JPH08163999A

JPH08163999A - サイトメガロウイルス増幅・検出用オリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JPH08163999A
Application number: JP6312029A
Authority: JP
Inventors: Koichi Yamanishi; 弘一山西; Motohiro Kondo; 元宏近藤; Toshiya Aono; 利哉青野; Misao Yoshimoto; 操吉本
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1994-12-15
Filing date: 1994-12-15
Publication date: 1996-06-25

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】直接的で簡便、迅速かつ確実なサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）遺伝子を増幅または検出できる新規
なオリゴヌクレオチドを提供する。【構成】配列表・配列番号１〜６に示される核酸配列
または該配列に相補的な核酸配列を有するオリゴヌクレ
オチドであるＣＭＶ増幅用オリゴヌクレオチド及び前記
オリゴヌクレオチドを使用するＣＭＶ検出用修飾オリゴ
ヌクレオチド及びこれらのオリゴヌクレオチドと修飾オ
リゴヌクレオチドを用いたＣＭＶの検出方法とその検出
用試薬キット。配列番号：１ GCGTGCCGTT GTCAATCAGG 20 配列番号：２ TGGCCAGGTA GCTGAACATT 20 配列番号：３ TTCCAAGACG TGCGCTACAT 20 配列番号：４ TGTCTCTACA CCGTGTTCGT 20 配列番号：５ CAGGAGTGTG GTGTGATAGA TTA 23 配列番号：６ AGTATCAGCG AGCTGCGGAT GAC 23 【効果】各種ヘルペスウイルス培養上清から、ＣＭＶ
の遺伝子を増幅でき、また特異的に該遺伝子を検出で
き、ＣＭＶによる疾患の診断が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はサイトメガロウイルス
（以下、ＣＭＶと略する）を簡便かつ迅速に検出するた
めのオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして使用するＣＭＶ増幅法および該オリゴヌク
レオチドをプローブとして使用するＣＭＶ検出法および
それらの試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＣＭＶはヘルペス科に属するウイルスで
あり、宿主細胞、増殖サイクルおよび潜伏様式からβヘ
ルペスウイルスに属している。ＣＭＶは初感染後に生体
内に終生にわたり潜伏感染し、宿主の生理的変化によっ
て潜伏感染状態から活性化して感染ウイルスとなって、
回帰発症を繰り返すのが特徴である。ＣＭＶの場合、成
人の初感染はサイトメガロウイルス単核球症であり、妊
娠初期に妊婦が初感染すると、胎児は肝臓・脾臓の腫
脹、黄疸、血小板減少性紫班病または小頭症などで死産
となることが多い。生き残っても知能傷害、難聴または
小頭症が認められ、腎臓、肺、肝臓などの上皮細胞に核
内封入体を有する巨細胞があり、先天性巨細胞封入体症
といわれている。また、癌患者、エイズ患者または将来
増加すると見込まれている臓器移植患者にあっては、免
疫不全状態が、ＣＭＶの再燃の起因となり、間質性肺
炎、肝炎、網膜炎、脳炎または腎炎などが発症して重篤
になる。

【０００３】このように、ＣＭＶの感染や回帰発症は現
代病として大きな問題であり、早期診断法の確立が早期
治療のために重要である。従来、ＣＭＶ感染の診断法と
しては、患者からＣＭＶを分離するウイルス分離法があ
るが、数週間の期間を要して迅速性に欠ける。また、患
者血清中に抗ＣＭＶ抗体を検出する血清診断法では、抗
体非特異反応が起きたり、高感度が得られないという問
題がある他、抗体価が変化するためにウイルスの消長を
追跡するのが難しいという欠点があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ＣＭＶは初期感染時や
免疫不全状態時に重篤な症状を招くため、迅速な診断方
法が必要であるにもかかわらず、従来の診断法は迅速性
・高感度の点で問題がある。したがって、ＣＭＶによる
疾病の診断に関して、短時間で正確にＣＭＶを検出でき
る手法および体外診断薬の開発が望まれていた。本発明
の目的は簡便、迅速、特異的且つ高感度にＣＭＶを検出
可能なオリゴヌクレオチドを提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、配列
表・配列番号１〜６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシ
ン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位
置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されてもよい）に示され
る核酸配列もしくは該配列に相補的な核酸配列を有する
オリゴヌクレオドであることを特徴とするＣＭＶ増幅用
オリゴヌクレオチドである。（クレーム１）

【０００６】また本発明は、配列表・配列番号１〜６
（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、
Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル
（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸配列もしく
は該配列に相補的な核酸配列を有するオリゴヌクレオド
であることを特徴とするＣＭＶ検出用オリゴヌクレオチ
ドである。（クレーム２）

【０００７】さらに本発明は、配列表・配列番号１〜６
（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、
Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル
（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸配列もしく
は該配列に相補的な核酸配列を有するオリゴヌクレオド
が、修飾物により修飾されたオリゴヌクレオチドである
ことを特徴とするＣＭＶ増幅用修飾オリゴヌクレオチド
である。（クレーム３）

【０００８】本発明は、配列表・配列番号１〜６（但
し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔは
チミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）
と置換されてもよい）に示される核酸配列もしくは該配
列に相補的な核酸配列を有するオリゴヌクレオドが、修
飾物により修飾されたオリゴヌクレオチドであることを
特徴とするＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチドであ
る。（クレーム５）

