CN116209776A - 用于检测包括冠状病毒在内的呼吸道病毒的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明包括用于检测所有已知呼吸道病原体的组合物和方法，包括冠状病毒和最近发现的Sars‑CoV‑2，即CoVID大流行的病原体。本发明进一步包括检测感染冠状病毒以及其他感染性病原体的患者的免疫特征。

Description

用于检测包括冠状病毒在内的呼吸道病毒的组合物和方法

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)的规定，本申请享有2020年5月29日提交的美国临时专利申请号63/032,048的优先权，在此通过引用以其全部内容并入本文。

背景技术

由新型SARS-CoV-2病毒引起的正在进行的Covid-19大流行是迄今为止最致命的小核糖核酸病毒之一，也是所有人类冠状病毒中最具传染性的病毒。据估计，这种病毒的传染性是流感病毒的15-20倍左右，并且造成的死亡比SARS和MERS的总和还要多。这种疾病显然对年龄大的个体影响更大，死亡率与年龄的增长成正比。这在那些同时患有以下其他健康并发症和共病现象的个体中非常明显，包括糖尿病、心肺疾病或与其他主要器官系统相关的疾病。同样重要的是要注意到，免疫系统受损的个体有更大的风险发展为更快速的Covid-19疾病发作。这为保护患有广泛的恶性肿瘤的HIV阳性患者提供了强有力的理由，包括艾滋病限定和限定中的癌症。因此，患有癌症且HIV阳性的患者应被归类为快速Covid-19疾病发作和死亡率增加的高风险人群。

现在需要如此组合物和方法，其不仅用于检测患者的SARS-Cov-2，而且用于鉴定基于其相关的同时感染而死亡率风险增加的那些个体。本发明解决了这一需求。

发明内容

如本文所述，本发明涉及用于检测包括冠状病毒在内的所有已知呼吸道原(病原体，剂)(agent)的组合物和方法，以及感染冠状病毒的患者的免疫特征。

在一个方面，本发明包括包含PathoChip v5的组合物，其中PathoChip v5包括超过60,000个特异于多种微生物的探针，以及多个特异于冠状病毒的探针。

在某些实施方式中，冠状病毒探针包括至少一个选自SEQ ID NO:1-37的核苷酸序列。在某些实施方式中，冠状病毒探针由SEQ ID NO:1-37中叙述的核苷酸序列组成。

在另一个方面，本发明包括组合物，该组合物包括PathoChip，其包括多个特异于多种呼吸道病原体的探针，多个特异于冠状病毒的探针，以及多个特异于对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的先天和适应性应答的免疫标志物的探针。

在某些实施方式中，多个特异于先天和适应性应答的免疫标志物的探针包括至少一个选自SEQ ID NO:38-4,671的核苷酸序列。在某些实施方式中，多个特异于先天和适应性应答的免疫标志物的探针由SEQ ID NO:38-4,671中叙述的核苷酸序列组成。在某些实施方式中，冠状病毒探针包括至少一个选自SEQ ID NO:1-37的核苷酸序列。在某些实施方式中，冠状病毒探针由SEQ ID NO:1-37中叙述的核苷酸序列组成。

在另一个方面，本发明包括包含多个核酸的组合物，其中核酸包括至少一个选自SEQ ID NO:1-37的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明包括包含多个核酸的组合物，其中核酸由SEQ ID NO:1-37中叙述的核苷酸序列组成。

在另一个方面，本发明包括包含多个核酸的组合物，其中核酸包括至少一个选自SEQ ID NO:38-4,671的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明包括包含多个核酸的组合物，其中核酸由SEQ ID NO:38-4,671中叙述的核苷酸序列组成。

在某些实施方式中，组合物包括微阵列。在某些实施方式中，微阵列包括生物芯片、载玻片、珠或纸。

在另一个方面，本发明包括包含免疫组ChIP的组合物，其中免疫组ChIP包括多个特异于对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的先天和适应性应答的免疫标志物的探针。

在某些实施方式中，多个探针包括至少一个选自SEQ ID NO:38-4,671的核苷酸序列。在某些实施方式中，多个探针由SEQ ID NO:38-4,671中叙述的核苷酸序列组成。

在另一个方面，本发明包括检测来自受试者的样品中冠状病毒的方法。方法包括将来自样品的可检测地标记的核酸与PathoChip v5阵列杂交，其中PathoChip v5包括超过60,000个特异于多种微生物的探针，以及多个特异于冠状病毒的探针。当来自样品的核酸与PathoChip v5上的至少三个冠状病毒探针杂交时，在样品中检测到冠状病毒。

在另一个方面，本发明包括鉴定高风险受试者的方法。方法包括将来自受试者的样品的可检测地标记的核酸与PathoChip v5阵列杂交，其中PathoChip v5包括超过60,000个特异于多种微生物的探针，和多个特异于冠状病毒的探针。当来自样品的核酸与PathoChip v5上的至少三个冠状病毒探针和至少三个特异于微生物的探针杂交时，受试者被鉴定为高风险。

在另一个方面，本发明包括检测来自受试者的样品中冠状病毒的方法。方法包括将来自样品的可检测地标记的核酸与PathoChip阵列杂交，其中PathoChip包括多个特异于多种呼吸道病原体的探针，多个特异于冠状病毒的探针，以及多个特异于对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的先天和适应性应答的免疫标志物的探针。当来自样品的核酸与PathoChip上的至少三个冠状病毒探针杂交时，在样品中检测到冠状病毒。

在另一个方面，本发明包括鉴定高风险受试者的方法。方法包括将来自受试者的样品的可检测地标记的核酸与PathoChip阵列杂交，其中PathoChip包括多个特异于多种呼吸道病原体的探针、多个特异于冠状病毒的探针，以及多个特异于对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的先天和适应性应答的免疫标志物的探针。当来自样品的核酸与PathoChip上的至少三个冠状病毒探针和至少三个特异于先天和适应性应答的免疫标志物的探针杂交时，受试者被鉴定为高风险。

在某些实施方式中，冠状病毒探针包括至少一个选自SEQ ID NO:1-37的核苷酸序列。在某些实施方式中，冠状病毒探针由SEQ ID NO:1-37中叙述的核苷酸序列组成。

在某些实施方式中，当在来自受试者的样品中检测到冠状病毒或受试者被鉴定为高风险时，则对受试者施用冠状病毒的治疗。

在某些实施方式中，多个特异于先天和适应性应答的免疫标志物的探针包括至少一个选自SEQ ID NO:38-4,671的核苷酸序列。在某些实施方式中，多个特异于先天和适应性应答的免疫标志物的探针由SEQ ID NO:38-4,671中叙述的核苷酸序列组成。

在某些实施方式中，受试者是人类。

在某些实施方式中，可检测地标记的核酸用荧光团、放射性磷酸盐、生物素或酶标记。在某些实施方式中，荧光团是Cy3或Cy5。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解以下对本发明具体实施方式的详细描述。为了说明本发明的目的，附图中显示了示例性实施方式。然而，应该理解的是，本发明并不局限于附图中所示的实施方式的精确布置和手段。

图1示出了PathoChip和它的多种版本。本文公开了第5版(v5)，包括超过60,000个特异于病毒、蠕虫、原生动物、真菌和细菌的探针(Banerjee et al.(2015)Sci Rep.5:15162,10.1038/srep15162；Baldwin et al.(2014)MBio.5,e01714-01714.doi:01710.01128/mBio.01714-01714)，此外还有37个特异于冠状病毒的探针(SEQ ID NO:1-37)。

图2示出了冠状病毒(包括SARS-CoV-2)探针的选择。

图3A-3B示出了冠状病毒探针用来自患者样品的RNA的验证结果，显示具有病毒基因组RNA的SARS-CoV-2探针与具有一些SARS-CoV-2基因组序列中常见的突变的独特、保守的探针的强杂交。它还显示了探针对作为不应该与探针杂交的基因组部分而被包括的区域以及与探针杂交显示了特异性的一些区域的特异性。B图显示了SARS-CoV-2探针组(独特的、保守的和突变体探针)的信号框图。

图4示出了探针ID和信号强度。左上图显示了从人类基因组核酸中获得的信号，其中一些探针的检测量最小。具体是在不同数量的SARS-COV-2RNA中，整个探针组都被检测到，其中有些探针的强度很大。

