽出する。 ある態様におい ては、 目 的 と する配列を含む核酸を増幅する。 続いて、 得ら れた増幅産物をプロ ーブ固定化チ ップに対してハイ プリ ダイ ズし、 更にそのプロ ーブ固定化チ ッ プに対して結合する核酸 を検出する こ と によ って、 得られた増幅物を解析する。 こ の よ う に して、 前記個体からの特定の疾患に関連する核酸の情 報が、 前記個体に存在する病原微生物か ら得られる特定疾患 に関連する核酸についての情報と共に得られる。
上記の方法では、 ヒ ト個体の例について記載したが、 個体 はヒ ト に限定する も のではない。 本発明の態様に従 う と 、 対 象と なる 「個体」 の例は、 ヒ ト 、 ィ ヌ 、 ネ コ 、 ゥ シ、 ャギ、 ブタ、 ヒ ッジ、 又はサルを含む任意の哺乳動物であ り 得る。 しかしなが ら ヒ ト が最も好適な個体であ る。 また、 本発明の 側面に従 う と 、 個体は健康な個体であっ て も、 何らかの疾患 に罹患 している個体であって も よい。 し力、しなが ら、 一般的 には、 病原微生物 と 、 個体が有する核酸の型によ って引 き起 こ される疾患に罹患 している個体に対して行 う こ と によ っ て 本発明に従 う 方法は、 よ り 有効に使用 されるであろ う。 本明 細書において使用 される 「特定の疾患」 の語は、 病原性微生 物、 例えば、 ウ ィ ルス 、 ノ ク テ リ ア、 酵母またはマイ コプラ ズマに関連する疾病並びに腫瘍学的疾患を含み、 好ま し く は 病原微生物に関連する疾患をいい、 よ り 好ま し く は、 当該疾 患に罹患 している個体に含まれる核酸の型お よび/またはそ の よ う な核を含む遺伝子の発現の有無に依存 して、 その発症 および治療効果等が左右 される疾患であ る。 しか しなが ら、 これらの疾患に特に限定される ものではない。
こ こで使用 さ れる 「標的核酸」 の語は、 検出およびノまた は解析したい配列を含む核酸をい う 。
本発明の態様に従っ て、 抽出 される個体由来核酸は、 個体 に由来する核酸であればよ く 、 D N Aであっ て も R N Aであ つて も よ く 、 ゲノ ム D N Aであって も よい。 ま た、 抽出 され る病原微生物由来核酸は、 対象と なる病原微生物に由来する 核酸であればよ く 、 D N Aであって も R N Aであって も よい 試料物質から核酸成分を抽出する方法は、 上記の手段に特 に限定される も のではな く 、 フ エ ノ ール ク ロ 口 ホルム法 等の液一液抽出法や担体を用いる 固液抽出法を用いる こ と も でき る。 また、 これに限定する も のではないが、 例えば、 核 酸抽出方法 Q I A a m p ( Q I A G E N社製） またはゲノ ム D N A精製キ ッ ト （ Promega 社製） 、 スマイ テス ト （住友金 属社製） 等の市販のキ ッ ト を利用する こ と が可能である。 続 いて、 P C R な どの増幅操作を行って も よ く 、 または行わな く ても よい。
抽出 された核酸成分が R N Aである場合、 直接 H C V— R N Aを試料核酸 と して用いて も 良い し、 R N Aから逆転写酵 素を用いて c D N Aを作成した後試料核酸と して用いても良 い。 この場合も 、 個体由来の核酸と病原微生物由来の核酸を 分離せずに行っ て も よ く 、 例えば、 上述の方法において、 Q I A a m p D N A B l o o d M i d i K i d を用い て抽出を行っ た後に、 逆転写を行い、 続いて P C R増幅を行 つ て も よい。
本発明の態様に従っ て行 う 増幅は、 それ 自 体公知の一般的 に核酸を.増幅する手段であれば何れでも よ く 、 ポ リ メ ラーゼ 連鎖反応 （以下 P C R と記す） によ り 行 う こ と が好ま しい。 また、 試料物質が十分な量の核酸を含んでいれば、 増幅する こ と を省略して も よい。
本発明の態様に従って使用 し得るプロ ーブ固定化チップな どのプローブ固定化基体は、 互いに異なる塩基配列を有する 第 1 プローブ及び第 2 プロ ーブを基体上に固定化 してなる プ ローブ固定化チ ッ プであ る。 前記第 1 プロ ーブは、 特定疾病 に関連する病原微生物に由来する特定の核酸配列の存在を検 出するためのプロ ーブである。 前記第 2 プロ ーブは、 前記特 定疾病に関連 し、 個体に由来する特定の核酸配列の存在を検 出するためのプロ ーブである。
こ の よ う なプロ ーブ固定化基体は、 個体と 病原微生物 と い う 異なる 2 の由来から得た核酸に関 して同一の基体を用いる こ と によ り 解析を同時に行 う こ と が可能である。 こ のよ う な プローブ固定化チ ップは本出願人によって始めて開示される ものである。 本発明従 う と 、 こ の よ う なプロ ーブ固定化基体 も本発明の 1 側面 と して提供される。
本発明の態様に従 う プローブ固定化チッ プにおいて、 第 1 プローブは、 例えば、 ヒ ト患者からの全血などの試料物質中 に含まれる病原微生物由来の核酸配列の存在を検出する もの である。 そのよ う なプローブは、 対象と なる個体 （例えば、 ヒ ト患者） が感染している可能性のある病原微生物に由来す る染色体 D N A、 遺伝子 （ R N A ) に対応する塩基配列を有 していて も よ く 、 又はその c D N A又は c R N A、 染色体 D N A、 R N A、 c D N Aおよび c R N Aの断片又はそれらの 相補配列に対応する塩基配列を有していてもよい。
また、 試料物質中の病原微生物の量の測定も前記した第 1 プローブ、 すなわち病原微生物に由来する核酸配列、 その断 片又はそれらの相補配列、 に対応する塩基配列を有するプロ ーブを用いて測定するこ と が可能である。
更に、 前記第 1 プローブは、 試料物質中の前記病原微生物 の存在のみな らず前記病原微生物の遺伝子変異を検出するプ ローブである こ とが望ま しい。
試料物質中の病原微生物が発現した核酸 （ R N A ) の測定 も前記した第 1 プローブ、 すなわち病原微生物に由来する核 酸配列、 その断片又はそれらの相補配列、 に対応する塩基配 列を有するプローブを用いて測定が可能である。 この場合の 核酸鎖は R N A又は c D N A又は c R N Aを検出あるいは定 量する こ と ができ る。
当該病原微生物がウィルスである場合の 1 態様においては ウィルス の増殖期には特定の遺伝子が大量に発現される ので その発現パターン （量、 質） を測定する と薬効を予測する こ と が可能になる。 本発明の態様に従 う プローブ固定化チッ プにおいて、 第 2 プローブと しては、 個体が有する、 疾病に関わる染色体 D N A配列、 遺伝子 （ R N A ) 又はその c D N A又は c R N A、 それらの断片又はそれ ら の相補配列、 に対応する塩基配列が 挙げられる。 個体が有する 「疾病に関わる核酸配列」 と は、 前記個体の細胞内にある染色体中に存在する核酸配列であ り 治療に対する反応性を予測でき る核酸配列である。 よ り 詳 し く は、 当該核酸配列は、 例えば疾病に対する個体の反応性を 予測 した り 、 投与する薬の効きやすさ および/または副作用 の生 じやすさ等を決定する核酸配列である。
第 2 のプロ ーブに よ り 、 個体における特定の核酸配列の存 在並びに特定の遺伝子の発現量および個体における遺伝子の 発現パ ーンな どを検出する こ と が可能である。
本発明に従 う 第 1 プローブまたは第 2 プロ ーブは、 少な く と も 1 1 塩基、 好ま し く は少な く と も 1 2 塩基、 よ り 好ま し く は少な く と も 1 3 、 1 4 、 1 5 、 1 6 、 1 7 、 1 8 、 1 9 2 0 、 2 1 、 2 2 、 2 3 、 2 4 、 2 5 、 2 6 、 2 7 、 2 8 、 2 9 、 および 3 0 塩基の長さ の塩基配列を有する ものである こ と が望ま しい。 基体に固定化する塩基配列の長さ が過度に 長い と 、 1 個の塩基の相違を識別する こ と が困難になる。 一 方、 基体に固定化する塩基配列の長 さ が過度に短い と試料中 に含まれる塩基配列の塩基配列の決定が困難になる。
また、 第 1 プロ ーブ又は第 2 プロ ーブと しては、 リ ボ核酸 ( R N A ) 、 デォキシ リ ボ核酸 （ D N A ) 、 ペプチ ド核酸 ( P N A ) 、 メ チルフォスホネー ト核酸、 S —オリ ゴな どの オ リ ゴヌ ク レオチ ドや、 C D N A、 c R N Aな どのポ リ ヌ ク レオチ ドな どの核酸を用いる こ と ができ る。
本発明の態様に従 う と 、 プロ ーブ固定化基体は、 基板、 多 孔質体（Beattie et al., Clin. Chem., 41, 700 (1995))、 マイ ク ロ タ イ タ ー プ レー ト （Kawai et al., Anal. Biochem., 209, 63 (1993))、 ビーズ（Mirkin et al" Nature, 382, 607 (1996)、 球状 物質、 粒子状物質、 磁性体、 磁気 ビーズ（Miller et al., J. Magnet. Magn. Mater., 225, 138 (2001), DNA capillary electrophoresis chip (Chou et al., Proc. Natl. Acd. Sci.， 96, 11 (1999)、 メ ンプラ ンベース ァ レイ （Lemieux et al., Molecular Breeding, 4, 277 (1998)、 半導体を基礎に したデバイ ス な ど (Thewes et al., 2002 IEEE International Solid-State Circuits Conference, 350 (2002)、 導波性物質な ど（Piunno et al., Anal. Chim. Acta, 288, 205 (1994))、 SPR(Nelson et al., Anal. Chem., 73， 1 (2001) , QCM(Ito et al., Anal. Chim. Acta, 327, 29 (1996)、 質量分析（Amexis et al., Proc. Natl. Acd. Sci., 98, 12097 (2001)等で形成された基体に、 前記塩基配列か ら なる 第 1 プローブ及び第 2 プロ ーブを固定化する こ と によって作 成する こ と ができ る。 核酸を固定化すべき基体の材質、 大き さ 、 形状な どは特に限定される も のではな く 、 核酸を固定化 する こ と が可能な任意の基体を使用 してよい。 前記プロ ーブ 固定化基体を用いた試料物質中の核酸の配列の検出は、 例え ば、 個体から採取 した試料物質から核酸成分の抽出を行っ た 後、 前記試料核酸と プロ ーブ固定化チップな どのプローブ固 定化基体と を接触させ、 プロ ーブ固定化基体上のプローブと 試料核酸と のハイ プリ ダイゼーショ ン反応を検知すればよい 本発明は、 前記プローブ固定化チップ上のプローブと試料 中の核酸成分と のハイプリ ダイゼーショ ン反応を検知するた めの手段と して、 主に、 （ 1 ) 標識物質を用いる方法、 およ' ぴ （ 2 ) 電気化学的方法の 2種類を包含しても よい。
( 1 ) の標識物質を用いる方法の場合には、 試料核酸は、 F I T C 、 C y 3 、 C y 5若し く はローダミ ンなどの蛍光色 素、 またはビォチン、 ハプテン、 ォキシダーゼ若しく はボス フ ァ ターゼ等の酵素、 またはフエ 口セン若し く はキノ ン類等 の電気化学的に活性な物質で標識される。 或いは前述した物 質で標識したセカ ン ドプローブを用いる こ とで検出を行 う 。 複数の標識物質を同時に使用 しても よい。
( 2 ) の電気化学的方法の場合、 プローブを固定化する基 体と して導電性物質を用い、 プローブ固定化チップを電極と して使用する。 こ の電極を用いたハイ プリ ダイゼーショ ン反 応の存在の検出は他の一般的な電気化学的検出法と 同じよ う に、 こ の電極の他に、 対極や参照極を使用する。 参照極を配 置する場合、 例えば、 銀/塩化銀電極や水銀 Z塩化水銀電極 などの一般的な参照極を使用 し得る。 異なる塩基配列を有す るプローブは、 それぞれ別々 の異なる導電性基体に固定化し て同一の基板な どに配設されたチップを構成してよい。 これ によ り 精度の高い測定を行 う こ と が可能である。 その場合、 各電極から得られる電気化学的信号が どのプローブに対応し たものであるのか検知する。
幾つかの態様においては、 試料物質から抽出 した核酸成分 と プローブ固定化チップに固定化されたプローブとのハイ ブ リ ダィゼーシヨ ン反応は、 例えば、 以下のよ う に行う。 即ち . ハイ ブ リ ダィゼーシ ヨ ン反応溶液は、 イ オン強度 0 . 0 1 〜 5 の範囲で、 p H 5 〜 1 0 の範囲の緩衝液中で行 う。 こ の溶 液中にはハイ プ リ ダイゼーショ ン促進剤である硫酸デキス ト ラ ン、 並びに、 サケ精子 D N A、 牛胸腺 D N A、 E D T Aお よび界面活性剤な どを添加しても よい。 こ こに抽出した核酸 成分を添加し、 9 0 °C以上で熱変性させる。 プローブ固定化 チップの揷入は、 変性直後、 あるいは 0 °Cに急冷後に行って よい。 また、 基体上に液を滴下する こ と でハイ ブ リ ダィゼー シヨ ン反応を行 う こ と も可能である。 反応中は、 撹拌、 ある いは振と う な どの操作で反応速度を高めて も よい。 反応温度 は、 例えば、 1 0 °C〜 9 0 °Cの範囲で、 反応時間は 1 分以上 1 晚程度で行えばよい。 ハイ プ リ ダィゼーシ ヨ ン反応後、 電 極を取 り 出 し洗浄を行 う 。 洗浄には、 例えば、 イ オン強度 0 0 ：! 〜 5 の範囲で、 p H 5 〜 l 0 の範囲の緩衝液を用いる。
( 1 ) の標識物質を用いる方法の場合、 ハイ ブ リ ダィゼー シ ヨ ン反応の検出は、 標識の種類に応じた適宜の検出装置を 用いて、 試料中の標識された塩基配列又は 2次プローブ中の 標識を検出する こ と によ って行 う。 標識が蛍光物質の場合に は、 例えば、 蛍光検出器を用いて標識を検出すればよい。
( 2 ) の電気化学的方法の場合、 以下のよ う な手順で検出 を行 う。 基体は洗浄後、 電極表面に形成した二本鎖部分に選 択的に結合する二本鎖認識体を作用 させ、 電気化学的な測定 を行 う。 こ こで用いられる二本鎖認識体は特に限定される も のではないが、 例えば、 へキス ト 3 3 2 5 8 、 ァク リ ジンォ レンジ、 キナク リ ン、 ド ウ ノ マイ シン、 メ タ 口 イ ンターカ レ 一ター、 ビスアタ リ ジン等の ビスイ ンターカ レーター、 ト リ スィ ンタ一力 レーターおよびポ リ ィ ンタ一力 レーター等を用 いる こ と が可能である。 更に、 これらのイ ンターカ レーター を電気化学的に活性な金属錯体、 例えば、 フ エ 口セン、 ピオ ロ ゲン等で修飾しておく こ と も可能である。 D N A結合物質 の濃度は、 その種類によって異なるが、 一般的には 1 n g / m L〜 l rn g Zm Lの範囲で使用する。 この際には、 イ オン 強度 0 . 0 0 1 ~ 5 の範囲で、 p H 5〜 1 0 の範囲の緩衝液 を用いる。 電極を二本鎖認識体と反応させた後、 洗浄し、 電 気化学的な測定を行う。
電気化学的な測定では、 二本鎖認識体が電気化学的に反応 する電位以上の電位を印加 し、 二本鎖認識体に由来する反応 電流値を測定する。 この際、 電位は定速で掃引する力、、 ある いはパルスで印加するか、 あるいは、 定電位を印加する こ と ができ る。 測定には、 例えば、 ポテンシヨ スタ ツ ト、 デジタ ノレマルチメ ーターおよびフ ァ ンク シ ョ ンジエネ レーター等の 装置を用いて電流、 電圧を制御する。 得られた電流値を基に 検量線から標的核酸の濃度が算出 され得る。
