CN111041131A - 基于微滴式数字pcr的eb病毒检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请公开一种基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括:微滴式数字PCR用反应预混液；目的片段检测混合液，包括目的片段的扩增引物和探针，目的片段的扩增引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，目的片段的探针的序列如SEQ ID No.3所示；内标及内标检测混合液，包括作为内标的外源重组质粒，以及所述内标的扩增引物和探针，内标的扩增引物的序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，内标的探针的序列如SEQ ID No.6所示；阳性对照预混液；阴性对照预混液；本申请优化利用数字PCR技术针对EB病毒进行绝对定量检测的成品试剂盒，为EB病毒相关疾病诊断提供准确的诊断依据。

Description

基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒。

背景技术

EB病毒(epstein-barr virus,EBv)，又称人类疱疹病毒4型(Human herpesvirus4 (HHV-4))。EB病毒是Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，认为该病毒是多种恶性肿瘤(如Burkitt 淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等)的病因之一，它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。

鼻咽癌是我国南方及东南沿海地区高发的头颈部恶性肿瘤，全世界约 80%的鼻咽癌都发生在我国，严重威胁人民的生命健康。鼻咽癌对放射治疗比较敏感，随着放疗技术的不断发展，早期鼻咽癌的 5 年生存率已高达 95%。但在临床实践中，由于鼻咽癌发病部位隐匿，发病症状与其他良性疾病难以鉴别，大部分鼻咽癌患者确诊时已处于中晚期，伴随颈部淋巴结和或远处转移，转移和复发风险显著升高，死亡率急剧上升。因此，提高鼻咽癌的早期诊断和预后判断水平是提升鼻咽癌整体治疗水平的有效途径。鼻咽癌标志物的开发、应用、评价和完善是实现上述目标的关键步骤。

国内首个《鼻咽癌标志物临床应用专家共识》指出：血浆EBV DNA筛查可以显著提高鼻咽癌的早诊率，从而相应地提高疗效，在鼻咽癌高发区，推荐将EBV DNA检测作为鼻咽癌早期筛查的常规项目；治疗前后血浆EBV DNA水平的变化可用于鼻咽癌疗效判断的依据；综合考虑治疗全程的血浆EBV DNA水平和TNM分期，可更加准确地判断预后，为肿瘤治疗后进展提供早期干预依据。

实时荧光定量PCR技术是目前EBV DNA检测应用最广泛的技术。由于可以实现快速、灵敏检测，大量文献证实荧光定量PCR检测 EBV-DNA 对鼻咽癌的诊断、治疗方案的选择、疗效判定及预后意义重大。但由于不同实验室PCR平台间缺少统一的检测执行标准，无论是样本类型、DNA提取方法、检测的DNA 片段、质量控制、检测设备、检测极限值等均缺乏统一标准，导致同一份样本在不同的实验室的检测结果，尤其在 EBV DNA 阈值设置上，存在较大差异，导致出现实验结果无法重复，甚至结果互相矛盾的状况。且依赖于Cq值仍然是目前定量PCR最大的技术瓶颈，在这个意义上所谓的“定量”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。而检测报告结果的准确性直接影响临床疾病的诊断和治疗效果的判断，因此亟需研制更加敏感和精确的血浆EBV DNA定量方法和试剂，制定标准化的检测和结果判定方法，以提高 EBV DNA 检测临床应用的可靠性。

数字PCR (digital PCR)是近年来新出现的技术，通过对样本进行微小单元化处理，可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，且数字PCR不依靠任何校准物或外标便可直接计数目标分子数，为绝对定量PCR技术。因此数字PCR特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

发明内容

本申请的目的是为克服现有技术的不足，提供一种有效提高EB病毒检测灵敏度和准确度的基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒。

为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

一种基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括:

微滴式数字PCR用反应预混液；

目的片段检测混合液，包括目的片段的扩增引物和探针，目的片段的扩增引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，目的片段的探针的序列如SEQ ID No.3所示；

内标及内标检测混合液，包括作为内标的外源重组质粒，以及所述内标的扩增引物和探针，内标的扩增引物的序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，内标的探针的序列如SEQID No.6所示；

阳性对照预混液，包括作为阳性对照的含有所述目的片段的假病毒，以及稀释用的人源血浆；

阴性对照预混液，包括人源血浆。

优选地，所述目的片段为EB病毒的DNA或EB病毒的DNA片段。

具体地，所述微滴式数字PCR反应预混液包括PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、taq DNA聚合酶和UDG酶。

