CN112322795A - 实时荧光定量pcr检测hhv7病毒的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种实时荧光定量PCR检测HHV7病毒的方法及试剂盒。其中引物包括正向引物和逆向引物，如SEQ ID NO:2～3所示；探针，如SEQ ID NO:4所示；QPCR模板，如SEQ ID NO:1所示。本发明通过对NCBI数据库中所有HHV7基因组DNA和H gene分离株序列共22个做了同源性比对，设计出1组实时定量PCR的正反向引物以及探针，能够高效、准确的检测出所有类型的HHV7 DNA，并且不受大量背景细胞DNA的影响，特别适用于检测生物制药原料和产品，尤其是细胞库中的HHV7病毒污染。
Description
技术领域
本发明所属生物检测技术领域，特别是涉及运用体外核酸检测法检测生物制品中的HHV7病毒污染的方法。
背景技术
人疱疹病毒7型(Human Parvovirus HHV7)于1990年由Frenkel等首次在健康人体外周血活化CD4+T细胞中分离得到，后又在人体的血液和唾液中被分离鉴定。因其基因组与人疱疹病毒6型(HHV6)及人巨细胞病毒(HCMV)约有75％的同源性，故将其归于一疱疹病毒亚科。临床上，HHV7与小儿急疹和玫瑰疹等发病密切相关，并与神经系统病变有一定联系。HHV7引起的原发感染多发生于幼童时期，以引起短暂发热为主，有时可伴皮疹。当器官移植受者体内潜伏的HHV7病毒被激活后，将出现严重并发症。故近来，人们已经认识到HHV7是一种机会性感染病原，对人体健康产生严重影响。
HHV7病毒的检测方法很多，主要包括抗体检测技术、抗原检测技术以及核酸检测技术。抗体检测技术不适用于培养细胞的检测；抗原检测技术检测灵敏度较低。核酸检测技术适用范围广，且灵敏度较高，是HHV7检测的一种较好的选择。该检测技术主要包括核酸分子检测技术和核酸分子扩增检测技术两种。
目前，常用的核酸检测技术为实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR)法。该方法指在PCR扩增过程中，通过荧光信号的强弱，对PCR产物进行实时检测，从而快速、高效、准确的检测出HHV7基因组DNA。检测生物制品中的HHV7病毒的方法需要尽可能多地覆盖HHV7的变异株。目前文献公开的HHV7病毒qPCR检测方法均不能保证覆盖所有类型的HHV7。
因此，本领域需要提供一种准确的检测出所有类型的HHV7 DNA的方法，并且该方法不受大量背景细胞DNA的影响，特别适用于检测生物制药原料和产品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种能高效、准确的检测出所有类型的HHV7DNA且不受大量背景细胞DNA的影响的检测HHV7病毒的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种实时荧光定量PCR检测HHV7病毒的方法，按以下条件进行:
1)提取待测样品总DNA；可将总DNA的浓度调整为0.1μg/μL；
2)制备反应体系，每份反应体系包括预混液、一对引物及相应的探针；所述预混液为TaqMan Universal Master Mix；所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列为：GACACATATGCTTGATAATGTCATGGAC(如SEQ ID NO:2所示)，所示反向引物的核苷酸序列为：CACCTTGTTTGTGTATGCGTCTAGG(如SEQ ID NO:3所示)；所述探针的核苷酸序列为：FAM-TCCTTGTGCAACAGCCACGCGC-BHQ(如SEQ ID NO:4所示)；
3)梯度稀释DNA模板，得到标准曲线样品；所述DNA模板的核苷酸序列为：5’ACTCTCAGAAATTGGAAACAGTCTAGTCTTCCAAGAAAAGATCAAGCGAAAGATTCATGTTTTGCTCGCAAGTCTGTGCAATCCTTTGGAAATGTATTTTTGGACACATATGCTTGATAATGTCATGGACATTGAAACGATGTTTTCTCCTTGTGCAACAGCCACGCGCAAAGATTTAACTCAAAGAGTTGTCAACAACATTTTATCCTATAAAAACCTAGACGCATACACAAACAAGGTGATGAACACACTTTCTGTATATAG 3’(如SEQ ID NO:1所示)；
4)试剂的阴性对照、待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样；
5)QPCR反应；
6)绘制标准曲线，分析待测样品的检测结果。
具体的，所述步骤3)中，标准曲线样品的浓度梯度为每5μl含有1x105，1x104，1x103，1x102及10个靶序列拷贝。
具体的，所述步骤5)中，采用ABI 7500PCR仪进行QPCR反应。
具体的，所述步骤5)中，QPCR反应程序为：
Step1：95℃，10min；
Step2：95℃，15sec，然后60℃，1min；
Step2执行40cycles。
具体的，所述方法用于细胞库中的HHV7病毒的检测。
具体的，所述DNA模板为包含模板靶序列的质粒。
本发明还提供一种用于实时荧光定量PCR检测HHV7病毒的引物及探针的组合，其中，
所述引物包括正向引物和反向引物，
所述正向引物的核苷酸序列为：GACACATATGCTTGATAATGTCATGGAC(如SEQ ID NO:2所示)，
所示反向引物的核苷酸序列为：CACCTTGTTTGTGTATGCGTCTAGG(如SEQ ID NO:3所示)；
所述探针的核苷酸序列为：FAM-TCCTTGTGCAACAGCCACGCGC-BHQ(如SEQ ID NO:4所示)。
