CN103361063A - 一种稳定的水溶性量子点-菁染料探针 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种稳定的水溶性量子点-菁染料探针及其制备方法。该类探针具有量子点和菁染料的双重优点，稳定性和荧光量子产率较单独的量子点或菁染料都有显著提高，同时具有良好的水溶性，可以被近红外光源激发，能够作为血液样品中白细胞分类的染色试剂应用，且具有灵敏度高，用量少的优点。

Description

一种稳定的水溶性量子点-菁染料探针

技术领域

本发明涉及水溶性量子点-菁染料探针，具体地讲，本发明涉及一种最大吸收在近红外区域的水溶性量子点-菁染料探针，其制备方法以及在生物样品染色中的用途。

背景技术

近红外荧光探针在生物体内分子的诊断识别中起着关键的作用。因为近红外波段(600～800nm)的光波避开了体内水，有氧及无氧血红蛋白等主要吸收组织的最佳吸收波长，因而具有良好的生物组织穿透能力，且对生物组织无损伤。用于生物分子和细胞标记与识别的近红外荧光探针包括无机分子荧光探针和有机分子荧光探针两类。无机分子荧光探针主要是量子点(Quantum Dots，QDs)。QDs是指半径小于或接近于激子波尔半径的半导体纳米晶粒，粒径通常为1-10nm，一般为由II-VI族或III-V族元素构成的化合物。有机分子荧光探针的种类比较多，如早期应用的吖啶、菲啶类染料，包括吖啶橙、溴乙锭等，但有很大的毒性和致癌性。随后人们发现了TOTO(噻唑橙二聚体)、YOYO(恶唑黄二聚体)等类型的多正电荷荧光染料，但存在着Stoke位移小，量子产率低等不足。此外，这些有机染料的光化学稳定性较差，光漂白与光解使每个染料探针能够发出的荧光光子平均数量不可能太多，光解产物还往往会对生物体产生杀伤作用。

量子点作为一种新型荧光染料，具有很多独特而优良的光学特性，包括(1)连续而宽的激发光谱，且荧光谱峰位置可通过改变QDs的粒径进行调控，这样仅用一种波长的激发光源便可激发多种不同颜色荧光的QDs，进行多元荧光检测。(2)发射光谱窄，可同时显现多种不同颜色而无重叠。(3)Stokes位移大，能够避免发射谱与激发谱重叠，从而允许在低信号强度的情况下进行光谱学检测。(4)抗光漂白能力强，而这种抗光漂白的高度光稳定性对于需要长时间成像的研究而言极为重要。(5)光稳定性高，便于获得无背景干扰的荧光信号等优良的光物理特性。(6)荧光产率高，强度强，单一量子点表现出的荧光亮度是有机荧光染料的10-20倍。因此，量子点在多个研究领域显示出其独特的应用前景。

量子点合成方法依据采用的溶剂可归结为两大类，一种方法是在高沸点的有机溶剂中利用前躯体热分解来合成，得到的产物荧光效率高、尺寸均匀、稳定性好。另一种是利用稳定剂在水溶液中直接合成，产物的尺寸分布宽，荧光效率较低。一般量子点的合成是在有机溶剂中进行的，在非金属核的外面形成了疏水性的外壳，使得合成的量子点具有疏水性而不能在生物学上应用。为了使它们具有生物相容性，常对它们进行功能化，或对其进行第二层包被，可以增强其水溶性、核的持久稳定性以及悬浮性质，使量子点具有更好的生物活性。

CN100497516公开一种稳定的水溶性壳聚糖衍生物荧光量子点及其制备方法。这种荧光量子点以壳聚糖衍生物为模版，在其分子网格中原位生长形成纳米微晶的方法制得，产品粒径在2～6nm之间。但这些壳聚糖衍生物不具有抗氧化的能力，不能提高量子点-菁染料形成共价偶联探针的稳定性。

CN101638579公开了一种量子点-菁染料-叶酸生物探针及其制备方法。该探针结构包括有量子点键合菁染料再键合叶酸而形成的探针，具有靶向识别肿瘤组织和荧光共振能量转移的特性。但在该探针中没有应用生物相容性良好的材料，与染料形成共价产物后不能有效改善其易被光漂白的不足。