优选地，所述目的片段的扩增引物的工作浓度为500～1000nM，所述目的片段的探针的工作浓度为200～500 nM；所述内标的扩增引物的工作浓度的为500～1000nM，所述内标的探针的工作浓度为200～500 nM。

进一步优选地，所述目的片段检测混合液中目的片段的扩增引物和探针的浓度为其工作浓度的5～10倍；所述内标检测混合液中内标的扩增引物和探针的浓度为其工作浓度的5～10倍。

可选择地，所述目的片段检测混合液和内标检测混合液在试剂盒内预先混合。

优选地，所述阳性对照，包括第一阳性对照和第二阳性对照，所述第一阳性对照的拷贝数至少是第二阳性对照的拷贝数的100倍。

进一步优选地，所述人源血浆采用正常人混合血浆。

进一步地，所述试剂盒中，其应用包括以下步骤：

1）获取样本的总DNA；

2）按照预设的反应数配置微滴式数字PCR的反应混合液的总体积；

3）按照预设的反应数制备各个反应体系；

4）将各个反应体系分别进行微液滴处理；

5）对各个经过微液滴处理的反应体系进行微滴式数字PCR扩增之后，根据扩增结果计算各个样本的核酸浓度。

优选地，所述样本来源于人源血清和/或血浆。

进一步地，阳性对照和阴性对照需跟样本一起提取，在提取步骤之前加入内标；所述获取样本的总DNA，通过核酸提取试剂盒进行抽提。

进一步地，所述预设的反应数的计算方法为待检样本数、阳性对照数以及阴性对照数的总和再加1。

优选地，所述微滴式数字PCR的反应混合液包括微滴式数字PCR用反应预混液、目标片段检测混合液、内标检测混合液和无核酸酶水。

优选地，每次测试时，所述反应体系均需同时设置阳性对照和阴性对照。

可选择地，所述阳性对照来源于试剂盒内的阳性对照预混液；阴性对照来源于试剂盒内的阴性对照预混液。

进一步地，所述将各个反应体系进行微液滴处理时，每个反应体系的总微液滴数大于或等于50000，则确认微液滴生成有效。

与现有技术相比较，本申请具有如下优势：

（1）本申请的试剂盒，优化了利用数字PCR技术针对EB病毒进行绝对定量检测的适合产业化的成品试剂盒。结果精准：实现绝对定量，不依赖Cq值，无需标准曲线，更精准的检测病毒含量，为EB病毒相关疾病诊断提供准确的诊断依据；灵敏度高，可检测单拷贝模板；

（2）本申请的试剂盒，利用优化设计的目的片段的扩增引物和探针，以及内标的扩增引物和探针，使检测精度提高，也适用复杂样品检测，不易受PCR抑制物影响；

（3）本申请的试剂盒，使用了两组阳性对照，并且两组阳性对照之间的拷贝数有数量级的差异，可以分别作为强阳性对照和弱阳性对照，可以避免出现样本DNA拷贝数过高或过低从而无法定量的情况。

附图说明

图1为采用本申请基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒及使用方法检测血浆EBV DNA阳性的临床样本结果二维图；

图2为采用本申请基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒及使用方法检测正常人及鼻咽癌病人血浆EBV DNA结果统计图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述。

实施例一

本申请的基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒，包括：

(1)微滴式数字PCR用反应预混液：包括buffer（反应缓冲液）、dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）、taq 酶（taq DNA聚合酶）、UDG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶）；该微滴式数字PCR用反应预混液应当与进行数字PCR的设备适配，可以替换为其他数字PCR用反应预混液，也可以依据数字PCR条件自行配制。

(2)目的片段检测混合液和内标检测混合液：包括检测目的片段的引物和探针组合，检测内标的引物和探针组合；所述目的片段在本实施例中为EB病毒的DNA或EB病毒DNA片段（EBV DNA）；

其中，所述EBV DNA的引物和探针组合，序列如下：

ddEBV–F：5'-CAAGAACCCAGACGAGTCCG-3'（SEQ ID No.1）；

ddEBV–R：5'-GTGAACCGCTTACCACCTCCT-3'（SEQ ID No.2）；

ddEBV- Probe：5'-FAM-TCCTCGTCCAGCAAGA-MGB-NFQ-3'（SEQ ID No.3）

所述EBV DNA的扩增引物的工作浓度为500～1000nM，所述EBV DNA的探针的工作浓度为200～500 nM。优选的，本实施例中，EBV DNA的引物工作浓度为900nM，EBV DNA的探针的工作浓度为250nM。