電極を用いた塩基配列検出装置は、 例えば、 核酸抽出部、 核酸反応部、 二本鎖認識体反応部、 電気化学測定部および洗 浄部等から構成される。
また、 電気化学的な手法に基づく D N Aチップの他の例は 例えば、 以下の文献に開示されている （ H a s h i m o t o e t a 1 . 1 9 9 4， W a n g e t a 1 . 1 9 9 8 ) 。 橋本 ら は、 D N Aプロ ーブで修飾 された金電極と 電 気化学的に活性な色素を用いる配列特異的遺伝子検出を報告 した。 色素に由来する陽極の電流は、 標的 D N Aの濃度に相 関する。 ワ ン ら は、 イ ンディ ケ一ターフ リ ーの電気化学的な D N A のノヽイ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ンを報告 した。 こ のバイ オセ ンサ一の構成は、 カーボンペース ト電極へのイ ノ シン置換プ ローブ （グァニ ンを含まない） の固定化 と 、 当該標識のグァ ニン酸化ピーク の存在によ る二重鎖の形成のク ロ ノ ポテンシ ョ メ ト リ ッ ク検出を含む。 これ ら の文献は引用する こ と によ り 本明細書に組み込まれる。
電気化学的な手法は試料核酸の標識が不要である。 また検 出は電気信号を測定する こ と によ っ て行われる。 従って、 蛍 光検出に必要と される よ う な複雑なシス テ ムは不要である。 従って、 こ の よ う な手法ではシス テ ム の小型化も期待でき る 以上の よ う な本発明の態様に従 う と 、 患者な どの個体から 採取 した血液な どの試料物質から、 患者自 体が持つ前記疾病 に関わる核酸配列 と 、 患者が感染 した病原微生物の核酸配列 に関する情報と を簡便に得る こ と が可能である。
本発明の態様に係る プローブ固定化基体は、 疾病に曝され た個体における適切な治療方法を予測する ために使用 される 当該プロ ーブ固定化基体は、 同一の基体上に固定化された第 2 のプロ ーブ と 第 1 のプローブを具備する。 第 2 のプローブ は、 個体の細胞内にある染色体中に存在する前記疾病に リ ン ク （連鎖） する核酸配列に関する情報を得るためのプローブ (第 2 プローブ） であ り 、 第 1 のプローブは、 前記疾病を誘 起する病原微生物の核酸配列に関連する情報を得るためのプ ロープ （第 1 プローブ） である。 当該プローブ固定化基体の 長所によ り 、 個体から抽出 した試料物質から、 前記個体およ ぴ病原微生物に由来する特定の疾病および/または特定の疾 患の治療の反応性の予測に関連する情報を共に且つ簡便に得 る こ と が可能である。
幾つかの態様において、 当該方法およびプローブ固相化基 体は、 C型肝炎の治療効果を予測する こ と が可能である。 も う 1 つの態様は、 A I D S の治療を評価する （例えば、 H I Vの定量および変異の検出等） ために使用 される当該方法お よびプローブ固定化基体である。 更なる態様は、 B型肝炎の 治療を評価する （例えば、 H B Vの定量、 型および変異の検 出等） ために使用 される当該方法およびプローブ固定化基体 である。
例えば、 C型肝炎に感染する と、 肝硬変を経て肝癌に進行 する こ と が知 られている。 その治療法の 1 つにイ ンターフエ ロ ン （以下、 I F N と記す） を投与する I F N治療がある。 多く は I F N <¾および ]3 が治療に使用 されている。 し力、し、 I F Nの有効性には大きなばらつきがある こ と が知 られてい る。 例えば、 日本人の ヒ ト患者では I F N治療は約 2〜 3割 の人に しか効果がな く 、 効果があっても非常に強い副作用が 報告されている。 このよ う な個体の違いによ る治療効果の違 いは、 個体が感染した C型肝炎ウ ィ ルス （以下、 H C V と記 す） の遺伝子型 （ J . C 1 i n . M i c r o b i o l . ， 3 4 , 2 5 1 6 ( 1 9 9 6 ) ) 及びウィルス量と 、 個体 自 身が有する核酸配列の個体差に起因 している と考え られるお
H C Vの異なる領域のヌ ク レオチ ドおよび予測される ア ミ ノ 酸配列の比較を基に、 少な く と も 6 つの主な遺伝子型が報 告されてレヽる（Forns et al., J. Clin. Microbiol., 34, 2516 (1996): Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)。
従っ て、 本発明の態様に従っ て、 C型肝炎に対する I F N 治療の効果を予測する こ と が可能である。 こ こ で、 本明細書 において 「イ ンターフェ ロ ン ( I F N ) J と は、 イ ンタ ーフ ヱ ロ ン α 、 β γ および/ま たは ω を示す語と して使用する , 例'えば、 感染 した ウィルスの型が 1 b 型 （ 日 本人に多い） の 場合には I F N治療の効果は少ない。 これは、 血清中の H C V— R N A、 H C V抗体、 G O P および G P Tが、 I F N療 法に よ り 減少 されないこ と を意味する。 2 a 型の場合には治 療の効果はよ り 高い。 これは、 血清中の H C V— R N A、 H C V抗体、 G 〇 P および G P T力 S I F N療法によ り 減少する こ と を意味する。 また、 ゥィ ルス量カ 1 0 6 <： 0 7 7 111 し 以上 と 多い場合にも効果が少ない。 従って、 感染 した ウィル スの遺伝子型及びウィルス量を核酸レベルで調べるための第 1 プローブを使用する。
例えば、 試料物質中の C型肝炎 ウィルス （以下、 H C V と も記す） の核酸配列の存在の検出に用い られる プローブ と し ては、 H C V— R N A、 その断片またはそれらの相補配列、 に対応する塩基配列が挙げられる。 本発明の態様に従 う プロ ープは、 望ま し く は、 H C V — R N Aの遺伝子型または変異 を検出する ための少な く と も 1 1 塩基、 好ま し く は少な く と も 1 2塩基、 よ り 好ま し く は少な く と も 1 3 、 1 4 、 1 5 、 1 6 、 1 7 、 1 8 、 1 9 、 2 0 、 2 1 、 2 2 、 2 3 、 2 4 、 2 5 、 2 6 、 2 7 、 2 8 、 2 9 および 3 0 塩基の配列を有す る。 或いは、 ま た、 当該プローブは、 少な く と も 3 0 、 好ま し く は約 4 0 、 5 0 、 6 0 、 7 0 、 8 0 、 9 0 、 1 0 0 、 2 0 0 、 5 0 0 、 1 0 0 0 塩基よ り も長 く て も、 H C Vゲノ ム の検出には好ま しい。 1 1 から 3 0 の長さ がチ ップ形成には 適切であ り 、 3 0 塩基よ り も長いプロ ーブは一般的なハイ ブ リ ダィ ゼーシ ヨ ン形成に適切である。 例えば配列表に示 され る配列番号 1 、 2 、 3 、 4 またはそれ ら の相補配列に対応す る塩基配列を有する も のを用いる こ と が可能である。 これら の配列は、 全ての H C Vの遺伝子型において も つ と も保存さ れている（Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)。
また、 前記第 1 プロ ーブは、 試料物質中の前記病原微生物 の存在のみな らず前記病原微生物の遺伝子変異を検出するプ ロ ーブを使用する こ と も好ま しい。 C型肝炎の場合、 ウィ ル ス の核酸配列の特定の部位の変異によ って I F N治療の効果 が異なる こ と が報告 されている （Nagayama et al.,Hepatology, 31, 745 (2000)) 。 試料物質中の ウィ ルス の核酸配列の特定 の部位の変異を検出する ための第 1 プロ ーブの例は、 H e p a t o 1 o g y , 3 1 , 7 4 5 ( 2 0 0 0 ) に記載の H C Vの p o l y p r o t e i n の 4 3 4 、 5 8 0 、 9 3 8 、 9 6 2 、 1 1 7 6 、 あるいは 2 7 7 4番 目 のア ミ ノ 酸の 相違を決定する塩基配列を有するプローブを用いる こ と が可 能である。 肝細胞癌 （以下 H C C と記す） 患者からの H C V 一 1 b のゲノ ム配列は、 無症候性キャ リ ア （以下 A S C と記 す） からのものよ り も、 よ り 多く が変異型残基を有する傾向 がある。 これら を使用する こ と によ り 精度の高い予測が可能 と なる。
上述の通 り 、 H C Vの遺伝子型によって I F N治療の効果 が異なる こ と が報告されている。 従って、 第 1 プローブは、 H C V — R N A、 その断片またはそれらの相補配列、 に対応 する塩基配列であっても よい。 例えば H C Vの 1 型 （配列番 号 5 ) 、 2型 （配列番号 6 ) 、 3 型 （配列番号 7 ) の遺伝子 型をそれぞれ特異的に検出するプローブを、 検出 したい遺伝 子型に応じて第 1 プローブと して用いても よい。 即ち、 それ ぞれ配列表に示される配列番号 5 、 配列番号 6 、 配列番号 7 またはそれらの相補配列に相当する配列を有する核酸を第 1 プローブと して用いても よい。
遺伝子型を検出可能なプローブを用いる際は、 異なる遺伝 子型に対応する複数のプローブを基体上に同時に固定化 して 用いる こ と によ り 精度の高い検出が可能と なる。
また、 試料物質中の病原微生物の遺伝子型を検出する には 1 態様においては、 試料物質中の病原微生物の核酸配列に対 して予めその遺伝子型に特徴的なプライマ ーを用いて P C R 反応を行い、 その後それらの遺伝子型を考慮する こ と な しに 全ての C型肝炎ウィ ルスを検出する こ と が可能なュニバーサ ルプローブを固定化したプローブで検出する こ と も可能であ る（Andonov et al " J . Clin . Microbiol . , 33 , 254 ( 1 995 )。 C型肝炎の場合は、 セ ンス鎖と しては配列番号 8 あるいは 配列番号 9 に示される塩基配列のものを用いて、 アンチセ ン ス鎖と して 1 a 型には配列番号 1 0、 1 b 型には配列番号 1 1、 2 a型には配列番号 1 2、 2 b型には配列番号 1 3、 3 a 型には配列番号 1 4 の塩基配列のものを用いて P C R反応 を行い、 ユニバーサルプロープと して配列番号 1 5 の塩基配 列のものを用いても よい。
試料物質中の病原微生物の量の測定も前記した第 1 プロ一 ブ、 すなわち病原微生物に由来する核酸配列、 そ の断片又は それらの相補配列、 に対応する塩基配列を有するプローブを 用いて測定する こ とが可能である。
例えば C型肝炎の場合は血液中の H C V量によって I F N 療法の効果が異なる こ とが報告されている （ J . C l i n . M i c r o b i o l . , 3 3 , 2 5 4 ( 1 9 9 5 ) ) < I Ν F は、 そ の患者が血清中に有する H C Vが 1 0 6 コ ピー /m L を超える と 、 効果を得られに く い（Yeh et al., J. Med. Biol., 66, 481 (2002)。 そこで、 ウ ィ ルス量を定量的に評価す るためのプローブと しても、 H C V— R N A、 その断片又は それらの相補配列、 に対応する塩基配列が挙げられる。 ウイ ルス量は試料物質中の核酸を蛍光標識している場合にはチッ プ上のプローブと試料物質中の核酸をハイ プリ ダイズさせた 後に基体上における標識の蛍光強度から濃度を算定する。 電 気化学的な方法を用いる場合は、 チップ上のプローブと試料 物質中の核酸をハイ プリ ダイ させた後、 チップから得られ る電流値から濃度を算出する。 本発明のプローブ固定化チップにおいて、 第 1 プローブと して上記したプローブ、 配列番号 5 、 6 および/または 7 を 用いれば、 個体が感染した病原微生物のウィルスの遺伝子型 又はウィルス量、 特定部位の変異、 発現遺伝子の量と質など の知見が得られ、 ウ ィ ルス の型が 日本人に多い 1 b型であれ ば I F N療法の効果は少ないが 2 a 型であれば効果的に作用 する こ と 、 またウィ ルス量力 S l 0 6 c o p y / m L以上と多 い場合には I F N療法の効果が少ないと予測でき、 それによ り 前記個体に対する I F N療法の有効性を予測する こ と がで さ る。
C型肝炎に関する I F N治療の効果を予測する別の方法を 本出願人は特願 2 0 0 1 - 6 2 3 7 1 号及ぴ特願 2 0 0 1 一 6 2 3 7 2号で報告 している。 即ち、 ヒ ト遺伝子の M x Aた んぱく 質をコー ドする遺伝子のプロモーター領域、 即ち、 M x Aのプロモーター領域の一 8 8位 （以下、 M x A— 8 8 と 記す） に存在する特定の一塩基多型 （ s i n g 1 e n u c 1 e o t i d e p o l y m o r p h i s m、 以下 S N P と 記す） が I F N治療効果の大小を決定するため、 その S N P を調べる こ と によ り I F N治療効果の大小を予測する方法で ある。 即ち、 I N F は、 M x Aプロモーター領域の S N Pの 特定の型を有する患者においては有効である。 したがって、 その S N P の存在をチェ ッ クする こ と によ り 、' I F N療法の 効果が評価される。 従って、 本発明の 1 態様において、 個体 の核酸を検出するための第 2 のプローブが、 M x Aにおける S N P を検出する ものが使用 される。 上記の知見では、 当該 M x Aのプロモーター領域の一 8 8 位 （以下、 ]^ 一 8 8 と記す） が G / G型の場合には I F N治療効果が低く 、 G / Tおよび T / T型の場合には治療効 果が高いこ と 、 同領域の一 1 2 3位 （以下、 M x A— 1 2 3 と記す） が C / C型の場合には I F N治療効果が低く 、 C / Aおよび A Z A型の場合には治療効果が髙いこ と を基に I F Nの治療効果を予測する。 こ こで 「一 8 8位」 および 「一 1 2 3位」 の表記は、 M X A遺伝子の転写開始部位を + 1 と し た場合の位置である。 W O O 1 / 7 1 0 0 1 の図 1 は、 M x A遺伝子の当該プロ モーター領域のヌ ク レオチ ド配列を示す 従って、 本発明の態様に従って C型肝炎に関する I F N治 療効果を予測する場合には、 例えば、 H C Vの遺伝子の存在 さ らには H C Vの遺伝子型あるいは遺伝子変異を検知するた めの第 1 プローブと、 個体が有する M x Aたんぱく 質をコー ドする遺伝子のプロモーター領域の S N P における塩基の種 類を検知するため の第 2 プローブと を固定化したプローブ固 定化チップを用い、 個体から採取した試料物質の中の H C V の遺伝子診断及び個体が有する M x Aたんぱく 質をコー ドす る遺伝子のプロモーター領域の遺伝子診断を行 う こ と によ り その I F N治療の効果を簡単に予測する こ とができ る。