CN10138160公开了一种生物相容的水相量子点的制备方法，该方法通过高质量的量子点及其核壳结构提高量子点的稳定性，再通过分子间力的相互作用，改变量子点表面的有机分子链，将油溶性量子点改性为具有生物相容性且易溶于水的量子点。但该方法需要在高温下制备，条件比较苛刻，且在对油性量子点改性过程较易降低荧光量子产率。

因此需要开发新的量子点，该量子点具有以下特点：具有量子点和菁染料的双重优点，量子点-菁染料具有良好的稳定性和荧光量子产率，量子点-菁染料探针具有良好的水溶性，可以被近红外光源激发，同时自身没有背景荧光的干扰。

发明内容

本发明的目的：本发明一种稳定的水溶性量子点-菁染料探针是为了利用量子点的优点同时改善菁染料容易被光漂白的不足，得到具有良好水溶性和生物安全性的探针，并提高量子产率，减少探针的用量。

本发明的技术方案：一种稳定的水溶性量子点-菁染料探针，首先利用谷胱甘肽作为稳定剂制备了具有良好水溶性的量子点，发射光谱在近红外区。在化学交联剂的作用下，量子点和近红外菁染料进一步偶联，形成量子点-菁染料探针。谷胱甘肽不仅起到偶联量子点和菁染料的桥梁作用，它的抗氧化作用也使得菁染料的光降解和稳定性得到了改善。

菁染料是一类重要的合成染料。菁染料分子内部含有亚甲基组成的共轭链，共轭链两端或者中间连接有杂环、芳香环化合物、环烯化合物等，与共轭链组成一个大的π共轭体系，分子内包的氢原子可被一定数目的各类取代基所取代，其吸收光谱可以通过改变亚甲基链的长度来调节。然而菁染料尤其是近红外菁染料的光稳定性较差，且亚甲基链越长，染料的稳定性越差，这已经成为影响其广泛使用的主要因素。因此，研究和提高菁染料的光稳定性具有十分重要的意义。至今，已经研究了亚甲基链上的取代基，端基杂环以及平衡离子对菁染料光降解的影响。除此以外，可通过与某些添加剂配合使用也能打到提高光稳定性的目的。

谷胱甘肽属于三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸所构成，半胱氨酸上的巯基为其活性基团。巯基与隔离子(Cd²⁺)具有较强的配位作用，可以包围在隔离子的周围，使量子点外面为羧基和氨基环绕，从而提高了量子点的水溶性和化学稳定性。以还原型谷胱甘肽为稳定剂制备的量子点水溶性较巯基酸包被的量子点的要强，且生物毒性低。谷胱甘肽是动物细胞中重要的抗氧化物，存在于充满水的细胞内部，可以保护DNA免于氧化。本发明人在研究过程中发现，谷胱甘肽稳定的量子点和菁染料偶联形成荧光探针后不仅使菁染料光的稳定性有了明显的改善，而且提高了菁染料的量子产率，降低了在生物检测中的使用量。

本发明所述一种稳定的水溶性量子点-菁染料探针通过如下步骤制备得到：

(1)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的制备

a、NaHA(A为Te或Se)溶液的制备

在磁力加热搅拌器上安装50mL洁净三口烧瓶，氮气保护条件下，向其中中加入适量A(A为Te或Se)和NaBH₄，恒温70～90℃，注入3mL煮沸后冷却的双蒸水。反应2～30min，待黑色粉末消失，溶液变为NaH A(A为Te或Se)溶液，标记为A溶液。

b、谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的制备

在氮气保护条件下，向洁净的200mL三口烧瓶中加入适量1.0mmol/L Cd²⁺(或Zn²⁺)溶液和0.1mmol/L谷胱甘肽(GSH)溶液，用1mol/L NaOH溶液调节pH为10，再加入A溶液，加热回流30～120min，制得谷胱甘肽稳定的Cd(或Zn)A(A为Te或Se)量子点。

(2)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的活化

取Cd(或Zn)A(A为Te或Se)-GSH量子点在洁净的三口烧瓶中，在氮气保护条件下，加入10倍摩尔比例的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和10倍摩尔比例的N-羟基琥珀酰亚胺，反应20～60min后，得到活化的量子点。