图5示出了所选冠状病毒探针的核苷酸序列。

图6示出了免疫组ChIP可以检测到的总的免疫组特征，包括感染、免疫紊乱、代谢、毒理学和炎症应答等领域，其涵盖了所有已知的免疫标志物。

图7A-7E示出了已知与不同免疫应答相关的细胞因子芯片符号。左边的蓝条显示了在5种不同类型的免疫应答中独特或保守的应答，以及所显示的每个分组的总数。

具体实施方式

定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在实践中可以使用与本文描述的方法和材料相类似或相当的任何方法和材料来测试本发明，但本文描述了示例性材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。

还应理解本文使用的术语是仅出于描述具体的实施方式的目的，并且不意欲是限制性的。

本文使用的冠词“一个”、“一种”和“该”用来指代冠词的一个或多个(即至少一个)语法对象。举例来说，“要素”是指一个要素或多于一个要素。

如本文使用的，当提及可测量的值比如量、时距等时，术语“大约”意思是涵盖从规定值±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，和还更优选地±0.1％的变化，这是由于这样的变化适合于执行公开的方法。

如本文使用的，“生物标志物”或“标志物”通常指的是核酸分子、临床指示物、蛋白质或与疾病相关联的其它分析物。在某些实施方式中，核酸生物标志物指示样品中病原生物体——包括但不限于病毒、类病毒、细菌、真菌、蠕虫和原生动物——的存在。在多种实施方式中，标志物在由受试者——其患有疾病(例如，传染病)或处于发展出疾病(例如，传染病)的风险下——获得的生物学样品中相对于参考差异地存在。如果在样品中存在的生物标志物的平均或中值水平在统计学上不同于在参考中存在的水平，则标志物差异地存在。参考水平可以是，例如，在由清洁或未污染来源获得的环境样品中存在的水平。参考水平可以是，例如，在由健康对照受试者获得的样品中存在的水平或在较早的时间点——即治疗之前——由受试者获得的水平。用于统计学显著性的常用检验包括t检验、ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和优势比等。生物标志物——单独地或组合地——提供了受试者属于感兴趣的表型状态的相对可能性的量度。受试者样品中本发明的标志物的差异存在对如下可以是有用的：将受试者表征为患有疾病(例如，传染病)或处于发展出疾病(例如，传染病)的风险下，确定受试者的预后，评价治疗功效，或选择治疗方案。

“剂(agent)”的意思是任意核酸分子、小分子化合物、抗体、或多肽、或其片段。

“改变”或“变化”的意思是增加或减少。改变可以少至1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、或40％、50％、60％，或甚至多至70％、75％、80％、90％或100％。

“生物学样品”的意思是任意组织、细胞、流体或源自生物体的其它材料。

“捕获试剂”的意思是特异性地结合核酸分子或多肽以选择或分离核酸分子或多肽的试剂。

如本文使用的，“冠状病毒”是指属于冠状病毒科的阳性单链包膜RNA病毒，其包括但不限于SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、229E(α冠状病毒)、NL63(α冠状病毒)、OC43(β冠状病毒)、HKU1(β冠状病毒)、2019-nCoV以及其他与普通感冒相关的常见冠状病毒。

如本文使用的，术语“测定”、“评估”、“分析”、“测量”和“检测”指的是定量和定性测定二者，并且因此，术语“测定”在本文与“分析”、“测量”等可交换地使用。在意欲定量测定时，使用短语“测定分析物的量”等。在意欲定性和/或定量测定时，使用短语“测定分析物的水平”或“检测”分析物。

“可检测的部分”的意思是如下组合物：当连接至感兴趣的分子时其致使后者经由光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测。例如，有用的标记物包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶粒、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如在ELISA中常用的)、生物素、洋地黄毒苷或半抗原。

“疾病”是指动物的健康状态，其中动物不能维持动态平衡，并且其中如果疾病没有得到改善，那么动物的健康就会继续恶化。相反，动物的“紊乱”是这样的健康状态，其中动物能够保持动态平衡，但其中动物的健康状态不如没有紊乱时那么有利。如果不进行治疗，紊乱并不一定会导致动物健康状态的进一步下降。

“有效量”或“治疗有效量”在本文可互换使用，并且是指可有效实现具体的生物学结果或提供治疗或预防益处的本文所述的化合物、制剂、材料或组合物的量。这种结果可包括但不限于通过本领域内合适的任何手段确定的抗肿瘤活性。

“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中具体核苷酸序列作为生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板的固有性质以及由此产生的生物学特性，所述聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列二者之一。因此，如果与基因相对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生了蛋白质，则该基因编码了蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，并通常以序列列表的形式提供)和非编码链(用作基因或cDNA的转录模板)都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

“片段”的意思是核酸分子的部分。该部分包含，优选地，参考核酸分子或多肽的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以包含5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。

如本文使用的，“同源的”是指两个聚合分子之间的亚基序列同一性，例如，两个核酸分子例如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间。当两个分子二者中的一个亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每个的位置被腺嘌呤占据，那么它们在该位置是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，在长度为10个亚基的聚合物中的5个位置)是同源的，那么这两个序列的同源性为50％；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配或同源的，那么这两个序列的同源性为90％。

“杂交”意思是互补的核碱基之间的氢键键合，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核苷酸，其通过形成氢键配对。

如本文使用的，“同一性”是指两个聚合分子之间，具体是两个氨基酸分子之间例如，两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同的位置具有相同的残基时；例如，如果两个多肽分子中的每个的一个位置被精氨酸占据，那么它们在该位置是同一的。比对中两个氨基酸序列在相同位置上有相同残基的同一性或程度通常用百分比表示。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或同一位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，在长度为10个氨基酸的聚合物中的5个位置)是同一的，这两个序列的同一性为50％；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配或同一的，这两个氨基酸序列的同一性为90％。

如本文使用的，“指导材料”包括出版物、录音、图表或任何其他可用于传达本发明的组合物和方法的有用性的表达媒介。例如，本发明试剂盒的指导材料可以贴在含有本发明核酸、肽和/或组合物的容器上，或者与含有核酸、肽和/或组合物的容器一起运输。可选地，指导材料可以与容器分开运输，目的是使指导材料和化合物被接受者合作使用。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”指的是在不同程度上不含如下组分的材料：如在所述材料的天然状态中发现的，所述组分正常地伴随所述材料。“分离”表示与原始来源或环境的分开程度。“纯化”表示比分离更高的分开程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白质足够地不含其它材料，以便任何杂质不实质上影响蛋白质的生物学性质或引起其它不利后果。即，如果当通过重组DNA技术产生时本发明的核酸或肽基本上不含细胞材料、病毒材料、或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品，则其是纯化的。通常使用分析化学技术——例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法——测定纯度和均一性。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条带。对于可以经受修饰——例如磷酸化或糖基化——的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，其可以被单独地纯化。

“标志物概况”的意思是两种或更多种标志物(例如，多核苷酸)的信号、水平、表达或表达水平的表征。

术语“微生物”的意思是归类在常用的术语“微生物学”内的任意和所有生物体，其包括但不限于细菌、病毒、真菌和寄生虫。

术语“微阵列”的意思是固定化在基底上的核酸探针的集合。如本文使用的，术语“核酸”指的是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或修饰的核苷酸、和以单链或双链形式的其聚合物。该术语涵盖包含已知的核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，其是合成的、天然存在的和非天然存在的。在本发明的方法中有用的核酸分子包括特异性地结合靶核酸(例如，核酸生物标志物)的任意核酸分子。这样的核酸分子不需要与内源性核酸序列100％同一，但是将通常展现基本上同一性。与内源性序列具有“基本上同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”的意思是在各种严格性条件下在互补的多核苷酸序列(例如，本文描述的基因)或其部分之间配对以形成双链分子。(参见，例如，Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)MethodsEnzymol.152:507)。

如本文使用的，术语“调节”是指与没有治疗或化合物的情况下受试者的应答水平相比，和/或与其他相同但未治疗的受试者的应答水平相比，介导受试者的应答水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响自然信号或应答，从而在受试者，优选是人类中介导有益的治疗应答。

在本发明的背景下，常见的核酸碱基的缩写如下。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，和“U”是指尿苷。

