CN103443295B

CN103443295B - 体外确定个体患结直肠癌概率的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN103443295B
Application number: CN201280015168.9A
Authority: CN
Inventors: 叶迅; 吴非; 徐清华; 刘芳; 孟夏; B·穆然
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2011-03-25
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2032-03-23
Also published as: CN103443295A; CN106048050A; CN106048050B

Abstract

本发明涉及在外周血样品中体外确定个体患结直肠癌概率的方法，使用待测个体基因的核酸表达产物的量与得自组成阳性对照的CRC患者组的相同基因的核酸表达产物的量及与得自组成阴性对照的CNC个体组的相同基因的核酸表达产物的量的比较；还涉及包含所述表达产物的特异性结合配偶体的试剂盒。

Description

体外确定个体患结直肠癌概率的方法及试剂盒

发明领域

本发明涉及检测结直肠癌，特别涉及用于确定患这种癌症的概率的方法及试剂盒。

背景

结直肠癌（CRC）也称为结肠癌或大肠癌，是美国第五最常见癌症形式，中国第四位常见癌症及欧洲癌症相关死亡的第三位因素。CRC早期检测是成功治疗及患者存活的关键，代表主要公共健康挑战。事实上，CRC经常是可治愈的，特别是当在早期诊断时。在各个国家已有一些筛查策略。传统CRC筛查测试包括大便潜血试验（FOBT）、乙状结肠镜检测结肠镜检查、双重对比钡剂灌肠、或者直肠指检。所有这些均具有优点和限制，但是依从性仍低于预期，主要由于患者的不便或者不适。

寻找目的在于CRC早期检测的外周血生物学标记物几年来成为焦点，特别是因为其方便性。同时，只有极少研究支持基于血液的测试的可行性，这些研究发现血液中的基因生物学标记物可以区分CRC患者和对照。这些研究基于流式细胞术，其是计数和检查显微颗粒如细胞的技术，所述技术通过将它们悬浮在液流中并用电子检测装置分析它们。

本发明人发现，在外周血样品中，差异表达的基因代表重要的生物学标记物。它们不使用经典流式细胞术技术，而是确定来自全血的基因的差异表达。通过分析全血中的转录物来确定基因表达水平是不寻常的，因为本领域技术人员普遍承认，当无特异性纯化步骤时，非常难以获取稀释于RNA复杂混合物（总RNA）中的特异信息。本发明方法的优势还包括避免RNA纯化步骤。

因此，本发明涉及在外周血样品中体外确定个体患结直肠癌概率的方法，所述方法包括步骤：

a)在外周血样品中确定来自至少一种核酸序列且不超过7种核酸序列的至少一种表达产物的量，所述核酸序列选自SEQ ID NO:1-11的序列，

b)将步骤a)中确定的所述表达产物的量与一组先前诊断为结直肠癌患者的个体的表达产物的参考量以及与一组先前确认为非结直肠癌个体的个体的表达产物的参考量进行比较，

c)进行步骤b）结果的分析，其中：

-如果测试个体的结果接近或等于得自先前诊断为结直肠癌患者的个体组的结果，则该测试个体被分类为结直肠癌患者，而

-如果测试个体的结果接近或等于得自先前确认为非结直肠癌个体的个体组的结果，则该测试个体被分类为非结直肠癌个体。

表达产物的量直接与由其核酸序列限定的基因的表达水平相关。

至少一种上述核酸的表达水平是确定个体是否是CRC的足够信息。但是，在本发明优选实施方案中，在步骤a）中，来自选自下组的核酸序列的表达产物的量被确定：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。

来自核酸的表达产物的量通过将所述表达产物与特异于每种表达产物的至少一种结合配偶体接触而确定。

表达产物是指RNA转录物或多肽。因此，在本发明方法中，至少一种RNA转录物或至少一种多肽的量被确定。

术语RNA转录物是指总RNA，即直接得自外周血样品或细胞裂解后间接得自血液样品的编码或非编码RNA。特别地，总RNA包含转移RNA（tRNA），信使RNA（mRNA），如从靶基因转录也从其他基因转录的mRNA，以及核糖体RNA。

具体说明，当RNA是胞内RNA时，其可以通过裂解步骤从血液样品中存在的细胞提取，以释放待测个体细胞中含有的核酸。例如，可以使用如下专利申请中描述的裂解方法：WO00/05338，涉及混合磁性及机械裂解，WO99/53304，涉及电裂解，WO99/15321，涉及机械裂解。本领域技术人员可以使用其它熟知裂解方法，例如热休克或渗透压休克，或者使用离液剂如胍盐的化学裂解（美国专利号5,234,809）。还可以提供额外步骤以从裂解步骤释放的其它细胞组分分离核酸。这通常能够浓缩核酸。

在本发明方法中，RNA转录物可以通过杂交、扩增或测序检测及量化。特别地，为检测及量化，RNA转录物与至少一种探针或至少一种引物在预定条件下接触，所述预定条件使得所述探针和/或所述引物与所述RNA转录物杂交。但是在本发明另一个实施方案中，制备RNA转录物的DNA拷贝，通过与至少一种探针或至少一种引物在预定条件下接触，所述预定条件使得所述探针和/或所述引物与所述DNA拷贝杂交而确定所述DNA拷贝。

