CN113237853A - 一种基于硅衬底GaN基黄光发光二极管光源的落射式荧光成像系统 - Google Patents

Abstract

发明一种基于硅衬底GaN基黄光发光二极管光源的落射式荧光成像系统，采用硅衬底GaN基黄光发光二极管作为光源，构建了一套荧光成像系统。主要发明内容包括的照明系统模块、样品激发模块和荧光探测模块。照明系统模块中，采用非球面透镜组对硅衬底GaN基黄光LED光源进行准直；样品激发模块中，将准直后的光束通过二向色镜反射进入光阑和物镜聚焦，对样品进行激发；荧光探测模块中，将激发出的荧光经物镜接收后通过二向色镜和荧光滤色片，经收集透镜后进入CMOS相机成像。本发明将硅衬底GaN基黄光LED作为光源应用于落射式荧光成像系统，相比于商业显微镜中常用的汞灯照明的超宽光谱，LED窄带波普可以减少交叉激发，同时具有增加图像的对比度和信曝比等优势。

Description

一种基于硅衬底GaN基黄光发光二极管光源的落射式荧光成 像系统

技术领域

本系统与生物医学有关，涉及荧光成像，适用于医学中对生物组织内部的检测。具体地，采用硅衬底GaN基黄光发光二极管作为光源，构建荧光成像系统，是该光源的一种新的应用方向。

背景技术

随着生物医学领域的快速发展，显微成像技术已经越来越受到生物和医学领域的关注，由于光学显微术不仅可以实现对活体生物组织的无损伤、非侵入及实时的探测和成像，还可以获取样品重要的光学信息(如反射率，折射率，偏振态以及光谱等信息)和一些特性参数测量(如吸收系数，散射系数等)。例如，在生物样品中使用荧光分子标记特定的蛋白质，荧光显微镜就可以追踪定位单个蛋白质分子，开展对活细胞进行实时监测观察，实现其生命活动特征的探测。因此它已经成为生命科学研究中的重要手段。随着发光二极管(LED)技术的快速发展，LED作为光源已经应用于显微成像领域的发展。LED光源由于其体积小、价格低、工作时间长、光色纯、安全可靠等优点，低电压、低电流和省电的特点,在仪器小型化和降低成本方面有很大优势，具有成为应用前景可观的荧光成像光源。商业显微镜中常用的汞灯照明，光谱较宽，需要使用干涉滤色片选择窄带波长的激发光束对样品进行激发，这会损失了一定的光通量，增加了系统的复杂性，也增加了成本。相比于激光光源，LED光源的成像系统整体成本较低，并且操作简单。

近年来，南昌大学国家硅基LED工程技术研究中心开发出的硅衬底GaN基黄光发光二极管，是目前为止国际上光电转换效率最高(约26.7％，20A/cm2)的硅衬底黄光LED。硅衬底GaN基LED技术是由我国发展起来的一项LED技术，获得了2015年度中国国家技术发明一等奖。相比于荧光粉LED照明，该项LED光源技术省去了稀土这一稀缺资源，具有较高的现实价值和战略意义。本发明提出使用该新型的硅衬底GaN基黄光LED作为荧光成像系统的光源，构建一种基于硅衬底GaN基黄光发光二极管光源的落射式荧光成像系统，解决了硅衬底GaN基黄光LED的发散光光束准直、物镜激发和荧光探测及成像等光路设计和构建、样品激发参数探索等技术问题，并使用样品开展了荧光成像验证和系统分辨率标定等工作。本发明的提出探索了南昌大学国家硅基LED工程技术研究中心的硅衬底GaN基黄光发光二极管这种新型光源的一种新的应用方向。相比于商业显微镜中常用的汞灯照明的超宽光谱，该LED光源窄带波谱省去了使用激发光干涉滤色片和激发块转盘的光学元件，同时可以减少交叉激发，具有增加图像的对比度和信曝比等优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于硅衬底GaN基黄光发光二极管(LED)光源的落射式荧光成像系统，解决现有技术中的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于硅衬底GaN基黄光发光二极管光源的落射式荧光成像系统，采用硅衬底GaN基黄光发光二极管作为光源，辐照样品并以样品的荧光为信号，构建落射式荧光成像系统，所述系统包括照明系统模块、样品激发模块和荧光探测模块；

照明系统模块中，光源(2)为硅衬底GaN基黄光发光二极管，由可调直流稳压电源(1)为光源(2)提供电源，并控制光源(2)的电压在3V以下，电流在1A以下；硅衬底GaN基黄光发光二极管的发散光束通过准直透镜组调至准直，该准直透镜组包括非球面聚光透镜(3)和平凸透镜(4)，光束先经过非球面聚光透镜(3)再经过平凸透镜(4)；

