CN108982444A - 一种led激发的短波红外荧光显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种LED激发的短波红外荧光显微成像系统。本发明中的单色LED发出的激光首先经过准直透镜被准直，并引入到显微镜落射式照明器的光路中，该激发光被二向色镜反射，并会聚到显微物镜的后焦面上，会聚光通过物镜后形成平行的激发光束，照射到样品上，激发样品中的荧光探针发出荧光；荧光信号通过物镜并透过二向色镜，最终被InGaAs相机的探测面接收，实现光电转化，信号传输到计算机进行数据处理，得到成像图或视频。本发明具有高信噪比、高放大率、高分辨率、可实时成像、可层析成像、大穿透深度以及小的组织损伤等显著优点。

Description

一种LED激发的短波红外荧光显微成像系统

技术领域

本发明属于应用光学的显微成像领域，是一种采用LED激发、结合了传统的荧光显微成像术并应用在短波红外波段的显微成像系统。

背景技术

荧光显微成像已经广泛地应用于生命科学的研究。荧光成像指利用生物组织或结构发出的荧光进行成像。由于某些荧光染料可以实现特异性标记，使得荧光成像具有提供特异性的位置信息的能力。显微成像则指使用显微物镜，实现较大放大倍数的成像。一个典型的荧光显微成像系统包括光源、分束器、物镜、荧光样品以及光电探测器。来自光源的激发光通过照明光路再经过显微物镜照射在样品上，样品被激发所产生的荧光继而被物镜收集，成像在光电探测器的探测面上，其中分束器用来分离激发光和荧光信号。共聚焦扫描显微成像和多光子扫描显微成像是其中两种重要的显微成像方法。

短波红外指的是波长位于900nm~1700mm之间的近红外光，相对于可见光（通常波长在380nm~760nm），其在生物组织内的散射更小，因此短波红外荧光显微成像具有更大的穿透深度、更高的信噪比等优势。此外，如果激发光的波长也是位于或接近短波红外波段，其对生物组织的损伤会更小。目前，基于短波红外波段的荧光成像是光学生物成像的研究热点之一。

目前用于荧光激发的光源主要有激光、LED、汞灯等。LED作为一种非相干光源，具有成本较低、波段选择范围广、光斑均匀、光束口径大等优点。国内外有一些成型的荧光显微成像系统，但尚未有基于LED激发的并在短波红外进行荧光显微成像的装置。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种LED激发的短波红外荧光显微成像系统。本发明是在正置生物显微镜的基础上搭建的一套短波红外荧光显微成像系统。采用单色LED作为光源，从上述显微镜的落射式照明器的后口引入，通过二向色镜反射到荧光样品上，激发出短波红外的荧光信号，该信号被显微物镜收集，并由InGaAs相机将光信号转化为电信号，实现荧光显微成像。

本发明采用的技术方案是：

整个显微成像系统由单色LED光源、准直透镜、显微镜落射式照明器、二向色镜、物镜、镜筒透镜、滤光片、InGaAs相机和计算机等组成。

LED发出的光首先经过准直透镜被准直，并引入到显微镜落射式照明器的光路中，该激发光被二向色镜反射，并会聚到显微物镜的后焦面上，会聚光通过物镜后形成平行的激发光束，照射到样品上，激发样品中的荧光探针发出荧光。荧光信号通过物镜并透过二向色镜，最终被InGaAs相机的探测面接收，实现光电转化，信号传输到计算机进行数据处理，得到成像图或视频。滤光片被放置在二色镜和探测器探测面之间的光路中，来滤除杂散光和激发光的干扰。改变物镜和样品之间的距离，进行不同深度的对焦，可实现样品的层析成像。

本发明具有的有益效果是：

该系统采用高功率单色LED作为激发光源，相对于显微镜配套的汞灯光源，具有如下优点：

一是LED的激发效率更高。汞灯的光谱较宽，单位波长上的功率不高，而LED可将功率集中在较窄的波段内，对具有某一特定吸收峰的荧光探针激发效果更好。

二是LED的波段选择范围广。LED可选择从紫外到近红外的一系列波段，而汞灯的光谱主要集中在可见光波段，限制了对于某些需要短波红外光激发的荧光探针的应用。

三是LED较窄的光谱可以更容易地避免杂散光的干扰。在荧光成像的应用中，可以通过添加滤光片或选择二色镜来滤除激发光进入探测器，而汞灯较宽的光谱使得滤除激发光变得更困难。

为了实现宽场照明，也可采用将激光扩束之后通过显微镜落射式照明器的后口引入的方法。相对于激光激发，LED具有如下优点：由于激光具有散斑效应，以及激光的发散角很小，使得照射在样品上的光斑直径小且亮度不均匀，而LED在整个视场上具有均匀的照明。

