CN108982445A - 多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统。本发明中1220nm飞秒激光被引入到奥林巴斯正置扫描显微镜，经过近红外增透物镜聚焦于样品，近红外二区荧光信号由大口径光纤准直器收集后耦合进近红外增透大口径光纤，最终被近红外二区响应的光电倍增管探测转换成电信号，电信号由信号放大器放大后转换成电计数信号输入TCSPC计数板卡，同时TCSPC计数板卡接收到来自激光器的同步脉冲信号，将其作为计时停止信号，用以计算出所接收光子的时间信息，经计算机处理后，得到样品的近红外二区双光子荧光寿命图像和近红外二区双光子荧光强度图像。本发明简单实用、稳定性好、使用方式灵活。

Description

多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统

技术领域

本发明属于应用光学的显微生物成像领域，涉及一种多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统。

背景技术

一、多光子激发的近红外二区荧光显微成像

根据生物组织窗口的相关理论，近红外二区（1000～1700nm）荧光在生物组织中具有较强的穿透能力，有利于实现大深度成像，并且生物组织不具备这一波段的自发荧光，因此图像具有较高的信噪比。目前，市场上已有商用的近红外二区荧光宏观成像系统，可以实现生物标本（如小鼠）的近红外二区荧光宏观（全身）成像。然而这种成像方式空间分辨率较低，且缺乏生物样品的深度信息。

为解决这一问题，人们开发出了激光逐点扫描和光电倍增管逐点探测的三维显微成像方式，它主要有两种类型：单光子荧光共聚焦扫描成像和多光子荧光扫描成像（包括双光子，三光子激发等）。本发明在第二种类型：“多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统”的基础上，进一步引入时间相关单光子计数(TCSPC)技术，实现多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像。

二、时间相关单光子计数——TCSPC（Time-Correlated Single PhotonCounting）。

TCSPC技术是20世纪60年代晚期开始出现的一种极弱光探测技术。早期由于光源重复频率低和电子学系统速度慢的限制，TCSPC技术的采集时间相对较长。经过20多年的发展，该技术已经从一种慢速、一维的荧光寿命测量技术，发展成为一种快速、多维的光学信号记录技术。现在，先进的TCSPC技术已被广泛应用于单分子光谱、荧光相关光谱、时间分辨激光扫描显微成像和扩散光学层析成像等领域。

目前，商用的基于TCSPC技术的时间分辨激光扫描显微成像系统，其基本原理如下：记录下所探测的每一个光子的时间信息（t）和像素位置信息（X，Y），分别存入不同的内存。（X,Y）这两个参数表征该光子属于图像的哪个像素点，根据这两个参数的不同，可以把所探测到的光子分配给图像上不同的像素点；t这一参数表明该光子所处的激光脉冲周期的时间位置，根据这一参数的不同，可以把所探测到的光子按照时间分布累积起来，进而拟合出荧光衰减曲线，得到样品每个像素点上的荧光寿命。此外，每个像素点上累积的光子数能代表该像素的总体光强度，于是一幅光强度成像图也可以被重构出来。然而，目前该商用成像系统主要存在以下两点不足：

1.主要用于探测可见光波段（380～780nm）的微弱荧光。由于实验室环境中可见光波段的杂散光较多，为防止系统过曝，需要做严格的遮光处理并且对激发光功率也有严格限制，以防样品过亮而使成像过曝——这些限制都对实验条件提出了严格要求。

2.可见光波段对于大深度的生物显微成像而言并非最优，而波长位于近红外二区（1000～1700nm）的光在生物组织中的散射较小，并且生物组织在近红外二区波段的自发荧光相对较小，因此基于近红外二区的荧光生物成像具有大深度、高分辨率、高信噪比的特点。而且实验室环境中的近红外杂散光很少，所以不需要非常严格的遮光处理。