更精确地，在上述方法中，RNA转录物或DNA拷贝与至少一种杂交探针和至少一种引物接触，更特别与至少一种杂交探针和两种引物接触。

术语“杂交”是指这样的过程，其中在合适条件下，两个核苷酸片段以稳定和特异性氢键结合以形成双链复合物。这些氢键在互补腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）（或尿嘧啶（U））碱基之间形成（称为A-T键）或者在互补的鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）碱基之间形成（称为G-C键）。两个核苷酸片段的杂交可以是完全的（称为互补核苷酸片段或序列），即在这个杂交过程中获得的双链复合物仅包含A-T键及C-G键。这个杂交可以是部分的（称为足够互补的核苷酸片段或序列），即获得的双链复合物包含使得能形成双链复合物的A-T键和C-G键，也包含不结合互补碱基的碱基。两个核苷酸片段之间的杂交取决于使用的工作条件，特别取决于严格性。严格性特别定义为两个核苷酸片段的碱基组成的函数，也通过两个核苷酸片段之间的错配程度限定。严格性也可以取决于反应参数，例如杂交溶液中存在的离子种类的浓度及类型，变性剂的性质及浓度，和/或杂交温度。所有这些数据均是熟知的并且本领域技术人员可以确定合适的条件。通常，根据要杂交核苷酸片段的长度，杂交温度在大约20和70℃之间，特别是在35和65℃之间，在浓度大约0.5-1M的盐水溶液中。序列或核苷酸片段或寡核苷酸或多核苷酸是通过磷酸酯键组装在一起的一系列核苷酸基序，特征在于天然核酸的信息序列，能够与核苷酸片段杂交，该系列可以含有不同结构的单体，可以得自天然核酸分子和/或通过遗传重组和/或通过化学合成获得。基序是单体衍生物，其可以是核酸的天然核苷酸，其组成元件是糖、磷酸基团和含氮碱基；在DNA中，糖是脱氧-2-核糖，在RNA中，糖是核糖；根据涉及DNA或RNA，含氮碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；或者单体是在三种组成元件中的至少一种中被修饰的核苷酸；例如，修饰可以发生在碱基水平，修饰的碱基例如肌苷、甲基-5-脱氧胞苷、脱氧尿苷、二甲基氨基-5-脱氧尿苷、二氨基-2，6-嘌呤、溴-5-脱氧尿苷或者任何其它能杂交的修饰碱基，或者修饰可以发生在糖水平，例如用聚酰胺置换至少一个脱氧核糖(P.E.Nielsen et al，Science，254，1497-1500(1991))，或者修饰可以发生在磷酸基团水平，例如其用酯特别选自二磷酸酯、烷基膦酸酯和芳基膦酸酯及硫代磷酸酯置换。

为本发明目的，术语“扩增引物”是指包含5-100个核苷酸、优选15-30个核苷酸的核苷酸片段，其允许起始酶促聚合，例如酶促扩增反应。术语“酶促扩增反应”是指通过至少一种酶的作用产生核苷酸片段的多个拷贝的过程。这种扩增反应是本领域技术人员熟知的，可特别提及的是下述技术：PCR(聚合酶链反应)，如美国专利号4,683,195和美国专利号4,683,202所述，LCR(连接酶链反应)，如专利申请EP0201184中所述，RCR(修复链反应)，如专利申请WO90/01069所述，专利申请WO90/06995的3SR(自持续（self sustained）序列复制)，专利申请WO91/02818的NASBA(基于核酸序列的扩增)，美国专利号5,399,491的TMA(转录介导的扩增)及RT-PCR。

当酶促扩增是PCR时，其使用至少两种特异于靶基因的扩增引物，使得特异于靶基因的扩增材料。特异于靶基因的材料优选包含经衍生自靶基因的信使RNA的逆转录获得的互补DNA（称为cDNA），或者经特异于靶基因的cDNA的转录获得的互补RNA（称为cRNA）。当酶促扩增是在逆转录反应后进行的PCR时，称为RT-PCR。

术语“杂交探针”是指包含至少5个核苷酸、如5-100个核苷酸、特别是10-75个核苷酸、如15-35个核苷酸和60-70个核苷酸的核苷酸片段，在给定条件下具有杂交特异性，从而与特异于靶基因的材料形成杂交复合物。在本发明中，特异于靶基因的材料可以是包括在衍生自靶基因的信使RNA中的核苷酸序列（称为靶基因特异性mRNA），包括在通过所述信使RNA的逆转录获得的互补DNA中的核苷酸序列（称为靶基因特异性cDNA），或者包括在通过如上所述cDNA的转录获得的互补RNA中的核苷酸序列（称为靶基因特异性cRNA）。杂交探针可以包括标记物用于其检测。术语“检测”是指直接检测如计数法，或者通过使用标记物的检测方法间接检测。现有许多检测方法用于检测核酸（参见例如Kricka et al.，ClinicalChemistry，1999，no45(4)，p.453-458or Keller G.H.et al.，DNA Probes，2ndEd.，Stockton Press，1993，sections5and6，p.173-249）。术语“标记物”是指能产生可被检测信号的示踪剂。这些示踪剂的非限制性列表包括酶，其产生可以通过例如比色法、荧光或发光检测的信号，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；生色团如荧光、发光或染料化合物；电子致密基团，可被电子显微镜或通过它们的电学性质如导电性检测，通过电流分析法或伏特计方法、或通过阻抗测量检测；可以通过光学方法或物理方法检测的基团，所述光学方法例如衍射、表面等离子体共振或接触角变化，所述物理方法例如原子力光谱学、隧道效应等；放射活性分子如³²P，³⁵S或¹²⁵I。