免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括，例如，皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸腔内注射，或输液技术。

如本文使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，而且对可构成蛋白质或多肽序列的最大氨基酸数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连结的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文使用的，该术语既指短链，例如在本领域通常也被称为肽、寡肽和低聚物，并且也指长链，在本领域通常被称为其中有许多类型的蛋白质。“多肽”包括，例如，生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然多肽、重组多肽、合成多肽或其组合。

“参考”的意思是比较标准品。如对本领域技术人员明显的，适当的参考是其中改变要素以便测定该要素的作用。在一个实施方式中，在样品中存在的靶核酸分子的水平可以与在清洁或未污染样品中存在的该靶核酸分子的水平比较。例如，在样品中存在的靶核酸分子的水平可以与在对应的健康细胞或组织中或者患病细胞或组织(例如，源自患有疾病、紊乱或病症的受试者的细胞或组织)中存在的靶核酸分子的水平比较。

如本文使用的，术语“样品”包括生物学样品比如任何组织、细胞、流体或源自生物体的其它材料。

“特异性地结合”的意思是识别和结合分子(例如，核酸生物标志物)，但是基本上不识别和结合样品——例如生物学样品——中的其它分子的化合物(例如，核酸探针或引物)。

“基本上同一的”的意思是展现与参考氨基酸序列(例如，本文描述的氨基酸序列中的任一种)或核酸序列(例如，本文描述的核酸序列中的任一种)至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，在氨基酸水平或核酸下，这样的序列至少60％，更优选地80％或85％，和更优选地90％、95％、96％、97％、98％或甚至99％或更大同一于用于比较的序列。

通常使用序列分析软件(例如，Sequence Analysis Software Package of theGenetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705(1710University Avenue,Madison,Wis.53705威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组的序列分析软件程序包)、BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列同一性。这样的软件通过向多种取代、缺失和/或其它修饰指定同源性程度匹配同一的或相似的序列。保守性取代通常包括在下列组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在测定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e^-3和e^-100之间的可能性分数指示密切相关的序列。

“受试者”的意思是哺乳动物，其包括但不限于人或非人哺乳动物，比如牛、马、犬、绵羊、猫、小鼠或猴。术语“受试者”可以指的是动物，其是治疗、观察或实验的目标(例如，患者)。

“靶核酸分子”的意思是待分析的多核苷酸。这样的多核苷酸可以是靶序列的有义链或反义链。术语“靶核酸分子”还指的是原始靶序列的扩增子。在多种实施方式中，靶核酸分子是一种或多种核酸生物标志物。

“靶位点”或“靶序列”是指基因组核酸序列，其限定了核酸的一部分，在足以发生结合的条件下，结合分子可与其特异性结合。

如本文使用的，术语“治疗的”是指治疗和/或预防。治疗效果是通过对疾病状态的抑制、缓解或根除来获得的。

如本文使用的，术语“治疗(treat、treating、treatment)”等指的是减少或减轻紊乱和/或与其相关联的症状。应当领会虽然没有排除，但是治疗紊乱或病症不需要紊乱、病症或与其相关联的症状被完全地消除。

术语“肿瘤组织样品”是指来自受试者内肿瘤的任何样品，包括受试者内任何实体和非实体肿瘤。

范围：在整个本公开内容中，本发明的多个方面都可以用范围格式来表述。应该理解的是，以范围格式描述只是为了方便和简洁，不应该被理解为对本发明范围的僵化限制。因此，对范围的描述应被视为已经具体公开了该范围内的所有可能的子范围以及个体数值。例如，对例如从1到6范围的描述应被视为具体公开了例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等的子范围，以及该范围内的个体数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。

描述

本发明的特征是用于检测受试者体内冠状病毒(包括SARS-CoV-2)的组合物和方法。在检测冠状病毒的同时，还可以检测其他共适应症或共病现象(如细菌、病毒或寄生虫感染或癌症)。受试者对冠状病毒的免疫应答也可以使用本文公开的方法来确定。

在一个实施方式中，本文开发了诊断测试，用于准确鉴定最近被鉴定为Covid-19疾病的致病因子的SARS-CoV-2冠状病毒。系统使用8个阵列的60,000个探针的微阵列平台，用于检测所有已知病毒和其他致病细菌、真菌和寄生虫。这涵盖了超过6000种与疾病相关的微生物增加物(accession)，包括所有已知的呼吸道病原体。该技术被修改为包括新的病毒SARS-CoV-2探针，并且可以在快至24小时内检测到这些生物体。同时，针对超过1720种免疫标志物，对探针进行了生物信息学工程化设计，以涵盖所有对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的先天和适应性应答。所生成的独特探针将提供对SARS-CoV-2的免疫应答的快照，这将允许对可能有更大风险疾病严重性发展的患者进行分层。同时，该测试涵盖了所有已知的呼吸道病原体，包括来自蝙蝠和其他哺乳动物的其他冠状病毒，提供了准确和有效的SARS-CoV-2检测，以及潜在反射其他呼吸道病原体和与Covid-19疾病相关的细胞因子。因此，该测试的益处在于灵敏度和准确性，如果在试验筛选中一个探针失败，通过使用整个基因组的多个探针避免阴性结果。整体筛选可用于研究以及临床样品检测，以高灵敏度和准确性检测SARS-Cov2冠状病毒。

组合物

在一个方面，本发明包括包含PathoChip v5的组合物，其中PathoChip v5包括超过60,000个特异于多种微生物的探针，以及多个特异于冠状病毒的探针。在某些实施方式中，冠状病毒探针包括至少一个选自SEQ ID NO:1-37的核苷酸序列。在某些实施方式中，冠状病毒探针由SEQ ID NO:1-37中叙述的核苷酸序列组成。

在另一个方面，本发明包括PathoChip，其进一步包括多个另外的探针，这些探针特异于对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的先天和适应性应答的免疫标志物。这个版本的PathoChip也被称为ImmunoChIP。在某些实施方式中，PathoChip(ImmunoChIP)包括15,000个探针，这些探针特异于所有已知的呼吸道病原体(包括冠状病毒)、性传播原、食源性病原体和其他常见的传播原。在某些情况下，冠状病毒探针包括至少一个选自SEQ IDNO:1-37的核苷酸序列。在某些实施方式中，冠状病毒探针由SEQ ID NO:1-37中叙述的核苷酸序列组成。在某些实施方式中，多个另外的探针特异于1,728个已知的免疫标志物，这些免疫标记物响应于对人类的生物或物理攻击。在某些实施方式中，多个另外的探针包括至少一个选自SEQ ID NO:38-4,671的核苷酸序列。在某些实施方式中，多个另外的探针由SEQID NO:38-4,671中叙述的核苷酸序列组成。

在另一个方面，本发明包括包含多个核酸的组合物，其中核酸包括至少一个选自SEQ ID NO:1-37的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明包括包含多个核酸的组合物，其中核酸由SEQ ID NO:1-37中叙述的核苷酸序列组成。

在另一个方面，本发明包括包含多个核酸的组合物，其中核酸包括至少一个选自SEQ ID NO:38-4,671的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明包括包含多个核酸的组合物，其中核酸由SEQ ID NO:38-4,671中叙述的核苷酸序列组成。

在某些实施方式中，组合物包括微阵列。在某些实施方式中，微阵列包括生物芯片、载玻片、珠或纸。

在另一个方面，本发明包括包含免疫组ChIP的组合物，其中免疫组ChIP包括多个探针，这些探针特异于对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的先天和适应性应答的免疫标志物。在某些实施方式中，多个探针包括至少一个选自SEQ ID NO:38-4,671的核苷酸序列。在某些实施方式中，多个探针由SEQ ID NO:38-4,671中叙述的核苷酸序列组成。

如本文所述，还提供了包含本文公开的组合物或用于实施本发明方法的试剂盒。例如，在一些实施方式中，本发明包括包含PathoChip v5或免疫组ChIP的试剂盒。在用试剂盒组分实践的方案中需要或期望的另外的试剂可以包括在试剂盒中。另外的试剂可以包括但不限于补充核酸、载体和PCR扩增试剂(例如，核苷酸、缓冲剂、阳离子等)等。试剂盒组分可以存在于单独的容器中，或者一种或多种组分可以存在于同一容器中，其中容器可以是储存容器和/或在试剂盒设计的试验期间所采用的容器。