また更に、 C型肝炎に関する I F N治療の効果を予測する 方法と しては、 マ ン ノ ース結合レ ク チン （以下、 M B L と記 す） の遺伝子の 2箇所の S N P のタイ プによって、 I F N治 療効果の大小を予測する方法が知られている （M. M a t s u s h i t a e t a 1· . , J . H e p a t o l o g v 2 9 ； 6 9 5 - 7 0 0 , 1 9 9 8 ) 。 M B Lは、 生来の免 疫系の重要な因子であ り 、 遺伝子多型が存在する。 M B L遺 伝子型のグループ 「 X B」 は、 I F Nに反応しない。 ローセ ンは、 M B L の配列について報告してレ、る（Immunology, 93, 421 (1998)) 。 こ の文献は引用する こ と によ り 本明細書に組 み込まれる。 従って、 上記のよ う な M x Aたんぱく 質をコー ドする遺伝子のプロモーター領域の遺伝子診断の共に、 また はそれに代わってマンノ ース結合レクチン （以下、 M B L と 記す） の遺伝子に関する遺伝子診断を行っても よい。
I F Nの効果に影響を及ぼす M B Lの多型部位は、 M B L 遺伝子のプロモータ領域の— 2 2 1位 （以下、 M B L — 2 2 1 と記す） と 、 M B L遺伝子のェク ソン 1 のコ ドン 5 2 、 5 4 および 5 7 に存在する。 こ こで 「一 2 2 1位」 の表記は、 M B L遺伝子の転写開始部位を + 1 と した場合の位置である M B L — 2 2 1 の遺伝子型の取り 得る塩基は、 Cまたは G であ り 、 Cの場合にはタイ プ X と称し、 Gの場合にはタイ プ Y と称す （こ の命名法はマツ ドセンらに従 う ； M a d s e n H〇， G a r r e d P， T h i e 1 S , K u r t z h a 1 s J A L , L a m m L U , R y d e r L P , e t a 1 . 「プロモータ と構造遺伝子との間の相 互作用はヒ トマ ンナン結合蛋白質の最低血清レベルをコ ン ト ロールする」 J I m m u o l 1 9 9 5 ; 1 5 5 : 3 0 1 3 - 2 0 ) 。 こ の文献は引用する こ と によ り 本明細書に組 み込まれる。
また、 M B L遺伝子のェク ソン 1 のコ ドン 5 2 、 5 4 およ び 5 7 は、 構造遺伝子であ る コ ラ ーゲン様 ドメ イ ン内に存在 する。 コ ドン 5 2 の取 り 得る遺伝子型は、 C G T または T G Tであ り 、 マ ッ ドセン ら の分類に よ る と 前者がタイ プ A、 後 者がタ イ プ D である。 同様に、 コ ドン 5 4 の取 り 得る遺伝子 型は、 G G C または G A C であ り 、 同分類によ る と前者が タ イ ブ A、 後者がタイ プ B である。 また、 コ ドン 5 7 の取 り 得 る遺伝子型は G G Aまたは G A Aであ り 、 同分類によ る と 前 者がタイ プ A、 後者がタイ プ C である。 これ ら全てコ ドンに おいて、 タイ プ Aは野生型対立遺伝子であ り 、 その他のタ イ プ 8 、 Cおよび Dは変異型対立遺伝子である。 コ ドン 5 2 、 5 4 および 5 7 の対立遺伝子が全てタイ プ Aである場合には 他の場合、 即ち、 少な く と も何れかの対立遺伝子がタイ プ A ではない場合に比較 して I F Nの効果は高い。
上記 M B L — 2 2 1 がタイ プ Yであ り 、 且つコ ドン 5 2 、 5 4 お よび 5 7 の対立遺伝子がタイ プ Aである、 Y A— Y A ホモ接合である患者の場合、 他のタイ プの患者に比べて I F Nの効果は得られやすい。 また、 上記 M B L — 2 2 1 がタ イ プ Yであ り 、 且つコ ドン 5 2 、 5 4 および 5 7 の対立遺伝子 の何れかがタイ プ Aではない場合、 即ち、 Y n o n A— Y A ヘテ ロ接合または Y n o n A - Υ η ο η Αホモ接合である患 者の場合には、 Υ Α— Υ Αホモ接合の患者に比べて I F Nの 効果は得られに く い。
以上の知見か ら第 2 プロ ーブを決定する こ と が可能であ る 当該疾患が C型肝炎であ り 、 当該薬剤が I F Nである 1 態 様において、 個体の核酸に対するハイ ブ リ ダイ ゼーショ ンに おいて使用 される （プロ ーブ固定化チ ッ プ上での使用 も含 む） 第 2 のプローブは、 上述したよ う な M x Aプ ロ モーター の S N P を検出するプロ モーターである。 当該疾患が C型肝 炎であ り 当該薬剤が I F Nであるその他の態様においては、 個体の核酸に対するハイ プリ ダイゼーショ ンにおいて使用 さ れる （プローブ固定化チップ上での使用も含む） 第 2のプロ ーブは、 上述したよ う に、 I F Nの効果に関連する M B Lの 多型を検出するプローブである。
4 5 5位と 4 2 0位に存在する S N P を含むヒ ト M x A遺 伝子のプロモーター領域のこれらの塩基配列の各々が I F N 療法の効果に関連する。 従って、 配列番号 1 6 、 1 7、 1 8 1 9 、 3 7 、 3 8 、 3 9 および 4 0 に よ り 示 される塩基配 更なる態様において、 第 2 のプローブは以下からなる群よ り 選択される ： '
(at455) 下記配列表の配列番号 16 に示される塩基配列、 (bt455) 前記（at455)に示される塩基配列中の 455 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列 ； M B Lの多型を検出するための修飾され たプローブは M B L をコー ドする個々 の核酸に対してハイ ブ リ ダィ ズでき る能力を維持している。 修飾されたプローブに 使用 される 当該ハイ プリ ダイゼーショ ン条件は一般的なプ口 ーブのそれと は異なる。 望ま しく は、本発明に従 う 修飾され たプローブは、 H C V— R N Aの遺伝子型または変異を検出 するための少な く と も 1 1 塩基、 好ま しく は少なく と も 1 2 塩基、 よ り 好ま し く は少なく と も 1 3 、 1 4 、 1 5 、 1 6、 1 7 、 1 8 、 1 9 、 2 0 、 2 1 、 2 2 、 2 3 、 2 4 、 2 5 、 2 6 、 2 7 、 2 8 、 2 9 および 3 0塩基の配列を有する。 或 いは、 また、 当該プローブは、 少なく と も 3 0 、 好ま しく は 約 4 0 、 5 0 、 6 0 、 7 0、 8 0 、 9 0 、 1 0 0 、 2 0 0 、 5 0 0 、 1 0 0 0塩基よ り も長く ても、 H C Vゲノ ムの検出 には好ま しい。 1 1 から 3 0 の長さがチップ形成には適切で あ り 、 3 0塩基よ り も長いプローブは一般的なハイブリ ダィ ゼーシ ョ ン形成に適切である。
(ct455) 配列番号 16 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt455) 配列番号 16 の 449〜 459 位に示される配列を含む塩 基配列、
(et455) 前記（at455)〜（dt455)から選択される塩基配列の相補 配列、
(ag455) 下記配列表の配列番号 17 に示される塩基配列、 (bg455) 前記（ag455)に示される塩基配列中の 455位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cg455) 配列番号 17 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dg455) 配列番号 17 の 449〜 459位に示される配列を含む塩 基配列、
(eg455) 前記（ag455)〜（dg455)か ら選択される塩基配列の相 捕配列
(aa455) 下記配列表の配列番号 18 に示される塩基配列、 (ba455) 前記（aa455)に示される塩基配列中の 455 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ca455) 配列番号 18 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(da455) 配列番号 18 の 449〜459 位に示される配列を含む塩 基配列、
(ea455) 前記（aa455)〜（da455)か ら選択される塩基配列の相 補配列
(ac455) 下記配列表の配列番号 19 に示される塩基配列、 (bc455) 前記（ac455)に示される塩基配列中の 455 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cc455) 配列番号 19 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc455) 配列番号 19 の 449〜 459 位に示される配列を含む塩 基配列、
(ec455) 前記（ac455)〜（dc455)か ら選択 される塩基配列の相 捕配列、 ·
からなる群よ り選択される塩基配列を使用 しても よい。
配列番号 1 6 、 配列番号 1 7 、 配列番号 1 8 、 配列番号 1 9 、 配列番号 3 7 、 配列番号 3 8 、 配列番号 3 9及び配列番 号 4 0 の塩基配列は、 ヒ ト M x A遺伝子のプロモーター領域 を包含する塩基配列であ り 、 これらの塩基配列の 4 5 5位お ょぴ 4 2 0位に存在する S N P 力 S I F N療法の効果に対する 応答性に関与している
配列番号 1 6 〜 1 9 の塩基配列は 4 5 5位の塩基を除き共 通の配列を有する。 配列番号 1 6 の 4 5 5位はチミ ンである , 配列番号 1 7 の 4 5 5位はグァニンである。 また、 配列番号 1 8 の 4 5 5位アデニンである。 配列番号 1 9 の 4 5 5位は シ ト シンである。
これらの 4 5 5位の塩基がチミ ンである配列番号 1 6 の核 酸配列を有する H C V感染者は、 I F N療法が有効であるの に対して、 4 5 5位の塩基がチミ ンである配列番号 1 6 の核 酸配列を持たない H C V感染者は、 I F N療法が有効でない つま り 、 4 5 5位の塩基配列がチミ ンである配列番号 1 6 の 核酸と、 4 5 5位の塩基配列がグァニンである配列番号 1 7 の核酸をへテロ接合で有する （以下、 G Z Tヘテロ と略記す る） H C V感染者、 又は 4 5 5位の塩基配列がチミ ンである 配列番号 1 6 の核酸をホモ接合で有する （以下、 T / Tホモ と略記する） H C V感染者と比べて、 4 5 5位の塩基配列が グァニンである配列番号 1 7 の核酸をホモ接合で有する （以 下、 G / Gホモ と略記する） H C V感染者は I F N療法が有 効でない。
あるいは、 T Z n o n — Tヘテ ロ又は T Z Tホモの H C V 感染者と比べて、 4 5 5位の塩基配列がチ ミ ンでない Μ X A 遺伝子のプロモーター領域をホモ接合で有する H C V感染者 (以下、 n o n — T Z n o n — Tホモと略記する） は、 I F N療法が有効でないこ と が示された。 n o η — Τ / η ο η - Τホモの組み合わせと しては G / G、 G / A , G / C、 A / A、 A / C N C Z Cがある。 T Z n o n — Tの組み合わせと しては、 T / G、 T /A、 T / Cがある。
配列番号 3 7 〜 4 0 の塩基配列は 4 2 5位の塩基を除き共 通の配列を有する。 配列番号 3 7 の 4 2 5位はアデユンであ る。 配列番号 3 8 の 4 2 5位はシ トシンである。 また、 配列 番号 3 9 の 4 2 5位はチミ ンである。 配列番号 4 0 の 4 2 5 位はグァニンである。
本発明のプローブ固定化チップにおいて、 個体の有する核 酸の配列を検出する第 2 プローブと して前記 S N P部位を含 み当該 S N P部位の塩基配列がチ ミ ンである配列番号 1 6 の 塩基配列、 その断片又はそれらの相補配列 （ （ a t 4 5 5 ) 〜 （ e t 4 5 5 ) ) を使用する と 、 個体が有する ヒ ト M x A 遺伝子のプロ モーター領域を包含する塩基配列の前記 S N P 部位がチミ ンであるか否かを治療の前に調べる こ と ができ る それによ り 前記個体に対する I F N療法の有効性を予測する こ とができ る。
従って、 I F N療法の実施に先立って、 例えば H C V感染 者が有する ヒ ト M x A遺伝子のプロモーター領域を包含する 塩基配列における前記 S N P部位の塩基を決定する こ と によ つ て、 該 H C V感染者に対して、 I F N療法が有効性を検知 するこ と ができ る。
また、 本発明のプローブ固定化チップにおいて、 個体の有 する核酸の配列を検出する第 2 プローブと して、 前記 S N P 部位を含み、 当該 S N P部位の塩基配列がグァニンである配 列番号 1 7 の塩基配列、 その断片またはそれら の相補配列 ( ( a g 4 5 5 ) 〜 （ e g 4 5 5 ) ) 又は当該 S N P部位の 塩基配列がアデニンである配列番号 1 8 の塩基配列、 その断 片またはそれら の相補配列 （ （ a a 4 5 5 ) 〜 （■ e a 4 5 5 ) ) 、 又は当該 S N P部位の塩基配列がシ ト シンである配 列番号 1 9 の塩基配列、 その断片ま たはそれ ら の相補配列
( ( a c 4 5 5 ) 〜 （ e c 4 5 5 ) ) を用いれば、 個体が有 する ヒ ト M x A遺伝子のプロモーター領域を包含する塩基配 列の前記 S N P部位の配列を調べる こ とができ、 それによ り 前記個体に対する I F N療法の有効性を予測する こ とができ る。 （特願 2 0 0 1 — 6 2 3 7 1 号及ぴ特願 2 0 0 1 — 6 2 3 7 2号） 。
当該疾患が C型肝炎であ り 、 当該薬剤が I F Nである 1 態様において、 個体の核酸に対するハイ プ リ タ"ィゼーショ ン において使用 される （プローブ固定化チップ上での使用も含 む） 第 2 のプローブは、 以下 ；
(aa420) 下記配列表の配列番号 37 に示される塩基配列、 (ba420) 前記（aa420)に示される塩基配列中の 420 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ca420) 配列番号 37 の 415〜 425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(da420) 前記（aa420)〜（ca420)か ら選択さ れる塩基配列の相 補配列
(ac420) 下記配列表の配列番号 38 に示される塩基配列、 (bc420) 前記（ac420)に示される塩基配列中の 420 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れ .た修飾塩基配列、
(c c420 ) 配列番号 3 8 の 4 1 5〜 425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc420) 前記（ac420)〜（cc420)か ら選択される塩基配列の相 補配列
(at420) 下記配列表の配列番号 3 9 に示される塩基配列、 (bt420) 前記（at420 )に示される塩基配列中の 420 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ct420) 配列番号 3 9 の 4 1 5〜425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt420) 前記（at420)〜（ct420)から選択される塩基配列の相補 配列