此外，该系统在短波红外波段进行荧光成像，相对于传统的在可见光波段观察的荧光成像，具有穿透深度大、生物组织损伤小的优点。该系统属于宽场照明成像，相对于逐点扫描成像，具有成像速度快、信号强的优点。本系统简单可靠、高效稳定，对设备要求低，是对现有荧光成像技术的一种优良改进，在生物医学、农林、材料、化学等学科和领域具有广阔的发展和应用前景。

附图说明

图1为本发明中提及的LED激发的短波红外荧光显微成像系统示意图；

图2为本发明的成像效果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明。

如图1所示，本发明由LED光源、准直透镜、显微镜落射式照明器、二向色镜、物镜、镜筒透镜、滤光片、InGaAs相机和计算机等组成。

LED灯珠后面紧贴着金属散热器1用于散热，再将此光源接到一个内有准直透镜的套筒2，调节LED光源和准直透镜之间的距离，使其达到最好的准直效果，准直后出来的光束具有最小的发散角，且在整个光斑范围内亮度均匀，光斑的直径与准直透镜的直径相当（约50mm）。将准直后的LED通过上述套筒接到显微镜落射式照明器的后端口上，准直光就被引入到了显微镜的光路中，经过其内部的透镜组（由3-1、3-2、3-3组成）进行扩束、聚焦，通过二向色镜4（对短波长反射，长波长透射）反射，最终聚焦到显微物镜5的后焦面上。显微物镜把聚焦的光束变成平行光出射，照射到样品6上，形成一个较大的照明视场，并激发荧光探针发出荧光。荧光信号通过物镜返回，并透过二向色镜，再经过滤光片滤除激发光的干扰后，通过其上方的镜筒透镜7聚焦到InGaAs相机8-1（8-2是相机电源）的探测面上。相机把光信号转化为电信号，并传输到计算机9，由计算机的软件显示图像或视频。调节样品和显微物镜之间的距离，将实现不同深度的层析成像。

本发明的系统可采用如下的应用实例。LED光源采用Thorlabs公司的M780L3-C1（中心波长为780nm），该光源已经接上一个准直透镜，通过准直透镜后的光束总功率可达到210mW。显微镜采用舜宇RX50系列生物显微镜。二色镜采用Thorlabs公司的DMLP900R，该二色镜反射900nm波长以下的光，透过900nm波长以上的光。物镜采用Olympus公司的XLPLN25XWMP2，其放大倍数为25倍，工作介质是水，工作距离为2mm，在400nm~1600nm光波段具有良好的透过率。信号光滤光片采用Thorlabs公司的FELH0850和FELH0900长通滤光片，其截止波长分别为850nm和900nm。短波红外探针采用一种新型有机荧光染料，其吸收峰在700nm左右，荧光峰在950nm左右。探测器采用深圳天盈光电公司生产的SW640-T型InGaAs相机，采用热电制冷，响应范围为900~1700nm，像素为640512。用毛细管吸取上述荧光染料放置在物镜焦面上，得到的成像效果如图2所示。

本发明介绍了一种采用LED激发的用于短波红外波段的宽场荧光显微成像系统。采用高功率单色LED作为激发光源，并把光引入到显微镜的落射式照明器，再通过二向色镜反射，并会聚到显微物镜后焦面，形成平行的宽场激发光照射到样品上，激发样品中的荧光探针发出荧光，该信号通过物镜和二向色镜，被短波红外相机所接收，最终成像的信号传输到计算机，实现了短波红外的显微成像。该成像系统具有高信噪比、高放大率、高分辨率、可实时成像、可层析成像、大穿透深度以及小的组织损伤等显著优点，并且系统操作简便、搭建成本较低、稳定性好。在生物医学、农林、材料、化学等方面具有良好的应用价值和前景，适于推广。

Claims (3)

1.一种LED激发的短波红外荧光显微成像系统，包括单色LED光源、准直透镜、显微镜落射式照明器、二向色镜、物镜、镜筒透镜、滤光片、InGaAs相机和计算机，其特征在于：

单色LED发出的激光首先经过准直透镜被准直，并引入到显微镜落射式照明器的光路中，该激发光被二向色镜反射，并会聚到显微物镜的后焦面上，会聚光通过物镜后形成平行的激发光束，照射到样品上，激发样品中的荧光探针发出荧光；荧光信号通过物镜并透过二向色镜，最终被InGaAs相机的探测面接收，实现光电转化，信号传输到计算机进行数据处理，得到成像图或视频；滤光片放置在二色镜和探测器探测面之间的光路中，来滤除杂散光和激发光的干扰，通过改变物镜和样品之间的距离，进行不同深度的对焦，可实现样品的层析成像。

2.根据权利要求1所述的一种LED激发的短波红外荧光显微成像系统，其特征在于：所述的显微镜的光路中设置了透镜组，用于扩束和聚焦。

3.根据权利要求1或2所述的一种LED激发的短波红外荧光显微成像系统，其特征在于：所述的LED光源采用Thorlabs公司的M780L3-C1，其中心波长为780nm。