CN111781356A - 一种胃癌极早期细胞标志和胃癌前病变早期细胞标志及其在诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

一种胃癌极早期细胞标志和胃癌前病变早期细胞标志及其在诊断试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明人发现了一群在胃低级别异型增生阶段开始出现、具有特定分子特征、且具有高度癌变风险的细胞群(命名为“胃癌极早期细胞”)，可作为极早期诊断胃癌的标志。胃癌极早期细胞的分子标志被应用到制备基于胃组织或血液样本实现胃癌或其他消化系统肿瘤早期诊断的试剂盒中。该胃癌极早期细胞标志还可区分胃癌术后复发风险，以及肠、胰腺以及食管等消化系统器官肿瘤发生的风险。另外，本发明人还发现一群在胃癌前病变早期出现、具有特定分子特征的细胞群，可作为早期诊断胃癌前病变的标志，也被集成到试剂盒中。本发明可用于临床上早期诊断胃癌及其他消化道肿瘤的发生，也可作为上述消化道肿瘤防治的干预靶点，应用前景良好。

Description

一种胃癌极早期细胞标志和胃癌前病变早期细胞标志及其在 诊断试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及一种用于辅助极早期诊断胃癌及其他消化系统肿瘤中的细胞标志及其测定系统和方法，同时涉及一种用于早期诊断胃癌前病变的细胞标志及其测定系统和方法。
背景技术
胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，具有较高的死亡率。大多数胃癌的发生会经历一系列癌前病变的过程，包括肠上皮化生以及异型增生等。癌前病变患者罹患胃癌的风险是非癌前病变患者的近3倍[1]。早期诊断胃癌前病变对于胃癌的预防具有重要的意义。
除胃癌前病变外，胃癌的极早期诊断对于胃癌的防治同样具有重要意义。研究表明，胃早癌患者的5年术后生存率可达96％[2]。然而，胃早癌的诊断目前依然以影像学、内镜、病理组织学为主，均存在一定的局限。基于影像学的诊断无法精确地观测到细胞层次的变化，容易遗漏关键生物特征；而基于病理组织学观测和常规肿瘤标志物分子表达的诊断方式会受限于灵敏度和特异度。例如，经典的胃癌标志物CEACAM5，在胃癌细胞及其癌旁的其他类型细胞(如肠细胞和正常胃上皮细胞)中均表现出高表达，因此很难成为胃癌早期筛查的特异标志物。更为重要的是，由于胃炎癌转化时程长，难以界定胃炎癌转化的关键转化点、亦即“癌变起始点”，这是胃癌极早期诊断的关键难点，也是限制临床胃癌极早期诊断的关键瓶颈。因此，识别高精度的胃癌极早期细胞标志对于界定胃炎癌转化的“癌变起始点”、实现胃癌临床极早期诊断具有十分重要的意义。
与胃癌发生发展类似的是，消化系统其他器官如肠、食管以及胰腺中肿瘤的发生与炎症的恶性转化密切相关，也会经历包括异型增生在内的癌前病变过程。因此，以胃癌极早期细胞标志的识别为切入点，找到消化系统肿瘤共性的早癌标志物对于提高消化系统肿瘤早期诊断率也具有十分重要的意义。
发明内容
在本发明中，本发明人发现了一群在胃低级别异型增生阶段开始出现、具有特定分子特征(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)、且具有较高癌变风险的细胞群(发明人将其命名为“胃癌极早期细胞”)，可作为极早期诊断胃癌的标志。本发明人将出现该细胞群的阶段定义为胃癌前病变向胃癌转化的关键点、亦即“癌变起始点”。此外，本发明人还发现该胃癌极早期细胞标志可区分胃癌术后复发风险，以及评估肠、胰腺以及食管等消化系统器官癌前病变向癌症转化的风险。在本发明中，该胃癌极早期细胞标志的分子特征被应用到制备基于胃组织或血液样本实现胃癌或其他消化系统肿瘤早期诊断的试剂盒中。另外，本发明人还发现了一群在胃癌前病变早期阶段开始出现、具有特定分子特征(HES6)的细胞群，可作为早期诊断胃癌前病变的标志，也被集成到试剂盒中。该试剂盒有望为消化系统肿瘤患者采取相关治疗措施或决策提供有效依据，临床应用前景良好。