【０００９】また本発明は、配列表・配列番号１〜６
（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、
Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル
（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸配列もしく
は該配列に相補的な核酸配列を有し、修飾物により修飾
されたＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチドをプローブ
として、試料中の核酸に交雑させ、交雑した結合体の修
飾物を測定することを特徴とする試料中のＣＭＶの検出
方法である。（クレーム７）

【００１０】本発明の実施態様は、配列表・配列番号１
〜６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニ
ン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシ
ル（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸配列もし
くは該配列に相補的な核酸配列を有するＣＭＶ検出用オ
リゴヌクレオチドを固相担体に結合し、試料中の核酸と
交雑させ、固定化された試料中の核酸を配列表・配列番
号１〜６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグ
アニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウ
ラシル（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸配列
もしくは該配列に相補的な核酸配列を有するオリゴヌク
レオドが、修飾物により修飾されたＣＭＶ検出用修飾オ
リゴヌクレオチドと交雑させ、交雑した結合体の修飾物
を測定することを特徴とする試料中のＣＭＶの検出方法
である。（クレーム８）

【００１１】また本発明の別な実施態様は、配列表・配
列番号１〜６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇ
はグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴ
はウラシル（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸
配列もしくは該配列に相補的な核酸配列を有するオリゴ
ヌクレオドが、修飾物により修飾されたＣＭＶ検出用修
飾オリゴヌクレオチドを第１の修飾物の性質を利用して
固相担体に結合し、試料中の核酸と交雑させ、固定化さ
れた試料中の核酸を配列表・配列番号１〜６（但し、Ａ
はアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン
を表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換
されてもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相
補的な核酸配列を有するオリゴヌクレオドが、修飾物に
より修飾された第２のＣＭＶ検出用修飾オリゴヌと交雑
させ、交雑した結合体の第２の修飾物を測定することを
特徴とする試料中のＣＭＶの検出方法。（クレーム９）

【００１２】さらに本発明の実施態様は、配列表・配列
番号１〜６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇは
グアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴは
ウラシル（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸配
列もしくは該配列に相補的な核酸配列を有するＣＭＶ増
幅用オリゴヌクレオチドをプライマーとして、試料中の
核酸を増幅させ、得られた増幅産物に配列表・配列番号
１〜６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグア
ニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラ
シル（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸配列も
しくは該配列に相補的な核酸配列を有し、修飾物により
修飾されたＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして交雑させ、交雑した結合体の修飾物を測定す
ることを特徴とする試料中のＣＭＶの検出方法である。
（クレーム１１）

【００１３】また別な本発明は、配列表・配列番号１〜
６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニ
ン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシ
ル（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸配列もし
くは該配列に相補的な核酸配列を有し、修飾物により修
飾されたＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチドを含有す
ることを特徴とするＣＭＶ検出用試薬キットである。
（クレーム１２）

【００１４】本発明の実施態様は、配列表・配列番号１
〜６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニ
ン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシ
ル（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸配列もし
くは該配列に相補的な核酸配列を有するＣＭＶ増幅用オ
リゴヌクレオチドおよび配列表・配列番号１〜６（但
し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔは
チミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）
と置換されてもよい）に示される核酸配列もしくは該配
列に相補的な核酸配列を有し、修飾物により修飾された
ＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチドを含有することを
特徴とするＣＭＶ増幅・検出用試薬キットである。（ク
レーム１３）

【００１５】本発明の別な実施態様は、配列表・配列番
号１〜６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグ
アニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウ
ラシル（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸配列
もしくは該配列に相補的な核酸配列を有するＣＭＶ増幅
用オリゴヌクレオチドおよび配列表・配列番号１〜６
（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、
Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル
（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸配列もしく
は該配列に相補的な核酸配列を有し、修飾物により修飾
されたＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチド、核酸合成
酵素、ｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰおよび緩衝液を
含有することを特徴とする試料中のサイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）増幅・検出用試薬キットである。（クレー
ム１４）

【００１６】以下に、本発明に使用される用語を説明す
る。「修飾」とはオリゴヌクレオチドの配列部分に他の
ヌクレオチドを付加または置換することを意味する。付
加とはビオチン、リンカーアーム、蛍光物質等を有する
ヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配列の５’末端また
は３’末端に結合することである。またＲＮＡポリメラ
ーゼ用のプロモーター配列等をオリゴヌクレオチド配列
の５’末端または３’末端に結合することも含む。置換
とはビオチン、リンカーアーム、蛍光物質等を有するヌ
クレオチドをオリゴヌクレオチド配列中のヌクレオチド
の代わりに導入することである。また、放射性物質や酵
素、蛍光物質など公知のオリゴヌクレオチドの標識物を
導入することも含まれる。また、放射性物質や酵素、蛍
光物質などの公知の標識物を導入する方法も含まれる。

【００１７】「第１の修飾物で修飾されたＣＭＶ検出用
修飾オリゴヌクレオチド」とはＣＭＶ検出用オリゴヌク
レオチドの固相担体への固定を容易にするための修飾を
施されたＣＭＶ検出用オリゴヌクレオチドである。第１
の修飾物としては、好ましくはリンカーアーム、ビオチ
ンなどが挙げられる。

【００１８】「第２の修飾物で修飾されたＣＭＶ検出用
修飾オリゴヌクレオチド」とは検出を容易にするための
修飾物であるラジオアイソトープ、蛍光物質、酵素等で
修飾されたＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチドを用い
ればよい。第２の修飾物としては、好ましくはラジオア
イソトープ、蛍光物質、酵素等が挙げられる。