为本发明目的，杂交探针可以是“检测”探针。在这种情况中，“检测”探针由标记物标记。检测探针可以特别是“分子信标”检测探针，如Tyagi&Kramer所述(Nature biotech，1996，14:303-308)。这些“分子信标”在杂交期间发荧光。它们具有茎-环型结构，含有荧光团和“猝灭”基团。特异的环序列与其互补靶核酸序列的结合导致茎解开及在合适波长激发期间发射荧光信号。检测探针特别可以是“报道探针”，包含根据NanoString^TM技术的“颜色编码的条码”。

为检测杂交反应，可以利用具有直接（特别是通过在靶序列内掺入标记物）或间接（特别是使用上述检测探针）标记的靶序列。特别是可以在杂交步骤之前进行标记和/或裂解靶序列的步骤，例如在酶促扩增反应期间使用标记的脱氧核糖核苷酸三磷酸。裂解可以特别是通过咪唑或者氯化锰的作用而进行。靶序列也可以在扩增步骤之后标记，例如通过文件WO91/19812中所述的夹心杂交技术杂交检测探针。另一个特别优选的标记核酸的方法在申请FR2780059中描述。

根据本发明的优选实施方案，检测探针包含荧光团及猝灭剂。根据本发明更优选的实施方案杂交探针在其5’末端包含FAM（6-羧基-荧光素）或ROX（6-羧基-X-若丹明）荧光团及在其3’末端包含猝灭剂（Dabsyl）。

杂交探针也可以是“捕获”探针。在这种情况中，“捕获”探针通过任何合适方式即直接或间接固定化或者可以固定化在固相基质上，例如通过共价或吸附。作为固相基质，可以使用合成材料或天然材料，任选化学修饰的，特别是多糖如基于纤维素的材料，例如纸、纤维素衍生物如醋酸纤维素和硝基纤维素或葡聚糖、聚合物、共聚物，特别是基于苯乙烯型单体、天然纤维如棉花及合成纤维如尼龙；无机材料如二氧化硅、石英、玻璃或陶瓷；胶乳；磁性颗粒；金属衍生物，凝胶等。固相基质可以是微滴定板形式，如申请WO-A-94/12670描述的膜形式或者颗粒形式。还可以在基质上固定化一些不同的捕获探针，每个特异于靶基因。特别地，可以使用其上可以固定化大量探针的生物芯片作为基质。术语“生物芯片”是指尺寸小的固相基质，许多捕获探针可以附着于其上的预定位置。生物芯片或DNA芯片概念从1990年开始。其基于多学科技术，集成了微电子学、核酸化学、成像分析及信息技术。运行原理是基于分子生物学基础：杂交现象，即两个DNA和/或RNA序列的碱基的互补配对。生物芯片方法基于利用附着于固相基质的捕获探针，在探针上使得用荧光染料直接或间接标记的靶核苷酸片段样品起作用。捕获探针特殊定位在基质或芯片上，每个杂交给出与靶核苷酸片段相关的特定信息。所获得的信息是累积的，使得可以例如量化一或多种靶基因的表达水平。为了分析靶基因的表达，可以制备包含多个探针的基质，其相应于被转录成mRNA的靶基因的全部或部分。为本发明目的，术语“低密度基质”是指包含少于50个探针的基质。为本发明目的，术语“中等密度基质”是指包含50-10000个探针的基质。为本发明目的，术语“高密度基质”是指包含超过10000个探针的基质。

特异于希望去分析的靶基因的核酸的cRNA或cDNA然后与例如特异性捕获探针杂交。杂交后，洗涤基质或芯片，通过结合于例如荧光染料型标记物的高亲和性配体揭示标记的cDNA或cRNA/捕获探针复合物。例如用扫描仪读取荧光，荧光分析用信息技术加工。例如，可以提及由Affymetrix公司开发的DNA芯片("Accessing Genetic Information with High-DensityDNA arrays"，M.Chee et al.，Science，1996，274，610-614."Light-generatedoligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis"，A.Caviani Pease et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，5022-5026)，用于分子诊断。在这个技术中，捕获探针通常尺寸小，大约25个核苷酸。生物芯片的其它例子在如下出版物中给出：G.Ramsay，Nature Biotechnology，1998，No.16，p.40-44;F.Ginot，Human Mutation，1997，No.10，p.1-10;J.Cheng et al，Moleculardiagnosis，1996，No.1(3)，p.183-200;T.Livache et al，Nucleic Acids Research，1994，No.22(15)，p.2915-2921J.Cheng et al，Nature Biotechnology，1998，No.16，p.541-546，或者美国专利号4,981,783，美国专利号5,700,637，美国专利号5,445,934，美国专利号5,744,305及美国专利号5,807,522。固相基质的主要特征应该是保持捕获探针在靶核苷酸片段上的杂交特征，同时产生检测方法的最小背景噪声。可以分成三种主要制造类型用于将探针固定化在基质上。