除上述组分外，试剂盒还可进一步包括用于实践本文所述方法的说明书。说明书通常包括关于使用该组合物检测冠状病毒的信息。在某些实施方式中，说明书包括关于如何使用该试剂盒的信息。在某些实施方式中，说明书包括关于如何分析和解释使用该试剂盒生成的数据的信息。在其他实施方式中，说明书包括以下至少一项：治疗剂的描述；用于治疗或防止冠状病毒或其症状的剂量安排和使用；预防措施；警告；适应症；禁忌症；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。说明书可以直接印在容器上(如有的话)，或作为标签应用在容器上，或作为单独的纸、小册子、卡片或文件夹提供在容器中或与容器一起提供。

方法

本发明还包括检测冠状病毒的方法，确定对感染(例如COVID-19感染)的应答(如免疫应答)的方法，以及确定患者是否为高风险的方法。

在一个方面，本发明包括检测来自受试者的样品中冠状病毒的方法。方法包括将来自样品的可检测地标记的核酸与PathoChip v5阵列杂交，其中PathoChip v5包括超过60,000个特异于多种微生物的探针，以及多个特异于冠状病毒的探针。当来自样品的核酸与PathoChip v5上至少三个冠状病毒探针杂交时，在样品中检测到冠状病毒。

可以用本文公开的组合物和方法检测的冠状病毒包括但不限于SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、229E(α冠状病毒)、NL63(α冠状病毒)、OC43(β冠状病毒)、HKU1(β冠状病毒)和2019-nCoV。

在另一个方面，本发明包括检测来自受试者的样品中冠状病毒的方法。方法包括将来自样品的可检测地标记的核酸与PathoChip阵列杂交，其中当来自样品的核酸与PathoChip上至少三个冠状病毒探针杂交时，在样品中检测到冠状病毒。在某些实施方式中，PathoChip包括多个特异于所有呼吸道病原体(包括冠状病毒)，以及对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的先天和适应性应答的免疫标志物的探针。在这种情况下，使用PathoChip可以同时测量冠状病毒和受试者对该病毒的应答(例如免疫应答)。这个版本的PathoChip也被称为ImmunoChIP。

在另一个方面，本发明包括鉴定高风险受试者的方法，其包括将来自受试者的样品的可检测地标记的核酸与PathoChip v5阵列杂交，其中当来自样品的核酸与PathoChipv5上至少三个冠状病毒探针和至少三个特异于微生物的探针杂交时，受试者被鉴定为高风险。

在另一个方面，本发明包括鉴定高风险受试者的方法，其包括将来自受试者的样品的可检测地标记的核酸与PathoChip阵列杂交，其中PathoChip包括多个特异于多种呼吸道病原体的探针、多个特异于冠状病毒的探针，以及多个特异于对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的先天和适应性应答的免疫标志物的探针。当来自样品的核酸与PathoChip上至少三个冠状病毒探针和至少三个特异于先天和适应性应答的免疫标志物的探针杂交时，该受试者被鉴定为高风险。

在某些实施方式中，冠状病毒探针包括至少一个选自SEQ ID NO:1-37的核苷酸序列。在某些实施方式中，冠状病毒探针由SEQ ID NO:1-37中叙述的核苷酸序列组成。

在某些实施方式中，多个特异于先天和适应性应答的免疫标志物的探针包括至少一个选自SEQ ID NO:38-4,671的核苷酸序列。在某些实施方式中，多个特异于先天和适应性应答的免疫标志物的探针由SEQ ID NO:38-4,671中叙述的核苷酸序列组成。

在某些实施方式中，当从受试者的样品中检测到冠状病毒时，受试者被施用用于冠状病毒的治疗。

可以使用荧光团(例如Cy3或Cy5)、放射性磷酸盐、生物素或酶标记可检测地标记的核酸。

在某些实施方式中，受试者是人。

样品制备

本发明提供了用于分析在样品中存在的多种类型的核酸——包括DNA和RNA——的手段。在多种实施方式中，样品制备包括提取核酸分子(例如，DNA和RNA)的混合物。在其它实施方式中，样品制备包括从多种生物体、细胞类型、感染原或其任意组合提取核酸的混合物。在一个实施方式中，样品制备包括下面的工作流程。

A.将基因组DNA碎片化

B.通过随机引发的逆转录酶将总RNA转化为第一链cDNA

C.使用生物素或荧光染料通过化学或酶促并入标记基因组DNA

D.使用生物素或荧光染料通过化学或酶促并入标记cDNA

E.在相同的化学或酶促反应中标记基因组DNA和cDNA的混合物

F.混合C+D并且共杂交至探针的微阵列

G.使E杂交至探针的微阵列

H.扩增靶向的基因组DNA

1.使用全基因组扩增(GE GenomiPhi,Sigma WGA,NuGEN Ovation DNA)以非特异性地扩增基因组DNA

2.使用扩增的产物作为上述步骤C或E的输入

I.扩增靶向的总RNA

1.使用全转录物组扩增(Sigma WTA,Ambion体外转录，NuGEN Ovation RNA)以非特异性地扩增总RNA

2.使用扩增的产物作为输入

样品被杂交至微阵列(例如，PathoChip和ImmunoChIP)，并且在多种严格性下洗涤微阵列。微阵列被扫描用于检测荧光。应用背景校正和阵列间归一化算法。应用检测阈值。结果进行统计学显著性分析。

核酸扩增

靶核酸序列任选地在检测前被扩增。术语“扩增”限定由单或低拷贝数的核酸序列分子制造多拷贝的核酸的过程。通过本领域普通技术人员已知的生物化学过程体外进行核酸序列的扩增。在鉴定之前或与鉴定同时，病毒样品可以通过各种机制被扩增，其中的一些可以采用PCR。例如，PCR的引物可以被设计以扩增序列的区域。对于RNA病毒，第一逆转录酶步骤可以被用于由单链RNA生成双链DNA。参见，例如，PCR Technology:Principles andApplications for DNA Amplification(Ed.H.A.Erlich,Freeman Press,NY,N.Y.,1992)；PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications(Eds.Innis,et al.,AcademicPress,San Diego,Calif.,1990)；Mattila et al.,Nucleic Acids Res.19,4967(1991)；Eckert et al.,PCR Methods and Applications 1,17(1991)；PCR(Eds.McPherson etal.,IRL Press,Oxford)；和美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159、4,965,188和5,333,675。样品可以在阵列上被扩增。参见，例如，美国专利号6,300,070和美国序列号09/513,300。

其它合适的扩增方法包括连接酶链反应(LCR)(例如，Wu and Wallace,Genomics4,560(1989),Landegren et al.,Science 241,1077(1988)和Barringer et al.Gene 89:117(1990))、转录扩增(Kwoh et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,1173(1989)和WO88/10315)、自维持序列复制(Guatelli et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87,1874(1990)和WO90/06995)、靶多核苷酸序列的选择性扩增(美国专利号6,410,276)、共有序列引发的PCR(CP-PCR)(美国专利号4,437,975)、任意引发的PCR(AP-PCR)(美国专利号5,413,909、5,861,245)和基于核酸的序列扩增(NABSA)(参见，美国专利号5,409,818、5,554,517和6,063,603)。在美国专利号5,242,794、5,494,810、4,988,617和在美国序列号09/854,317中描述了可以使用的其它扩增方法。

在Dong et al.,Genome Research 11,1418(2001)，在美国专利号6,361,947、6,391,592和美国序列号09/916,135、09/920,491(美国专利申请公布20030096235)、09/910,292(美国专利申请公布20030082543)和10/013,598中描述了样品制备的另外的方法和用于降低核酸样品的复杂性的技术。