样品激发模块中，准直后的光束通过二向色镜(5)反射，依次通过光阑(6)、爬高架全反镜1(7)、爬高架全反镜2(8)后，经聚焦物镜(9)聚焦后照射样品(11)；样品(11)放置于三维手动平移台(10)，通过平移台(10)的移动，以实现对样品(11)的不同区域的探测；

荧光探测模块由物镜(9)、二向色镜(5)、滤色片(12)、收集透镜(13)、CMOS相机(14)和计算机组成，所述的滤色片(12)置于所述的二向色镜(5)的透射光方向，收集透镜(13)放置在滤色片(12)之后，CMOS相机(14)放置在收集透镜(13)的焦平面附近收集荧光信号并连接至计算机。

进一步地，光源(2)采用硅衬底GaN基发光二极管的120度的发散光源，波长为565nm，规格为3.5mm*3.5mm。

进一步地，照明系统模块中，使用包含非球面聚光透镜(3)和平凸透镜(4)的准直透镜组对光源(2)进行平行出射的光束调节；所述非球面聚光透镜(3)的直径为25.4mm,焦距为f1＝16mm，数值孔径为0.79，将其放置在光源(2)后大于等于非球面聚光透镜(3)的两倍焦距处；所述平凸透镜(4)的直径为25.4mm,焦距为f2＝175mm，放置在非球面聚光透镜(3)后191mm处。

进一步地，所述的二向色镜(5)为可用于反射硅衬底GaN基黄光波长、透射样品荧光波长的二向色镜。

进一步地，所述的滤色片(12)是对波长为628nm附近40nm范围的光束透射的带通滤色片。

一种基于硅衬底GaN基黄光发光二极管(LED)光源的落射式荧光成像系统，其特点是采用硅衬底GaN基黄光LED作为光源，将贴片式LED焊在铜基散热板上，通过可调直流稳压电源供电，其电功率设定在3W以下(3V*1A)。系统包括照明系统模块、样品激发模块和荧光探测模块。

照明系统模块：3535规格的硅衬底GaN基黄光LED，采用可调直流稳压电源调节使其电压在3V以下，电流在1A以下。本系统模块要解决的技术问题在于克服LED灯珠的发散光束的收集和调节准直，根据Zemax软件仿真模拟，采用了一款非球面透镜将3535规格的大面积的硅衬底GaN基黄光LED发散光束聚焦到一个尽可能小的点上，再采用一款长焦距的平凸透镜将聚焦后的点光源调节成平行光。系统中使用非球面透镜的第一个优点是减少球差。非球面不规则表面形状的本质就是使其能够更精确地同时操纵多种波长的光，从而获得更清晰的图像。非球面透镜的另一个光学好处是能够校正像场弯曲等离轴像差。由于非球面设计可以更好地将入射光校正到焦点上，因此增加了透镜的可用光圈，从而可以提供更大的光通量。最后，使用非球面设计的最大好处之一就是减少了获得给定结果所需的总体镜片数量。由于非球面镜可以更好地控制通过系统的光，因此在许多情况下，单个非球面镜可以提供与串联使用的多个标准镜头相同的精度。这有利于减少了整体重量，尺寸，甚至可能减少最终设计的成本。

照明系统中使用非球面透镜使得光路简单紧凑并且操作方便。根据Zemax设计，及硅衬底GaN基黄光LED的特点，选用非球面聚光透镜是直径25.4mm,焦距f1＝16mm，数值孔径0.79的非球面聚光透镜，将其放置在硅衬底GaN基黄光LED后大于等于非球面聚光透镜的两倍焦距处(距离LED光源约32mm处)；所述的平凸透镜是直径25.4mm,焦距f2＝175mm的平凸透镜，放置在非球面聚光透镜后(f1+f2)距离处。

样品激发模块：将准直后的LED光束通过二向色镜反射，依次通过光阑、爬高架的一对全反镜，经聚焦物镜聚焦后照射样品。样品放置于三维手动平移台上，通过平移台的移动，以实现对样品的不同区域的激发。

荧光探测模块：样品受激发后发射荧光，荧光由物镜收集后依次通过爬高架的一对全反镜、二向色镜、荧光滤色片后经过收集透镜进入CMOS相机。其中，CMOS相机放置在收集透镜的焦平面附近收集荧光信号并连接至计算机。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的落射式荧光成像系统预热时间短(启动速度快)、稳定性好、低电压、低电流和省电。同时该系统的LED光源窄带激发，可直接激发样品，可以避免使用激发光干涉滤色片选取波长，节省了成本，缩短了光程，简化了照明光路。系统仪器具有小型化，成本低廉的优点。