首先，第一种技术是沉积预合成的探针。探针的附着是通过微量移液器或微点（microdot）或通过喷墨装置直接转移而进行。这项技术允许附着尺寸为几个碱基（5-10个）直至相对较大尺寸60个碱基（印刷）至几百个碱基（微沉积）的探针。

印刷是喷墨打印机使用的方法的适应。其基于以可达到4000滴/秒的速率推进非常小的液滴（体积<1nl）。印刷不涉及释放液体的系统与其沉积的表面的任何接触。

微沉积是将几十至几百个碱基的长探针附着于玻片表面。这些探针通常从数据库中提取并且呈扩增及纯化产物形式。这个技术使得可以产生被称为微阵列的芯片，其在小于4cm²的表面积上携带大约1万个DNA斑点，称为识别区。然而不能忘记的是使用尼龙膜，被称为“大阵列（macroarray）”，其携带通常被PCR扩增的产物，直径为0.5-1mm，最大密度为25个斑点/cm²。这种非常灵活的技术被许多实验室使用。在本发明中，后一技术被认为包括在生物芯片中。但是一定体积的样品可以沉积在微滴定板每个孔的底部，如专利申请WO-A-00/71750和FR00/14896所述，或者一定数目的彼此分离的液滴可以沉积在同一皮氏皿的底部，如另一个专利申请FR00/14691所述。

将探针附着于基质或芯片的第二种技术成为原位合成。这个技术导致在芯片表面直接产生短探针。其基于原位寡核苷酸合成（特别参见专利申请WO89/10977和WO90/03382）及基于寡核苷酸合成仪方法。其包括沿玻璃表面移动反应室，其中发生寡核苷酸延伸反应。

最后，第三种技术成为光刻，其是Affymetrix开发的生物芯片的方法。其也是一种原位合成。光刻衍生自微处理器技术。芯片表面通过附着可以被光激活的光不稳定化学基团而修饰。一旦被照射，这些基团能够与寡核苷酸的3’末端反应。通过用限定形状的掩饰（mask）保护这个表面，可以选择性照射，因此激活芯片上希望附着4种核苷酸的一种或另一种的区域。相继使用不同掩饰使得可以交替保护/反应循环，因此在大约几十平方微米(μm²)的斑点上产生寡核苷酸探针。这个分辨率使得可以在几平方厘米(cm²)的表面积上产生几十万个斑点。光刻具有优势：以大批平行的方式，其能够仅通过4xN个循环便产生N聚体芯片。所有这些技术均可以用于本发明。根据本发明优选实施方案，上述步骤b）的至少一种特异性试剂包含至少一种杂交探针，其优选固定化在基质上。这个基质优选是如上所述的低、高或中等密度基质。

在包含多个探针的基质上的这些杂交步骤之前可以是如上所述酶促扩增反应步骤，以增加靶遗传物质的量。

确定靶基因的表达水平可以通过本领域技术人员已知的任何方案进行。通常，靶基因的表达可以通过在给定时间检测从靶基因转录的mRNA（信使RNA）而分析。

本发明优选涉及通过根据本领域技术人员已知的任何方案检测衍生自靶基因的mRNA而确定靶基因的表达水平。根据本发明的特定实施方案，一些靶基因的表达水平通过检测一些不同mRNA而被同时确定，每种mRNA衍生自一种靶基因。

通过扩增，可以如下确定靶基因表达水平：1)在从全血中提取总RNA（包含转移RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）和信使RNA（mRNA））之后，进行逆转录步骤以获得所述mRNA的互补DNA（cDNA）。例如，这种逆转录反应可以用逆转录酶进行，可以从RNA片段获得互补DNA片段。可以特别使用来自AMV（禽类成髓细胞瘤病毒）或来自MMLV（莫罗尼鼠白血病病毒）的逆转录酶。当更希望仅获得mRNA的cDNA时，这个逆转录步骤在包含仅胸腺嘧啶碱基（polyT）的核苷酸片段存在下进行，polyT通过互补性与mRNA的polyA序列杂交，以形成polyT-polyA复合物，作为由逆转录酶进行的逆转录反应的起始点。然后获得与衍生自靶基因的mRNA互补的cDNA（靶基因特异性cDNA）及与衍生自非靶基因的基因的mRNA互补的cDNA（非特异于靶基因的cDNA）。2)特异于靶基因的扩增引物与靶基因特异性cDNA及非特异于靶基因的cDNA接触。特异于靶基因的扩增引物与靶基因特异性cDNA杂交，来自靶基因的mRNA来源的cDNA的已知长度的预定区域被特别扩增。非特异于靶基因的cDNA不被扩增，然后获得大量靶基因特异性cDNA。为本发明目的，可提及“靶基因特异性cDNA”或“来自靶基因的mRNA来源的cDNA（cDNAs originatingfrom the mRNAs derived from the target gene）”，两者并无差别。这个步骤可以特别通过PCR型扩增反应或通过上述任何其它扩增技术进行。通过PCR，还可以同时扩增一些不同的cDNA，每个cDNA特异于不同靶基因，使用一些不同扩增引物，每个引物特异于一个靶基因，然后进行多重扩增。3)靶基因的表达通过检测及量化上述步骤2）中获得的靶基因特异性cDNA确定。这个检测可以在靶基因特异性cDNA根据它们的大小电泳迁移后进行。迁移的凝胶及介质可以包括溴化乙锭以允许在给定迁移时间后将凝胶置于UV（紫外）线桌台上通过光信号发射而直接检测靶基因特异性cDNA。靶基因特异性cDNA量越大，光信号越亮。这些电泳技术是本领域技术人员熟知的。靶基因特异性cDNA也可以用进行直至饱和的扩增反应获得的量化范围而检测及量化。为了考虑可能在各个步骤期间观测到的酶效率的差异（逆转录、PCR等），各组患者的靶基因的表达可以通过同时确定“管家”基因的表达而标准化，管家基因的表达在各组患者中是相似的。通过获得靶基因表达与管家基因表达的比率，即通过获得靶基因特异性cDNA的量与管家基因特异性cDNA的量的比率，由此可以校正各个实验间的任何差异。本领域技术人员可以特别参考下列出版物：Bustin S A，J Mol Endocrinol，2002，29:23-39;Giulietti A Methods，2001，25:386-401。