生物标志物的检测

可以通过任何合适的方法检测本发明的生物标志物。本文描述的方法可以被单独地或组合地用于生物标志物的更精确的检测。本领域已经研发出执行多核苷酸杂交试验的方法。杂交试验程序和条件将取决于应用而变化并且根据已知的一般结合方法进行选择，所述方法包括在下中被提及的那些：Sambrook and Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(3^rd Ed.Cold Spring Harbor,N.Y,2001)；Berger and KimmelMethods in Enzymology,Vol.152,Guide to Molecular Cloning Techniques(AcademicPress,Inc.,San Diego,Calif.,1987)；Young and Davism,P.N.A.S,80:1194(1983)。已经在美国专利号5,871,928、5,874,219、6,045,996和6,386,749、6,391,623中描述了用于进行重复和可控杂交反应的方法和设备。用于解译来自阵列的杂交结果的数据分析算法(E-predict)是公开可获得的(参见Urisman,2005,Genome Biol 6:R78)。

在一个实施方式中，通过可视化附连至样品核酸或在样品核酸内并入的一种或多种标记物来检测杂交的核酸。可以通过本领域普通技术人员熟知的任何许多手段附连或并入标记物。在一个实施方式中，在样品核酸的制备中，在扩增步骤期间同时并入标记物。因而，例如，使用标记的引物或标记的核苷酸进行PCR将提供标记的扩增产物。在另一个实施方式中，如上面描述的，使用标记的核苷酸(例如荧光素标记的UTP和/或CTP)进行转录扩增将标记物并入转录的核酸。在另一个实施方式中，PCR扩增产物被碎片化并且通过末端脱氧转移酶和标记的dNTP进行标记。可选地，标记物可以被直接地添加至原始核酸样品(例如，mRNA、polyA mRNA、cDNA等)或在完成扩增后添加至扩增产物。将标记物附连至核酸的手段对本领域普通技术人员是熟知的并且包括，例如，切口平移或末端标记(例如使用标记的RNA)，其通过激活(kinasing)核酸和随后将接合样品核酸的核酸连接体附连(连接)至标记物(例如，荧光团)。在另一个实施方式中，标记物使用末端脱氧转移酶被添加至片段的末端。

适合用于本发明的可检测的标记物包括通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何组合物。本发明中有用的标记物包括但不限于：与标记的链酶抗生物素缀合物一起用于染色的生物素；抗生物素抗体、磁珠(例如，Dynabeads^TM.)；荧光染料(例如，Cy3、Cy5荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)；放射性标记物(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、⁴C或³²P)；磷光标记物；酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和在ELISA中常用的其它酶)；和比色标记物，比如胶体金或着色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。教导使用这样的标记物的专利包括美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。

检测这样的标记物的手段对本领域普通技术人员是熟知的。因而，例如，可以使用胶卷或闪烁计数器检测放射性标记物；可以使用光检测器检测发射光来检测荧光标志物。通常通过给酶提供底物和检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测酶促标记物，并且通过简单地可视化着色的标记物来检测比色标记物。

在例如美国专利号5,143,854、5,547,839、5,578,832、5,631,734、5,800,992、5,834,758；5,856,092、5,902,723、5,936,324、5,981,956、6,025,601、6,090,555、6,141,096、6,185,030、6,201,639；6,218,803；和6,225,625，在美国序列号10/389,194、60/493,495和在PCT申请PCT/US99/06097(公布为WO99/47964)中公开了用于信号检测和处理强度数据的方法和设备。

通过微阵列的检测

在本发明的某些方面，借助微阵列分析样品。本发明的核酸分子可用作微阵列中可杂交的阵列单元。微阵列一般包括固体基底并且具有大体上平的表面，捕获试剂(也称为吸附或亲和试剂)被附连至所述表面。经常地，生物芯片的表面包括多个可寻址的位置，其中的每个具有结合在那里的捕获试剂。

阵列单元以有序方式被组织，以便每个单元在基底上的规定位置处存在。有用的基底材料包括由纸、尼龙或其它材料构成的膜，过滤器，芯片，载玻片，和其它固体支持物。阵列单元的有序布置允许杂交图谱和强度被解译为特定基因或蛋白质的表达水平。用于制造核酸微阵列的方法对技术人员是已知的并且在例如美国专利号5,837,832、Lockhart等(Nat.Biotech.14:1675-1680,1996)和Schena等(Proc.Natl.Acad.Sci.93:10614-10619,1996)中描述，其通过引用并入本文。美国专利号5,800,992和6,040,138描述了用于制造核酸探针阵列——其可以被用于检测包含特定核苷酸序列的核酸的存在——的方法。以最小数目的合成步骤形成核酸、肽和其它聚合物序列的高密度阵列的方法是已知的。可以通过各种方法在固体基底上合成核酸阵列，包括但不限于光定向的化学偶联和机械定向的偶联。对于与再测序阵列相关的额外描述和方法，参见美国专利申请序列号10/658,879、60/417,190、09/381,480、60/409,396，和美国专利号5,861,242、6,027,880、5,837,832、6,723,503。

“杂交”的意思是在多种严格性条件下在互补的多核苷酸序列(例如，本文描述的基因)或其部分之间配对以形成双链分子。(参见，例如，Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。例如，严格的盐浓度将一般小于大约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选地小于大约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，和更优选地小于大约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格性杂交可以在不存在有机溶剂例如甲酰胺的情况下获得，而高严格性杂交可以在存在至少大约35％甲酰胺，和更优选地至少大约50％甲酰胺的情况下获得。严格的温度条件将一般包括至少大约30℃，更优选地至少大约37℃，和最优选地至少大约42℃的温度。变化的另外的参数，比如杂交时间、清洁剂——例如十二烷基硫酸钠(SDS)——的浓度、和包括或排除运载体DNA是本领域普通技术人员熟知的。根据需要通过组合这些各种条件实现各种水平的严格性。在优选的实施方式中，杂交将在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％ SDS中在30℃下发生。在更优选的实施方式中，杂交将在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％ SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性的大马哈鱼精子DNA (ssDNA)中在37℃下发生。在最优选的实施方式中，杂交将在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％ SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中在42℃下发生。这些条件的有用的变化对本领域普通技术人员将是显而易见的。

对于大部分应用，杂交之后的洗涤步骤也将在严格性方面改变。可以通过盐浓度和通过温度限定洗涤严格性条件。如上面的，可以通过降低盐浓度或通过增加温度增加洗涤严格性。例如，洗涤步骤的严格的盐浓度将优选地小于大约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，和最优选地小于大约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格的温度条件将一般包括至少大约25℃，更优选地至少大约42℃，并且甚至更优选地至少大约68℃的温度。在优选的实施方式中，洗涤步骤将在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中在25℃下发生。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中在42℃下发生。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中在68℃下发生。这些条件的另外的变化对本领域普通技术人员将是显而易见的。杂交技术对本领域普通技术人员是熟知的并且在如下中描述，例如，Benton and Davis(Science196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubelet al.(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,AcademicPress,New York)；和Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York。

微阵列可以是生物芯片，或在载玻片、珠或纸上。

通过核酸生物芯片的检测

在本发明的方面，借助核酸生物芯片(也称为核酸微阵列)分析样品。为了生产核酸生物芯片，寡核苷酸可以使用化学偶联程序和喷墨施加设备被合成或结合至基底的表面，如在PCT申请W095/251116(Baldeschweiler等)中描述的。可选地，栅格阵列(griddedarray)可以使用真空系统，热、UV、机械或化学结合程序被用于将cDNA片段或寡核苷酸布置和连接至基底的表面。在本发明中有用的示例性核酸分子包括多核苷酸和其片段，所述多核苷酸将核酸生物标志物特异性地结合至一种或多种病原生物体。

如本文描述的，源自生物学样品的核酸分子(例如RNA或DNA)可以被用于产生杂交探针。生物学样品通常源自患者，例如，如体液(比如血液、血清、血浆、唾液、尿、腹水、囊液等)；匀浆的组织样品(例如，通过活组织检查获得的组织样品)；或由患者样品分离的细胞或细胞群。对于一些应用，可以使用培养的细胞或其它组织制剂。根据标准方法分离mRNA，并且cDNA被产生并用作模板以制造适于杂交的互补的RNA。这样的方法是本领域熟知的。在存在荧光核苷酸的情况下扩增RNA，并且标记的探针然后与微阵列一起温育以允许探针序列杂交至互补的寡核苷酸——其结合至生物芯片。