附图说明

图1为Zemax软件仿真的LED散射光使用聚光透镜聚焦效果图；

图2为硅衬底GaN基黄光发光二极管室温电致发光光谱图；

图3为硅衬底GaN基黄光发光二极管光源的光经过透镜对准直后的光束；

图4为本发明系统光路设计图：其中:1为可调直流稳压电源，2为硅衬底GaN基黄光LED光源，3为非球面聚光透镜，4为平凸透镜，5为二向色镜(对588nm高通低返)，6为光阑，7为爬高架全反镜1和8为爬高架全反镜2，9为物镜(100倍油浸物镜，NA＝1.4)，10为三维手动平移台，11为样品，12为滤色片(对628nm附近通过)，13为收集透镜，14为CMOS相机；

图5为本发明系统对ATTO590荧光团样品的成像结果；

图6为本发明系统对均匀平铺的20纳米深红色荧光小球的成像结果a及分辨率分析b。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本系统作进一步说明，但不应以此限制本系统的保护范围。

实施例1

如图4所示，本发明荧光成像系统采用南昌大学国家硅基LED工程技术研究中心开发出的硅衬底GaN基黄光发光二极管作为光源，将贴片式LED焊在铜基散热板上，通过可调直流稳压电源(1)供电，其电功率设定在3W以下(3V*1A)。系统包括照明系统模块、样品激发模块和荧光探测模块。

照明系统模块中，光源(2)采用硅衬底GaN基黄光发光二极管的120度的发散光源，波长为565nm，规格为3.5mm*3.5mm；可调直流稳压电源(1)为光源(2)提供电源，并控制光源(2)的电压在3V以下，电流在1A以下。硅衬底GaN基黄光发光二极管(LED)的发散光束通过准直透镜组调至准直，该准直透镜组包括非球面聚光透镜(3)和平凸透镜(4)，光束先经过非球面聚光透镜(3)再经过平凸透镜(4)。

由于硅衬底GaN基黄光发光二极管LED的发光面积较大，所以先需要使用非球面聚光透镜将大发散角的LED散射光调节至一个近似点光源。根据Zemax设计，及硅衬底GaN基黄光LED的特点，调整Zemax软件仿真透镜参数：直径25.4mm，焦距16mm，后焦距7.3mm，NA为0.79，中心厚度14mm，边缘厚度1.2mm，如图1所示。选择直径为25.4mm、焦距为f1＝16mm、数值孔径为0.79的非球面聚光透镜(3)，将其放置在光源(2)后约32mm处；选择直径为25.4mm、焦距为f2＝175mm的平凸透镜(4)，放置在非球面聚光透镜(3)后191mm处。

硅衬底GaN基黄光发光二极管光源经过非球面聚光透镜(3)收集光束后，通过一个长焦距的平凸透镜(4)，调节非球面透镜和LED光源之间的距离，即非球面聚光透镜(3)在光源(2)后约32mm处，平凸透镜(4)放置在非球面聚光透镜(3)后191mm处，点光源的发散光束经过准直透镜组后为平行光束。经过良好准直的光束，其发散角应很小，并且不会在光路中的任何点聚焦，如图2所示。硅衬底GaN基黄光发光LED光源经过准直透镜组后，距离平凸透镜约2米处的准直光的光斑大小，如图3所示。

样品激发模块中，准直后的光束将通过二向色镜(5)反射，依次通过光阑(6)、爬高架全反镜1(7)、爬高架全反镜2(8)后，经聚焦物镜(9)聚焦后照射样品(11)。样品(11)放置于三维手动平移台(10)，通过平移台(10)的移动，以实现对样品(11)的不同区域的探测。二向色镜(5)为可用于反射硅衬底GaN基黄光波长、透射样品荧光波长。

荧光探测模块由物镜(100倍油浸物镜，NA＝1.4)(9)、二向色镜(5)、滤色片(12)、收集透镜(13)、CMOS相机(14)和计算机组成，所述的滤色片(12)置于所述的二向色镜(5)的透射光方向，收集透镜(13)放置在滤色片(12)之后，CMOS相机(14)放置在收集透镜(13)的焦平面附近收集荧光信号并连接至计算机。二向色镜(5)为可用于反射硅衬底GaN基黄光波长、透射样品荧光波长。

基本工作过程为：硅衬底GaN基黄光发光二极管(LED)光源(2)的发散光束经过准直透镜组准直后经由二向色镜(5)反射后依次通过光阑(6)、一对爬高架全反镜后通过聚焦物镜(9)聚焦到样品(11)中，照明光所激发的荧光再次被聚焦物镜(9)收集，经由二向色镜(5)和滤色片(12)、收集透镜(13)，进入CMOS相机(14)。接着，通过调节三维手动平移台(10)扫描样品的不同位置，计算机可以显示出样品的显微图象。实施中，我们以光束行进方向作为Z轴，以垂直光束行进方向作为X-Y平面，将样品(11)的入射表面和聚焦物镜(9)焦点之间的距离定义为层析深度d。改变深度d，依次获取样品在不同d位置处的X-Y成像。