根据本发明的一个方面，提供了检测标志物的表达水平的试剂在制备确定极早期胃癌的产品中应用，其中所述标志物包括从由KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B组成的组中选出的至少一种。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于确定胃癌极早期细胞含量、进而诊断极早期胃癌的产品。其特征在于，所述产品包括检测样本中标志物表达水平的试剂，其中所述标志物包括从由KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B组成的组中选出的至少一种。
根据本发明的另一个方面，提供了检测HES6表达水平的试剂在制备确定胃癌前病变水平的产品中应用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于确定胃癌前病变水平的产品，其特征在于，所述产品包括检测样本中HES6表达水平的试剂。
本发明主要包括以下方面，即：
1)本发明提供了13个分子(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)可作为胃癌极早期细胞群的特征，并应用于早期诊断胃癌的新用途。
2)本发明还提供了分子(HES6)作为胃癌前病变早期阶段细胞群的特征，并应用于早期诊断胃癌前病变的新用途。
本发明提供了13个分子(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)在胰腺、肠和食管等组织中从癌前病变到早癌的变化特征，并应用于早期诊断胰腺癌、肠癌和食管癌的新用途。
本发明提供了13个分子(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)的表达水平与胃癌术后复发生存风险之间的关联，并应用于判断胃癌术后复发风险的新用途。
3)本发明提供了一种检测试剂盒，既可用于免疫组化(IHC)染色上述蛋白分子获取其在待测胃组织中的表达情况，进而评估待测组织中的胃癌前病变早期阶段细胞以及早癌细胞含量；也可以用于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测上述蛋白分子在血液中的表达情况
4)本发明提出了一种胃癌前病变、胃癌、胰腺癌、肠癌以及食管癌早期诊断和胃癌术后复发风险评估的系统和方法。对于该系统依据组织或血液中细胞标志蛋白的表达情况，来评估胃组织中胃癌前病变细胞以及早癌细胞数量，进而给出待检测者罹患胃癌前病变以及胃癌的风险、胃癌术后复发的风险。该系统还可以依据患者组织或血液中细胞标志蛋白的表达情况，给出待检测者罹患肠癌、食管癌、胰腺癌等消化系统其他肿瘤的风险。该系统包括以下两部分：
检测试剂盒(20)，用于分别免疫组化染色上述胃癌前病变早期阶段细胞标志HES6(10)以及13种胃癌极早期细胞标志(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)的表达水平(11)从而获取其在待测组织中的表达情况；也可以用于通过酶联免疫吸附测定检测获取待测患者血液样本中胃癌极早期细胞标志的含量。
若是待测组织样本，则胃癌前病变及胃癌极早期细胞计数装置(30)，用于确定胃癌前病变早期阶段细胞标志HES6阳性细胞比例分数(31)以及胃癌极早期细胞标志KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B阳性细胞比例分数(32)。若是待测血液样本，则该计数装置通过计算平均值进而确定血清中KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B的总体表达水平(33)。
系统根据胃癌前病变早期阶段细胞占整个待测组织中细胞总数的比例给出患者罹患胃癌前病变的风险指数以及罹患胃癌的风险指数；也可根据胃癌极早期细胞比例占整个待测组织中细胞总数的比例给出患者罹患胃癌的风险指数、以及胃癌术后复发风险指数；也可根据食管、胰腺以及肠道组织中胃癌极早期细胞标志物分子的表达水平来分别评估罹患食管癌、胰腺癌以及肠癌的风险指数。同时，胃癌极早期细胞的标志物分子在血清中的总体表达水平也可以用来评估待测患者罹患消化系统肿瘤的风险指数