调节温育条件，以便取决于采用的严格性程度，在精确的互补匹配或在多种较小互补性程度的情况下发生杂交。例如，严格的盐浓度将一般小于大约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，小于大约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，或小于大约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格性杂交可以在不存在有机溶剂——例如甲酰胺——的情况下获得，而高严格性杂交可以在存在至少大约35％甲酰胺，并且最优选地至少大约50％甲酰胺的情况下获得。严格的温度条件将一般包括至少大约30℃、至少大约37℃或至少大约42℃的温度。变化的另外的参数，比如杂交时间、去污剂——例如十二烷基硫酸钠(SDS)——的浓度、和包括或排除运载体DNA，对本领域普通技术人员是熟知的。根据需要通过组合这些各种条件来实现各种水平的严格性。在优选的实施方式中，杂交将在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中在30℃下发生。在实施方式中，杂交将在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性的大马哈鱼精子DNA(ssDNA)中在37℃下发生。在其它实施方式中，杂交将在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％ SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中在42℃下发生。这些条件的有用的变化对本领域普通技术人员将是显而易见的。

可以例如通过洗涤实现未杂交的探针的去除。杂交之后的洗涤步骤也可以在严格性方面改变。可以通过盐浓度和通过温度限定洗涤严格性条件。如上面的，可以通过降低盐浓度或通过增加温度增加洗涤严格性。例如，洗涤步骤的严格的盐浓度将优选地小于大约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，和最优选地小于大约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格的温度条件将一般包括至少大约25℃、至少大约42℃或至少大约68℃的温度。在实施方式中，洗涤步骤将在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中在25℃下发生。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中在42℃下发生。在其它实施方式中，洗涤步骤将在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中在68℃下发生。这些条件的另外的变化对本领域普通技术人员将是显而易见的。

用于测量所有特定的核酸序列的杂交存在、不存在和量的检测系统是本领域熟知的。例如，在Heller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.94:2150-2155,1997中描述了同时检测。在某些实施方式中，使用扫描仪测定荧光的水平和图谱。

除非另外指示，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其充分地在技术人员的范围内。这样的技术在文献中被充分地说明，比如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,fourth edition(Sambrook,2012)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984)；“Culture of AnimalCells”(Freshney,2010)；“Methods in Enzymology”“Handbook of ExperimentalImmunology”(Weir,1997)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller andCalos,1987)；“Short Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,2002)；“PolymeraseChain Reaction:Principles,Applications and Troubleshooting”,(Babar,2011)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan,2002)。这些技术可适用于本发明的多核苷酸和多肽的产生，并且因此，可以在进行和实践本发明中考虑。本文将讨论用于具体实施方式的具体有用的技术。

提出下列实施例以便于给本领域普通技术人员提供如何进行和使用本发明的试验、筛查和治疗方法的完整的公开内容和描述，并且不意欲限制本发明人视为其发明的范围。

实验实施例

通过参考以下实验实施例，进一步详细描述本发明。提供这些实施例只是为了说明问题，除非另有说明，否则并不意味着是限制性的。因此，本发明绝不应被理解为仅限于以下的实施例，而应被理解为包括由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有的变化。

无需进一步描述，相信本领域的普通技术人员可以利用前面的描述和下面的说明性实施例来制造和利用本发明的化合物，并实践所要求保护的方法。因此，下面的工作实施例具体指出了本发明的示例性实施方式，而不应被理解为以任何方式限制本公开内容的其余部分。

现在对这些实验中采用的材料和方法进行描述。

PathoChip设计：PathoChip阵列v1、v2、v3和v4的细节先前已经描述过(Banerjeeet al.(2015)Sci Rep.5:15162.,10.1038/srep15162；Baldwin et al.(2014)MBio.5,e01714-01714.doi:01710.01128/mBio.01714-01714)。PathoChip包括60,000个来自Genbank的测序的微生物的探针组，这些探针组被制造为SurePrint载玻片微阵列(AgilentTechnologies Inc.)，每片含有8个重复阵列。每个探针是靶向致病病毒、原核和真核微生物的多个基因组区域的60nt的DNA寡聚体。具体来说，每个增加物平均有5-10个靶特异性探针，增加物包括大约4200种病毒、320种细菌、360种真菌、130种原生动物和250种蠕虫。靶区域的探针在病毒家族之间是保守的，并且对选定的病毒剂，包括饱和探针组。

PathoChip技术与PCR和NGS相结合，也是检测和鉴定乳腺癌、口咽癌和卵巢癌病原体的有价值策略(Banerjee et al.(2015)Sci Rep.5:15162.,10.1038/srep15162；Banerjee et al.(2017)Sci Rep.7,4036.doi:4010.1038/s41598-41017-03466-41596；Banerjee et al.(2017)Oncotarget 8,36225-36245.doi:36210.18632/oncotarget.16717；Baldwin et al.(2014)MBio.5,e01714-01714.doi:01710.01128/mBio.01714-01714)。探针和增加物注释可在Gene Expression Omnibus(http://wwwdotncbinlmdotnihdotgov/geo/)中获得。

样品制备和微阵列处理：从样品中提取DNA和RNA(Banerjee et al.(2015)SciRep.5:15162.,10.1038/srep15162；Banerjee et al.(2017)Sci Rep.7,4036.doi:4010.1038/s41598-41017-03466-41596；Banerjee et al.(2017)Oncotarget 8,36225-36245.doi:36210.18632/oncotarget.16717；Baldwin et al.(2014)MBio.5,e01714-01714.doi:01710.01128/mBio.01714-01714)并用于筛选。提取的核酸质量通过琼脂糖凝胶电泳和A260/280比率来确定。使用RNA和DNA各50ng作为输入和制造商方案，使用TransPlex Complete Transcriptome Amplification Kit(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)对提取的RNA和DNA样品进行全基因组和转录组扩增(本文称为WTA)。通过琼脂糖凝胶电泳分析WTA产物，并显示出200-400bp的扩增子尺寸范围，并且在WTA期间使用的非模板对照中没有污染。还提取了人类参考RNA和DNA，并各以15ng用于WTA。纯化WTA产物(PCR纯化试剂盒，Qiagen，Germantown，MD，USA)，并且按照制造商的协议，用Cy3标记2μg的扩增产物和用Cy5标记来自人类参考的产物(SureTag标记试剂盒，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)。人类参考DNA和RNA被用来确定探针与人类DNA的交叉杂交。标记的cDNA/DNA被纯化，并通过测量550nm(Cy3)和650nm(Cy5)的吸光度来确定标记的效率。如先前所述的，将标记的样品(Cy3加Cy5)杂交到PathoChip上(Banerjee et al.(2015)Sci Rep.5:15162.,10.1038/srep15162；Banerjee et al.(2017)Sci Rep.7,4036.doi:4010.1038/s41598-41017-03466-41596；Banerjee et al.(2017)Oncotarget 8,36225-36245.doi:36210.18632/oncotarget.16717；Baldwin et al.(2014)MBio.5,e01714-01714.doi:01710.01128/mBio.01714-01714)。将杂交鸡尾酒(CGH阻断剂和杂交缓冲液)添加到每个标记的与参考(Cy5)混合的测试样品(Cy3)，变性并杂交到8室垫片玻片的阵列中。该玻片在65℃下旋转温育并洗涤，然后使用Agilent SureScan G4900DA阵列扫描仪进行扫描，以用于可视化。

微阵列数据的提取和统计分析：如先前所述，提取和分析微阵列数据((Banerjeeet al.(2015)Sci Rep.5:15162.,10.1038/srep15162；Banerjee et al.(2017)SciRep.7,4036.doi:4010.1038/s41598-41017-03466-41596；Banerjee et al.(2017)Oncotarget 8,36225-36245.doi:36210.18632/oncotarget.16717；Baldwin et al.(2014)MBio.5,e01714-01714.doi:01710.01128/mBio.01714-01714)。使用AgilentFeature Extraction软件提取了微阵列图像的原始数据。R程序被用于归一化和数据分析。使用人类探针的绿色和红色通道的信号来计算比例因子(scale factor)。比例因子是人类探针的绿色信号之和/红色信号之和的比。然后用比例因子来获得所有其他探针的归一化信号。对于除人类探针外的所有探针，归一化信号是绿色信号/比例因子修改的红色信号的log2转换(log2 g-log2比例因子*r)。在归一化信号上，通过比较测试样品与对照，应用t检验来选择在测试样品(病毒样品)中显著存在的探针，并选择在测试样品与对照组相比显著存在的探针。显著性截止值是log2倍数变化>1和调整后的p值(经多重检验校正)<0.05。通过计算杂交信号大于暗角或阴性对照探针平均信号的测试案例数量计算流行率，并以百分比表示。