【００１９】「試料」とは全ての核酸含有物のことを意
味する。臨床検体やウイルス感染細胞培養物なども試料
に含まれる。場合によっては、交雑、検出、固定などを
しやすくするための処理、例えば蛋白分解酵素処理、フ
ェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿等を行
い、混入タンパク質を分解除去したものでよい。また、
ここで使用される試料は、検出感度を上げるために、Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより増幅させる方法（特開昭61-274
697 号公報、以下、「ＰＣＲ法」と略す）やＲＮＡポリ
メラーゼにより増幅させる方法（特開平2-5864号公報、
特開平4-501057号公報など、以下「ＮＡＳＢＡ法」と略
す）を用いて、遺伝子増幅したものであってもよい。

【００２０】本発明のオリゴヌクレオチドとは、配列表
・配列番号１〜６に示される核酸配列もしくは該配列に
相補的な核酸配列を含有する。オリゴヌレオチドの数は
約１５塩基〜３０塩基であることが好ましい。該オリゴ
ヌクレオチドは通常、化学合成により調製できる。本発
明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）
でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸の場合はチ
ミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読み替えるこ
とは言うまでもない。また合成に際して任意の位置のＴ
をＵに変えて合成を行ない、ウリジン残基を含むＤＮＡ
であってもよい。同様に任意の位置のＵをＴに変えたチ
ミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。またオリゴヌ
クレオチド中に欠失、挿入あるいは置換といった点突然
変異や、修飾ヌクレオチドがあってもよい。本発明のオ
リゴヌクレオチドは合成物であるから、クローン化した
オリゴヌクレオチドに比べ、容易、大量且つ安価に一定
品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能である。

【００２１】本発明のＣＭＶ増幅用オリゴヌクレオチド
とは、上記配列表・配列番号１〜６に示される核酸配列
もしくは該配列に相補的な核酸配列を有する。また本発
明のＣＭＶ増幅用修飾オリゴヌクレオチドとは、上記配
列表・配列番号１〜６に示される核酸配列もしくは該配
列に相補的な核酸配列が修飾物で修飾されたものであ
る。

【００２２】本発明のＣＭＶ検出用オリゴヌクレオチド
とは、上記配列表・配列番号１〜６に示される核酸配列
もしくは該配列に相補的な核酸配列を有する。また本発
明のＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチドとは、上記配
列表・配列番号１〜６に示される核酸配列もしくは該配
列に相補的な核酸配列が修飾物で修飾されたものであ
る。

【００２３】修飾物としては、ラジオアイソトープ、蛍
光物質、酵素、リンカーアームを有するヌクレオチド、
ビオチンまたはＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
などが挙げられる。修飾物のうち、ラジオアイソトー
プ、蛍光物質、酵素などは標識として直接的に測定が可
能である。リンカーアームを有するヌクレオチド、ビオ
チンなどは捕捉物質として利用される。またＲＮＡポリ
メラーゼのプロモーター配列などは、増幅手段のひとつ
として利用される。

【００２４】例えばオリゴヌクレオチドを酵素標識する
場合、特開昭60-500717 号公報に開示された合成法によ
りリンカーアームを有するヌクレオチドをデオキシウリ
ジンから化学合成し、オリゴヌクレオチド配列の一員と
して、該ヌクレオチドを置換または付加後、文献 (Nucl
eic Acids Research; 14巻6115頁1986年）に従って、得
られたオリゴヌクレオチドを酵素標識すればよい。

【００２５】本発明ではＣＭＶ増幅用オリゴヌクレオチ
ドを用いて検出感度を向上のため、ＣＭＶ遺伝子の増幅
が可能である。増幅法は特に限定されない。増幅法を実
施するには、まず、増幅対象である試料（臨床検体や、
ウイルス感染細胞培養物など）から、核酸を抽出する。
抽出方法については一般的な方法を用いればよく、例え
ば蛋白分解酵素処理、フェノール・クロロホルム処理、
エタノール沈澱等を行えば良い。続いて、本発明のＣＭ
Ｖ増幅用オリゴヌクレオチドをプライマーとして、試料
中の核酸を増幅させる。代表的な増幅法にひとつである
ＰＣＲ法では、試料中の核酸（ＤＮＡ）を一本鎖ＤＮＡ
として鋳型とし、２種のプライマー（フォワード側プラ
イマー、リバース側プライマー）をアニールさせ、ＤＮ
Ａポリメラーゼによりプライマーの伸長反応を行い、得
られた二本鎖を温度変化により分離し、得られた伸長反
応生成物をさらなる鋳型として、２種のプライマーをア
ニールし、伸長反応、分離反応の各工程を繰り返す。こ
の増幅法の一例としては、配列表・配列番号１または配
列番号２の配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワー
ド側プライマー、配列表・配列番号３または配列番号４
の配列をオリゴヌクレオチドをリバース側プライマーと
して用いれば良い。また、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ法を行
う場合には、例えば配列表・配列番号１と配列番号４を
有する２種のオリゴヌクレオチドでまずＰＣＲ増幅を行
い、続いて配列表・配列番号２と配列番号３を有する２
種のオリゴヌクレオチドで再びＰＣＲ増幅を行えばよ
い。