5)本发明提出了分别检测上述胃癌前病变早期阶段细胞标志HES6(10)以及13种胃癌极早期细胞标志(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)的表达水平从而获取其在待测组织/血液中的表达情况的试剂在制备用于早期诊断胃癌前病变和/或胃癌及其他消化系统肿瘤中的组合物中的应用。
附图说明
图1是根据本发明的一个实施例的基于细胞标志的胃癌前病变及胃癌及其他消化系统肿瘤辅助早期诊断系统的原理图。
图2A用于说明根据本发明的一个典型实施例的，论证细胞标志HES6在胃癌前病变特定细胞类型中特异表达的示意图。
图2B是在根据本发明的实施例中胃癌前病变早期阶段细胞标志(HES6)所标记的阳性细胞与癌前病变晚期阶段标志MUC2所标记的阳性细胞在胃癌前病变组织中的比例分布。
图2C是在根据本发明的实施例中胃癌前病变早期阶段细胞标志(HES6)所标记的阳性细胞在非癌前病变阶段、轻度癌前病变、重度癌前病变以及胃癌早期阶段等四个阶段胃组织中的比例分布。
图2D是在根据本发明的实施例中胃癌前病变细胞标志(HES6)所标记的阳性细胞在正常胃组织以及胃癌前病变组织中的比例分布。
图2E用于说明根据本发明的一个典型实施例的、论证细胞标志HES6与胃癌前病变经典标志MUC2在组织中部分共表达的示意图。
图2F用于说明根据本发明的一个典型实施例的、论证细胞标志HES6在组织中伴随着增值细胞标志KI67出现，但不共表达的示意图。
图3A是在根据本发明的实施例中13个早癌细胞标志(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)在胃早癌组织中不同类型细胞的表达模式。
图3B是在根据本发明的实施例中13个早癌细胞标志(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)在独立的胃炎(19例)、胃癌前病变(39例)及胃早癌(19例)样本中的表达模式。
图3C是在根据本发明的实施例中13个早癌细胞标志(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)在独立的胃炎、胃癌患者血液样本中的表达模式。
图3D是在根据本发明的实施例中胃癌极早期细胞五个代表性标志分子(KLK10、KRT17、TIMP1、MAP17和KLK6)在正常胃组织、异型增生(胃癌前病变)以及早期胃癌的表达模式。
图3E是在根据本发明的实施例中胃癌极早期细胞典型标志(KLK10)所标记的阳性细胞在胃癌前病变、早期胃癌以及进展期胃癌中的比例分布。
图4用于说明根据本发明的一个典型实施例的胃癌极早期细胞标志代表性成分(KLK10、SLC11A2、KLK7和TIMP1)与胃癌术后复发风险的关联。
图5A是在根据本发明的实施例中13个胃癌极早期细胞标志(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)在独立的正常肠组织(38例)、癌前病变(29例)及肠癌(27例)样本中的表达模式。
图5B是在根据本发明的实施例中13个胃癌极早期细胞标志(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)在独立的正常食管(5例)、癌前病变(4例)及食管癌(3例)样本中的表达模式。
图5C是在根据本发明的实施例中胃癌极早期细胞标志中代表性分子(ECM1、KRT17、TIMP1以及MMP7)在独立的正常胰腺(8例)、上皮内瘤变(6例)及胰腺癌(12例)样本中的表达模式。
具体实施方式
图1是根据本发明的一个实施例的基于细胞标志的胃癌前病变及胃癌辅助早期诊断系统的原理图。
具体地，本发明首先提供了一种基于14个分子的检测试剂盒。该试剂盒包括检测KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B等分子表达水平的试剂，还包括空白液、稀释液、抗原修复液等。作为优选实施方案之一，所述试剂为免疫组化检测方法用抗体，具体如表1所示。所述试剂也可以为WesternBlot或ELISA检测方法用抗体。
表1.待测分子所用免疫组化检测抗体列表及配制浓度比
Figure BDA0002439575120000051
Figure BDA0002439575120000061