所述内标的引物和探针组合，序列如下：

Control-F：5' - CTACCAGCAGAACACCCCCA -3'（SEQ ID No.4）；

Control-R：5' - GCGGCGGTCACGAACTC -3'（SEQ ID No.5）；

Control-Probe：5'-VIC - CCCAACGAGAAGCG –MGB-NFQ-3'（SEQ ID No.6）。

所述内标的扩增引物的工作浓度的为500～1000nM，所述内标的探针的工作浓度为200～500nM。优选的，本实施例中，所述内标的引物工作浓度为900nM，所述内标的探针的工作浓度为375nM。

优选的，EBV DNA和内标的引物和探针分别按各成分用量配制成5～10倍工作浓度的检测混合液，考虑到使用的便利性和各成分之间的兼容性，可以将所述目的片段检测混合液和内标检测混合液预先混合，标记为“5×EBV检测混合液”或“10×EBV检测混合液”。

(3) 内标：人工合成的外源重组质粒，用于监测提取及检测流程；选取表达稳定的DNA片段以及成熟的转座子体系，即可容易获得所述内标。

(4) 弱阳性对照：为含有扩增目的基因片段的假病毒用正常人血浆稀释制备而成；

(5) 强阳性对照：为含有扩增目的基因片段的假病毒用正常人血浆稀释制备而成；

上述弱阳性对照和强阳性对照的差别在于所述目的基因片段的拷贝数的差异，弱阳性对照和强阳性对照目的在于避免出现样本DNA拷贝数过高或过低从而无法定量的情况，优选地，强阳性对照的拷贝数至少是弱阳性对照拷贝数的100倍，即假设，弱阳性对照的浓度为50 copies/μl，强阳性对照的浓度为5000 copies/μl。

(6) 阴性对照：正常人混合血浆。

实施例二

本申请的基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒的使用方法，包括：

(1). 样本采集：适用样本类型为血清或血浆。

a. 血清 用无菌注射器在受检者手臂弯曲处或手背处抽取静脉血 2ml，待样本自行析出血清后直接室温 1600rpm 离心 5 分钟分离出血清后转移至1.5ml 灭菌离心管中备用。

b.血浆 用无菌注射器在受检者手臂弯曲处或手背处抽取静脉血 2ml，注入含有EDTA 的无菌收集管中，立即轻轻颠倒混匀，待样本自行析出血浆后， 室温 1600rpm 离心5 分钟分离出血浆后转移至 1.5ml 灭菌离心管中备用。

样本收集后立即用冰块保存或置于 4℃。 样本在 4℃保存不超过 72 小时，-20℃条件下可以保存数月，长期保存请将样本置于-70℃。

(2). 样本处理和核酸提取（样本处理区）

购买核酸提取试剂盒，按核酸提取试剂盒说明书对临床样本、阳性及阴性对照进行总DNA提取，提取前向样本中加入内标，最后，洗脱体积为均为50µl。

(3). 试剂配制（试剂准备区）

a. 检测反应设置阳性质控和阴性质控，所述阳性质控和阴性质控分别采用阳性对照和阴性对照实现。

b. 配制过程

1） 将所有组分解冻至室温，各组分充分溶解后振荡混合均匀，短暂离心；

2）确定反应数N,N=待检样本数（n）+质控数（3，包括2个阳性质控和1个阴性质控）+1。计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算组分与体积如表1所示 ：

上述微滴式数字PCR用反应预混液为制品，与本实施例中使用的MicroDrop-100微滴式数字PCR系统配套使用。

3)取1.5ml无菌离心管配制反应体系，试剂全部加入后震荡混匀，离心数秒。

4）然后将上述混合液16μl/管分装至0.2ml PCR反应管中。

c.加样（样本制备区）

取EBV阴性对照、EBV阳性对照、临床样本DNA各4μl分别加入至0.2ml PCR反应管中，以形成各个反应体系。之后盖紧管盖，震荡混合均匀，短暂离心将管壁上的液体全部甩至管低（避免产生气泡），然后进行制备微液滴。

d.制备微液滴（样本制备区）

1）将微液滴生成芯片置于芯片卡座中，向油相孔加入40μl 微液滴生成油，向样本孔中加入20μl 已加入样本的PCR反应水相。待油相和水相加入完成后，盖上微液滴生成芯片密封垫，将微液滴生成芯片置于MicroDrop -100A微滴生成仪中进行微液滴生成；