通过杂交，靶基因的表达可以通过如下方式确定：1)在从全血中提取总RNA之后，进行如上述逆转录步骤，以获得与衍生自靶基因的mRNA互补的cDNA(靶基因特异性cDNA)和与衍生自除了靶基因之外的基因的mRNA互补的cDNA(非特异于靶基因的cDNA)。2)将所有cDNA均与其上固定了特异于其表达希望被分析的靶基因的捕获探针的底物接触，以进行靶基因特异性cDNA与捕获探针之间的杂交反应，非特异于靶基因的cDNA与捕获探针不杂交。杂交反应可以在固体底物上进行，包括上述所有材料。根据一个优选的实施方案，将杂交探针固定在底物上。优选地，底物是如上文定义的低-、高-或中等密度的底物。杂交反应也可以在如上述靶基因特异性cDNA的酶扩增组成的步骤之后进行，以获得大量的靶基因特异性cDNA及增加靶基因特异性cDNA与特异于靶基因的捕获探针杂交的可能性。杂交反应也可以在如上述标记和/或裂解靶基因特异性cDNA的步骤之后进行，例如使用标记的脱氧核糖核苷酸三磷酸进行扩增反应。裂解可以特别通过咪唑和二氯化锰的作用而进行。靶基因特异性cDNAye可以在扩增步骤之后标记，例如根据如文献WO-A-91/19812中所述夹心杂交技术与标记的探针杂交而进行。其它优选的标记和/或裂解核酸的特定方法在专利申请WO99/65926、WO01/44507、WO01/44506、WO02/090584、WO02/090319中描述。3)随后进行检测杂交反应的步骤。所述检测通过将其上特异于靶基因的捕获探针与靶基因特异性cDNA杂交的底物与用标记物标记的“检测”探针接触，并检测由该标记物发出的信号而进行。当靶基因特异性cDNA已经预先用标记物标记时，直接检测该标记物发出的信号。

靶基因的表达也可以通过如下方式确定：1)在从全血中提取总RNA之后，进行如上述逆转录步骤，以获得所述生物材料的mRNA的cDNA。随后使用T7聚合酶进行该cDNA的互补RNA的聚合化，所述聚合酶在启动子的控制下，使得可以从DNA模板中获得互补RNA。然后获得特异于靶基因的mRNA的cDNA的cRNA(称作靶基因特异性cRNA)和非特异于靶基因的mRNA的cDNA的cRNA。2)将所有cRNA均与其上固定了特异于其表达希望被分析的靶基因的捕获探针的底物接触，以进行靶基因特异性cRNA与捕获探针之间的杂交反应，非特异于靶基因的cRNA与捕获探针不杂交。当需要同时分析一些靶基因的表达时，可以将一些不同的捕获探针固定在底物上，每个探针均特异于一个靶基因。杂交反应也可以在如上述标记和/或裂解靶基因特异性cRNA组成的步骤之后进行。3)随后进行由检测杂交反应组成的步骤。所述检测可以通过将其上特异于靶基因的捕获探针与靶基因特异性cRNA杂交的底物与用标记物标记的“检测”探针接触，并检测由所述标记物发出的信号而进行。当靶基因特异性cRNA已经预先用标记物标记时，直接检测由该标记物发出的信号。当使用其上杂交了大量探针的生物芯片类型底物时，使用cRNA是特别有利的。

当表达产物是多肽时，可以通过将其与如下文定义的至少一种特异性配体接触而进行检测。在一个优选的实施方案中，将表达的多肽与如下文定义的至少两种特异性配体接触。特异性配体例如是指称作“Nanofitin^TM”的抗体或亲和性蛋白质。

Nanofitin是具有竞争特性的亲和性蛋白质。其存在与看题相似的竞争性亲和性。

术语“抗体”涵盖了多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，重组抗体。其产生方法为本领域技术人员熟知。

本发明还包括在体外确定个体患有结肠癌的可能性的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种特异于至少一种核酸序列的结合配偶体且不超过7种特异于7种核酸序列的7种表达产物的结合配偶体，其中至少一种结合配偶体特异于选自SEQ ID NO:1-11的至少一种核酸序列的至少一种表达产物。

特别地，所述试剂盒包含7种结合配偶体的组合，其特异于具有SEQ IDNO:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4、SEQID NO:5或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示序列的7种核酸序列的表达产物。