(ag420) 下記配列表の配列番号 40 に示される塩基配列、 (b g420 ) 前記（at420)に示される塩基配列中の 420 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cg420) 配列番号 40 の 4 1 5〜 425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dg420) 前記（ag420)〜（cg420)か ら選択される塩基配列の相 補配列
からなる群よ り選択される塩基配列が使用 されてもよい。
これらの 4 2 5位の塩基がアデニンである配列番号 3 7 の 核酸配列を有する H C V感染者は、 I F N療法が有効である のに対して、 4 2 5位の塩基がアデニンである配列番号 3 7 の核酸配列を持たない H C V感染者は、 I F N療法が有効で ない。 配列 と有効性に関する詳細は、 上述の 4 5 5位の S N P のための記載と 同様に理解する こ とができ るであろ う 。
また更に、 前記疾病が I F N療法の有効性が確認された疾 病、 例えば C型肝炎である場合、 前記第 2 プローブは、 例え ば、 後述する （ i ) から （ t ) までのよ う な配列であっても よレヽ。 これらは M B L — 2 2 1 の遺伝子型と コ ドン 5 2 、 5 4 および 5 7 の多型の存在を決定するために使用するために 好適な核酸である。
M B L — 2 2 1 と コ ドン 5 2 、 5 4および 5 7 にコー ドさ れる多型を含む M B L遺伝子を配列番号 4 1 から配列番号 5 6 に示す。 M B L — 2 2 1 はこれらの配列の 4 2 5位に存在 する。
また、 ェク ソン 1 はこれらの配列の 6 4 6位力 ら始ま り 、 コ ドン 5 2 は同 8 6 8 力、ら 8 7 0位に、 コ ドン 5 4 は同 8 7 4 力 ら 8 7 6位に、 コ ドン 5 7 は同 8 8 3 力 ら 8 8 5位に存 在する。 コ ドン 5 2 の S N P は同 8 6 8位に、 コ ドン 5 4 の S N P は同 8 7 5位に、 コ ドン 5 7 の S N P は同 8 8 4位に 存在する。
( i ) 前記 M B L — 2 2 1 の S N P部位を含む配列番号 4 1 、 配列番号 4 2 、 配列番号 4 3 、 配列番号 4 4 の核酸断 片であって、 配列番号 4 1 、 配列番号 4 2 、 配列番号 4 3 、 配列番号 4 4 の 4 1 8 〜 4 3 2位に相当する配列を有する核 酸を含む断片。 ( j ) 前記 M B L — 2 2 1 の S N P部位を含む配列番号 4 1 、 配列番号 4 2 、 配列番号 4 3 、 配列番号 4 4 の核酸断 片であって、 配列番号 4 1 、 配列番号 4 2 、 配列番号 4 3 、 配列番号 4 4 の 4 2 1 〜 4 3 0位に相当する配列を有する核 酸を含む断片。
( k ) 上記 （ i ) および （ ； j ) に記載の相補配列。
( 1 ) 前記コ ドン 5 2 、 5 4および 5 7 の S N P部位を 含む配列番号 4 5 、 配列番号 4 6 、 配列番号 4 7 、 配列番号
4 8 、 配列番号 4 9 、 配列番号 5 0 、 配列番号 5 1 、 配列番 号 5 2 、 配列番号 5 3 、 配列番号 5 4 、 配列番号 5 5および 配列番号 5 6 の核酸の断片であって、 これらの配列の 8 6 8 から 8 8 5位に相当する配列を有する核酸を含む断片。 例え ば、 配列番号 4 5 から配列番号 5 6 に示す核酸を含む断片。
( m ) 前記コ ド ン 5 2 および 5 4 の S N P部位を含む配 列番号 4 5 、 配列番号 4 6 、 配列番号 4 7 、 配列番号 4 8 、 配列番号 4 9 、 配列番号 5 0 、 配列番号 5 1 、 配列番号 5 2 配列番号 5 3 、 配列番号 5 4 、 配列番号 5 5 および配列番号
5 6 の核酸の断片であって、 これらの配列の 8 6 8 カゝら 8 7 6位に相当する配列を有する核酸を含む断片。 例えば、 配列 番号 4 5 から配列番号 5'6 に示す核酸を含む断片。
( n ) 前記コ ドン 5 4および 5 7 の S N P部位を含む配 列番号 4 5 、 配列番号 4 6 、 配列番号 4 7 、 配列番号 4 8 、 配列番号 4 9 、 配列番号 5 0 、 配列番号 5 1 、 配列番号 5 2 配列番号 5 3 、 配列番号 5 4 、 配列番号 5 5 およぴ配列番号 5 6 の核酸の断片であって、 これらの配列の 8 7 4 カゝら 8 8 5位に相当する配列を有する核酸を含む断片。 例えば、 配列 番号 4 5 から配列番号 5 6 に示す核酸を含む断片。
( 0 ) 前記コ ド ン 5 4 の S N P部位を含む配列番号 4 5 配列番号 4 6 、 配列番号 4 7 、 配列番号 4 8 、 配列番号 4 9 配列番号 5 0 、 配列番号 5 1 、 配列番号 5 2 、 配列番号 5 3 配列番号 5 4 、 配列番号 5 5 および配列番号 5 6 の核酸の断 片であって、 これらの配列の 8 7 4 力、ら 8 7 6位に相当する 配列を有する核酸を含む断片。 例えば、 配列番号 4 5 から配 列番号 5 6 に示す核酸を含む断片。 特に 8 6 9位〜 8 8 0位 を含む断片が望ま しい。
( p ) 前記コ ド ン 5 2 の S N P部位を含む配列番号 4 5 配列番号 4 6 、 配列番号 4 7 、 配列番号 4 8 、 配列番号 4 9 配列番号 5 0 、 配列番号 5 1 、 配列番号 5 2 、 配列番号 5 3 配列番号 5 4 、 配列番号 5 5 および配列番号 5 6 の核酸の断 片であって、 これらの配列の 8 6 8 力 ら 8 7 0位に相当する 配列を有する核酸を含む断片。 例えば、 配列番号 4 5 から配 列番号 5 6 に示す核酸を含む断片。 特に 8 6 4位から 8 7 3 位を含む断片が望ま しい。
( q ) 前記コ ドン 5 7 の S N P部位を含む配列番号 4 5 配列番号 4 6 、 配列番号 4 7 、 配列番号 4 8 、 配列番号 4 9 配列番号 5 0 、 配列番号 5 1 、 配列番号 5 2 、 配列番号 5 3 配列番号 5 4 、 配列番号 5 5 および配列番号 5 6 の核酸の断 片であって、 これらの配列の 8 8 3 力、ら 8 8 5位に相当する 配列を有する核酸を含む断片。 例えば、 配列番号 4 5から配 列番号 5 6 に示す核酸を含む断片。 特に 8 8 0 〜 8 9 0位を W
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含む断片が望ま しい。
( r ) 前記コ ドン 5 4 の S N P部位を含む配列番号 4 5 . 配列番号 4 6 、 配列番号 4 7 、 配列番号 4 8 、 配列番号 4 9 . 配列番号 5 0 、 配列番号 5 1 、 配列番号 5 2 、 配列番号 5 3 . 配列番号 5 4 、 配列番号 5 5 および配列番号 5 6 の核酸の断 片であって、 当該コ ドン 5 4 の S N P が存在する前記配列の 8 7 5位を含む核酸を含む断片。 例えば、 配列番号 4 5 から 配列番号 5 6 に示す核酸を含む断片。
( s ) 前記 （ i ) から （ m) に示される核酸断片であつ て、 長さが 1 1 から 3 0 である核酸断片。 好ま しいプローブ 配列は、 M B L遺伝子に関しては、 少な く と も第 4 2 0位か ら第 4 3 0位、 第 8 6 4位から第 8 7 4位、 第 8 7 0 力ゝら第 8 8 0位および第 8 7 9位から第 8 8 9位を含む。 また M x A遺伝子に関 しては、 少なく と も第 4 5 0位から第 4 6 0位 を含むこ とが好ま しい。
( t ) 前記 （ i ) から （m) に示される核酸断片であつ て、 当該多型部位を除く 1 も しく は数個のヌ ク レオチ ドが欠 失、 置換、 または付加された修飾核酸。
本明細書の配列表に記載 した各配列 中、 「 N」 お よ び Γ n」 はアデニン、 チミ ン、 グァニンまたはシ ト シンの何れ かの塩基を示す。
本発明のプローブ固定化チップにおいて、 個体が発現した 核酸 （ R N A ) の測定も前記した第 2 プローブ、 すなわち個 体に由来する核酸配列、 その断片又はそれらの相補配列、 に 対応する塩基配列を有するプローブを用いて測定が可能であ る。 こ の場合、 核酸鎖は R N A又は c D N A又は c R N Aで あ り 、 これら を検出あるいは定量する こ と ができ る。 例えば I F Nの効き 目 は個人の体質に よ り 異な る ので、 投与の際の 遺伝子発現パタ ーン （量、 質） を測定する と薬効を予測する こ と が可能になる。
上述 した通 り 本発明の態様に従って対象と なる疾病は、 病 原性微生物に誘起される疾病であれば、 特に限定される も の ではない。 本発明は、 病原微生物に関する疾患を含む。 ま た 本発明は腫瘍学的疾患も含む。 例えば、 I F N治療の有効性 を予測する場合には、 C型肝炎以外の疾病であっ ても I F N 治療の有効性が確認されている疾病であれば同様に治療効果 が予測でき る。 その よ う な例は、 肝炎 ウィルス （ A、 B、 C D、 E、 F、 G型） 、 H I V 、 イ ンフルエ ンザ ウ イ ルス 、 へ ルぺス群 ゥ イ ノレス 、 アデ ノ ウ イ ノレス 、 ヒ ト ポ リ オ一マ ウ イ ノレ ス 、 ヒ トノ ピ ロ ーマ ウ ィ ルス 、 ヒ ト ノ ノレボ ウイ ノレス 、 ム ンプ ス ウィ ル素、 ヒ ト ロ タ ウ ィ ルス 、 ェ ンテ ロ ウ ィ ルス 、 日 本脳 炎 ウィ ルス 、 デングウ ィ ルス 、 風疹 ゥイ ノレス および H T L V 等の ウ ィ ルス感染症、 黄色ブ ド ウ球菌、 溶血性連鎖球菌、 病 原性大腸菌、 腸炎 ビブ リ オ菌、 へ リ コパク ター ピロ リ 菌、 力 ン ピ ロ バ ク タ一、 コ レ ラ 菌、 赤痢菌、 サルモネ ラ 菌、 エルシ ニァ、 淋菌、 リ ス テ リ ア菌、 レプ ト ス ビ ラ 、 レジオネラ菌、 ス ピ ロ ヘータ 、 肺炎マイ コプラズマ、 リ ケ ッチア、 ク ラ ミ ジ ァ、 マラ リ ア、 赤痢アメ ーバおよび病原真菌等の細菌感染症 寄生虫、 並びに真菌に起因する疾病な どが挙げられるが、 こ れに限定される も のではない。 また更に、 遺伝性疾患、 網膜芽細胞腫、 ウィ ルム ス腫瘍、 家族性大腸ポ リ ポーシス 、 遺伝性非ポ リ ポーシス大腸癌、 神 経腺維腫症、 家族性乳ガ ン、 色素性乾皮症、 脳腫瘍、 口腔癌 食道癌、 胃ガン、 大腸癌、 肝臓癌、 膝臓癌、 肺ガ ン、 甲状腺 腫瘍、 乳腺腫瘍、 泌尿器腫瘍、 男性器腫瘍、 女性器腫瘍、 皮 膚腫瘍、 骨 · 軟部腫瘍、 白血病、 リ ンパ腫および固形腫瘍等 の腫瘍性疾患について も I F N治療の有効性を予測する こ と が可能である。
本発明の態様に従って検出 し得る病原微生物は、 特に限定 される も のではないが、 例えば I F N治療の有効性を予測す る場合は、 I F N治療の有効性が確認されている疾病を誘起 する病原微生物が挙げられ、 例えば H C Vが挙げ られる が、 I F N治療の有効性が確認 されている疾病に関連する病原微 生物であれば特に限定される も の ではない。 病原性微生物が 当該疾患またはその疾患の症状と 直接的または間接的に相互 関係がある場合、 その病原性微生物はその疾患と 関連する。
例えば、 肝炎 ウ ィ ルス （ A、 B、 C、 D、 E、 F、 G型） H I V 、 イ ンフノレェ ンザ ウ ィ ルス 、 ヘルぺス群 ウ ィ ルス 、 ァ デノ ウィルス 、 ヒ ト ポ リ オ一マ ウイ ノレス 、 ヒ トパ ピロ ーマ ウ ィ ルス 、 ヒ ト パノレボ ウイ ノレス 、 ム ンプス ウ ィ ル素、 ヒ ト ロ タ ゥイ ノレス 、 ェンテ ロ ウ ィ ルス 、 日 本脳炎ウ ィ ルス 、 デング ゥ ィ ルス 、 風疹 ウィ ルスお よ び H T L V等の ウ ィ ルス 、 黄色ブ ド ウ球菌、 溶血性連鎖球菌、 病原性大腸菌、 腸炎 ビブ リ オ菌 ヘ リ コ ノ ク タ一ピ ロ リ 菌、 カ ン ピ ロ ノく ク タ一、 コ レ ラ菌、 赤 痢菌、 サルモネ ラ菌、 エルシニア 、 淋菌、 リ ス テ リ ア菌、 レ プ ト ス ビラ 、 レジオネラ菌、 ス ピ ロ ヘータ、 肺炎マイ コ プラ ズマ、 リ ケ ッチア、 ク ラ ミ ジァ、 マラ リ ア、 赤痢アメ ーバお よび病原真菌等の細菌、 寄生虫並びに真菌の検出に用いる こ と ができ る。
上記の例では、 I F N療法と 各疾患と個体遺伝子に関する 解析の例を示 した。 しかしなが ら、 本発明はこれに限定する も の ではない。 幾つかの態様においては、 例えば、 個体に存 在 す る ヒ ト 兌 3ヽ 全 ゥ イ ノレ ス 、 human immunodeficiency virus; 以下 H I V と記す） と 当該個体遺伝子を解析する こ と に よ り 、 エ イ ズ ( acquired immunodenciency syndrome; AIDS) の罹患性を予測する こ と が可能であ る。 また更に、 H I Vの遺伝子型および/またはコ ピー と 、 当該個体遺伝子 の特定の多型を分析 した後に、 得られた情報から、 以下の よ う な薬剤、 例えば、 リ トナ ビル （以下 R T V と記す） および サキナビル （以下 S Q V と 記す） な どのプロテアーゼイ ン ヒ ビター、 並びにア ジ ドチ ミ ジン （以下 A Z T ) およびジダノ シン （以下 d d 1 と記す） な どの逆転写阻害剤の治療効果を 予測 しても よい。 更なる幾つかの態様では、 個体に存在する 水痘帯状疱疹ウィ ルス （Varicella Zoster Virus; VZV) と 当該 個体遺伝子を解析する こ と に よ り 、 水痘（varicella)または帯 状疱疹 （zona) の罹患性を予測する こ と が可能である。 また 得られた核酸に関する情報か ら ァシク ロ ビルな どの抗ウィ ル ス薬の有効性を解析しても よい。 或いは、 イ ンフルエンザゥ ィ ルス （influenza virus) の遺伝子型お よびコ ピー数、 並ぴ に個体の遺伝子型を解析する こ と に よ り 、 ィ ンフルェ ンザの 罹患性やタ ミ フル （ Tamifulu) な どの抗ウィルス薬の有効性 が解析されても よい。
抽出された核酸成分が H C V— R N Aである場合、 直接 H C V— R N Aを試料核酸と して用いても良い し、 H C V— R N Aから逆転写酵素を用いて c D N Aを作成した後試料核酸 と して用いても良い。
また、 遺伝子型を検出可能なプローブを用いる際は、 異な る遺伝子型に対応する複数のプローブを基体上に同時に固定 化して用いる こ と によ り精度の高い検出が可能と なる。
以下の例は、 本発明を説明する こ と を意図する ものであ り 本発明を制限する こ と を 目的とする ものではない。
例
例 1 は、 ヒ ト対象から核酸を抽出するための方法を記載する 1 . 患者患者から の ヒ ト ゲノ ム及びウィ ルス ゲノ ムの抽出 法