(3)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点与菁染料偶联

在洁净的三口烧瓶中加入适量活化后的量子点，磁力搅拌条件下，缓慢加入2～5倍摩尔比例的菁染料，反应2～12小时后，得到量子点-菁染料探针，如下所示。

本发明再一方面还提供了本发明式量子点-菁染料探针在生物样品进行染色中的用途。

本发明的有益效果：本发明利用谷胱甘肽为稳定剂制备水溶性的量子点并进一步与菁染料偶联，形成近红外量子点-菁染料探针。该类探针具有量子点和菁染料的双重优点，不仅具有良好的稳定性和荧光量子产率，而且具有良好的水溶性，可以被近红外光源激发，同时自身没有背景荧光的干扰。

本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。

附图说明

图1是CdTe量子点-菁染料探针(探针I)和ZnSe量子点-菁染料探针(探针IV)的光照稳定性测试。

图2是采用探针I作为白细胞分类测定试剂，测定血液样本在流式细胞仪中的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。

图3是采用菁染料I作为白细胞分类测定试剂，测定血液样本在流式细胞仪中的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。

图4是采用探针II作为白细胞分类测定试剂，测定血液样本在流式细胞仪中的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。

图5是采用探针III作为白细胞分类测定试剂，测定血液样本在流式细胞仪中的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。

具体实施方式

以下所提供的实施例仅用于对本发明作出进一步的举例说明，而无意于对说明书作出任何限定。

实施例1  水溶性CdTe量子点-菁染料探针(探针I)

(1)谷胱甘肽稳定的水溶性CdTe量子点的制备

a、NaHTe溶液的制备

在磁力加热搅拌器上安装50mL洁净三口烧瓶，氮气保护条件下，向其中加入0.09g Te粉和0.06g NaBH₄，恒温75℃，注入3mL煮沸后冷却的双蒸水。反应10min，待黑色粉末消失，溶液变为紫红色的NaHTe溶液，标记为A溶液。

b、谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的制备

在氮气保护条件下，向洁净的200mL三口烧瓶中加入100mL 1.0mmol/L Cd²⁺溶液和0.1mmol/L谷胱甘肽(GSH)溶液，用1mol/LNaOH溶液调节pH为10，再加入A溶液300uL，加热回流100min，制得谷胱甘肽稳定的CdTe(CdTe-GSH)量子点。

(2)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的活化

取10mmol/L CdTe-GSH量子点20mL加入洁净的三口烧瓶中，在氮气保护条件下，加入10倍摩尔比例的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和10倍摩尔比例的N-羟基琥珀酰亚胺水溶液，反应30min后，得到活化的量子点，标记为溶液B。

(3)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点与菁染料偶联

在洁净的三口烧瓶中加入溶液B 10ml，磁力搅拌条件下，缓慢加入2倍摩尔比例的Cy5菁染料溶液，反应10小时后，得到量子点-Cy5菁染料探针。

实施例2  水溶性ZnTe量子点-菁染料探针(探针II)

(1)谷胱甘肽稳定的水溶性ZnTe量子点的制备

a、NaHTe溶液的制备

在磁力加热搅拌器上安装50mL洁净三口烧瓶，氮气保护条件下，向其中加入0.09g Te粉和0.06g NaBH₄，恒温75℃，注入3mL煮沸后冷却的双蒸水。反应10min，待黑色粉末消失，溶液变为紫红色的NaHTe溶液，标记为A溶液。

b、谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的制备

在高纯氮气保护条件下，向洁净的200mL三口烧瓶中加入100mL 1.0mmol/L Zn²⁺溶液和0.1mmol/L谷胱甘肽(GSH)溶液，用1mol/L NaOH溶液调节pH为10，再加入A溶液300uL，加热回流120min，制得谷胱甘肽稳定的ZnTe(ZnTe-GSH)量子点。

(2)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的活化

取10mmol/L ZnTe-GSH量子点20mL加入洁净的三口烧瓶中，在氮气保护条件下，加入10倍摩尔比例的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和10倍摩尔比例的N-羟基琥珀酰亚胺水溶液，反应30min后，得到活化的量子点，标记为溶液C。

(3)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点与菁染料偶联

在洁净的三口烧瓶中加入溶液C 10ml，磁力搅拌条件下，缓慢加入4倍摩尔比例的Cy5菁染料溶液，反应12小时后，得到量子点-Cy5菁染料探针。

实施例3  水溶性CdSe量子点-菁染料探针(探针III)