本发明还提供实时荧光定量PCR检测HHV7病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒包含引物和探针，
述引物包括正向引物和反向引物，
所述正向引物的核苷酸序列为：GACACATATGCTTGATAATGTCATGGAC(如SEQ ID NO:2所示)，
所示反向引物的核苷酸序列为：CACCTTGTTTGTGTATGCGTCTAGG(如SEQ ID NO:3所示)；
所述探针的核苷酸序列为：FAM-TCCTTGTGCAACAGCCACGCGC-BHQ(如SEQ ID NO:4所示)。
具体的，所述试剂盒还包括预混液。所述预混液优选为TaqMan Universal MasterMix。
具体的，所述试剂盒还包括QPCR反应的DNA模板。所述DNA模板的核苷酸序列为：5’ACTCTCAGAAATTGGAAACAGTCTAGTCTTCCAAGAAAAGATCAAGCGAAAGATTCA TGTTTTGCTCGCAAGTCTGTGCAATCCTTTGGAAATGTATTTTTGGACACATATGCTTGATAATGTCATGGACATTGAAACGATGTTTTCTCCTTGTGCAACAGCCACGCGCAAAGATTTAACTCAAAGAGTTGTCAACAACATTTTATCCTATAAAAACCTAGACGCATACACAAACAAGGTGATGAACACACTTTCTGTATATAG 3’(如SEQ ID NO:1所示)。
本发明通过对NCBI数据库中所有HHV7基因组DNA和H gene分离株序列(共22个)做同源性比对，设计出1组实时定量PCR的正反向引物以及探针，能够高效、准确的检测出所有类型的HHV7 DNA，并且不受大量背景细胞DNA的影响，特别适用于检测生物制药原料和产品，尤其是细胞库中的HHV7病毒污染。
本发明能够检测出NCBI数据库中现有的所有HHV7病毒分离株的基因组DNA，包括JI及RK两个HHV7品系及20个临床分离出的病毒株。这也同时也说明我们选择的扩增检测区域是HHV7基因组中非常保守的区域，将来新出现的变异株被该方法检测到的几率很高。
本发明的检测方法用时约1.5h，与病毒细胞培养检测相比，时间缩短较大，降低了人工和物料成本。
本发明的检测方法可以检测出低至10个病毒基因组拷贝(附图1)，而目前已有的方法检测低限在100-1000个拷贝。该方法的高灵敏度能够更好地保证生物制品的安全性。
细胞库的生物安全检测需要检测到大量细胞中的微量病毒污染。用PCR方法做检测时，检测样本DNA中也包含大量的细胞DNA与微量的病毒DNA(如果病毒污染存在)。大量的细胞DNA常常会抑制PCR反应。本发明提供的检测方法不被细胞基因组DNA所干扰，特别适合于检测含细胞的样品中的病毒污染，是一种非诊断目的的检测方法。
附图说明
图1为利用本发明的引物、探针、扩增模板minigene及方法步骤得到的扩增曲线图。图中数字(10，102，102，103，105)为模板拷贝数。结果表示检测体系可检测到10拷贝的模板。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
1.取待测细胞，提取待测样品总DNA，测定并计算细胞总DNA的浓度，并将浓度调整为0.1μg/μL。
2.计算PCR反应数N。根据下表制备反应体系预混液。其中，
正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.分别梯度稀释DNA模板至每5μl含有1x105，1x104，1x103，1x102及10个靶序列拷贝。
4.在样品孔中分别加入：
样品加入终体积为每个反应10μl。其中，DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.采用ABI 7500实时PCR系统进行QPCR反应。其中，
QPCR反应程序为：
Step1：95℃，10min；
Step2：95℃，15sec，然后60℃，1min；
Step2执行40cycles。
6.结果分析
结果表明，QPCR能够检测出低至10个拷贝的模板DNA(如附图1)。细胞基因组DNA不产生任何阳性信号，且不影响目的DNA的检出，特别适用于检测生物制药原料和产品，尤其是细胞库中的HHV7病毒污染。
本发明中引物探针的设计是在病毒基因序列比对后选取保守序列设计的，因此我们尝试的引物探针在检测HHV7的特异性上(即能检测到多少HHV7病毒株)是一致的，差别主要在检测灵敏度上。我们还筛选了其它7套引物探针，多数只能检测到100个目的序列拷贝。本实施例选中的这套是灵敏度最高的，能够稳定检出10个拷贝。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 苏州药明检测检验有限责任公司
<120> 实时荧光定量PCR检测HHV7病毒的方法及试剂盒
<130> CPC-NP-20-102225
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 264
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actctcagaa attggaaaca gtctagtctt ccaagaaaag atcaagcgaa agattcatgt 60
tttgctcgca agtctgtgca atcctttgga aatgtatttt tggacacata tgcttgataa 120
tgtcatggac attgaaacga tgttttctcc ttgtgcaaca gccacgcgca aagatttaac 180
tcaaagagtt gtcaacaaca ttttatccta taaaaaccta gacgcataca caaacaaggt 240