实施例2

将ATTO590荧光团样品的浓度用纯水稀释至0.1mg/ml后进行水浴超声，取20ul作为样品置于盖玻片上，用旋转仪转涂，风干后盖上载玻片，将其放置在三维手动平移台上。选取电压2V，CMOS相机一帧时间10ms下的成像结果如图5所示。由图5可知，ATTO590荧光团能被硅衬底GaN基黄光LED激发出荧光，落射式荧光成像系统实现了荧光成像功能。

实施例3

将20纳米深红色荧光小球(Invitrogen)用纯水稀释至109particles/mL，进行水浴超声后取20ul作为样品置于盖玻片上，用旋转仪转涂，风干后盖上载玻片，将其放置在三维手动平移台上。选取电压2V，CMOS相机一帧时间10ms下的单个荧光小球成像结果如图6(a)所示。由图6(a)可知，20纳米深红色荧光小球能被硅衬底GaN基黄光LED激发出荧光，落射式荧光成像系统实现了荧光成像功能。图6(b)的中心荧光强度曲线分布表明系统空间分辨率(半高全宽)约402nm。

实验表明，使用硅衬底GaN基黄光发光二极管(LED)作为荧光成像系统的光源，通过非球面聚光透镜和平凸透镜的组合，光束在两米范围内基本准直。以100nm金颗粒测试了该荧光成像系统的可靠性，并对ATTO590荧光团和20纳米深红色荧光小球样品进行了扫描成像。从理论和实验两个角度，证实了硅衬底GaN基黄光发光二极管(LED)作为荧光成像系统光源的可行性。

尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案，这对本领域的技术人员而言是显而易见，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种基于硅衬底GaN基黄光发光二极管光源的落射式荧光成像系统，其特征是采用硅衬底GaN基黄光发光二极管作为光源，辐照样品并以样品的荧光为信号，构建落射式荧光成像系统，所述系统包括照明系统模块、样品激发模块和荧光探测模块；

照明系统模块中，光源(2)为硅衬底GaN基黄光发光二极管，由可调直流稳压电源(1)为光源(2)提供电源，并控制光源(2)的电压在3V以下，电流在1A以下；硅衬底GaN基黄光发光二极管的发散光束通过准直透镜组调至准直，该准直透镜组包括非球面聚光透镜(3)和平凸透镜(4)，光束先经过非球面聚光透镜(3)再经过平凸透镜(4)；

样品激发模块中，准直后的光束通过二向色镜(5)反射，依次通过光阑(6)、爬高架全反镜1(7)、爬高架全反镜2(8)后，经聚焦物镜(9)聚焦后照射样品(11)；样品(11)放置于三维手动平移台(10)，通过平移台(10)的移动，以实现对样品(11)的不同区域的探测；

荧光探测模块由物镜(9)、二向色镜(5)、滤色片(12)、收集透镜(13)、CMOS相机(14)和计算机组成，所述的滤色片(12)置于所述的二向色镜(5)的透射光方向，收集透镜(13)放置在滤色片(12)之后，CMOS相机(14)放置在收集透镜(13)的焦平面附近收集荧光信号并连接至计算机。

2.根据权利要求1所述的一种基于硅衬底GaN基黄光发光二极管光源的落射式荧光成像系统，其特征在于光源(2)采用硅衬底GaN基发光二极管的120度的发散光源，波长为565nm，规格为3.5mm*3.5mm。

3.根据权利要求1所述的一种基于硅衬底GaN基黄光发光二极管光源的落射式荧光成像系统，其特征在于照明系统模块中，使用包含非球面聚光透镜(3)和平凸透镜(4)的准直透镜组对光源(2)进行平行出射的光束调节；所述非球面聚光透镜(3)的直径为25.4mm,焦距为f1＝16mm，数值孔径为0.79，将其放置在光源(2)后大于等于非球面聚光透镜(3)的两倍焦距处；所述平凸透镜(4)的直径为25.4mm,焦距为f2＝175mm，放置在非球面聚光透镜(3)后191mm处。

4.根据权利要求1所述的一种基于硅衬底GaN基黄光发光二极管光源的落射式荧光成像系统，其特征在于所述的二向色镜(5)为可用于反射硅衬底GaN基黄光波长、透射样品荧光波长的二向色镜。

5.根据权利要求1所述的一种基于硅衬底GaN基黄光发光二极管光源的落射式荧光成像系统，其特征在于所述的滤色片(12)是对波长为628nm附近40nm范围的光束透射的带通滤色片。

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