H C V感染患者の血液を、 E D T A 2 K入 り の真空採血管 中に約 3 m L程度ずつ採血した。 その後、 Q I A a m p D N A B l o o d M i d i K i t ( Q I A G E N ) を用 いて核酸抽出を行った。 得られた抽出産物に含まれる H C V ゲノ ム R N Aについて逆転写反応を行った。 こ の逆転写反応 は、 前記抽出産物の一部に対して、 H e x a — d e o x y r i b o n u c l e o t i d e m i x t u r e ( T A K A R A ) と M— M L V R e v e r s e T r a n s c r i p t a s e ( L I F E T E C H N O L O G I E S ) と を用いて、 4 2 °C、 3 0分間行った。 2 . ヒ ト ゲノ ム抽出用キ ッ ト を使用 して H C Vゲノ ム R N Aを抽出する際の抽出効率についての検討
H C Vゲノ ム R N Aを抽出する際、 通常は、 全血ではな く 血清を用いる。 更に、 不要な蛋 白等の夾雑物をでき るだけ除 いた状態に した後、 グァニジンバッ フ ァ一等を用いて H C V ゲノ ム R N Aを抽出する。 し力 しなが ら、 本発明の態様に従 う 方法では、 ヒ ト ゲノ ム D N A と の同時抽出を行 う 。 従って 全血を用いて ヒ ト ゲノ ム抽出用のキ ッ ト を使用 して ヒ ト ゲノ ム D N Aを抽出 した場合の H C Vゲノ ムの抽出効率を調べた 通常法と して 3 6 6 0 6 11 6 1 ¥ — 1 (三光純薬） を用 いて血清 1 0 0 μ L から H C Vゲノ ムの抽出を行 う 方法 と 、 Q I A a m p D N A B l o o d M i d i K i t ( Q I A G E N ) を用いて全血から H C Vゲノ ムを抽出する方法 と を比較 した。 全血から抽出する方法については、 更に Q I A a m p D N A B l o o d M i d i K i t で H C V ゲノ ムを抽出 した後、 それによ り 得られた抽出産物をェタ ノ ール沈殿 して精製する場合 と エタ ノ ール沈殿を行わない場合 について、 逆転写反応に供して得られる結果についての比較 も ττつた。
抽出効率の評価には、 H C Vゲノ ムの 5 ' U T Rの配列を 利用 した c o m p e t i t i v e P G R ( K . C h a y a m a e t a 1 . , J . G a s t r o e n t e r o l H e p a t o l . 8 , S 4 0 — 4 4 , 1 9 9 3 ) を用 レヽた。
結果を表 1 に示す。 表 1 各抽出法と H C Vゲノ ム抽出効率の比較
Figure imgf000042_0001
その結果、 通常の H C V R N A抽出法に比 して Q I A a m p D N A B l o o d M i d i K i t を用いた方法 では、 H C V R N Aの抽出効率が約 1 0 倍程度下がる こ と がわ力 つ た。 よ っ て、 Q I A a m p D N A B l o o d M i d i K i t を用いた抽出法は、 血中の ウィルス量が極 めて低い検体に対して行われる場合には、 測定不能になる場 合が生じた り 、 チップを用いた ウィルスの定量等の用途には 使用 しに く い と 考え られた。 しか しなが ら、 逆に通常法での ウィルス量が、 全血中で 1 0 c o p y / m 1 以上の濃度を 占 める検体では、 理論的には、 Q I A a m p D N A B i o o d M i d i K i t を使用 した D N Aおよび R N Aの同 時抽出が可能である と示唆された。 即ち、 Q I A a m p D N A B l o o d M i d i K i t を使用 した抽出産物を 用いて、 ウィルス を定性的に測定でき る こ と が示唆された。
上述の通 り に逆転写反応を行って得たサンプルについて、 ヒ トゲノ ム と H C Vゲノ ムの同時増幅を行った。 増幅のためのプライ マーには、 ヒ ト ゲノ ムのためには M X A F 0 1 と M x A R O 2 を用いた。 H C Vゲノ ムのためには n c 2 ( K . C h a y a m a e t a 1 . , J . G a s t r o e n t e r o l . H e p a t o l . 8 , S 4 0 — 4 4， 1 9 9 3， n t 2 7 - 4 5 ) と p r i m e r 3 3 ( O k a m o t o e t a 1 . , J p n J . E x p . M e d . 6 0 , 2 1 5 - 2 2 2 , 1 9 9 0 ) を 用いた。 増幅は 1 本のチューブ内で行った。 なお、 P C Rは 9 4 °Cで 3 0 秒、 5 5 °Cで 3 0 秒、 7 2 °Cで 1 分を 5 0 サ イ タル行い、 その前に 9 4 °Cで 4 分、 後に 7 2 °Cで 7 分の処 理を行った。
P r i m e r の配歹 IJ ：
MxAFOl ： 5'-ACACACCCGTTTCCACCCTGGAGAGGCCAG-3' MxAR02 ： 5'-TGCGCAGTGCTGGAGTGCGGCCTCCGCTCT-3'
NC2 ： 5'-CCT GTG AGG AAC TAC TGT C-3' 33 ： 5，-GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC-3' その結果、 ヒ ト ゲノ ム 由来の産物 （ s i z e ： 6 1 0 b p ) と H C Vゲノ ム由来の産物 （ s i z e ： 3 0 0 b P ) は両者と も増幅された。 よ って、 ゲノ ムの抽出から特定 領域の増幅までの行程は、 ヒ ト ゲノ ム D N A と H C Vゲノ ム R N Aの両者に対 して同一の処理を行 う こ と によ って達成さ れる こ と が明かと なった。
こ の よ う な本発明の態様によれば、 個体か ら抽出 した試料 物質から、 簡便に且つ短時間にその疾病に対する治療法を予 測する こ と が可能と なる。 また、 このよ う な態様によれば、 個体から得た 1試料から同時に複数の情報を得る こ とができ るので、 検査の途中で生じ得る試料の取り 違いを防止でき る また、 危険性の高い試科を扱う 場合であっても、 そのよ う な 試料によ る汚染の範囲の広が り を従来よ り も狭く する こ と が 可能であ り 、 且つ試料によ る汚染事故の危険性も最小限に留 める こ とが可能である。
例 2 は、 I F N療法の効果を評価するための D N Aチップを 記載する。
I F N治療効果予測用 D N Aチップ
まず、 患者 （ ヒ ト） の血液から ヒ トの染色体 D N Aと H C V— R N Aを採取した。 染色体 D N Aは、 配列番号 2 0 、 配 列番号 2 1 のプライマーを用いて 1 3 5 b p の断片を増幅し た。 また、 H C V— R N Aは逆転写酵素を用いて c D N Aを 作製した。
以上の工程によ り 得られた核酸サンプルに対して、 フ アル マシア社製のキッ ト を用いて F I T C標識を行った。
図 1 に本実施例の D N Aチップの概略図を示す。 ポ リ リ ジ ンをコ一 ト したスライ ドガラスからなる基体 2 上に第 2 プロ ーブと して配列番号 2 2 、 配列番号 2 3 、 配列番号 2 4 、 配 列番号 2 5 、 配列番号 2 6 の D N Aプローブ及び第 1 プロ一 プと して配列番号 5 、 配列番号 6 、 配列番号 7 の D N Aプロ ープ （図 1 中第 1 プロ ーブ及び第 2 プローブは 1 〜 5 で示 す） を 2 0 O n Lずつスポッ ト して、 乾燥した。 その後、 U V照射を行ってプローブを基体 2上に固定化した。 配列番号 2 2 〜 2 5 の塩基配列は、 それぞれ配列番号 1 6 〜 1 9 の塩 基配列の 4 5 5位の S N P部位を含む断片である。 配列番号 5 〜 7 の塩基配列はそれぞれ H C V ウィルスの 1 型、 2型、 3型の遺伝子型を検出するプローブである。
F I T C標識した核酸サンプルを 2 x S S C _ l m m o 1 / L E D T A溶液に溶解した。 これを、 容量 2 0 L の リ アク シ ョ ンチャ ンバ一にいれ、 プローブ固定化スライ ドグラ スでふたを した。 5 0 °C、 1 2 時間の反応を行った後、 0 . 2 x S S C — I m m o l Z L E D T A溶液で 2 回洗浄し、 ス ライ ドガラス上の蛍光を測定した。 '
その結果、 配列番号 2 2 のプローブを固定化したスポッ ト からのみ有意な蛍光が観察された。 この試料物質に含まれる ヒ ト 由来核酸における M x A— 8 8 の遺伝子型は T / Tホモ 型である と考えられた。 また、 この試料物質に含まれる ウイ ルスは、 2型である判定された。 更に得られた蛍光強度から ウィルス濃度は 1 0 6 c o p y Z m L以下である と 見積も ら れた。 従って、 こ の試料物質が採取された患者には、 I F N が有効に働く こ とが予測された。
例 3 は、 I F N療法の効果を評価するための P N Rチップを 記載する。
I F N治療効果予測用 P N Aチップ
まず、 患者 （ヒ ト） の血液から ヒ トの染色体 D N Aと H C V— R N Aを採取した。 次に、 染色体 D N Aは配列番号 2 0 2 1 のプライマーを用いて 1 3 5 b p の断片を増幅した。 ま た、 H C V— R N Aは逆転写酵素を用いて c D N Aを作製し た。 得られた c D N Aを錶型に して配列番号 8 (これはセ ン スである） 、 配列番号 1 0 、 配列番号 1 1 、 配列番号 1 2 、 配列番号 1 3 、 配列番号 1 4 (これら はア ンチセ ンス であ る） のプライマーを用いて P C R反応を行った。
図 2 に本実施例の P N Aチップの概略図を示す。 ガラス基 板 1 2上に 1 0個の金電極 1 3 をノ ターユングしたプローブ 固定化チップに、 N末端にシスティ ンを修飾した第 2 プロ一 ブと して配列番号 2 7 、 配列番号 2 8 、 配列番号 2 9 、 配列 番号 3 0 、 配列番号 3 1 の P N Aプローブ、 第 1 プローブと して配列番号 3 2 、 配列番号 3 3 、 配列番号 3 4 、 配列番号 3 5 、 配列番号 3 6 の P N Aプローブ 7 〜 ： 1 1 を、 それぞれ 2 0 0 n Lずつスポッ ト し、 1 時間放置した。
配列番号 2 7 〜 3 0 の塩基配列は、 それぞれ配列番号 1 6 〜 1 9 の塩基配列の 4 5 5位の S N P部位を含む断片である 配列番号 3 2 〜 3 6 の塩基配列はそれぞれ H C V ウィ ルス の l a 型、 l b 型、 2 a 型、 2 b型、 3 a 型の遺伝子型を検出 するプローブである。
次に、 サンプルを 2 x S S C — l m m o 1 / L E D T A 溶液に溶解した。 これを容量 2 0 μ Lの リ ァク シ ョ ンチャ ン バーにいれ、 プローブ固定化チップでふたを した。 5 0。 (：、 1 時間の反応を行った後、 0 . 2 x S S C — l m m o l / L E D T A溶液で 2 回洗浄した。 次に、 これに 1 0 μ m o 1 Z Lのへキス ト 3 3 2 5 8溶液を滴下した。 別途対極と参照電 極を設置し、 金電極と対極間に電圧を印加 した と きのへキス ト 3 3 2 5 8 からの酸化電流を測定した。 その結果、 配列番号 2 7 と配列番号 2 8 と配列番号 3 4 の プローブを固定化した金電極 1 3 から有意な電流変化が観察 され、 こ の試料物質に含まれる ヒ ト 由来核酸における M x A — 8 8 の遺伝子型は G / Tヘテロ型である と考え られた。 ま た、 こ の試料物質に含まれる ウイノレスは、 2 a 型である と判 定された。 従って、 この試料物質が採取された患者には、 I F Nが有効に働く こ とが予測された。
例 4
本発明に従 う と、 C型肝炎感染者の感染している H C Vの ウィ ルス型、 感染者の M x A— 8 8 、 M x A— 1 2 3 、 M B L一 2 2 1 および M B Lのコ ラーゲン様 ドメ イ ンのコ ドン 5 4 の遺伝子型から、 C型肝炎感染者における I F N療法の有 効性を予測する こ とが可能である。
以下に図 3 を用いてウィルスの型、 M B Lおよび M x Aの 遺伝子型よ り I F N療法の効果を予測する方法の 1 例を説明 する。
ステ ッ プ 3 a では、 実施者が、 I F Nを投与されるべき個 体から血液サンプル等のサンプルを採取し、 予測を開始する. 採取されたサンプルは、 必要に応じて精製および抽出な どの 処理がな された後で、 ウィルスの型、 並びに M B Lおよび M x Aの遺伝子型、 即ち、 M x A— 8 8 と M x A— 1 2 3 の遺 伝子型、 ]\48 1^— 2 2 1 の遺伝子型、 M B Lのコ ラーゲン様 ドメ イ ンの コ ドン 5 4 の遺伝子型を決定し、 ステ ップ 3 わ へ 進む。
ステ ッ プ 3 b では、 ステ ッ プ 3 a で決定 した ウィルスの型 にタイ プ 1 が含まれている場合ステ ップ 3 c へ進むと判定し タイ プ 2 のみであれば （ 3 d ) へ進むと判定する。
ステップ 3 c では、 ステップ 3 a で決定した M B Lおよび M x Aの遺伝子型を基に、 遺伝子型と I F Nの効果を対応付 けたテーブル 2 を検索して対応する I F Nの効果を抽出 し、 それによつて I F N療法の有効性を予測 し、 全予測工程を終 了する。
ステ ップ 3 d では、 ステップ 3 a で決定した M B Lおよび M x Aの遺伝子型を基に、 遺伝子型と I F Nの効果を対応付 けたテーブル 3 を検索し対応する I F Nの効果を抽出 し、 そ れによって I F N療法の有効性を予測 し、 全予測工程を終了 する。
こ こで使用 されるテーブルは遺伝子型と I F N感受性を対 応付けた情報である。 各テーブルを表と して示したものがそ れぞれのテーブル番号に対応する表である。 上述の方法にお いて使用 した各表は例と して示したものである。 ここで使用 されるテーブルおよび表は、 各遺伝子型と I F Nの効果を対 応付けたも のであればよい。 例えば、 表 2 は、 タイプ 1 の H C Vに感染している患者における遺伝子型と I F Nの効果の 関係を示す表である。 一方、 表 3 は、 タイ プ 2 の H C Vに感 染している患者における遺伝子型と I F Nの効果の関係を示 す表である。 また、 使用 される表は、 その う ちの何れかの成 分のみを含む表であっても よ く 、 或いは他の組合せの成分か らなる表であってもよい。 上述の例ではステ ップ 3 c と ステ ップ 3 d にて参照 したテーブルと して、 それぞれ表 2 と表 3 を使用 し、 夫々 のステ ップ毎に必要な項目 を予め選択して作 製 した 2つの表を使用 している。 しかしなが ら、 これらをあ わせて作製した 1 つの表を用いても よい。 或いは他の組合せ の成分からなる表であっても よい。 成分の選択は、 例えば、 ステップ 3 c で使用 されるテーブルには、 タイ プ 1 の H C V 感染者における遺伝子型と著効または非著効の関連を示す情 報を選択し、 ステ ップ 3 d ではタイプ 2 の H C V感染者にお ける遺伝子型と著効または非著効の関連を示す情報を選択す ればよい。 しカゝしな力 S ら これに限られる も のではなく 、 成分 の選択は実施者が任意に行ってよい。