2）微液滴生成后，小心将生成的微液滴（大约45～55μl）转移至96孔PCR反应板中（推荐使用八排枪进行移微液滴）；

3）待微液滴转移至96孔PCR反应板后，盖上96孔板可穿刺热封膜，置于预热好的热封仪上进行封膜；封好膜之后应于30分钟内进行PCR扩增，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR扩增；

e.PCR扩增（扩增检测区）

将已封膜的96孔PCR反应板进行PCR反应扩增，扩增程序为：

50℃反应2min；

95℃反应10min；

95℃反应30sec，60℃反应60sec，45个循环；

98℃反应10min；

(4). 微液滴检测和结果分析

PCR扩增完后，将96孔PCR反应板置于MicroDrop-100B微滴检测仪中进行检测；检测完成后，单击“分析”以打开并分析数据。单击一维图（通道1或通道2）可显示选定孔的单通道数据，使用单选按钮选择要显示的通道。设置阈值,阈值设置在阴性微滴和阳性微滴分开的区域。单击“二维图”显示二维图，四区域见图1；点击“浓度”可显示各孔加入的DNA拷贝数，单位copies/μo。

(5). 检测结果判定

a.微滴生成有效性判断：每个反应管的总微滴数≥50000，若总微滴数＜50000，该反应孔的微滴生成不理想，需重新进行微滴生成。

b.阴性对照有效性判断：落在“Ch1+”区的点＜3个，落在“Ch2+”区的点＜3个；

c.阳性对照有效性判断：落在“Ch1+”区的点≥3个

d.满足上述a、b、c点后，样品中检测出阳性微滴，样本浓度计算如下：

f.满足上述a、b、c点后，样品中未检测出阳性微滴，则判定为低于检测限。

实施例三

本实施例采用实施例一所述的试剂盒，以及采用实施例二所述的使用方法对正常人及鼻咽癌病人血浆样本进行EB病毒的检测，具体的检测方法为：

（1）.样本提取：采用MAGEN“HiPure AS Blood DNA Mini Kit”柱提法对76例正常人和268例鼻咽癌初诊病人血浆样本、阳性对照及阴性对照进行总DNA提取。按核酸提取试剂盒说明书取200ul样本进行提取，提取时向样本中加入内标，按试剂盒操作说明书进行核酸的提取，洗脱体积为均为50µl。

（2）.反应体系配制：

分批进行EBV DNA检测，每批次检测均需平行进行阳性和阴性对照检测。

a.微滴数字PCR检测的PCR反应液的体系，各组分与体积如表2所示：

b.取1.5ml无菌离心管配制反应体系，试剂全部加入后震荡混匀，离心数秒。然后将上述混合液16μl/管分装至0.2ml PCR反应管中。

c.加样:取EBV阴性对照、EBV阳性对照、临床样本DNA各4μl分别加入至0.2ml PCR反应管中，以形成各个反应体系，之后盖紧管盖，震荡混合均匀，短暂离心将管壁上的液体全部甩至管低（避免产生气泡），然后进行制备微液滴。

（3）.微滴生成：将微液滴生成芯片置于芯片卡座中，向油相孔加入40μl 微液滴生成油，向样本孔中加入20μl 已加入样本的PCR反应水相。待油相和水相加入完成后，盖上微液滴生成芯片密封垫，将微液滴生成芯片置于MicroDrop -100A微滴生成仪中进行微液滴生成；微液滴生成后，小心将生成的微液滴（大约45～55μl）转移至96孔PCR反应板中（推荐使用八排枪进行移微液滴）；

待微液滴转移至96孔PCR反应板后，盖上96孔板可穿刺热封膜，置于预热好的热封仪上进行封膜。

（4）.PCR扩增:将已封膜的96孔PCR反应板进行PCR反应扩增，扩增程序为：

50℃反应2min；

95℃反应10min；

95℃反应30sec，60℃反应60sec，45个循环；

98℃反应10min；

(5).微液滴检测和结果分析:PCR扩增完后，将96孔PCR反应板置于MicroDrop-100B微滴检测仪中进行检测；检测完后用QuantDrop数据分析软件对结果进行分析。

采用上述试剂盒和上述检测方法对76例正常人和289例鼻咽癌初诊病人血浆样品进行检测，结果显示（见图2），检测76例正常人样本结果全部阴性，特异性100%；检测289例鼻咽癌病人样本，其中检出EBV DNA的 患者264 例，占总数的91.35％，并且能够对EBV DNA进行准确定量分析，明显优于一般荧光定量PCR方法，本发明具有特异性好，灵敏度高，定量准确，快速简便，重复性好的特点，有宜于提高检测EBV DNA的灵敏性和特异性，本发明的方法及试剂盒不仅可用于EBV DNA 的检测，也可作为临床实验室对EBV 感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段，具有潜在的应用价值。