【００２６】または別なる増幅法であるＮＡＳＢＡ法で
は、試料中の標的核酸配列（ＲＮＡ）に相補的な配列
（配列表・配列番号１〜６に示される核酸配列もしくは
それらの相補的な核酸配列）およびその５’末端側にＲ
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第１プラ
イマーを試料中の標的核酸（ＲＮＡ）にハイブリダイズ
させ、逆転写酵素によりＤＮＡを合成し（工程１）、Ｒ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみをリボヌクレア
ーゼＨにより分離して一本鎖ＤＮＡ（第２鋳型）を得
（工程２）、次いで該一本鎖ＤＮＡ（第２鋳型）に標的
核酸配列（ＤＮＡ）に相補的な配列（配列表・配列番号
１〜６に示される核酸配列もしくはそれらの相補的な核
酸配列）を有する第２プライマーをハイブリダイズさ
せ、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応を行い、二本鎖
ＤＮＡを得る（工程３）。次いでプロモーター配列を認
識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡのコピー
（第３鋳型）を多数合成する（工程４）。得られたＲＮ
Ａ（第３鋳型）を鋳型とし、逆転写酵素を使用した第２
プライマーによるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの合成
（工程５）、リボヌクレアーゼＨによるＲＮＡのみを分
離する一本鎖ＤＮＡ（第４鋳型）の合成（工程６）、得
られた一本鎖ＤＮＡ（第４鋳型）を鋳型として、ＤＮＡ
ポリメラーゼを使用した第１プライマーによる二本鎖Ｄ
ＮＡの合成（工程７）、ＲＮＡポリメラーゼを使用した
該二本鎖ＤＮＡからＲＮＡの多数コピー（第３鋳型）の
合成（工程８）を行う。これらの工程（工程５〜８）を
繰り返すことにより、試料中の核酸を増幅させることが
できる。

【００２７】または別なＮＡＳＢＡ法では、試料中の標
的核酸配列（ＤＮＡ）に相補的な配列（配列表・配列番
号１〜６に示される核酸配列もしくはそれらの相補的な
核酸配列）およびその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列を有する第１プライマーを試料中の
標的核酸（ＤＮＡ）にハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリ
メラーゼにより伸長させて二本鎖ＤＮＡを合成し（工程
１）、二本鎖ＤＮＡを分離して一本鎖ＤＮＡ（第２鋳
型）を得（工程２）、次いで該一本鎖ＤＮＡ（第２鋳
型）に標的核酸配列（ＤＮＡ）に相補的な配列（配列表
・配列番号１〜６に示される核酸配列もしくはそれらの
相補的な核酸配列）を有する第２プライマーをハイブリ
ダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応を行
い、二本鎖ＤＮＡを得る（工程３）。次いでプロモータ
ー配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ
のコピー（第３鋳型）を多数合成する（工程４）。得ら
れたＲＮＡ（第３鋳型）を鋳型とし、逆転写酵素を使用
した第２プライマーによるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
の合成（工程５）、リボヌクレアーゼＨによりＲＮＡの
みを分離する一本鎖ＤＮＡ（第４鋳型）の合成（工程
６）、得られた一本鎖ＤＮＡ（第４鋳型）を鋳型とし
て、ＤＮＡポリメラーゼを使用した第１プライマーによ
る二本鎖ＤＮＡの合成（工程７）、ＲＮＡポリメラーゼ
を使用した該二本鎖ＤＮＡからＲＮＡの多数コピー（第
３鋳型）の合成（工程８）を行う。これらの工程（工程
５〜８）を繰り返すことにより、試料中の核酸を増幅さ
せることができる。本発明の増幅法は上記方法に限られ
ない。

【００２８】本発明では、本発明のＣＭＶ検出用オリゴ
ヌクレオチドまたはＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチ
ドを用いて、試料中のＣＭＶ遺伝子の検出が可能であ
る。本発明のＣＭＶ検出用オリゴヌクレオチドとは、配
列表・配列番号１〜６に示される核酸配列もしくは該核
酸配列に相補的な核酸配列を有するオリゴヌクレオチド
である。またＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチドと
は、配列表・配列番号１〜６に示される核酸配列もしく
は該核酸配列に相補的な核酸配列を有するオリゴヌクレ
オチドが、修飾物により修飾されたオリゴヌクレオチド
である。修飾物としては、ラジオアイソトープ、蛍光物
質、酵素等の標識物、ビオチンなどの標識物質と結合し
得る化合物である。修飾物の修飾法は特に限定されな
い。本発明では、例えば、配列表・配列番号５または配
列番号６の配列もしくは該配列に相補的な核酸配列をＣ
ＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチドとして用いることに
より、ＣＭＶ遺伝子を検出することができる。

【００２９】本発明の試料中のＣＭＶの検出法は、具体
的にはＣＭＶ遺伝子もしくはＣＭＶ遺伝子からの増幅産
物をアガロースゲル電気泳動後、サザンブロット法によ
り、膜に固定し、本発明のＣＭＶ検出用修飾オリゴヌク
レオチドとハイブリダイゼーションを行い、修飾物の性
質に応じた既知の検出操作を行えば良い。また、増幅産
物を膜上にそのまま固定し、アルカリ変性後、上記の方
法で検出操作を行っても良い。修飾物の性質に応じた既
知の検出操作とは、ラジオアイソトープの場合にはオー
トラジオグラフィー、蛍光物質の場合には、蛍光光度計
等を用いて蛍光強度を測定する操作を意味する。酵素が
アルカリホスファターゼの場合には、例えば基質とし
て、3-(2'-スピロアダマンタン)-4-メトキシ-(3-ホスホ
リルオキシ) フェニル 1,2- ジオキセタン(AMPPD) 等を
用いて化学発光させるか、あるいは5-ブロモ-4- クロロ
-3- インドリルホスフェート(BCIP)とニトロブル- テト
ラゾリウムクロリド(NBT) 等を用いて化学発色させ、そ
の強度を測定する。ビオチンの場合には、例えばアビジ
ンと反応させ、次いでビオチン標識したアルカリホスフ
ァターゼと反応させ、上記アルカリホスファターゼをそ
の基質を用いて、化学発光あるいは化学発色させ、その
強度を測定する。