また、 こ こ で使用 される表 2 および 3 に記載される成分と しての数値は、 遺伝子型と I F N感受性または I F Nの効果 を対応付けた情報を示す表示の 1 例であ り 、 当該表に記載の 数値に限定される も のではない。 即ち、 遺伝子型と著効また は非著効と の相関関係を実質的に示すこ と が可能な表記であ れば、 例えば、 「〇」 、 「 X」 、 「厶」 であっても、 簡略化 された数値によ るス コア （例えば、 1 、 2 、 3 、 4および 5 等） であっても よい。
Figure imgf000050_0001
Z 峯
6t
C0J0/J0<If/X3d 18JZ.Z.0/Z0 OAV 表 2の続き
34
XB-G/G-C/C 5(13%) 8.124 0.004
(87%)
XB-G/G- XB-G/G- XB-G/T- XB-T/T- XB - G/T- XB-G/T- XB-T/T- XB-T/T-CACCCACACC CCCAAC--A
///////// //////// 47 73
YA-G/G- AACAACA AACCAAACAA
MBL と (39%) (61%)
YA-G/G-
MxA (- 88)と YA-G/G- MxA(-123) YA-G/T- YA-T/T- YA-G/T- YA-G/T- YA-T/T- YA-T/T-
36 96 0.000
XB or G/G or C/C 11.283
(27%) (73%)
YA-G/T-C/A,
YA-G/T-A/A, 16 11
YA-T/T-C/A, (59%) (41%)
YA - T/T-A/A 表 3 ウィルスの型と IFN療法の効果
Figure imgf000051_0001
以上の よ う な本発明の態様に従い、 多く の項目 を検討する こ と によ り 、 よ り 正確な予測が可能になる。 上述の本発明の 態様に従 う方法 （複数） およびプローブ固相化チップを用い る こ と によ り 、 試料物質から、 目 的とする核酸情報を簡便に 短時間に、 且つ正確に、 回収する こ とが可能である。 また、 上述の態様は本発明の 1 例であ り 本発明を制限する こ と を 目 的 と して記載される も のではない。 更なる利益お ょぴ変更が当業者に容易に見出 されるであろ う 。 従って、 そ の広範な側面における本発明は、 こ こに示し且つ記載した詳 細お よび代表的な態様に制限する も のではない。 従っ て、 種々 の変更は、 添付された請求の範囲およびそれらの均等物 によ り 明示される よ う な精神または一般的な本発明の概念の 範囲から逸れる こ と なく 行われ得る。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 特定疾病に曝された個体の核酸についての第 1 の情報と 前記個体に存在する病原微生物からの核酸についての第 2 の 情報と を得る方法であって、 前記病原微生物が当該特定疾患 に関連し、 以下を具備する方法 ；
( a ) 当該個体からの核酸の抽出物と 、 第 1 のプローブと 第 2 のプローブと を具備するプローブ固定化基体と を反応さ せる こ と と 、 こ こで、 前記第 1 のプローブは当該病原微生物 の特定の核酸配列の存在を検出 し、 前記病原微生物は前記特 定疾患に関連 し、 および前記第 2 のプローブは前記個体の特 定の核酸の存在を検出する ； 並びに
( b ) ( a ) の前記反応の結果、 も しあれば、 前記第 1 の プローブに対して結合した核酸の存在を検出する こ と によ り 前記第 1 の情報を得る こ と と、 およびも しあれば、 前記第 2 のプローブに対して結合した核酸の存在を検出する こ と によ り 第 2 の情報を得る こ と。
2 . 前記個体の前記核酸が当該疾患の治療に対する反応性に 関連し、 且つ前記病原微生物からの前記核酸と前記個体の核 酸の両者の存在が、 当該疾患の治療に対する反応性と相関す る請求項 1 に記載の方法。
3 . ( a ) の前記反応に先駆けて、 前記個体からの核酸の前 記抽出物を増幅し、 増幅された核酸を得る こ と に供する こ と を更に具備する請求項 1 の方法。
4 . 前記個体が ヒ トである請求項 1 に記載の方法。
5 . 核酸の前記抽出物が全血 （ w h o 1 e b 1 o o d s a m p 1 e ) から調製される請求項 1 に記載の方法。
6 . 前記個体からの前記核酸がヒ トゲノ ム核酸であ り ； 且つ 前記病原微生物からの前記核酸がゲノ ム核酸である請求項 5 に記載の方法。
7 . 前記個体からの核酸がヒ トゲノ ム核酸であ り 、 前記病原 微生物からの核酸が R N Aである こ と ； 並びに前記 （ a ) の 反応させる こ と に先駆けて逆転写反応を行う 請求項 1 に記載 の方法。
8 . 前記個体からの核酸が ヒ トゲノ ム核酸であ り 、 前記病原 微生物からの核酸が R N Aであ り 、 前記増幅に先駆けて逆転 写反応を行う請求項 3 に記載の方法。
9 . 前記核酸の抽出物がヒ トゲノ ム抽出用キッ ト によ り得ら れる請求項 6 に記載の方法。
1 0 . 前記ヒ トゲノ ム抽出用キッ トが Q I A a m p D N A B l o o d M i d i K i d である請求項 9 に記載の方法
1 1 . 前記特定疾患が肝炎であり 、 前記病原微生物が肝炎ゥ ィルスである請求項 1 に記载の方法。
1 2. 前記疾患が肝炎であ り 、 前記病原微生物が肝炎ウィル スである請求項 3 に記載の方法。
1 3 . 前記第 1 のプローブは C型肝炎ウィ ルス のゲノムを検 出 し、 且つ前記第 2 のプローブは M x Aプロモーター領域の S N P を検出する請求項 1 1 に記載の方法。
1 4 . 前記第 1 のプローブは C型肝炎ウィ ルス のゲノムを検 出 し、 且つ第 2 のプローブは M B L遺伝子の多型を検出する 請求項 1 1 に記載の方法。
1 5 . 前記第 1 プローブは 1 種類以上具備され、 且つ少なく と もその 1 種類が以下から選択される配列を含み ；
( a ) 配列番号 1 、 配列番号 2 、 配列番号 3および配列番号 5 からなる群よ り選択される配列に示される塩基配列、
( b ) 配列番号 5 、 配列番号 6 および配列番号 7からなる群 よ り 選択される配列に示される塩基配列、
( c ) ( a ) および （ b ) から選択される塩基配列の相補配 列 ； 並びに
前記第 2 プローブは 1種類以上具備され、 且つ少なく と もそ の 1 種類が以下から選択される配列を含む ；
(at455) 下記配列表の配列番号 16 に示される塩基配列、 (bt455) 前記（at455)に示される塩基配列中の 455 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ct455) 配列番号 16 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt455) 配列番号 16 の 449〜459 位に示される配列を含む塩 基配列、
(et455) 前記（at455)〜（dt455)から選択される塩基配列の相補 配列、
(ag455) 下記配列表の配列番号 17 に示される塩基配列、 (bg455) 前記（ag455)に示される塩基配列中の 455位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cg455) 配列番号 17 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dg455) 配列番号 17 の 449〜459位に示される配列を含む塩 基配列、
(eg455) 前記（ag455)〜（dg455)か ら選択 される塩基配列の相 補配列、
(aa455) 下記配列表の配列番号 18 に示される塩基配列、 (ba455) 前記（aa455)に示される塩基配列中の 455 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ca455) 配列番号 18 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、 ，
(da455) 配列番号 18 の 449〜459位に示される配列を含む塩 基配列、
(ea455) 前記（aa455)〜（da455)か ら選択 さ れる塩基配列の相 補配列、
(ac455) 下記配列表の配列番号 19 に示される塩基配列、 (bc455) 前記（ac455)に示される塩基配列中の 455 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cc455) 配列番号 19 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc455) 配列番号 19 の 449〜459位に示される配列を含む塩 基配列、
(ec455) 前記（ac455)〜（dc455)から選択される塩基配列の相 補配列、 (aa420) 下記配列表の配列番号 37 に示される塩基配列、 (ba420) 前記（aa420)に示される塩基配列中の 420 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ca420) 配列番号 37 の 415〜 425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(da420) 前記（aa420)〜（ca420)か ら選択される塩基配列の相 補配列、
(ac420) 下記配列表の配列番号 38 に示される塩基配列、 (bc420) 前記（ac420)に示される塩基配列中の 420 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cc420) 配列番号 38 の 415〜 425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc420) 前記（ac420)〜（cc420)か ら選択される塩基配列の相 補配列、
(at420) 下記配列表の配列番号 39 に示される塩基配列、 (bt420) 前記（at420)に示される塩基配列中の 420 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ct420) 配列番号 39 の 415〜425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt420) 前記（at420)〜(： ct420)か ら選択される塩基配列の相補 配列
(ag420) 下記配列表の配列番号 40 に示される塩基配列、 (bg420) 前記（at420)に示される塩基配列中の 420 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cg420) 配列番号 40 の 415〜 425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dg420) 前記（ag420)〜（cg420)か ら選択 さ れる塩基配列の相 捕配列、
(ag221) 下記配列表の配列番号 41 に示される塩基配列、 (bg221) 前記（ag221)に示される塩基配列中の 425位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cg221) 配列番号 41 の 418〜432 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dg221) 配列番号 41 の 421〜430 位に示される配列を含む塩 基配列
(eg221) 前記（ag221)〜（dg221)か ら選択 さ れる塩基配列の相 補配列、
(ac221 ) 下記配列表の配列番号 42 に示される塩基配列、 (bc221) 前記（ac221)に示される塩基配列中の 425 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cc221) 配列番号 42 の 418〜432 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc221) 配列番号 42 の 421〜 430 位に示される配列を含む塩 基配列 (ec221) 前記（ac221)〜（dc221)か ら選択さ れる塩基配列の相 補配列、
(aa221 ) 下記配列表の配列番号 43 に示される塩基配列、 (ba221) 前記（aa221)に示される塩基配列中の 425 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ca221) 配列番号 43 の 418〜 432 位に示される配列を含む塩 基配列、
(da221) 配列番号 43 の 421〜 430 位に示される配歹 ljを含む塩 基配列
(ea221) 前記（aa221)〜（da221)か ら選択さ れる塩基配列の相 補配列、
(at221) 下記配列表の配列番号 44 に示される塩基配列、 (bt221) 前記（at221)に示される塩基配列中の 425 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ct221) 配列番号 44 の 418〜432 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt221) 配列番号 44 の 421〜 430 位に示される配列を含む塩 基配列
(et221) 前記（at221)〜（dt221)から選択される塩基配列の相補 配列、
(ag54) 下記配列表の配列番号 45 に示される塩基配列、 (bg54) 前記（ag54)に示される塩基配列中の 875位の塩基を除 く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加され た修飾塩基配列、
(cg54) 配列番号 45 の 874〜 876 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dg54) 配列番号 45 の 869〜 880 位に示される配列を含む塩 基配列
(eg54) 前記（ag54)〜（dg54)から選択される塩基配列の相補配 列、
(aa54) 下記配列表の配列番号 46 に示される塩基配列、 (ba54) 前記（aa54)に示される塩基配列中の 875 位の塩基を除 く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加 され た修飾塩基配列、
(ca54) 配列番号 46 の 874〜 876 位に示される配列を含む塩 基配列、
(da54) 配列番号 46 の 869〜 880 位に示される配列.を含む塩 基配列
(ea54) 前記（aa54)〜（da54)から選択される塩基配列の相補配 列、
(ac54) 下記配列表の配列番号 47 に示される塩基配列、 (bc54) 前記（ac54)に示される塩基配列中の 875 位の塩基を除 く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加され た修飾塩基配列、
(cc54) 配列番号 47 の 874〜 876 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc54) 配列番号 47 の 869〜 880 位に示される配列を含む塩 基配列 (ec54) 前記（ac54)〜（dc54)から選択される塩基配列の相補配 列、 '
(at54) 下記配列表の配列番号 47 に示される塩基配列、
(M54) 前記（at54)に示される塩基配列中の 875 位の塩基を除 く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加され た修飾塩基配列、
(ct54) 配列番号 48 の 874〜876 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt54) 配列番号 48 の 869〜 880 位に示される配列を含む塩 基配列