然而，基于近红外二区成像的TCSPC显微成像系统，市面上鲜有商用。2013年4月，Becker & Hickl GmbH 公司推出了一款基于铟镓砷（InGaAs）单光子雪崩二极管的近红外（900～1700nm）TCSPC系统，然而，该系统各部分硬件封装严密，需要整机购买，价格昂贵，且这类“黑箱”式的使用方式对科研工作者而言，使用方式过于单一，缺乏使用的灵活性，不利于根据特定的实验条件进行改装使用。更重要的是，该系统尚未和扫描显微镜相结合，实现多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像功能。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统。

本发明的主要技术构思：本发明以奥林巴斯的正置扫描显微镜（FV1200+BX61）为基础光学系统，结合近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）、大口径近红外增透光纤准直器、近红外增透大口径光纤、TCSPC计数板卡（Becker & Hickl SPC-150），开发出一套基于TCSPC技术的多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统。本发明将1220nm飞秒脉冲激光引入系统激发近红外二区荧光探针（PbS量子点，荧光峰1250nm），并截取了900～1180nm波段的荧光信号的光子进行探测，取得了不错的效果，既获取了材料的近红外二区双光子荧光寿命图像，又得到了材料的近红外二区双光子荧光强度图像。

本发明的技术方案是：

本发明包括奥林巴斯正置扫描显微镜（FV1200+BX61）、近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）、近红外增透的大口径光纤准直器、近红外增透的大口径光纤、TCSPC计数板卡（Becker & Hickl SPC-150）、大带宽的信号放大器（C5594，滨松）、1220nm飞秒脉冲激光光源等。

在该系统中，1220nm飞秒激光被引入奥林巴斯正置显微镜（其扫描透镜和管镜是红外增透的），经过近红外增透物镜（XLPLN25XWMP2）聚焦于样品（PbS量子点），量子点的近红外荧光二区荧光信号由大口径光纤准直器收集后耦合进光纤，最终被近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）探测转换成电信号，电信号由信号放大器（C5594，滨松）放大后转换成电计数信号输入TCSPC计数板卡，同时计数板卡接收到来自激光器的同步脉冲信号（SYNC），将其作为计时停止信号，用以计算出所接收光子的t信息（光子所处的激光脉冲周期的时间位置），经计算机处理后，得到样品的近红外二区双光子荧光寿命图像和近红外二区双光子荧光强度图像。

本发明具有的优势是：

第一，相较于普通的多光子荧光显微成像系统，该系统由于其激发光和所探测到的荧光信号均位于近红外二区波段，且各部分光路都是针对该波段做特定优化的，因此具有更好的激发、探测效率，更大的生物组织成像深度，更小的生物组织损伤等。

第二，相较于封装严密的商用近红外TCSPC系统，该系统由各个功能独立的硬件模块组成，拆装方便，使用方式多样，总成本远低于商用近红外TCSPC系统。此外，目前的商用近红外TCSPC系统主要用于单光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像，若要获得高空间分辨率，需采用针孔（pinhole）进行共聚焦成像，而本发明采用双光子激发机制，省去了针孔，无需做精准的成像匹配，这大大简化了结构，使得操作更加简便。

第三，本发明首次将TCSPC技术用于近红外二区双光子荧光寿命显微，可同时获得样品的近红外二区双光子荧光寿命图像和近红外二区双光子荧光强度图像。利用这两个维度的信息进行活体显微成像，将获得大深度，高分辨率，信息丰富的生物图像。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为双光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像图（图中显示PbS量子点的近红外二区荧光寿命为196ns）；

图3为双光子激发的近红外二区荧光强度成像图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明。

本发明搭建了一套多光子激发的近红外二区（1000-1700nm）荧光寿命显微成像系统。它是在扫描显微镜的基础上，用波长可调谐的飞秒脉冲激光作为光源（这里以1220nm飞秒激光为例，检验系统的有效性），通过近红外增透的大口径光纤准直器及近红外增透的大口径光纤，将样品的近红外二区荧光引入近红外二区响应的光电倍增管（PMT）（H12397-75）并转换为电信号，配合Becker&Hickl的计数板卡（SPC-150），利用TCSPC技术，实现近红外二区多光子荧光寿命显微成像。