其次，本发明还提供了一种胃组织中上述13个分子表达水平的免疫组化检测方法。在该检测方法的一个实施例中，除试剂盒中包含的上述试剂外，用户可自行配制或购买以下试剂：
(1)蒸馏水或去离子水；
(2)3％H2O2；
(3)二甲苯；
(4)75％、85％、95％酒精及无水乙醇；
(5)10mM TBS溶液(pH7.2～7.4)：三羟基氨基甲烷1.21g，氯化钠7.6g，加蒸馏水800mL，浓盐酸调pH值至7.2～7.4，最后定容至1000mL；
(6)10mM pH6.0柠檬酸缓冲液：柠檬酸0.38g，柠檬酸三钠2.45g，加蒸馏水900mL，浓盐酸调pH值至6.0，最后定容至1000mL；
(7)苏木精溶液；
(8)中性树脂。
实施例1
为了验证本发明在辅助早期诊断胃癌前病变以及消化系统肿瘤、预测胃癌复发风险的作用，本发明人分别独立地对胃癌前病变、胃早癌、胃癌复发、其他消化系统肿瘤(肠癌、食管癌和胰腺癌)及其癌前病变典型病例进行了分析。
胃癌前病变极早期细胞的诊断
首先，发明人评估了胃癌前病变极早期细胞标志HES6在独立胃癌前病变样本不同类型细胞中的表达情况。结果如图2A所示，HES6在胃癌前病变细胞中特异高表达。
其次，发明人评估了胃癌前病变极早期细胞标志HES6与晚期标志MUC2在独立的胃癌前病变样本中的共表达情况。结果如图2B所示，HES6与MUC2呈互斥的表达模式，提示HES6所标记的细胞不在癌前病变晚期出现。
再次，发明人评估了胃癌前病变极早期细胞在非癌前病变阶段、轻度癌前病变阶段、重度癌前病变阶段以及早期癌变等四个阶段胃组织样本中的比例分布。结果如图2C所示，胃癌前病变极早期细胞在轻度癌前病变阶段中开始出现，并随着癌前病变程度的加深，其比例逐渐增加。
再次，依据本发明的免疫组化测试试剂盒(20)中胃癌前病变细胞标志(10)来获取HES6在胃癌前病变样本中的表达。该试剂盒利用免疫组化染色(IHC)来衡量标志物的表达水平。作为补充分析，发明人同时在样本中利用荧光共染了胃癌前病变经典标志MUC2以及细胞增值标志KI67。采用10％福尔马林缓冲液固定石蜡包埋手术样本，组织切片为4微米/张。
本实施例中的试剂盒，包括以下组分：
(1)试剂A：封闭液，为10％山羊血清；
(2)试剂B：已稀释的即用型抗HES6一抗；
(4)试剂C：抗山羊生物素化二抗；
(5)试剂D：链亲和素标记的HRP；
(6)试剂E：20倍浓缩DAB底物溶液；
(7)试剂F：20倍浓缩DAB底物缓冲溶液；
(8)试剂G：20倍浓缩DAB显色溶液。
根据本发明的一个具体实施例，上述试剂B原装进口分装即用型抗体，稀释倍数为1：200；试剂G原装进口分装即用型抗体，稀释倍数为1：400；试剂A、C、D、E、F、G为原装进口分装。
根据本发明的一个具体实施例，除试剂盒中包含的上述试剂，用户可自行配制或购买以下试剂：
(1)蒸馏水或去离子水；
(2)3％H 2O 2；
(3)二甲苯；
(4)75％、85％、95％酒精及无水乙醇；
(5)10mM TBS溶液(pH7.2～7.4)：三羟基氨基甲烷1.21g，氯化钠7.6g，加蒸馏水800mL，浓盐酸调pH值至7.2～7.4，最后定容至1000mL；
(6)10mM pH6.0柠檬酸缓冲液：柠檬酸0.38g，柠檬酸三钠2.45g，加蒸馏水900mL，浓盐酸调pH值至6.0，最后定容至1000mL；
(7)苏木精溶液；
(8)中性树脂。
利用上述试剂盒检测组织中标志物的表达：
(1)组织包埋：10％的中性福尔马林固定待测组织标本2h，用流水反复冲洗以去除固定液，将标本放置入75％酒精过夜，然后采用酒精梯度脱水，75％酒精1h，85％酒精1h，95％酒精1h，无水乙醇2次，每次1.5h，然后置于二甲苯中浸泡1.5h，60℃烘箱中浸蜡1h包埋，冷却后4℃保存备用；
(2)石蜡切片：修整蜡块，调整切片机(SLEE石蜡切片机CUT5062)将切片厚度设为3～4μm，连续切片，置于60℃温水漂浮展平，平铺于涂有阳离子树脂的载玻片上；
(3)烤片：将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1h；
(4)脱蜡：切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，每次10min；