(et54) 前記（at54)〜（dt54)か ら選択される塩基配列の相補配 列、
(ag52-57) 下記配列表の配列番号 45 に示される塩基配列、 (bg52-57) 前記（ag52-57)に示される塩基配列中の 875 位の塩 基を除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付 加された修飾塩基配列、
(cg52-57) 配列番号 45 の 868〜 885 位に示される配列を含む 塩基配列、
(dg52-57) 前記（ag52-57)〜（cg52-57)から選択される塩基配列 の相補配列（aa52-57) 下記配列表の配列番号 46 に示される 塩基配列、
(ba52-57) 前記（aa52-57)に示される塩基配列中の 875 位の塩 基を除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付 加された修飾塩基配列、
(ca52-57) 配列番号 46 の 886〜885 位に示される配列を含む 塩基配列、
(da52-57) 前記（aa52-57)〜（ca52-57)から選択される塩基配列 の相補配列、
(ac52-57) 下記配列表の配列番号 47 に示される塩基配列、 (bc52-57) 前記（ac52-57)に示される塩基配列中の 875 位の塩 基を除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付 加された修飾塩基配列、
(cc52-57) 配列番号 47 の 886〜 885 位に示される配列を含む 塩基配列、
(dc52-57) 前記（ac52-57)〜（cc52-57)から選択される塩基配列 の相補配列、
(at52-57) 下記配列表の配列番号 47 に示される塩基配列、 (bt52-57) 前記（at52-57)に示される塩基配列中の 875 位の塩 基を除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付 加された修飾塩基配列、
(ct52-57) 酉己列番号 48 の 886〜 885 位に示される配列を含む 塩基配列、
(dt52-57) 前記（at52-57)〜（ct52-57)から選択される塩基配列 の相補配列；
こ と を特徴とする請求項 1 1 に記載の方法。
1 6 . 前記第 1 プローブは 1 種類以上具備され、 且つ少なく と もその 1 種類が以下から選択される配列を含み ；
( a ) 配列番号 1 、 配列番号 2、 配列番号 3 およぴ配列番号 5 カゝらなる群よ り選択される配列に示される塩基配列、
( ) 配列番号 5 、 配列番号 6 および配列番号 7 からなる群 よ り 選択される配列に示される塩基配列、
( c ) ( a ) および （ b ) から選択される塩基配列の相補鎖 ； 並びに
前記第 2 プローブは 1 種類以上具備され、 且つ少なく と もそ の 1 種類が以下から選択される配列を含む ；
(at455) 下記配列表の配列番号 16 に示される塩基配列、 (bt455) 前記（at455)に示される塩基配列中の 455 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ct455) 配列番号 16 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt455) 配列番号 16 の 449〜459 位に示される配列を含む塩 基配列、
(et455) 前記（at455)〜（dt455)から選択される塩基配列の相補 配列、
(ag455) 下記配列表の配列番号 17 に示される塩基配列、 (bg455) 前記（ag455)に示される塩基配列中の 455位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cg455) 配列番号 17 の 441〜455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dg455) 配列番号 17 の 449〜459位に示される配列を含む塩 基配列、
(eg455) 前記（ag455)〜（dg455)か ら選択される塩基配列の相 補配列、 (aa455) 下記配列表の配列番号 18 に示される塩基配列、 (ba455) 前記（aa455)に示される塩基配列中の 455 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ca455) 配列番号 18 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(da455) 配列番号 18 の 449〜 459 位に示される配列を含む塩 基配列、
(ea455) 前記（aa455)〜（da455)か ら選択さ れる塩基配列の相 捕配列、
(ac455) 下記配列表の配列番号 19 に示される塩基配列、 (bc455) 前記（ac455)に示される塩基配列中の 455 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cc455) 配列番号 19 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc455) 配列番号 19 の 449〜 459 位に示される配列を含む塩 基配列、
(ec455) 前記（ac455)〜（dc455)から選択される塩基配列の相 捕配列、
(aa420) 下記配列表の配列番号 37 に示される塩基配列、 (ba420) 前記（aa420)に示される塩基配列中の 420位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ca420) 配列番号 37 の 415〜 425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(da420) 前記（aa420)〜（ca420)か ら選択 さ れる塩基配列の相 補配列、
(ac420) 下記配列表の配列番号 38 に示される塩基配列、 (bc420) 前記（ac420)に示される塩基配列中の 420 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cc420) 配列番号 38 の 415〜425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc420) 前記（ac420)〜（cc420)力 ら選択さ れる塩基配列の相 補配列、
(at420) 下記配列表の配列番号 39 に示される塩基配列、 (bt420) 前記（at420)に示される塩基配列中の 420 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ct420) 配列番号 39 の 415〜 425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt420) 前記（at420)〜 (： c 20)から選択される塩基配列の相補 配列、
(ag420) 下記配列表の配列番号 40 に示される塩基配列、 (bg420) 前記（at420)に示される塩基配列中の 420 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cg420) 配列番号 40 の 415〜 425 位に示される配列を含む塩 基配列、 (dg420) 前記（ag420)〜（cg420)か ら選択さ れる塩基配列の相 補配列、
(ag221) 下記配列表の配列番号 41 に示される塩基配列、 (bg221) 前記（ag221)に示される塩基配列中の 425位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加 さ れた修飾塩基配列、
(cg221) 配列番号 41 の 418〜432 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dg221) 配列番号 41 の 421〜 430 位に示される配列を含む塩 基配列
(eg221) 前記（ag221)〜（dg221)か ら選択される塩基配列の相 補配列、
(ac221) 下記配列表の配列番号 42 に示される塩基配列、 (bc221) 前記（ac221)に示される塩基配列中の 425 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加 さ れた修飾塩基配列、
(cc221) 配列番号 42 の 418〜 432 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc221) 配列番号 42 の 421〜430 位に示される配列を含む塩 基配列
(ec221) 前記（ac221)〜（dc221)か ら選択 される塩基配列の相 補配列、
(aa221) 下記配列表の配列番号 43 に示される塩基配列、 (ba221) 前記（aa221)に示される塩基配列中の 425 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ca221) 配列番号 43 の 418〜 432 位に示される配列を含む塩 基配列、
(da221) 配列番号 43 の 421〜 430 位に示される配列を含む塩 基配列
(ea221) 前記（aa221)〜（da221)か ら選択さ れる塩基配列の相 補配列、
(at221) 下記配列表の配列番号 44 に示される塩基配列、 (bt221) 前記（at221)に示される塩基配列中の 425 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ct221) 配列番号 44 の 418〜 432 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt221) 配列番号 44 の 421〜 430 位に示される配列を含む塩 基配列
(et221) 前記（at221)〜（dt221)から選択される塩基配列の相補 配列、
(ag54) 下記配列表の配列番号 45 に示される塩基配列、 (bg54) 前記（ag54)に示される塩基配列中の 875位の塩基を除 く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加され た修飾塩基配列、
(cg54) 配列番号 45 の 874〜876 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dg54) 配列番号 45 の 869〜880 位に示される配列を含む塩 基配列 (eg54) 前記（ag54)〜（dg54)から選択される塩基配列の相補配 列、
(aa54) 下記配列表の配列番号 46 に示される塩基配列、 (ba54) 前記（aa54)に示される塩基配列中の 875 位の塩基を除 く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加され た修飾塩基配列、
(ca54) 配列番号 46 の 874〜 876 位に示される配列を含む塩 基配列、
(da54) 配列番号 46 の 869〜 880 位に示される配列を含む塩 基配列
(ea54) 前記（aa54)〜（da54)から選択される塩基配列の相補配 列、
(ac54) 下記配列表の配列番号 47 に示される塩基配列、 (bc54) 前記（ac54)に示される塩基配列中の 875 位の塩基を除 く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加され た修飾塩基配列、
(cc54) 配列番号 47 の 874〜876 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc54) 配列番号 47 の 869〜 880 位に示される配列を含む塩 基配列
(ec54) 前記（ac54)〜（dc54)から選択される塩基配列の相補配 列、
(at54) 下記配列表の配列番号 47 に示される塩基配列、 (bt54) 前記（at54)に示される塩基配列中の 875 位の塩基を除 く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加され た修飾塩基配列、
(ct54) 配列番号 48 の 874〜 876 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt54) 配列番号 48 の 869〜 880 位に示される配列を含む塩 基配列 '
(et54) 前記（at54)〜（dt54)か ら選択 される塩基配列の相補配 列、
(ag52-57) 下記配列表の配列番号 45 に示される塩基配列、 (bg52-57) 前記（ag52-57)に示される塩基配列中の 875 位の塩 基を除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付 加された修飾塩基配列、
(cg52-57) 配列番号 45 の 868〜 885 位に示される配列を含む 塩基配列、
(dg52-57) 前記（ag52-57)〜（cg52-57)から選択される塩基配列 の相補配列、
(aa52-57) 下記配列表の配列番号 46 に示される塩基配列、 (ba52-57) 前記（aa52-57)に示される塩基配列中の 875 位の塩 基を除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付 加された修飾塩基配列、
(ca52-57) 配列番号 46 の 886〜 885 位に示される配列を含む 塩基配列、
(da52-57) 前記（aa52-57)〜（ca52-57)から選択される塩基配列 の相補配列、
(ac52-57) 下記配列表の配列番号 47 に示される塩基配列、 (bc52-57) 前記（ac52-57)に示される塩基配列中の 875 位の塩 基を除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付 加された修飾塩基配列、
(cc52-57) 配列番号 47 の 886〜 885 位に示される配列を含む 塩基配列、
(dc52-57) 前記（ac52-57)〜（cc52-57)から選択される塩基配列 の相補配列、
(at52-57) 下記配列表の配列番号 47 に示される塩基配列、 (bt52-57) 前記（at52-57)に示される塩基配列中の 875 位の塩 基を除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付 加された修飾塩基配列、
(ct52-57) 配列番号 48 の 886〜 885 位に示される配列を含む 塩基配列、
(dt52-57) 前記（at52-57)〜（ct52-57)から選択される塩基配列 の相捕配列；
こ と を特徴とする請求項 1 2 に記載の方法。
1 7 . 前記増幅が、 配列番号 8 および配列番号 9 からなる群 よ り 少な く と も 1 選択される塩基配列で示されるセンス鎖と 配列番号 1 0 、 配列番号 1 1 、 配列番号 1 2 、 配列番号 1 3 および配列番号 1 4 の群よ り少なく と も 1選択される塩基配 列で示されるアンチセンス鎖を使用する P C Rによって行う こ と を特徴とする請求項 1 2 に記載の方法。
1 8 . 基体と 、
病原微生物の特定の核酸配列の存在を検出するために、 当 該基体に固定化されの第 1 プローブと 、 こ こ で、 前記微生物 は特定疾患に関連する、 個体の特定の核酸の存在を検出するための、 前記基体に固 定化され且つ第 1 プローブと は異なる塩基配列を有する第 2 のプローブと、 こ こ で、 前記個体の前記核酸は、 当該疾患の 治療に対する反応性に関係する、
を具備するプローブ固定化基体。
1 9 . 前記病原微生物が C型肝炎ウィルスであ り 、 前記治療 で用いる薬剤が I F Nである請求項 1 8 に記載のプローブ固 定化基体。