实施例四

本申请采用实施例一所述的试剂盒，以及采用实施例二所述的使用方法对76例正常人和289例鼻咽癌初诊病人血浆样品进行检测，结果显示，检测76例正常人样本结果全部阴性，特异性100%；检测289例鼻咽癌病人样本，其中检出EBV DNA的 患者264 例，占总数的91.35％（结果见图2）。

其中的70例鼻咽癌标本采用不同的QPCR反应体系进行检测，结果显示，使用与所述试剂盒一致的引物探针进行QPCR反应，EBV阳性率71.43%（QPCR组）；在医院1采用广东某公司试剂盒进行QPCR检测，EBV阳性率81.43%（医院1-IVD组）；而另一家医院2采用实验室自建项目(LDTs)形式进行QPCR检测，EBV阳性率仅为50.79%（医院2-LDT组）；可见由于荧光定量PCR（QPCR）依赖于标准曲线和Cq值这一技术瓶颈，不同实验室PCR平台间缺少统一的检测执行标准，导致同一份样本在不同的实验室的检测结果存在较大差异（具体结果见表3）。数字PCR不依靠任何校准物或外标便可直接计数目标分子数这一特点，明显优于一般荧光定量PCR方法。

表3 采用本申请基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒及使用方法与QPCR检测鼻咽癌病人血浆EBV DNA结果统计，如表3所示：

综上所述，本申请的基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒及使用方法利用优化设计的目的片段的扩增引物和探针，以及内标的扩增引物和探针，使检测精度提高，也适用复杂样品检测。本申请具有特异性好，灵敏度高，定量准确，快速简便，重复性好的特点，有利于提高检测EBV DNA的灵敏性和特异性，本申请不仅可用于EBV DNA 的检测，也可作为临床实验室对EBV 感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段，具有潜在的应用价值。

上述实施例为本申请较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本申请的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 广东永诺医疗科技有限公司

<120> 基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caagaaccca gacgagtccg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgaaccgct taccacctcc t 21

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctcgtcca gcaaga 16

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctaccagcag aacaccccca 20

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcggcggtca cgaactc 17

<210> 6

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaacgaga agcg 14

Claims (9)

1.一种基于微滴式数字PCR的EB病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:

微滴式数字PCR用反应预混液；

目的片段检测混合液，包括目的片段的扩增引物和探针，目的片段的扩增引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，目的片段的探针的序列如SEQ ID No.3所示；

内标及内标检测混合液，包括作为内标的外源重组质粒，以及所述内标的扩增引物和探针，内标的扩增引物的序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，内标的探针的序列如SEQID No.6所示；

阳性对照预混液，包括作为阳性对照的含有所述目的片段的假病毒，以及稀释用的人源血浆；

阴性对照预混液，包括人源血浆。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述微滴式数字PCR反应预混液包括PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、taq DNA聚合酶和UDG酶。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述目的片段的扩增引物的工作浓度为500～1000nM，所述目的片段的探针的工作浓度为200～500 nM；所述内标的扩增引物的工作浓度的为500～1000nM，所述内标的探针的工作浓度为200～500nM；所述目的片段检测混合液中目的片段的扩增引物和探针的浓度为其工作浓度的5～10倍；所述内标检测混合液中内标的扩增引物和探针的浓度为其工作浓度的5～10倍；所述目的片段检测混合液和内标检测混合液在试剂盒内预先混合。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照，包括第一阳性对照和第二阳性对照，所述第一阳性对照的拷贝数至少是第二阳性对照的拷贝数的100倍。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述人源血浆采用正常人混合血浆。

6.如权利要求1～5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的应用包括以下步骤：

1）获取样本的总DNA；

2）按照预设的反应数配置微滴式数字PCR的反应混合液的总体积；

3）按照预设的反应数制备各个反应体系；

4）将各个反应体系分别进行微液滴处理；

5）对各个经过微液滴处理的反应体系进行微滴式数字PCR扩增之后，根据扩增结果计算各个样本的核酸浓度。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述样本来源于人源血清和/或血浆；阳性对照和阴性对照需跟样本一起提取，在提取步骤之前加入内标；所述获取样本的总DNA，通过核酸提取试剂盒进行抽提。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述预设的反应数的计算方法为待检样本数、阳性对照数以及阴性对照数的总和再加1；所述微滴式数字PCR的反应混合液包括微滴式数字PCR用反应预混液、目标片段检测混合液、内标检测混合液和无核酸酶水。

9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述反应体系均需同时设置阳性对照和阴性对照；所述阳性对照来源于试剂盒内的阳性对照预混液；阴性对照来源于试剂盒内的阴性对照预混液；将各个反应体系进行微液滴处理时，每个反应体系的总微液滴数大于或等于50000，则确认微液滴生成有效。

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