(1)谷胱甘肽稳定的水溶性CdSe量子点的制备

a、NaHSe溶液的制备

在磁力加热搅拌器上安装50mL洁净三口烧瓶，氮气保护条件下，向其中加入0.08g Se粉和0.06g NaBH4，恒温70℃，注入3mL煮沸后冷却的双蒸水。反应15min，待黑色粉末消失，溶液变为淡红色的NaHSe溶液，标记为D溶液。

b、谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的制备

在氮气保护条件下，向洁净的200mL三口烧瓶中加入100mL 1.0mmol/L Cd²⁺溶液和0.1mmol/L谷胱甘肽(GSH)溶液，调节溶液pH为10，再加入D溶液400uL，加热回流100min，制得谷胱甘肽稳定的CdSe(CdSe-GSH)量子点。

(2)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的活化

取10mmol/L CdSe-GSH量子点20mL在洁净的三口烧瓶中，在氮气保护条件下，加入10倍摩尔比例的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和10倍摩尔比例的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，反应60min后，得到活化的量子点，标记为E溶液。

(3)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点与菁染料偶联

在洁净的三口烧瓶中加入E溶液10mL，磁力搅拌条件下，缓慢加入3倍摩尔比例的Cy5菁染料，反应8小时后，得到量子点-Cy5菁染料探针。

实施例4  水溶性ZnSe量子点-菁染料探针(探针IV)

(1)谷胱甘肽稳定的水溶性ZnSe量子点的制备

a、NaHTe溶液的制备

在磁力加热搅拌器上安装50mL洁净三口烧瓶，氮气保护条件下，向其中加入0.08g Se粉和0.06g NaBH4，恒温70℃，注入3mL煮沸后冷却的双蒸水。反应15min，待黑色粉末消失，溶液变为淡红色的NaHSe溶液，标记为D溶液。

b、谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的制备

在氮气保护条件下，向洁净的200mL三口烧瓶中加入100mL 1.0mmol/L Zn²⁺溶液和0.1mmol/L谷胱甘肽(GSH)溶液，调节溶液pH为10，再加入D溶液，加热回流120min，制得谷胱甘肽稳定的ZnSe(ZnSe-GSH)量子点。

(2)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的活化

取10mmol/L CdTe-GSH 20mL量子点加入洁净的三口烧瓶中，在氮气保护条件下，加入10倍摩尔比例的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和10倍摩尔比例的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，反应30min后，得到活化的量子点。标记为F溶液。

(3)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点与菁染料偶联

在洁净的三口烧瓶中加入F溶液10mL，磁力搅拌条件下，缓慢加入2倍摩尔比例的Cy5菁染料，反应12小时后，得到量子点-Cy5菁染料探针。

实施例5  量子点-菁染料的量子产率测试

量子点-菁染料的荧光量子产率在室温下测定，以罗丹明B的水溶液(荧光量子产率为0.98)为参比溶液作为参比，分别测定罗丹明B和量子点-菁染料在相同波长激发下的积分荧光强度和该波长处的吸光度值，代入下面的公式计算量子产率：

$\mathrm{\Φ}={\mathrm{\Φ}}_{F,\mathrm{cal}}\frac{S}{S_{\mathrm{cal}}}\frac{A_{\mathrm{cal}}}{A}\frac{n^2}{n_{\mathrm{cal}}^2}\frac{{\mathrm{\λ}}_{\mathrm{excal}}}{{\mathrm{\λ}}_{\mathrm{ex}}}$

(Φ-待测物质的量子产率；Φ_F，cal-参比物的量子产率；S-荧光发射光谱的积分面积；A-溶液在选定的波长下的吸光度；n-溶液的折射率；λ-待测物质的激发波长；S_cal-参比物荧光发射光谱的积分面积；A_cal-参比溶液在选定波长下的吸光度；n_cal-参比溶液的折射率；λ_excal-参比物质的激发波长。)所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Lambda 35；荧光分光光度计，型号：FL-4500。

标准物质罗丹明B的水溶液荧光量子产率为0.98，计算得实施例1量子点-菁染料的量子产率为0.093，其中菁染料的量子产率为0.021；实施例2量子点-菁染料的量子产率为0.082，其中菁染料的量子产率为0.015；实施例3量子点-菁染料的量子产率为0.087，其中菁染料的量子产率为0.013；实施例4量子点-菁染料的量子产率为0.105，其中菁染料的量子产率为0.022。由此可以看出，与谷胱甘肽偶联形成量子点-菁染料探针后量子产率有了明显的提高。