在单个探针水平(包括特异性探针和保守性探针)和增加物(对于病毒)或属(对于细菌、真菌和寄生虫)水平进行了分析，考虑到每个增加物或属的所有探针。基于其总杂交信号(每个增加物或属的杂交信号之和)和流行率对微生物检测进行排名。还进行了保守探针分析，其中测量了靶向一个家族中两个或更多个生物体共享的保守序列的单个探针的信号。MAT分析分配了来源于每个滑动窗口所覆盖的多个相邻探针的检测分数。

探针捕获和下一代测序：进行探针捕获验证PathoChip结果，如先前所述(Banerjee et al.(2015)Sci Rep.5:15162.,10.1038/srep15162；Banerjee et al.(2017)Sci Rep.7,4036.doi:4010.1038/s41598-41017-03466-41596；Banerjee et al.(2017)Oncotarget 8,36225-36245.doi:36210.18632/oncotarget.16717；Baldwin etal.(2014)MBio.5,e01714-01714.doi:01710.01128/mBio.01714-01714)。简而言之，样品的WTA产物被汇集在一起，与选定的生物素化探针杂交，这些探针是通过PathoChip筛选鉴定的微生物特征靶样品。然后，靶序列被涂布有链霉亲和素的磁珠捕获，并生成用于NGS的文库。选定的探针被合成为5′-生物素化的DNA寡聚物(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA,USA)，汇集在一起，并与WTA池杂交。在6个独立的反应混合物(Pr1-6)中，将捕获探针池分别加入到每个汇集的WTA (150ng)中，该反应混合物含有3M四甲基氯化铵、0.1％月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)、50mM Tris-HCl、4mM EDTA，pH 8.0(1×TMAC缓冲液)。反应混合物进行变性(100℃，10分钟)，然后进行杂交步骤(60℃，3小时)。加入链霉亲和素磁珠(Streptavidin Dynabeads)(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)，在室温下持续混合2小时，然后用0.30M NaCl加0.030M柠檬酸钠缓冲液(2×SSC)对捕获的珠子-蛋白-靶复合物进行三次洗涤，再用0.1×SSC洗涤三次。捕获的单链靶DNA在Tris-EDTA中洗脱，使用Nextera XT样品制备试剂盒(Illumina,SanDiego,CA,USA)进行文库制备，然后进行NGS(Banerjee et al.(2015)Sci Rep.5:15162.,10.1038/srep15162；Banerjee et al.(2017)Sci Rep.7,4036.doi:4010.1038/s41598-41017-03466-41596；Banerjee et al.(2017)Oncotarget 8,36225-36245.doi:36210.18632/oncotarget.16717；Baldwin etal.(2014)MBio.5,e01714-01714.doi:01710.01128/mBio.01714-01714)。对这5个文库进行了质量控制检查，并使用Illumina MiSeq仪器以成对末端的250-nt读数提交用于NGS。首先使用Trim Galore软件(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)去除原始读数的衔接子(adapter)和低质量片段。然后用默认参数用基因组短读核苷酸比对程序(Genomic Short-read Nucleotide Alignment Program)(GSNAP)将处理的读数与宏基因组和人类基因组进行比对(Wu et al.(2010)Bioinformatics.26,873-881.doi:810.1093/bioinformatics/btq1057.Epub Feb 2010)。比对之后，采用featureCounts(Liao et al.(2014)Bioinformatics.30,923-930.doi:910.1093/bioinformatics/btt1656.Epub 2013Nov 1013)来计算有多少读数与每个捕获探针区域对齐。这些捕获探针的详细结果在IGV71中可视化。

微生物融合检测：微生物基因组在体细胞宿主染色体中的插入如先前所述确定(Banerjee et al.(2015)Sci Rep.5:15162.,10.1038/srep15162；Banerjee et al.(2017)Sci Rep.7,4036.doi:4010.1038/s41598-41017-03466-41596)。在进行融合检测之前，对测序读数进行了质量控制。采用Trim Galore软件(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)对原始读数进行质量修剪，以去除衔接子和低质量片段。Virus-Clip(Ho et al.(2015)Oncotarget.6,20959-20963)被用来鉴定人类基因组中的病毒融合位点。具体来说，病毒基因组被用作主要的读数比对靶标，读数首先被比对到PathoChip基因组上。一些映射的读数含有软修剪的段。从比对中提取出软修剪的读数，并将其映射到人类基因组上(包含潜在的病原体整合的人类基因座的序列)。利用这一映射信息，鉴定了单碱基分辨率的确切的人类和病原体整合断点。然后，所有的整合位点都被自动注释为受影响的人类基因和它们相应的基因区域。

一些通过高序列读数支持病毒基因组插入的宿主基因被进行了IngenuityPathway Analysis(IPA)(Kramer et al.(2014)Bioinformatics.30,523-530.doi:510.1093/bioinformatics/btt1703.Epub 2013Dec 1013)，其有助于将宿主基因与从文献中提取的知识相结合，以便预测可能的结果。IPA软件提供了这些基因与疾病结果关联的统计学显著性。

对PathoChip检测和微生物基因组插入的PCR验证：来自PathoChip筛选检测的微生物的保守和/或特异性区域的PCR引物被用于检测验证。为了验证微生物插入，设计了PCR引物，以便可以扩增融合结，一个引物是从微生物序列设计的，而另一个引物是从受影响的人类基因序列设计的。每个反应的PCR扩增反应混合物包含200-400ng的WTA产物和20pm的每个正向和反向引物，300μM的dNTP和2.5U的LongAmp Taq DNA聚合酶(NEB)。DNA在94℃下变性3分钟，然后94℃持续30秒进行30个循环，不同引物组的不同退火温度(一般比解链温度低3到5度)持续30秒，65℃持续30秒。对扩增子进行凝胶提取的sanger测序。使用BioEdit程序(TA,H.(1999)Nucleic Acids Symposium Series 41,95-98)对电泳图进行了可视化，并对序列进行了NCBI BLAST进行鉴定。

现在描述实验的结果。

实施例1：鉴定SARS-CoV-2(Covid-19的致病因子)的技术发展

修改了PathoChIP v4(Banerjee et al.(2015)Sci Rep.5:15162.,10.1038/srep15162；Baldwin et al.(2014)MBio.5,e01714-01714.doi:01710.01128/mBio.01714-01714)以包括检测冠状病毒(包括SARS-CoV-2)。利用生物信息学方法，设计了特异于冠状病毒的独特和保守的探针。简而言之，从NCBI网站上下载了三种人类冠状病毒(MERS、SARS和SARS-CoV-2)的fasta格式的基因组序列。然后使用延伸器(stretcher)(https://www.ebidotac.uk/Tools/psa/emboss stretcher/)对SARS和SARS-CoV-2以及SARS和MERS进行配对比对，以鉴定病毒剂的共线结构域。这鉴定了维持冠状病毒科的保守基因组的百分比。此外，还鉴定了每个病毒所独特的区域。然后，使用60个核苷酸的滑动窗口对比对的序列进行扫描，并计算每个窗口的同一性分数。这种方法被认为是严格的，因为大于42/60核苷酸匹配的区域被认为是保守的，并且小于24/60核苷酸匹配的区域被认为是独特的序列。然后，所有的段被连结成保守和独特的序列。独特序列区域与60条合成染色体的PathoChIP数据库进行比对(blast)，以确保其特异性，其显示没有显著的命中。这些区域被选择用于探针设计。在这一设计过程期间，探针被针对人类基因组、小鼠基因组和拟南芥基因组进行筛选，以确定是否与任何已知基因组发生任何交叉杂交。这通过减少由于其他基因组的序列信号在阵列上的可能性，增强了所选探针的特异性。