gatgaacaca ctttctgtat atag 264
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccttgttt gtgtatgcgt ctagg 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccttgtgca acagccacgc gc 22
Claims (10)
1.一种实时荧光定量PCR检测HHV7病毒的方法，其特征在于，按以下条件进行：
1)提取待测样品总DNA；
2)制备反应体系，每份反应体系包括预混液、一对引物及相应的探针；所述预混液为TaqMan Universal Master Mix；所述引物包括正向引物和反向引物，
所述正向引物的核苷酸序列为：GACACATATGCTTGATAATGTCATGGAC，
所述反向引物的核苷酸序列为：CACCTTGTTTGTGTATGCGTCTAGG；
所述探针的核苷酸序列为：FAM-TCCTTGTGCAACAGCCACGCGC-BHQ；
3)梯度稀释DNA模板，得到标准曲线样品；所述DNA模板的核苷酸序列为：
5’ACTCTCAGAAATTGGAAACAGTCTAGTCTTCCAAGAAAAGATCAAGCGAAAGATTCATGTTTTGCTCGCAAGTCTGTGCAATCCTTTGGAAATGTATTTTTGGACACATATGCTTGATAATGTCATGGACATTGAAACGATGTTTTCTCCTTGTGCAACAGCCACGCGCAAAGATTTAACTCAAAGAGTTGTCAACAACATTTTATCCTATAAAAACCTAGACGCATACACAAACAAGGTGATGAACACACTTTCTGTATATAG 3’；
4)试剂的阴性对照、待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样；
5)QPCR反应；
6)绘制标准曲线，分析待测样品的检测结果。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，标准曲线样品的浓度梯度为每5μl含有1x105，1x104，1x103，1x102及10个靶序列拷贝。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，采用ABI 7500PCR仪进行QPCR反应。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，QPCR反应程序为：
Step1：95℃，10min；
Step2：95℃，15sec，然后60℃，1min；
Step2执行40cycles。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于细胞库中的HHV7病毒的检测。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA模板为包含模板靶序列的质粒。
7.一种用于实时荧光定量PCR检测HHV7病毒的引物及探针的组合，其特征在于，
所述引物包括正向引物和反向引物，
所述正向引物的核苷酸序列为：GACACATATGCTTGATAATGTCATGGAC，
所示反向引物的核苷酸序列为：CACCTTGTTTGTGTATGCGTCTAGG；
所述探针的核苷酸序列为：FAM-TCCTTGTGCAACAGCCACGCGC-BHQ。
8.一种实时荧光定量PCR检测HHV7病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含引物和探针，
述引物包括正向引物和反向引物，
所述正向引物的核苷酸序列为：GACACATATGCTTGATAATGTCATGGAC，
所示反向引物的核苷酸序列为：CACCTTGTTTGTGTATGCGTCTAGG；
所述探针的核苷酸序列为：FAM-TCCTTGTGCAACAGCCACGCGC-BHQ。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括预混液，所述预混液为TaqMan Universal Master Mix。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括QPCR反应的DNA模板；所述DNA模板的核苷酸序列为：
5’ACTCTCAGAAATTGGAAACAGTCTAGTCTTCCAAGAAAAGATCAAGCGAAAGATTCATGTTTTGCTCGCAAGTCTGTGCAATCCTTTGGAAATGTATTTTTGGACACATATGCTTGATAATGTCATGGACATTGAAACGATGTTTTCTCCTTGTGCAACAGCCACGCGCAAAGATTTAACTCAAAGAGTTGTCAACAACATTTTATCCTATAAAAACCTAGACGCATACACAAACAAGGTGATGAACACACTTTCTGTATATAG 3’。
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Citations (5)
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-
2020
- 2020-12-07 CN CN202011414779.3A patent/CN112322795A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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