【００３０】また、別の検出法として、液相でラジオア
イソトープ、蛍光物質、酵素等の標識で修飾したＣＭＶ
検出用修飾オリゴヌクレオチドと捕捉可能な化合物で修
飾した捕捉用修飾オリゴヌクレオチドを反応させた後、
担体に結合した捕捉剤で、該捕捉用修飾オリゴヌクレオ
チドを捕捉する液相サンドイッチ法（特開昭61-195699
号公報、同61-274699 号公報、同62-229068 号公報、特
開平1-104200号公報、同1-501399号公報等）がある。

【００３１】また担体に直接結合した捕捉用オリゴヌク
レオチドとラジオアイソトープ、蛍光物質、酵素等の標
識で修飾したＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチドを用
いる固相サンドイッチ法（特開昭60-188100 号公報、同
60-188397 号公報、同61-264240 号公報、同62-81564号
公報等）などがある。

【００３２】これらの方法としては、例えば、配列表・
配列番号５を示す核酸配列または該配列に相補的な核酸
配列を有するオリゴヌクレオチドにラジオアイソトー
プ、蛍光物質、酵素等で修飾したＣＭＶ検出用修飾オリ
ゴヌクレオチドと、配列表・配列番号６または該配列に
相補的な核酸配列を有するオリゴヌクレオチドにビオチ
ン、リンカーアーム等で修飾した捕捉用修飾オリゴヌク
レオチドを用いれば良い。

【００３３】また、ＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチ
ドの配列として、配列表・配列番号６に示される核酸配
列または該配列に相補的な核酸配列を、捕捉用修飾オリ
ゴヌクレオチドの配列として、配列表・配列番号５の配
列または該配列に相補的な核酸配列を用いても良い。

【００３４】本発明のＣＭＶ試薬キットは、配列表・配
列番号１〜６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇ
はグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴ
はウラシル（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸
配列もしくは該配列に相補的な核酸配列を有し、修飾物
により修飾されたＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチド
を含有する。

【００３５】一実施態様では、配列表・配列番号１〜６
（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、
Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル
（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸配列もしく
は該配列に相補的な核酸配列を有するＣＭＶ増幅用オリ
ゴヌクレオチドおよび配列表・配列番号１〜６（但し、
Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミ
ンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置
換されてもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に
相補的な核酸配列を有し、修飾物により修飾されたＣＭ
Ｖ検出用修飾オリゴヌクレオチドを含有する。

【００３６】別な実施態様では、配列表・配列番号１〜
６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニ
ン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシ
ル（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核酸配列もし
くは該配列に相補的な核酸配列を有するＣＭＶ増幅用オ
リゴヌクレオチドおよび配列表・配列番号１〜６（但
し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔは
チミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）
と置換されてもよい）に示される核酸配列もしくは該配
列に相補的な核酸配列を有し、修飾物により修飾された
ＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチド、核酸合成酵素、
ｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰおよび緩衝液を含有す
る。

【００３７】修飾物は、ラジオアイソトープ、蛍光物
質、酵素、リンカーアームを有するヌクレオチド、ビオ
チン、またはＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列で
ある。核酸合成酵素としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ま
たは逆転写酵素、リボヌクレアーゼＨ、ＤＮＡポリメラ
ーゼおよびＲＮＡポリメラーゼの組み合わせが例示され
る。これらの核酸合成酵素は耐熱性酵素であることが望
ましい。ｄＮＴＰとは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰを意味する。またｄＴＴＰの代わりにｄＵ
ＴＰが含まれることがある。ｒＮＴＰとは、ｒＡＴＰ、
ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＵＴＰを意味する。またｒＧＴ
Ｐの代わりにｒＩＴＰが含まれることがある。緩衝液と
しては、従来から知られたものを使用できる。

【００３８】

【実施例】以下に、本発明を実施例と比較例により詳細
に説明する。比較例１特開平3-65200 号公報に記載のプライマーを用いて、試
料中のＣＭＶの検出を行った。（１）ＣＭＶ増幅用オリゴヌクレオチドの合成ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列（配列表に記載なし）:TTG CAG
GCC ACG AAC AAC GT 及び配列（配列表に記載なし）:G
TC TAC GGA TTG CTG ACG CTを有するオリゴヌクレオチ
ドを合成した。それぞれ、比較プライマー１、２と呼
ぶ。合成手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、各種オリゴ
ヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃一夜実施
した。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換
カラムにて実施した。

【００３９】（２）検体の調製ＣＭＶ培養上清に、５倍量の5x Protainase K buffer
（50 mM Tris-HCl (pH7.5), 50 mM EDTA, 750 mM NaCl,
2% SDS, 0.5mg/ml proteinaseK)を添加し、混合後、65
℃で一晩放置した。フェノール・クロロホルム液で夾雑
タンパク質を除去し、エタノール沈澱後、TE緩衝液に再
溶解した。