实施例6  CdTe量子点-菁染料探针(探针I)和ZnSe量子点-菁染料探针(探针IV)的光照 稳定性测试

将探针I与相应的菁染料I和探针IV与相应的菁染料IV分别配成1×10^-5M的甲醇溶液，装入可以密封的比色皿中。使用50g/L的亚硝酸钠溶液盛于一个长方体玻璃缸中做截止滤光器，滤去波长小于400nm的紫外光。另外，亚硝酸钠溶液也能起到冷阱的作用，使样品的温度保持常温。测定样品的初始吸光度值后，选用500W碘钨灯作为光源，距离样品20cm处，通电光照，计时。每隔1小时后，测量样品光照后的吸光度值。如图1所示，经过12小时光照后，探针I和探针IV的吸光度分别降低了22％和20％，对应的菁染料I和菁染料IV的吸光度则分别降低了60％和65％。由此可见看出，与谷胱甘肽稳定的量子点偶联形成量子点-菁染料探针后其稳定性有了明显的改善。

实施例7  探针I作为白细胞分类测试试剂

在1mL白细胞分类测定试剂中加入10uL经过EDTA.2K抗凝处理的血液，然后加入3uL10ppm的探针I，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪，采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息，结果如图2所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞五类。

实施例8  菁染料I的对比测试

在1mL白细胞分类测定试剂中加入10uL经过EDTA.2K抗凝处理的血液，然后加入3uL60ppm的菁染料I，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪，采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息，结果如图3所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞五类。

实施例9  探针II作为白细胞分类测试试剂

在1mL白细胞分类测定试剂中加入10uL经过EDTA.2K抗凝处理的血液，然后加入3uL12ppm的探针II，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪，采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息，结果如图4所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞五类。

实施例10  探针III作为白细胞分类测试试剂

在1mL白细胞分类测定试剂中加入10uL经过EDTA.2K抗凝处理的血液，然后加入3uL10ppm的探针III，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪，采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息，结果如图5所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞五类。

已通过上述各实施方案和具体实施例对本发明作出说明，但本领域技术人员会理解，在不偏离本发明宗旨和范围的情况下，可对本发明作出各种修改、变更和替换。

Claims (6)

1.一种水溶性量子点-菁染料探针，其特征在于由多肽类物质作为量子点的稳定剂和与发射光谱在近红外区的Cy5菁染料共价连接分子。

2.权利要求1中的水溶性量子点-菁染料探针，其中所述多肽类物质为三肽类分子，优选为谷胱甘肽，更优选为还原型谷胱甘肽。

3.权利要求1-2中所述水溶性量子点-菁染料探针通过如下步骤制备得到：

(1)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的制备

a、NaHA(A为Te或Se)溶液的制备

在磁力加热搅拌器上安装50mL洁净三口烧瓶，氮气保护条件下，向其中加入适量A(A为Te或Se)和NaBH4，恒温70～90℃，注入3mL煮沸后冷却的双蒸水。反应2～30min，待黑色粉末消失，溶液变为NaH A(A为Te或Se)溶液，标记为A溶液。

b、谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的制备

在氮气保护条件下，向洁净的200mL三口烧瓶中加入适量1.0mmol/L Cd²⁺(或Zn²⁺)溶液和0.1mmol/L谷胱甘肽(GSH)溶液，用1mol/L NaOH溶液调节pH为10，再加入A溶液，加热回流30～120min，制得谷胱甘肽稳定的Cd(或Zn)A(A为Te或Se)量子点。

(2)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点的活化

取Cd(或Zn)A(A为Te或Se)-GSH量子点在洁净的三口烧瓶中，在氮气保护条件下，加入10倍摩尔比例的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和10倍摩尔比例的N-羟基琥珀酰亚胺，反应20～60min后，得到活化的量子点。

(3)谷胱甘肽稳定的水溶性量子点与菁染料偶联

在洁净的三口烧瓶中加入适量活化后的量子点，磁力搅拌条件下，缓慢加入2～5倍摩尔比例的菁染料，反应2～12小时后，得到量子点-菁染料探针。

4.一种用于生物样品染色的组合物，其中所述组合物包含权利要求1-3中任一项的化合物。

5.权利要求4的组合物，其中所述生物样品选自血液中的白细胞。

6.一种分析白细胞的方法，该方法包括：

1)将待测血液样品用权利要求1-3中任一项的组合物染色；

2)在流式细胞分析仪上分析染色后血液样品中的白细胞。

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