为了设计用于SARS-CoV-2和其他感染人类的冠状病毒、SARS和MERS的探针，所选择的区域通过安捷伦CGH管线进行探针设计，其曾用于PathoChIP v2、v3和v4的先前设计。基于该管线，共选择了1147个探针，具有例如关于与病毒基因组的序列同源性、二级结构和碱基组成的探针得分信息。所得到的探针还针对人类基因组进行了评分，以检查与人类基因组DNA的交叉杂交，来确保阵列上没有来自基因组DNA的任何背景。根据为这些病毒生成的独特和保守探针的这一信息以及为每种病原体选择至少5个独特和5个保守探针的策略，为SARS-CoV-2选择了8个独特的探针和5个保守的探针。此外，还选择了3个特异地位于SARS-CoV-2突变区域中的探针。因此，总共选择了37个探针(图5，SEQ ID NO:1-37)，并作为修订版v5添加到PathoChIP中。这与之前的v4格式相同，采用8x60000的载玻片设计格式。

实施例2：对SARS-CoV-2的试验的验证

首先测试探针是否能够独特地检测SARS-CoV-2病毒。为了验证该试验，从NIH/NIAID生物防御和新发感染(Emerging Infections)(BEI)研究资源库获得了样品，他们提供了SARS-CoV-2的基因组RNA、合成RNA或SARS-CoV-2的区域，其可用于测试特异性探针或如果它们属于不含所选探针的区域则作为阴性对照。

从每个样品中提取RNA和DNA。分离RNA用于逆转录和cDNA合成，然后将DNA和RNA级分组合(各50ng)并扩增。这被用于生成增加的病毒序列池。核酸被用Cy5和Cy3荧光标签标记。也标记了人类基因组DNA，以便它们都能被混合并杂交到含有SARS-CoV-2特异性探针的阵列中。样品杂交12小时，洗涤，扫描，然后转移到信息学管线用于提取数据和分析，以鉴定SARS-CoV-2探针。

这种检测SARS-CoV2冠状病毒的快速测试显示了高灵敏度和准确性。

例3：免疫组ChIP

在生物信息学上工程化了超过1720个免疫标志物的探针，以涵盖对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的所有先天和适应性应答(表1；SEQ ID NO:38-4671)。所生成的独特探针提供了对SARS-CoV-2的免疫应答的快照，这将允许对可能有更大风险疾病严重性发展的患者进行分层。这些探针可与PathoChip(免疫组ChIP或ImmunoChIP)结合使用，这提供同时涵盖所有已知呼吸道病原体的测试，包括来自蝙蝠和其他哺乳动物的其他冠状病毒，提供SARS-CoV-2以及其他呼吸道病原体和与Covid-19疾病相关的细胞因子的准确和有效的检测。这种测试的益处包括：如果在试验筛选中一个探针失败，使用整个基因组的多个探针避免阴性结果的灵敏度和准确性。整体筛选可用于研究实验室环境，也可用于临床实验室。

免疫组ChIP从每个独特的抗原中确定独特的特征应答，提供了基于由于免疫应答和同时感染的疾病严重程度对患者进行分层的能力。

其他实施方式

本文对变量的任何定义中所列元件的叙述包括该变量的定义作为任何单一元件或所列元件的组合(或亚组合)。本文对实施方式的叙述包括实施方式作为任何单一实施方式或与任何其他实施方式或其部分的组合。

本文引用的每个和每项专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用以其全部并入本文。虽然本发明已经参照具体实施方式进行了公开，但显然，本发明的其他实施方式和变化可以由本领域的其他技术人员设计，而不偏离本发明的真正精神和范围。所附的权利要求旨在解释为包括所有这些实施方式和同等的变化。

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Claims (29)

1.一种包括PathoChip v5的组合物，其中所述PathoChip v5包括超过60,000个特异于多种微生物的探针，以及多个特异于冠状病毒的探针。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中冠状病毒探针包括至少一个选自SEQ ID NO:1-37的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述冠状病毒探针由SEQ ID NO:1-37中叙述的核苷酸序列组成。

4.一种包含PathoChip的组合物，所述PathoChip包括多个特异于多种呼吸道病原体的探针、多个特异于冠状病毒的探针和多个特异于对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的先天和适应性应答的免疫标志物的探针。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多个特异于先天和适应性应答的免疫标志物探针包括至少一个选自SEQ ID NO:38-4,671的核苷酸序列。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多个特异于先天和适应性应答的免疫标志物的探针由SEQ ID NO:38-4,671中叙述的核苷酸序列组成。

7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述冠状病毒探针包括至少一个选自SEQ IDNO:1-37的核苷酸序列。

8.根据权利要求4所述的组合物，其中所述冠状病毒探针由SEQ ID NO:1-37中叙述的核苷酸序列组成。

9.一种包含多个核酸的组合物，其中所述核酸包括至少一个选自SEQ ID NO:1-37的核苷酸序列。

10.一种包含多个核酸的组合物，其中所述核酸由SEQ ID NO:1-37中叙述的核苷酸序列组成。

11.一种包含多个核酸的组合物，其中所述核酸包括至少一个选自SEQ ID NO:38-4,671的核苷酸序列。

12.一种包含多个核酸的组合物，其中所述核酸由SEQ ID NO:38-4,671中叙述的核苷酸序列组成。

13.根据权利要求9-12中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括微阵列。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述微阵列包括生物芯片、载玻片、珠或纸。

15.一种包含免疫组ChIP的组合物，其中所述免疫组ChIP包括多个特异于对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的先天和适应性应答的免疫标志物的探针。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述多个探针包括至少一个选自SEQ ID NO:38-4,671的核苷酸序列。

17.根据权利要求12所述的组合物，其中所述多个探针由SEQ ID NO:38-4,671中叙述的核苷酸序列组成。

18.一种在来自受试者的样品中检测冠状病毒的方法，所述方法包括：

将来自所述样品的可检测地标记的核酸与PathoChip v5阵列杂交，其中所述PathoChip v5包括超过60,000个特异于多种微生物的探针，以及多个特异于冠状病毒的探针，

其中当来自所述样品的核酸与所述PathoChip v5上的至少三个冠状病毒探针杂交时，在所述样品中检测到冠状病毒。

19.一种鉴定高风险受试者的方法，所述方法包括：

将来自所述受试者的样品的可检测地标记的核酸与PathoChip v5阵列杂交，其中所述PathoChip v5包括超过60,000个特异于多种微生物的探针，以及多个特异于冠状病毒的探针，

其中当来自所述样品的核酸与所述PathoChip v5上的至少三个冠状病毒探针和至少三个特异于微生物的探针杂交时，所述受试者被鉴定为高风险。

20.一种检测来自受试者的样品中冠状病毒的方法，所述方法包括：

将来自所述样品的可检测地标记的核酸与PathoChip阵列杂交，其中所述PathoChip包括多个特异于多种呼吸道病原体的探针，多个特异于冠状病毒的探针，以及多个特异于对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的先天和适应性应答的免疫标志物的探针，

其中当来自所述样品的核酸与所述PathoChip上的至少三个冠状病毒探针杂交时，在所述样品中检测到冠状病毒。

21.一种鉴定高风险受试者的方法，所述方法包括：

将来自所述受试者的样品的可检测地标记的核酸与PathoChip阵列杂交，其中所述PathoChip包括多个特异于多种呼吸道病原体的探针，多个特异于冠状病毒的探针，以及多个特异于对感染、炎症、免疫紊乱、代谢和毒理学应答的先天和适应性应答的免疫标志物的探针，

其中当来自所述样品的核酸与所述PathoChip上至少三个冠状病毒探针和至少三个特异于先天和适应性应答的免疫标志物的探针杂交时，所述受试者被鉴定为高风险。

22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒探针包括至少一个选自SEQ ID NO:1-37的核苷酸序列。

23.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒探针由SEQ ID NO:1-37中叙述的核苷酸序列组成。

24.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，进一步包括其中当在来自所述受试者的样品中检测到冠状病毒或所述受试者被鉴定为高风险时，则对所述受试者施用冠状病毒的治疗。

25.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述特异于先天和适应性应答的免疫标志物的多个探针包括选自SEQ ID NO:38-4,671的至少一个核苷酸序列。

26.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述多个特异于先天和适应性应答的免疫标志物的探针由SEQ ID NO:38-4,671中叙述的核苷酸序列组成。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可检测地标记的核酸用荧光团、放射性磷酸盐、生物素或酶标记。

29.根据权利要求25所述的方法，其中所述荧光团是Cy3或Cy5。

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