【００４０】（３）ＰＣＲ法反応液組成は、比較プライマー１を１μＭ、比較プライ
マー２を１μＭ、 10mM Tris-HCl (pH8.9), 1.5mM MgCl
₂, 80mM KCl, 500μg/ml BSA, 0.1%コール酸ナトリウ
ム, 0.1% TritonX-100, それぞれ0.2mM のdATP, dCTP,
dGTP, dTTPおよびTth DNA ポリメラーゼ（東洋紡製）40
単位/ml、ＣＭＶ遺伝子抽出産物の段階希釈液１μｌで
あった。反応条件は次の通りであり、３０回繰り返し
た。熱変性：９４℃、１分アニーリング：５５℃、２分重合反応：７５℃、１．５分これらの操作はパーキン−エルマー／シータス(Perkin-
Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサイクラーを用いて行
った。

【００４１】（４）電気泳動による核酸増幅の確認ＰＣＲ法により得られた各種ウイルスゲノムからの増幅
産物を、２％アガロースゲルを用いて電気泳動後、エチ
ジウムブロマイドで染色し、核酸増幅の様子を確認し
た。（５）結果電気泳動の結果を図１に示す。この結果から特開平3-65
200 号公報に記載のプライマーの検出限界は、１０^-3希
釈までであった。

【００４２】実施例１（１）ＣＭＶ増幅用オリゴヌクレオチドの合成ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて、配列表・配列番号１〜４に示され
る配列を有する４種のオリゴヌクレオチド１〜４を合成
した。それぞれプライマー１〜４と呼ぶ。合成手法はＡ
ＢＩ社マニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱
保護はアンモニア水で５５℃一夜実施した。精製はファ
ルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムにて実施し
た。

【００４３】（２）ＰＣＲ法反応液組成は、プライマー１またはプライマー２を１μ
Ｍ、プライマー３またはプライマー４を１μＭ、 10mM
Tris-HCl(pH8.9), 1.5mM MgCl₂, 80mM KCl, 500μg/ml
BSA, 0.1%コール酸ナトリウム, 0.1% TritonX-100, そ
れぞれ0.2mM のdATP, dCTP, dGTP, dTTPおよびTth DNA
ポリメラーゼ（東洋紡製）40単位/ml 、ＣＭＶ遺伝子抽
出産物の段階希釈液１μｌ（比較例１で調製済み）であ
った。反応条件は次の通りであり、３０回繰り返した。熱変性：９４℃、１分アニーリング：５５℃、２分重合反応：７５℃、１．５分これらの操作はパーキン−エルマー／シータス(Perkin-
Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサイクラーを用いて行
った。

【００４４】（３）電気泳動による増幅の確認ＰＣＲ法により得られた各種ウイルスゲノムからの増幅
産物を、２％アガロースゲルを用いて電気泳動後、エチ
ジウムブロマイドで染色し増幅の様子を確認した。（４）結果電気泳動の結果を図２のＢ１〜Ｂ４に示す。これらの結
果から本発明のプライマーの検出限界は１０^-4希釈まで
であった。従って、比較例１よりも１桁検出感度が良か
った。

【００４５】実施例２増幅用オリゴヌクレオチドの特異性の検討（１）検体の調製各種ヘルペスウイルス（HSV-1 、HSV-2 、VZV 、EBV 、
CMV 、HHV-6A、HHV-6B、HHV-7 ）培養上清に、５倍量の
5x Protainase K buffer（50 mM Tris-HCl (pH7.5), 50
mM EDTA, 750 mM NaCl, 2% SDS, 0.5mg/ml proteinase
K)を添加し、混合後、65℃で一晩放置した。フェノール
・クロロホルム液で夾雑タンパク質を除去し、エタノー
ル沈澱後、TE緩衝液に再溶解した。

【００４６】（２）ＰＣＲ法反応液組成は、実施例１で合成したプライマー１または
プライマー２を１μＭ、プライマー３またはプライマー
４を１μＭ、 10mM Tris-HCl(pH8.9), 1.5mM MgCl₂, 80
mM KCl, 500μg/ml BSA, 0.1%コール酸ナトリウム, 0.
1% TritonX-100, それぞれ0.2mM のdATP, dCTP, dGTP,
dTTPおよびTth DNA ポリメラーゼ（東洋紡製）40単位/m
l 、各種ヘルペス遺伝子抽出産物の希釈液１μｌ（比較
例で調製済み）であった。反応条件は次の通りであり、
３０回繰り返した。熱変性：９４℃、１分アニーリング：５５℃、２分重合反応：７５℃、１．５分これらの操作はパーキン−エルマー／シータス(Perkin-
Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサイクラーを用いて行
った。

【００４７】（３）結果プライマー１またはプライマー２をフォワード側プライ
マー、プライマー３またはプライマー４をリバース側プ
ライマーとして、合計４種類の組み合わせで、ＰＣＲ増
幅を行った。得られた増幅産物の電気泳動結果を図３に
示す。その結果から、４種類の組み合わせのうち、いか
なるプライマーペアを用いても、ＣＭＶの遺伝子のみが
増幅された。