在试剂盒中，特异性结合配偶体包含：

-至少一种杂交探针，

-或者至少一种杂交探针和至少一种引物，或者

-至少一种杂交探针和两种引物，或者

-至少一种特异性配体或至少两种特异性配体，如抗体和/或亲和性蛋白。

最后，本发明涉及至少一种针对至少一种核酸序列的至少一种表达产物的特异性结合配偶体且不超过7种针对7种核酸序列的7种表达产物的特异性结合配偶体在制备用于体外确定个体患结直肠癌概率的组合物中的用途，所述至少一种核酸序列具有选自SEQ ID NO:1-11所示核酸序列的序列。

特别地，使用7种特异性结合配偶体的组合，所述7种特异性结合配偶体特异于具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11所示序列的7种核酸序列的7种表达产物。

特异性结合配偶体包含：

-至少一种杂交探针，

-或至少一种杂交探针及至少一种引物，或

-至少一种杂交探针及两种引物，或

实施例

I)材料及方法

1.患者及样品收集

在2006年至2010年期间从161个结直肠癌患者（CRC）及148个结肠镜阴性对照患者（CNC）收集外周血样品。CRC患者在中国FDUSCC的结直肠外科募集。根据国际防癌联盟（UICC）推荐的国际肿瘤-淋巴结-转移（TNM）系统对肿瘤分期。患者未接受手术前放疗或化疗。患有遗传性结直肠癌或炎性肠病（克罗恩氏病或溃疡性结肠炎）的患者被排除在本研究之外。已用结肠镜证实无任何息肉或结直肠癌症状的CNC从上海地区社区医院和FDUSCC登记加入。对于每个患者，将2.5ml外周血收集进PAXgene^TM Blood RNA试管(PreAnalytiX GmbH，Hombrechtikon，CH)并根据厂商指导加工。

研究涉及两个独立的参加者群组。群组1由100个CRC患者和100个CNC组成。对于CRC患者，在结肠镜后至少一周于手术前在FDUSCC收集血液样品。对于CNC，在结肠镜前一周在上海地区社区医院收集血液样品。分析来自这些样品的基因表达谱作为训练集以寻找与CRC相关的显著基因及鉴别分子特征。群组2包括61个CRC患者和48个CNC。样品以与群组1相同方式收集。群组2用作独立测试集以证实群组1中观测到的特征表现。

2.RNA提取及微阵列实验

用PAXgene^TM Blood RNA系统(PreAnalytix)根据厂商指导提取总RNA。用分光光度计在260nm光密度测量总RNA数量，质量用RNA6000NanoKit在BioAnalyzer Agilent2100(Agilent Technologies，PaloAlto，CA，U.S.A.)上评估。仅分析具有7-10的RNA完整性数目（RNAIntegrity Number）的样品。50ng总RNA然后经逆转录并且用Ribo-SPIA^TM技术用WT-Ovation^TM RNA扩增系统(NuGEN Technologies Inc.，San Carlos，CA，U.S.A.)根据厂商标准方案线性扩增成单链cDNA，产物用QIAquick^TMPCR纯化试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)纯化。2微克扩增纯化的cDNA随后用RQ1RNase-Free DNase(Promega Corp.，Fitchburg，WI，U.S.A.)片段化并且用生物素化脱氧核苷三磷酸经末端转移酶(Roche DiagnosticsCorp.，Indianapoli，IN，U.S.A.)和DNA标记试剂(Affymetrix Inc.，Santa Clara，CA，U.S.A)标记。标记的cDNA在杂交炉640(AgilentTechnologies)中以每分钟60转、50℃、18小时杂交到GeneChip HG U133Plus2.0阵列(Affymetrix)上。HG U133Plus2.0阵列含有54675个探针集，代表大约39000个最佳鉴定的人基因。在杂交后，阵列被洗涤并用Fluidics Station450(Affymetrix)根据Affymetrix方案EukGE-WS2v4染色。阵列用扫描仪3000(Affymetrix)扫描。

3.统计学分析

根据标准Affymetrix质量控制参数建议进行微阵列数据质量控制。Affymetrix表达阵列根据Robust Multi-chip Average法(RMA)进行全局预加工，使用背景校正、分位点标准化及中位数平滑总结(median polishsummarization)(Irizarry RA et al.，Biostatistics203;4:249-64)。

对于群组1数据，具有极端信号强度（低于log2(50)或高于2E14）的探针集被过滤掉。然后，用Entrez基因数据库(Maglot D et al.，Nucleic AcidsResearch2007;35:D26-31)的信息进行基于生物学知识的过滤。除去没有Entrez基因ID注释的探针集。对于作图为相同Entrez基因ID的多个探针集，仅保留具有最大Inter Quantile Range值的探针集。在两步过滤后，保留9859个探针集进行下游分析。为降低批次效应可能性，将Combat方法用于过滤的表达数据(Johnson WE et al.，Biostatistics2007;8:118-27)。通过微阵列的显著性分析（SAM）方法进行差异表达基因（DEG）分析（False DiscoveryRate=0.05;Type=“Two class unpaired”;test statistic=“t-statistic”;number ofpermutations=1,000)(Tusher VG et al.，PNAS USA2001，98:5116-21)。显著性基因选择及预测模型构建用RFE-SVM方法使用5倍交叉确认方法进行。在训练集的200个样品中，随机选择160个形成学习集；用RFE-SVM评分的范围从1到100个基因的不同大小产生预测模型；模型表现用其余40个样品评估。这个方法重复1000次。我们的结果提示用基于100个基因的SVM预测模型可实现最大97%精确度。特征大小优化考虑预测表现、特征复杂性及经济性。最后，我们鉴别了7种核心基因满足我们的目标表现，整体精确度为90%。所述7种基因经t-检验P值、变化倍数、生物学功能选择并且不与年龄或性别因素相关。