(5)水化：切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95％乙醇2次(每次2min)，85％乙醇2min；75％乙醇2min，蒸馏水冲洗1分钟；
(6)抗原修复：高压锅中加入柠檬酸缓冲液1000ml，将装有切片的切片架浸入缓冲液中，高温高压修复2分45秒，用TBS洗涤3次，每次2min；
(7)3％H 2O 2滴加在切片上，室温静置15min，TBS洗涤3次，每次2min；
(8)封闭：滴加试剂A于切片上，需完全覆盖组织切片，室温孵育10min后吸干液体，无需冲洗；
(9)加一抗：不同的切片分别滴加试剂B(抗Hes6一抗)，需完全覆盖组织切片，37℃湿盒孵育2hr或4℃过夜；
(10)洗涤：TBS-T洗涤(3×5min)；
(11)加二抗：试剂C(滴加生物素化二抗)，需完全覆盖组织切片，37℃湿盒中孵育30min；
(12)洗涤：TBS洗涤3次，每次5min；
(13)加HRP-SA：滴加试剂D(链亲和素标记的HRP)，需完全覆盖组织切片，37℃湿盒中孵育30min；
(14)洗涤：TBS洗涤3次，每次5min；
(15)制备DAB显色液：需现用现配，以染一张切片为例，取2.5ul试剂E加入到50ul蒸馏水中并混匀，再分别向上述液体中加入2.5ul试剂F及2.5ul试剂G，混匀；
(16)显色：滴加上述DAB显色液于切片上，需完全覆盖组织切片，显微镜下观察显色，蒸馏水冲洗终止显色；
(17)复染：苏木精复染3min，盐酸酒精分化；
(18)封片：75％酒精浸泡2min，85％酒精浸泡2min，95％酒精浸泡2min，无水乙醇浸泡2min，然后置于二甲苯中浸泡15min，更换二甲苯后再浸泡15min，中性树脂封片；
(19)结果判读：显微镜下观察染色的待测组织切片，阳性结果成棕黄色颗粒样染色，随机选择5个高倍视野(10*40)估计阳性细胞比例。
图2D展示了细胞标志HES6在正常胃组织、癌前病变胃组织中的表达情况。可以看出，在正常胃组织中HES6阳性细胞占比为0，而在胃癌前病变中其比例增加到10％。
最后，作为进一步的实施例材料，图2E和图2F分别展示了在独立的癌前病变样本中细胞标志HES6与经典的胃癌前病变标志MUC2以及增值细胞标志KI67之间共表达模式。。从图2E中可以看出，，HES6与胃癌前病变经典标志MUC2部分共表达；而从图2F中可以看出，HES6在组织中环绕在增值细胞标志KI67周围。因此可以认为HES6阳性细胞即为胃癌前病变早期阶段细胞。
胃癌极早期细胞在胃组织、血液样本中的诊断
首先，发明人评估了13个胃癌极早期细胞标志物分子(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)在独立胃早癌样本中不同细胞类型的表达情况。结果如图3A所示，这些细胞标志在癌细胞中特异高表达。
其次，本发明人评估了13个胃癌极早期细胞标志(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)在独立的胃炎(19例)、胃癌前病变(39例)及胃早癌(19例)样本中的表达情况。结果如图3B所示，这些细胞标志在胃炎中表达量显著低于异型增生阶段(胃癌前病变)和胃早癌阶段。将上述分子的均值表达作为一个分子标记(signature),发现其在胃炎-低级别异型增生-高级别异型增生-早期胃癌的转化中呈逐渐递增的变化趋势，提示上述分子在胃组织中的高表达与胃癌的发生具有密切关联，可作为评估胃癌发生风险的指标。本验证中涉及的样本数据来自于公共数据(GSE55696)。
再次，本发明人评估了13个胃癌极早期细胞标志(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)在独立的胃炎、胃癌患者血液样本中的表达情况。结果如图3C所示，相比于正常对照样本，这些细胞标志物在胃癌患者血清中的表达水平显著升高。将上述分子的均值表达水平作为分子标记(signature),发现其数值相比正常样本，在癌症样本中也显著升高。提示上述分子在血清中的高表达也与胃癌的发生具有密切关联，也可作为评估胃癌发生风险的指标。本验证涉及的样本数据来自于公共数据(GSE64916)。