【００４８】実施例３修飾オリゴヌクレオチドを用いたＣＭＶの検出（１）ＣＭＶ遺伝子を検出するためのＣＭＶ検出用修飾
オリゴヌクレオチドの合成ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表・配列番号５の配列、配列表
・配列番号６の配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチ
ド（以下、それぞれプローブ１、プローブ２と呼ぶ）と
該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以
下、それぞれプローブ１Ｒ、プローブ２Ｒと呼ぶ）を合
成した。この際、特表昭60-500717 号公報に記載された
合成法により、デオキシウリジンから化学合成により調
製した５位にリンカーアームを有するウリジンを５’末
端へ導入した。合成された各プローブはアンモニア水で
５０℃、一夜脱保護処理を施した後、ファルマシア社製
ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを用いて精製した。

【００４９】（２）アルカリ性ホスファターゼによる標
識上記各プローブと、そのリンカーアームを介してのアル
カリ性ホスファターゼとの結合を、文献 (Nucleic Acid
s Research; 14巻6115頁1986年）に従って行なった。す
なわちプローブ 1.5 A₂₆₀を 0.2M NaHCO₃ 12.5 μｌに
溶解し、ここへ10mg/ml スベリン酸ジスクシニミジル
（DSS)25μｌを加えて、室温、２分間反応させた。反応
液を１mM CH₃COONa (pH5.0) で平衡化したSephadex G-2
5(ファマシア社製）カラム(1cmφx30cm)で、ゲル濾過し
て過剰のDSS を除去した。末端のアミノ基が活性化され
た各プローブをモル比で２倍量のアルカリホスファター
ゼ(100mM NaHCO₃, 3MNaCl に溶解したもの）と室温、16
時間反応させてアルカリホスファターゼ標識された各プ
ローブを得た。得られた各酵素標識プローブは、ファル
マシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを用いて精製
した。

【００５０】（３）検体の調製及びＰＣＲ法実施例２の（１）及び（２）と同様にして、検体の調製
およびＰＣＲ法を行った。（４）検出上記実施例２と同様にして調製した各種ヘルペス遺伝子
からの増幅産物をナイロン膜にドロップし、アルカリ条
件で固定した。なお、コントロールとしてヒト胎盤から
の遺伝子１μｇを同様にナイロン膜に固定した。この膜
を中和後、ハイブリダイゼーションバック(BRL社）に該
膜を移し、アルカリホスファターゼ標識された各々のプ
ローブを含むハイブリダイゼーションバッファー(5xSS
C,0.5%ウシ血清アルブミン、0.5% ポリビニールピロリ
ドン、1%ドデシル硫酸ナトリウム）を加えて、ポリシー
ラーでシールし、５０℃１５分間ハイブリダイゼーショ
ンを行なった。

【００５１】ハイブリダイゼーション膜をポリバッグか
ら取り出し、洗浄液１(1xSSC, 1%ドデシル硫酸ナトリウ
ム）で５０℃、１０分間振とう洗浄した。更に洗浄液２
(1xSSC, 0.5%, TritonX-100)で室温、１０分間振とう洗
浄した。最後に洗浄液３(1xSSC）で室温５分間振とう洗
浄した。膜を新しいハイブリダイゼーションバッグに移
し、基質液(0.1M Tris-HCl, 0.1MNaCl, 0.1M MgCl₂, 0.
3mg/ml ニトロテトラゾリウムブルー 0.3mg/ml 、ブロ
ムクロロインドフェリールホスフェート pH7.5）を入
れ、ポリシーラーでシールし、37℃で１時間インキュベ
ートした。

【００５２】（５）結果ドロップブロットの結果を表１に示す。アルカリホスフ
ァターゼにより生じる紫色色素のスポットを目視により
判定した。スポットの確認できたものを陽性とした。合
計４種類の組み合わせでＰＣＲ増幅を行って得られた増
幅産物から、各プローブで検出操作を行ったところ、全
て同様の結果が得られたので、まとめて表１に示した。
各プローブともＣＭＶのみを選択的に検出し、これらの
オリゴヌクレオチド配列が正常に機能していることがわ
かる。陽性は＋、陰性は−と表示した。

【００５３】

【表１】

【００５４】

【発明の効果】本発明では、本発明のＣＭＶ増幅用（修
飾）オリゴヌクレオチドおよび／またはＣＭＶ検出用
（修飾）オリゴヌクレオチドを使用して、試料中のＣＭ
Ｖ遺伝子の存在を直接的で簡便、迅速かつ確実に検出可
能となった。従来の免疫法と比較し、大幅に時間を短縮
することができ、簡便で、且つ再現性のある結果が得ら
れるので、その臨床的意義は大きい。

【００５５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列 GCGTGCCGTT GTCAATCAGG 20

【００５６】配列番号：２配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列 TGGCCAGGTA GCTGAACATT 20

【００５７】配列番号：３配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列 TTCCAAGACG TGCGCTACAT 20

【００５８】配列番号：４配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列 TGTCTCTACA CCGTGTTCGT 20

【００５９】配列番号：５配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列 CAGGAGTGTG GTGTGATAGA TTA 23

【００６０】配列番号：６配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列 AGTATCAGCG AGCTGCGGAT GAC 23