2 0 . 当該個体の前記核酸が M x Aのプロモーター領域であ る請求項 1 8 に記載のプローブ固定化基体。
2 1 . 当該個体の前記核酸が M B L をコー ドする遺伝子であ る請求項 1 8 に記載のプローブ固定化基体。
2 2 . 前記第 1 のプローブが C型肝炎ウィルスの遺伝子型を 検出する請求項 1 8 に記載のプローブ固定化基体。
2 3 . 基体と、
前記基体に固定化され、 且つ以下の配列 ；
( a ) 配列番号 1 、 配列番号 2 、 配列番号 3 および配列番号 5 からなる群よ り選択される配列に示される塩基配列、
( b ) 配列番号 5 、 配列番号 6 および配列番号 7 からなる群 よ り 選択される配列に示される塩基配列、
( c ) ( a ) および （ b ) から選択される塩基配列の相補配 列 ；
から少なく と も 1選択される配列を含む第 1 プローブと ； 前記基体に固定化され、 且つ以下の配列 ；
(at455 ) 下記配列表の配列番号 1 6 に示される塩基配列、 (bt455) 前記（at455)に示される塩基配列中の 455 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ct455) 配列番号 16 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt455) 配列番号 16 の 449〜459 位に示される配列を含む塩 基配列、
(et455) 前記（at455)〜（dt455)か ら選択される塩基配列の相補 配列、
(ag455) 下記配列表の配列番号 17 に示される塩基配列、 (bg455) 前記（ag455)に示される塩基配列中の 455位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cg455) 配列番号 17 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dg455) 配列番号 17 の 449〜 459位に示される配列を含む塩 基配列、
(eg455) 前記（ag455)〜（dg455)か ら選択される塩基配列の相 補配列
(aa455) 下記配列表の配列番号 18 に示される塩基配列、 (ba455) 前記（aa455)に示される塩基配列中の 455 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ca455) 配列番号 18 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、 (da455) 配列番号 18 の 449〜459 位に示される配列を含む塩 基配列、
(ea455) 前記（aa455)〜（da455)から選択 される塩基配列の相 補配列
(ac455) 下記配列表の配列番号 19 に示される塩基配列、 (bc455) 前記（ac455)に示される塩基配列中の 455 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cc455) 配列番号 19 の 441〜 455 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc455) 配列番号 19 の 449〜459位に示される配列を含む塩 基配列、
(ec455) 前記（ac455)〜（dc455)から選択される塩基配列の相 補配列、
(aa420) 下記配列表の配列番号 37 に示される塩基配列、 (ba420) 前記（aa420)に示される塩基配列中の 420位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ca420) 配列番号 37 の 415〜 425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(da420) 前記（aa420)〜（ca420)から選択 される塩基配列の相 補配列
(ac420) 下記配列表の配列番号 38 に示される塩基配列、 (bc420) 前記（ac420)に示される塩基配列中の 420位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cc420) 配列番号 38 の 415〜 425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc420) 前記（ac420)〜（cc420)か ら選択される塩基配列の相 補配列
(at420) 下記配列表の配列番号 39 に示される塩基配列、 (bt420) 前記（at420)に示される塩基配列中の 420 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ct420) 配列番号 39 の 415〜425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt420) 前記（at420)〜（ct420)から選択される塩基配列の相補 配列
(ag420) 下記配列表の配列番号 40 に示される塩基配列、 (bg420) 前記（at420)に示される塩基配列中の 420 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cg420) 配列番号 40 の 415〜 425 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dg420) 前記（ag420)〜（cg420)か ら選択さ れる塩基配列の相 補配列、
(ag221) 下記配列表の配列番号 41 に示される塩基配列、 (bg221) 前記（ag221)に示される塩基配列中の 425位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、 (cg221) 配列番号 41 の 418〜 432 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dg221) 配列番号 41 の 421〜 430位に示される配列を含む塩 基配列
(eg221) 前記（ag221)〜（dg221)から選択される塩基配列の相 補配列、
(ac221) 下記配列表の配列番号 42 に示される塩基配列、 (bc221) 前記（ac221)に示される塩基配列中の 425 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(cc221) 配列番号 42 の 418〜 432 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc221) 配列番号 42 の 421〜 430 位に示される配列を含む塩 基配列
(ec221) 前記（ac221)〜（dc221)か ら選択さ れる塩基配列の相 補配列、
(aa221) 下記配列表の配列番号 43 に示される塩基配列、 (ba221) 前記（aa221)に示される塩基配列中の 425 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ca221) 配列番号 43 の 418〜432 位に示される配列を含む塩 基配列、
(da221) 配列番号 43 の 421〜 430 位に示される配列を含む塩 基配列
(ea221) 前記（aa221 )〜（da221 )か ら選択 さ れる塩基配列の相 補配列、
(at221 ) 下記配列表の配列番号 44 に示される塩基配列、 (bt221) 前記（at221)に示される塩基配列中の 425 位の塩基を 除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加さ れた修飾塩基配列、
(ct221) 配列番号 44 の 418〜432 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt221) 配列番号 44 の 421〜 430 位に示される配列を含む塩 基配列
(et221) 前記（at221)〜（dt221)から選択される塩基配列の相補 配列、
(ag54) 下記配列表の配列番号 45 に示される塩基配列、 (bg54) 前記（ag54)に示される塩基配列中の 875位の塩基を除 く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加され た修飾塩基配列、
(cg54) 配列番号 45 の 874〜 876 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dg54) 配列番号 45 の 869〜880 位に示される配列を含む塩 基配列
(eg54) 前記（ag54)〜（dg54)から選択される塩基配列の相捕配 列、
(aa54) 下記配列表の配列番号 46 に示される塩基配列、 (ba54) 前記（aa54)に示される塩基配列中の 875 位の塩基を除 く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加され た修飾塩基配列、 (ca54) 配列番号 46 の 874〜 876 位に示される配列を含む塩 基配列、
(da54) 配列番号 46 の 869〜 880 位に示される配列を含む塩 基配列
(ea54) 前記（aa54)〜（da54)から選択される塩基配列の相補配 列、
(ac54) 下記配列表の配列番号 47 に示される塩基配列、 (bc54) 前記（ac54)に示される塩基配列中の 875 位の塩基を除 く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加され た修飾塩基配列、
(cc54) 配列番号 47 の 874〜 876 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dc54) 配列番号 47 の 869〜880 位に示される配列を含む塩 基配列
(ec54) 前記（ac54)〜（dc54)から選択される塩基配列の相補配 列、
(at54) 下記配列表の配列番号 47 に示される塩基配列、 (M54) 前記（at54)に示される塩基配列中の 875 位の塩基を除 く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付加され た修飾塩基配列、
(ct54) 配列番号 48 の 874〜876 位に示される配列を含む塩 基配列、
(dt54) 配列番号 48 の 869〜 880 位に示される配列を含む塩 基配列
(et54) 前記（at54)〜（dt54)か ら選択される塩基配列の相補配 列、
(ag52-57) 下記配列表の配列番号 45 に示される塩基配列、 (bg52-57) 前記（ag52-57)に示される塩基配列中の 875 位の塩 基を除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付 加された修飾塩基配列、
(cg52-57) 配列番号 45 の 868〜885 位に示される配列を含む 塩基配列、
(dg52-57) 前記（ag52-57)〜（cg52-57)から選択される塩基配列 の相補配列、
(aa52-57) 下記配列表の配列番号 46 に示される塩基配列、 (ba52-57) 前記（aa52-57)に示される塩基配列中の 875 位の塩 基を除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付 加された修飾塩基配列、
(ca52-57) 配列番号 46 の 886〜885 位に示される配列を含む 塩基配列、
(da52-57) 前記（aa52-57)〜（ca52-57)から選択される塩基配列 の相補配列、
(ac52-57) 下記配列表の配列番号 47 に示される塩基配列、 (bc52-57) 前記（ac52-57)に示される塩基配列中の 875 位の塩 基を除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付 加された修飾塩基配列、
(cc52-57) 配列番号 47 の 886〜885 位に示される配列を含む 塩基配列、
(dc52-57) 前記（ac52-57)〜（cc52-57)から選択される塩基配列 の相補配列、 (at52-57) 下記配列表の配列番号 47 に示される塩基配列、 (bt52-57) 前記（at52-57)に示される塩基配列中の 875 位の塩 基を除く 数個の塩基が欠失、置換され、又は 1 以上の塩基が付 加された修飾塩基配列、
(ct52-57) 配列番号 48 の 886〜885 位に示される配列を含む 塩基配列、
(dt52-57) 前記（at52-57)〜（ct52-57)から選択される塩基配列 の相補配列；
から少なく と も 1 選択される配列を含む第 2 プローブと ； を具備するプローブ固定化基体。
2 4 . 当該特定の核酸の存在の検出が電気化学的に行われる 請求項 1 8 に記載のプローブ固定化基体。
2 5 . 当該特定の核酸の存在の検出が電気化学的に行われる 請求項 2 3 に記載のプローブ固定化基体。
2 6 . 以下を具備する個体の疾患の治療に対する反応性を決 定する方法、 こ こで、 当該疾患は当該個体における病原微生 物の存在に関連する ；
( a ) 前記個体からの核酸の抽出物と、 当該病原微生物の 核酸にハイブリ ダィズする第 1 の核酸プローブ [こ こで当該 病原微生物は前記疾患と関連する ] および前記個体の標的核 酸にハイブリ ダィズする第 2 の核酸プローブ [こ こで、 前記 個体の当該標的核酸は個体の疾患の治療に対する反応性と関 連する ] と を反応させるこ と と、
( b ) 前記第 1 の核酸プローブに結合する前記病原微生物 の前記核酸と、 前記第 2 の核酸プローブに結合する前記個体 の前記標的核酸とを検出する こ と [こ こで、 第 1 の核酸プロ ープに結合する前記病原微生物の前記核酸と前記第 2の核酸 プローブに結合する前記個体の前記標的核酸の両方の存在は
、 当該疾患の治療に対する反応性と相関する ] 。
2 7 . 当該プローブが基体に固定化されている請求項 2 6 に 記載の方法。
2 8 . ( a ) の前記反応に先駆けて前記個体からの前記核酸 を増幅するこ とを更に具備する請求項 2 6 に記載の方法。
2 9 . 以下を具備する疾患に対する個体の罹患性を決定する 方法 ；
( a ) 前記個体からの核酸の抽出物と、 疾患に関連する病 原微生物の核酸にハイプリ ダイズする第 1 の核酸プローブお よび前記疾患に対する罹患性に関連する前記個体の標的核酸 にハイブリ ダィズする第 2の核酸プローブとを反応させるこ と と、
( b ) 前記第 1 の核酸プローブに結合する前記病原微生物 の前記核酸と、 前記第 2 の核酸プローブに結合する前記個体 の前記核酸とを検出するこ と [こ こで、 前記第 1 の核酸プロ ーブに結合する前記病原微生物の前記核酸と、 前記第 2 の核 酸プローブに結合する前記個体の前記核酸との両方の存在は
、 前記疾患に対する前記個体の罹患性と関連する ] 。
3 0 . 当該プローブが基体に固定化されている請求項 2 9 に 記載の方法。
3 1 . ( a ) の前記反応に先駆けて前記個体からの前記核酸 を増幅するこ とを更に具備する請求項 2 9 に記載の方法。
3 2 . 疾患に関連する病原微生物の特定の核酸の存在を検出 する第 1 のプローブと、 当該疾患の治療に対する反応性に関 連する個体の特定の核酸の存在を検出する第 2のプローブと を具備するプローブ固定化基体の製造方法であって、 当該第
1 のプローブと当該第 2 のプローブとを基体に固定する こ と を具備する方法。
3 3 . 前記基体がベースプレー ト、 多孔質体、 マイ ク ロタイ タープレー ト、 ビーズ、 球状物質、 粒子状物質、 磁性体、 磁 気ビーズからなる群よ り選択される請求項 3 2 に記載の方法
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