实施例2
本发明人依据本发明的免疫组化测试试剂盒(20)中胃癌前病变细胞标志(11)来获取早癌细胞标志中五个代表性成分(KLK10、KRT17、TIMP1、MAP17和KLK6)在正常胃组织、胃癌前病变、早期癌变以及进展期癌变中的表达。该试剂盒利用免疫组化染色(IHC)来衡量标志物的表达水平。采用10％福尔马林缓冲液固定石蜡包埋手术样本，组织切片为4微米/张。
本实施例中的试剂盒，包括以下组分：
(1)试剂A：封闭液，为10％山羊血清；
(2)试剂B：已稀释的即用型抗Klk10一抗(也可以是Table 1中KRT17,TIMP1,MAP17以及KLK6抗体的任意一只)；
(4)试剂C：抗山羊生物素化二抗；
(5)试剂D：链亲和素标记的HRP；
(6)试剂E：20倍浓缩DAB底物溶液；
(7)试剂F：20倍浓缩DAB底物缓冲溶液；
(8)试剂G：20倍浓缩DAB显色溶液。
根据本发明的一个具体实施例，上述试剂B原装进口分装即用型抗体，稀释倍数为1：200；试剂G原装进口分装即用型抗体，稀释倍数为1：400；试剂A、C、D、E、F、G为原装进口分装。
除试剂盒中包含的上述试剂，本发明人还自行配制了以下试剂(这些试剂也可以在市面上购买到)：
(1)蒸馏水或去离子水；
(2)3％H 2 O 2；
(3)二甲苯；
(4)75％、85％、95％酒精及无水乙醇；
(5)10mM TBS溶液(pH7.2～7.4)：三羟基氨基甲烷1.21g，氯化钠7.6g，加蒸馏水800mL，浓盐酸调pH值至7.2～7.4，最后定容至1000mL；
(6)10mM pH6.0柠檬酸缓冲液：柠檬酸0.38g，柠檬酸三钠2.45g，加蒸馏水900mL，浓盐酸调pH值至6.0，最后定容至1000mL；
(7)苏木精溶液；
(8)中性树脂。
利用上述试剂盒检测组织中标志物的表达：
(1)组织包埋：10％的中性福尔马林固定待测组织标本2h，用流水反复冲洗以去除固定液，将标本放置入75％酒精过夜，然后采用酒精梯度脱水，75％酒精1h，85％酒精1h，95％酒精1h，无水乙醇2次，每次1.5h，然后置于二甲苯中浸泡1.5h，60℃烘箱中浸蜡1h包埋，冷却后4℃保存备用；
(2)石蜡切片：修整蜡块，调整切片机(SLEE石蜡切片机CUT5062)将切片厚度设为3～4μm，连续切片，置于60℃温水漂浮展平，平铺于涂有阳离子树脂的载玻片上；
(3)烤片：将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1h；
(4)脱蜡：切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，每次10min；
(5)水化：切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95％乙醇2次(每次2min)，85％乙醇2min；75％乙醇2min，蒸馏水冲洗1分钟；
(6)抗原修复：高压锅中加入柠檬酸缓冲液1000ml，将装有切片的切片架浸入缓冲液中，高温高压修复2分45秒，用TBS洗涤3次，每次2min；
(7)3％H 2 O 2滴加在切片上，室温静置15min，TBS洗涤3次，每次2min；
(8)封闭：滴加试剂A于切片上，需完全覆盖组织切片，室温孵育10min后吸干液体，无需冲洗；
(9)加一抗：不同的切片分别滴加试剂B，需完全覆盖组织切片，37℃湿盒孵育2hr或4℃过夜；
(10)洗涤：TBS-T洗涤(3×5min)；
(11)加二抗：试剂C(滴加生物素化二抗)，需完全覆盖组织切片，37℃湿盒中孵育30min；
(12)洗涤：TBS洗涤3次，每次5min；
(13)加HRP-SA：滴加试剂D(链亲和素标记的HRP)，需完全覆盖组织切片，37℃湿盒中孵育30min；
(14)洗涤：TBS洗涤3次，每次5min；
(15)制备DAB显色液：需现用现配，以染一张切片为例，取2.5ul试剂E加入到50ul蒸馏水中并混匀，再分别向上述液体中加入2.5ul试剂F及2.5ul试剂G，混匀；
(16)显色：滴加上述DAB显色液于切片上，需完全覆盖组织切片，显微镜下观察显色，蒸馏水冲洗终止显色；
(17)复染：苏木精复染3min，盐酸酒精分化；