如图1所示，本实施例包括奥林巴斯正置扫描显微镜（FV1200+BX61）、近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）、近红外增透的大口径光纤准直器、近红外增透的大口径光纤、TCSPC计数板卡（Becker & Hickl SPC-150）、大带宽信号放大器、1220nm飞秒脉冲激光光源等。

首先，1220nm飞秒激光1通过爬高系统2（由两个全反镜组成），进入奥林巴斯正置扫描显微镜8（FV1200+BX61）。激发光进入显微镜后，通过扫描振镜系统3，达到扫描功能，再经过全反镜4，反射至1180nm短通二色镜5（1180nm以上的光被反射，1180nm以下的光能透射），经过二色镜反射后，准直的激发光进入近红外增透物镜9（XLPLN25XWMP2）。物镜将激发光聚焦于样品10（PbS量子点）。样品经激发光激励后产生荧光峰位于1250nm处的双光子荧光。荧光信号被物镜9收集后，入射到二色镜5，再经过二色镜的透射，荧光入射到1180nm短通滤光片6（用于进一步滤除激发光），经其滤光后，由摄影物镜7将荧光充分收集并缩束，然后入射到大口径光纤准直器11。光纤准直器将荧光耦合进近红外增透大口径光纤12，经过光纤传输后，荧光最终被近红外二区响应的光电倍增管13（H12397-75）探测到。由于探测到的荧光很弱，因此光电倍增管输出的电信号是不连续的，可以认为是电计数脉冲信号，电脉冲的个数与光子数一一对应，因此，统计出了电脉冲数目也就统计出了光子数。这些电脉冲信号传输到高带宽信号放大器14（滨松C5594信号放大器）。经放大后的电脉冲信号和来自激光器1的同步脉冲信号（SYNC）一起输入TCSPC计数板卡15（Becker & Hickl SPC-150）进行统计运算。最后计算机16根据板卡的统计数据（提供光子数目n和时间t的信息）和控制振镜的同步扫描信号（提供像素位置信息X,Y），构建出荧光寿命图像和荧光强度图像。通过这套自建的系统，取得的实验效果如图2、图3所示。

Claims (5)

1.多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统，包括奥林巴斯正置扫描显微镜、近红外二区响应的光电倍增管、近红外增透的大口径光纤准直器、近红外增透大口径光纤、TCSPC计数板卡、信号放大器、1220nm飞秒脉冲激光光源，其特征在于：

1220nm飞秒激光被引入到奥林巴斯正置扫描显微镜，经过近红外增透物镜聚焦于样品，近红外二区荧光信号由大口径光纤准直器收集后耦合进近红外增透大口径光纤，最终被近红外二区响应的光电倍增管探测转换成电信号，电信号由信号放大器放大后转换成电计数信号输入TCSPC计数板卡，同时TCSPC计数板卡接收到来自激光器的同步脉冲信号，将其作为计时停止信号，用以计算出所接收光子的时间信息，经计算机处理后，得到样品的近红外二区双光子荧光寿命图像和近红外二区双光子荧光强度图像。

2.根据权利要求1所述的多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统，其特征在于：所述的1220nm飞秒激光由爬高系统引入至奥林巴斯正置扫描显微镜。

3.根据权利要求2所述的多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统，其特征在于：所述的爬高系统由两个全反镜组成。

4.根据权利要求1所述的多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统，其特征在于：所述的奥林巴斯正置扫描显微镜中的扫描振镜系统受控于计算机。

5.根据权利要求1所述的多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统，其特征在于：所述的奥林巴斯正置扫描显微镜中的扫描振镜中的二色镜为1180nm短通二色镜。