II)结果

1.结直肠癌和对照患者群的特征

在两个群组中的309个参加者中，有161个CRC患者和148个CNC。患者的人口统计学及临床特征总结在表1中。

表1：患者的临床特征

2.7-基因CRC生物学标记物组：鉴别及确认

训练集：发明人基于5倍交叉确认方法进行了显著性基因选择及预测模型构建。方法重复1000次。在每次重复中，他们记录了独特的前7位(top-7)基因集及其经内部检验倍数（internal test fold）评估的相应预测模型表现。最终，通过取在内部检验倍数中的1000个预测模型的平均表现估算整体表现。结果显示用预测模型可实现90.0%的整体精确度表现。发明人选择了最佳的7-基因预测模型，其对于训练集90.0%精确度、89.0%灵敏度及91.0%特异性。

测试集：发明人然后在一个包括109个样品、61个CRC及48个CNC的独立群组（测试集）中确认了在训练集中鉴别的上述预测模型的特征表现。这个特征的整体表现是83.0%(CI%:73.9，88.9)精确度；84.0%(CI%:71.5，91.4)灵敏度；及81.0%(CI%:66.9，86.6)特异性。

3.来自从训练集观测的特征的各基因的区分能力分析

表2总结了所述7种基因的个体表现。对于每个基因给出了个体特征如Probeset_id(Affymetrix探针集鉴别)，在100个CNC和100个CRC之间观测的T_检验P值及在100个CNC和100个CRC之间观测的变化倍数。

表2

Probeset_id^*

基因符号^**

SEQ ID NO:

平均信号^***

t-检验P值

变化倍数

方向(在CRC中)

227062_at

NEAT1

1

621

3.8410^-11

1.46

up

223204_at

FAM198B

2，3，4

97

3.5610^-12

1.52

up

205785_at

ITGAM

5，6

95

1.3510^-17

1.32

up

213906_at

MYBL1

7，8

139

3.5110^-8

1.38

down

209339_at

SIAH2

9

252

8.0610^-6

1.25

up

1553589_a_at

PDZK1IP1

10

407

9.3210^-5

1.37

down

1553991_s_at

VSIG10

11

65

1.4710^-14

1.41

up

Up：是指CRC组的平均信号高于CNC组

Down：是指CRC组平均信号低于CNC组

*是指根据Affymetrix annotation version in2010的Probeset_id(https://www.affymetrix.com/analysis/netaffx/xmlquery.affx?netaffx=netaffx4_a nnot&_requested=403680)

**是指鉴别的基因及其变体或者与所述基因或变体相关的序列

***是指100个CRC及100个CNC阵列实验观测的平均信号

Claims

1.特异于SEQ ID NO:5或6所示的ITGAM基因、SEQ ID NO:11所示的VSIG10基因，以及，任选地，选自SEQ ID NO:1所示的NEAT1基因、SEQ ID NO:2或3或4所示的FAM198B基因、SEQ ID NO:7或8所示的MYBL1基因、SEQ ID NO:9所示的SIAH2基因以及SEQ ID NO:10所示的PDZK1IP1基因的一或多种基因的表达产物的结合配偶体在制备用于通过包括以下步骤的方法在外周血样品中体外确定个体患结直肠癌概率的试剂盒中的用途：

a)在外周血样品中确定所述表达产物的量，

b)将步骤a)中确定的所述表达产物的量与一组先前诊断为结直肠癌患者的个体的所述表达产物的参考量以及与一组先前确认为非结直肠癌个体的个体的所述表达产物的参考量进行比较，

c)对步骤b)的结果进行分析，其中：

2.权利要求1的用途，其中在步骤a)中，来自所述表达产物的量通过将所述表达产物与特异于所述表达产物的至少一种结合配偶体接触而确定。

3.权利要求1或2的用途，其中在步骤a)中，在外周血样品中确定SEQID NO:5或6所示的ITGAM基因、SEQ ID NO:11所示的VSIG10基因以及SEQ ID NO:2或3或4所示的FAM198B基因的表达产物的量。

4.权利要求1或2的用途，其中在步骤a)中，在外周血样品中确定SEQID NO:5或6所示的ITGAM基因、SEQ ID NO:11所示的VSIG10基因、SEQ ID NO:2或3或4所示的FAM198B基因以及SEQ ID NO:1所示的NEAT1基因的表达产物的量。

5.权利要求1或2的用途，其中在步骤a)中，在外周血样品中确定SEQID NO:5或6所示的ITGAM基因、SEQ ID NO:11所示的VSIG10基因、SEQ ID NO:2或3或4所示的FAM198B基因、SEQ ID NO:1所示的NEAT1基因以及SEQ ID NO:7或8所示的MYBL1基因的表达产物的量。

6.权利要求1或2的用途，其中在步骤a)中，在外周血样品中确定SEQID NO:5或6所示的ITGAM基因、SEQ ID NO:11所示的VSIG10基因、SEQ ID NO:2或3或4所示的FAM198B基因、SEQ ID NO:1所示的NEAT1基因、SEQ ID NO:7或8所示的MYBL1基因以及SEQ ID NO:9所示的SIAH2基因的表达产物的量。