(18)封片：75％酒精浸泡2min，85％酒精浸泡2min，95％酒精浸泡2min，无水乙醇浸泡2min，然后置于二甲苯中浸泡15min，更换二甲苯后再浸泡15min，中性树脂封片；
(19)结果判读：显微镜下观察染色的待测组织切片，阳性结果成棕黄色颗粒样染色，随机选择5个高倍视野(10*40)估计阳性细胞比例。
如图3D展示了胃癌极早期细胞中五个代表性标志分子(KLK10、KRT17、TIMP1、MAP17和KLK6)在正常胃组织、异型增生(胃癌前病变)以及早期胃癌的表达情况。其中，在胃癌前病变中依据上述代表性标志分子所识别出的胃癌极早期细胞用圆圈圈了出来。可以看出，胃癌极早期细胞开始出现于异型增生阶段，并在早癌中继续存在。
进而，利用本发明的早期诊断系统中胃癌前病变及早癌细胞计数装置(32)，计算了在各个阶段中胃癌极早期细胞的含量。如图3E展示了胃癌极早期细胞典型标志(KLK10)所标记的阳性细胞在胃癌前病变、早期胃癌以及进展期胃癌中的比例分布。可以看出KLK10阳性细胞未出现在胃癌前病变阶段样本，而在早期胃癌样本中其比例为5％，在进展期样本中其比例增加到35％。
胃癌极早期细胞标志物分子在评估胃癌术后复发风险中的应用
发明人评估了胃癌极早期细胞标志中的代表性成分(KLK10、SLC11A2、KLK7和TIMP1)与胃癌术后复发风险的关联。这些数据来源于431例记录术后复发时间信息的胃癌患者。结果如图4所示，上述细胞标志与胃癌术后复发生存风险呈显著相关(p<0.05)。将胃癌极早期细胞标志分子在样本中的均值表达量作为一个分子标记(signature),发现其也与胃癌的术后复发呈显著相关(p<0.01)，提示了该胃癌极早期细胞标志可作为评估胃癌复发风险的标志物。本验证中涉及的样本数据来自于公共数据(TCGA)。
胃癌极早期细胞标志物分子在评估胰腺癌、肠癌以及食管癌风险中的应用
本发明人还验证了胃癌极早期细胞标志分子(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)在评估消化系统其他器官(胰腺、食管以及肠)从癌前病变向癌症转化风险的应用。
1.胃癌极早期细胞标志物分子在评估肠癌风险中的应用。本发明人评估了13个胃癌极早期细胞标志(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)在独立的正常肠组织(38例)、癌前病变(29例)及肠癌(27例)样本中的表达情况。结果如图5A所示，这些胃癌极早期细胞标志在正常肠组织中的表达量显著低于异型增生阶段(肠癌前病变)和肠癌阶段(p<0.05)。将上述分子在样本中表达量的均值作为分子标记(signature),发现其在正常肠-低级别异型增生-高级别异型增生-肠癌的转化过程中呈逐渐递增的变化趋势，提示上述分子在肠组织中的高表达与肠癌的发生具有密切关联，可作为评估肠癌发生风险的指标。本验证中涉及的样本数据来自于公共数据(GSE37364)。
2.胃癌极早期细胞标志物分子在评估食管癌风险中的应用。
其次，本发明人评估了13个胃癌极早期细胞标志(KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B)在独立的正常食管(5例)、癌前病变(4例)及食管癌(3例)样本中的表达情况。结果如图5B所示，这些胃癌极早期细胞标志在正常食管中的表达量低于异型增生阶段(癌前病变)和食管癌阶段。提示上述分子在食管中的高表达与食管癌的发生具有密切关联，可作为评估食管癌发生风险的指标。本验证中涉及的样本数据来自于公共数据(GSE19529)。
3.胃癌极早期细胞标志中代表性分子在评估胰腺癌风险中的应用。
本发明人评估了胃癌极早期细胞标志中代表性分子(ECM1、KRT17、TIMP1和MMP7)在独立的正常胰腺(8例)、上皮内瘤变(6例)及胰腺癌(12例)样本中的表达情况。结果如图5C所示，这些胃癌极早期细胞代表性标志物分子在正常胰腺组织中的表达量显著低于在上皮内瘤变阶段(癌前病变)和胰腺癌中。将上述分子的均值表达作为一个分子标志(signature),发现其在正常胰腺-胰腺上皮内瘤变-胰腺癌的转化过程中呈逐渐递增的变化趋势，提示上述分子在胰腺组织中的高表达与胰腺癌的发生具有密切关联，可作为评估胰腺癌发生风险的指标。本验证中涉及的样本数据来自于公共数据(GSE43288)。