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の比較例１の電気泳動の結果を示す図面
である。

【図２】本発明の実施例１の電気泳動の結果を示す図面
である。

【図３】本発明のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ法
により、得られた各種ウイルスゲノムからの増幅産物を
２％アガロースゲルで電気泳動した後、エチジウムブロ
マイドで染色した図面を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｑ 1/70 9453−4Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相補的
な核酸配列を有するオリゴヌクレオドであることを特徴
とするサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）増幅用オリゴヌ
クレオチド。
【請求項２】配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相補的
な核酸配列を有するオリゴヌクレオドであることを特徴
とするＣＭＶ検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項３】配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相補的
な核酸配列を有するオリゴヌクレオドが、修飾物により
修飾されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする
ＣＭＶ増幅用修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項４】修飾物が、ラジオアイソトープ、蛍光物
質、酵素、リンカーアームを有するヌクレオチド、ビオ
チン、またはＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列で
あることを特徴とする請求項３に記載のＣＭＶ増幅用修
飾オリゴヌクレオチド。
【請求項５】配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相補的
な核酸配列を有するオリゴヌクレオドが、修飾物により
修飾されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする
ＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項６】修飾物が、ラジオアイソトープ、蛍光物
質、酵素、リンカーアームを有するヌクレオチド、ビオ
チン、またはＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列で
あることを特徴とする請求項５に記載のＣＭＶ検出用修
飾オリゴヌクレオチド。
【請求項７】配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相補的
な核酸配列を有し、修飾物により修飾されたＣＭＶ検出
用修飾オリゴヌクレオチドをプローブとして、試料中の
核酸に交雑させ、交雑した結合体の修飾物を測定するこ
とを特徴とする試料中のＣＭＶの検出方法。
【請求項８】配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相補的
な核酸配列を有するＣＭＶ検出用オリゴヌクレオチドを
固相担体に結合し、試料中の核酸と交雑させ、固定化さ
れた試料中の核酸を配列表・配列番号１〜６（但し、Ａ
はアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン
を表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換
されてもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相
補的な核酸配列を有するオリゴヌクレオドが修飾物によ
り修飾されたＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチドと交
雑させ、交雑した結合体の修飾物を測定することを特徴
とする試料中のＣＭＶの検出方法。
【請求項９】配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相補的
な核酸配列を有するオリゴヌクレオドが、修飾物により
修飾されたＣＭＶ検出用修飾オリゴヌクレオチドを第１
の修飾物の性質を利用して固相担体に結合し、試料中の
核酸と交雑させ、固定化された試料中の核酸を配列表・
配列番号１〜６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、
Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置の
Ｔはウラシル（Ｕ）と置換されてもよい）に示される核
酸配列もしくは該配列に相補的な核酸配列を有するオリ
ゴヌクレオドが、修飾物により修飾された第２のＣＭＶ
検出用修飾オリゴヌクレオチドと交雑させ、交雑した結
合体の第２の修飾物を測定することを特徴とする試料中
のＣＭＶの検出方法。
【請求項１０】第１の修飾物がリンカーアームを有す
るヌクレオチドであり、第２の修飾物がラジオアイソト
ープ、蛍光物質、酵素またはビオチンであることを特徴
とする請求項９記載の試料中のＣＭＶの検出方法。
【請求項１１】配列表・配列番号１〜６（但し、Ａは
アデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを
表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換さ
れてもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相補
的な核酸配列を有するＣＭＶ増幅用オリゴヌクレオチド
をプライマーとして、試料中の核酸を増幅させ、得られ
た増幅産物に配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはアデ
ニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相補的
な核酸配列を有し、修飾物により修飾されたＣＭＶ検出
用修飾オリゴヌクレオチドをプローブとして交雑させ、
交雑した結合体の修飾物を測定することを特徴とする試
料中のＣＭＶの検出方法。
【請求項１２】配列表・配列番号１〜６（但し、Ａは
アデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを
表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換さ
れてもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相補
的な核酸配列を有し、修飾物により修飾されたＣＭＶ検
出用修飾オリゴヌクレオチドを含有することを特徴とす
るＣＭＶ検出用試薬キット。
【請求項１３】配列表・配列番号１〜６（但し、Ａは
アデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを
表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換さ
れてもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相補
的な核酸配列を有するＣＭＶ増幅用オリゴヌクレオチド
および配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはアデニン、
Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。ま
た、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されてもよ
い）に示される核酸配列もしくは該配列に相補的な核酸
配列を有し、修飾物により修飾されたＣＭＶ検出用修飾
オリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするＣＭＶ
増幅・検出用試薬キット。
【請求項１４】配列表・配列番号１〜６（但し、Ａは
アデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを
表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換さ
れてもよい）に示される核酸配列もしくは該配列に相補
的な核酸配列を有するＣＭＶ増幅用オリゴヌクレオチド
および配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはアデニン、
Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。ま
た、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されてもよ
い）に示される核酸配列もしくは該配列に相補的な核酸
配列を有し、修飾物により修飾されたＣＭＶ検出用修飾
オリゴヌクレオチド、核酸合成酵素、ｄＮＴＰおよび／
またはｒＮＴＰおよび緩衝液を含有することを特徴とす
る試料中のＣＭＶ増幅・検出用試薬キット。
【請求項１５】修飾物が、ラジオアイソトープ、蛍光
物質、酵素、リンカーアームを有するヌクレオチド、ビ
オチン、またはＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
であることを特徴とする請求項１４に記載のＣＭＶ増幅
・検出用試薬キット。
【請求項１６】核酸合成酵素がＤＮＡポリメラーゼであ
る請求項１４記載のＣＭＶ増幅・検出用試薬キット。
【請求項１７】核酸合成酵素が、逆転写酵素、リボヌク
レアーゼＨ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラ
ーゼである請求項１４記載のＣＭＶ増幅・検出用試薬キ
ット。