7.权利要求1或2的用途，其中在步骤a)中，在外周血样品中确定SEQID NO:5或6所示的ITGAM基因、SEQ ID NO:11所示的VSIG10基因、SEQ ID NO:2或3或4所示的FAM198B基因、SEQ ID NO:1所示的NEAT1基因、SEQ ID NO:7或8所示的MYBL1基因、SEQ ID NO:9所示的SIAH2基因以及SEQ ID NO:10所示的PDZK1IP1基因的表达产物的量。

8.权利要求1的用途，其中所述表达产物是至少一种RNA转录物或者至少一种多肽。

9.权利要求8的用途，其中所述表达产物是至少一种mRNA。

10.权利要求9的用途，其中所述RNA转录物通过杂交、通过扩增或通过测序检测及量化。

11.权利要求8的用途，其中所述RNA转录物与至少一种探针和/或至少一种引物在预定条件下接触，所述预定条件使得所述探针和/或所述引物与所述RNA转录物杂交。

12.权利要求10的用途，其中制备所述RNA转录物的DNA拷贝，且将所述DNA拷贝与至少一种探针和/或至少一种引物在预定条件下接触，所述预定条件使得所述探针和/或所述引物与所述DNA拷贝杂交。

13.权利要求8的用途，其中通过与至少一种特异性配体接触而检测所表达的多肽。

14.权利要求13的用途，其中所述特异性配体是抗体或亲和性蛋白。

15.权利要求13的用途，其中将所表达的多肽与至少两种特异性配体接触。

16.权利要求15的用途，其中所述至少两种特异性配体是至少两种抗体或两种亲和性蛋白或一种抗体及一种亲和性蛋白。

17.用于体外确定个体患结直肠癌概率的试剂盒，包含特异于SEQ IDNO:5或6所示的ITGAM基因、SEQ ID NO:11所示的VSIG10基因，以及，任选地，选自SEQ ID NO:1所示的NEAT1基因、SEQ ID NO:2或3或4所示的FAM198B基因、SEQ ID NO:7或8所示的MYBL1基因、SEQID NO:9所示的SIAH2基因以及SEQ ID NO:10所示的PDZK1IP1基因的一或多种基因的表达产物的结合配偶体。

18.权利要求17的试剂盒，其包含7种结合配偶体的组合，它们特异于SEQ ID NO:1所示的NEAT1基因、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的FAM198B基因、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的ITGAM基因、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的MYBL1基因、SEQID NO:9所示的SIAH2基因、SEQ ID NO:10所示的PDZK1IP1基因和SEQID NO:11所示的VSIG10基因的表达产物。

19.权利要求17的试剂盒，其中所述特异性结合配偶体包含至少一种杂交探针。

20.权利要求19的试剂盒，其中所述特异性结合配偶体包含至少一种杂交探针及至少一种引物。

21.权利要求19的试剂盒，其中所述特异性结合配偶体包含至少一种杂交探针及两种引物。

22.权利要求17的试剂盒，其中所述特异性结合配偶体包含至少一种特异性配体。

23.权利要求22的试剂盒，其中所述特异性配体是抗体或亲和性蛋白。

24.权利要求22的试剂盒，其中所述特异性结合配偶体包含至少两种特异性配体。

25.权利要求24的试剂盒，其中所述至少两种特异性配体是至少两种抗体或两种亲和性蛋白或一种抗体及一种亲和性蛋白。

26.针对SEQ ID NO:5或6所示的ITGAM基因、SEQ ID NO:11所示的VSIG10基因，以及，任选地，选自SEQ ID NO:1所示的NEAT1基因、SEQ ID NO:2或3或4所示的FAM198B基因、SEQ ID NO:7或8所示的MYBL1基因、SEQ ID NO:9所示的SIAH2基因以及SEQ ID NO:10所示的PDZK1IP1基因的一或多种基因的表达产物的特异性结合配偶体在制备用于体外确定个体患结直肠癌概率的组合物中的用途。

27.权利要求26的用途，其是7种特异性结合配偶体的组合的用途，所述7种特异性结合配偶体特异于SEQ ID NO:1所示的NEAT1基因、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的FAM198B基因、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6所示的ITGAM基因、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的MYBL1基因、SEQ ID NO:9所示的SIAH2基因、SEQ ID NO:10所示的PDZK1IP1基因和SEQ ID NO:11所示的VSIG10基因的表达产物。

28.权利要求26的用途，其中所述特异性结合配偶体包含至少一种杂交探针。

29.权利要求28的用途，其中所述特异性结合配偶体包含至少一种杂交探针及至少一种引物。

30.权利要求29的用途，其中所述特异性结合配偶体包含至少一种杂交探针及两种引物。

31.权利要求26的用途，其中所述特异性结合配偶体包含至少一种特异性配体。

32.权利要求31的用途，其中所述特异性配体是抗体或亲和性蛋白。

33.权利要求31的用途，其中所述特异性结合配偶体包含至少两种特异性配体。

34.权利要求33的用途，其中所述至少两种特异性配体是至少两种抗体或两种亲和性蛋白或一种抗体及一种亲和性蛋白。