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Claims (20)

1.检测标志物的表达水平的试剂在制备确定胃癌极早期细胞含量从而确定极早期胃癌的产品中应用，其中所述标志物包括从由KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B组成的组中选出的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述试剂利用免疫组化染色或酶联免疫吸附来衡量所述标志物的表达水平。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述产品是从芯片、制剂、试剂盒中选出的一种。
4.一种用于确定胃癌极早期细胞含量的产品，其特征在于，所述产品包括检测样本中标志物表达水平的试剂，其中所述标志物包括从由KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B组成的组中选出的至少一种。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于所述产品是从芯片、制剂、试剂盒中选出的一种。
6.检测标志物的表达水平的试剂在制备用于消化系统肿瘤的辅助极早期诊断的产品中应用，其中所述标志物包括从由KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B组成的组中选出的至少一种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述试剂利用免疫组化染色来衡量所述标志物的表达水平。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：
所述产品是从芯片、制剂、试剂盒中选出的一种。
9.一种用于消化系统肿瘤的辅助极早期诊断的产品，其特征在于：
所述产品包括检测样本中标志物表达水平的试剂，其中所述标志物包括从由KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B组成的组中选出的至少一种。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于所述试剂利用免疫组化染色来衡量所述标志物的表达水平。
11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于：
所述产品是从芯片、制剂、试剂盒中选出的一种。
12.检测HES6表达水平的试剂在制备确定胃癌前病变水平的产品中应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：
所述试剂利用免疫组化染色或酶联免疫吸附来衡量HES6的表达水平。
14.根据权利要求12或13所述的应用，其特征在于：
所述产品是从芯片、制剂、试剂盒中选出的一种。
15.一种用于确定胃癌前病变水平的产品，其特征在于所述产品包括检测样本中HES6表达水平的试剂。
16.根据权利要求15所述的产品，其特征在于：
所述试剂利用免疫组化染色或酶联免疫吸附来衡量HES6的表达水平。
17.根据权利要求15或16所述的产品，其特征在于所述产品是从芯片、制剂、试剂盒中选出的一种。
18.检测标志物的表达水平的试剂在制备用于辅助评估胃癌复发风险的产品中应用，其中所述标志物包括从由KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3、KLK6、KIAA1199、KRT17、MMP7、TIMP1、PDZK1IP1和KRT6B组成的组中选出的至少一种。
19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于：
所述试剂利用免疫组化染色来衡量所述标志物的表达水平。
20.根据权利要求18或19所述的应用，其特征在于：
所述产品是从芯片、制剂、试剂盒中选出的一种。
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