CN110646385A - 基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置以及成像方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置以及成像方法，包括：近红外半导体激光器、三维可调准直扩束镜、激发滤光片、二色镜、物镜、载物台、发射滤光片、相机、光路；近红外半导体激光器与三维可调准直扩束镜相连接，三维可调准直扩束镜与光路相连通且两者之间设置有激发滤光片；光路内的通道的中部设置有二色镜，二色镜面向激发滤光片；光路的顶部由下至上依次设置有物镜、载物台，载物台上设置有样品器皿，样品器皿内盛有稀土掺杂的上转换发光纳米材料；光路内的通道的下部设置有发射滤光片，相机位于光路的下端的下方。该成像方法具有穿透性好、对生物样品损害小、信噪比高，灵敏度高，成像速度快等特点。

Description

基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置以及成像方法
技术领域
本发明涉及全内反射成像，具体地，涉及一种基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置以及成像方法。
背景技术
全内反射成像技术，采用隐失波(evanescent field)作为样品的激发光源，激发深度浅，有效地控制了激发体积及入射光的干扰，因此具有信噪比高、分辨率高等特点。在过去的十几年中，被广泛地应用于活细胞中单分子成像、生物大分子相互作用、生物大分子构象变化、单分子的电子转移、ATP酶的翻转，聚合物内单个分子的结构变化、单颗粒示踪等领域。目前，全内反射成像技术，均采用普通的荧光发射模式(短波激发，长波发射)，所涉及的均为单光子过程，所用激发光一般波长在可见光区(如405nm,488nm,533nm,632nm)，容易对生物组织造成光损伤而且组织穿透力较差；所采用荧光材料主要有有机染料、量子点等，上述材料一般具有严重的光漂白性和光闪烁(Blinking)以及毒性高等缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置以及成像方法，该基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置具有结构简单和操作简便的优势，同时该成像方法具有穿透性好、对生物样品损害小、信噪比高，灵敏度高，成像速度快等特点，能够应用于单颗粒的检测中。
为了实现上述目的，本发明提供了一种基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置，包括：近红外半导体激光器、三维可调准直扩束镜、激发滤光片、二色镜、物镜、载物台、发射滤光片、相机、光路；近红外半导体激光器与三维可调准直扩束镜相连接，三维可调准直扩束镜与光路相连通且两者之间设置有激发滤光片；光路内的通道的中部设置有二色镜，二色镜面向激发滤光片；光路的的一端由内至外依次设置有物镜、载物台，载物台上设置有样品器皿，样品器皿内盛有稀土掺杂的上转换发光纳米材料；光路内的通道的的另一端内的通道中设置有发射滤光片，相机面向所述光路的另一端的尾部。
优选地，近红外半导体激光器发射的激发光源的波长为808nm、980nm、1064nm中的至少一者。
优选地，激发滤光片选用窄带通滤光片；
优选地，二色镜选用长反短通二色镜；
更优选地，物镜选用牌号N.A.＝1.49全内反射专用物镜；
进一步优选地，相机选用牌号Photometrics Prime95B背照式sCMOS相机。
优选地，相机与计算机相连接。
优选地，稀土掺杂的上转换发光纳米材料选用NaYF4:Yb,Er@NaYF4上转换纳米粒子、NaGdF4:Yb,Er@NaYF4上转换纳米粒子和NaYF4:Yb,Er@NaYGdF4上转换纳米粒子中的至少一者。
优选地，样品器皿为玻底培养皿或硅烷化过的玻璃片。
优选地，在样品器皿为玻底培养皿时，焦距为2200-2300nm；
或，在样品器皿为硅烷化过的玻璃片时，焦距为3700-3800nm。
优选地，近红外半导体激光器、三维可调准直扩束镜通过FC标准接口相连接。
本发明还提供了一种如上述的基于上转换发光全内反射单颗粒成像方法，该基于上转换发光全内反射单颗粒成像方法在上述的基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置中进行，包括：
1)将稀土掺杂的上转换发光纳米材料置于样品器皿中，接着开启近红外半导体激光器以发射激发光源进入三维可调准直扩束镜中，三维可调准直扩束镜能够准直扩束后的激发光；
2)激发光经过激发滤光片以能够除去杂散光，纯化后的激发光经过二色镜反射进入物镜；通过三维可调准直扩束镜调节激发光的入射角度，以使得激发光形成以水平方向光束接近消失的临界角度；
3)激发光激发稀土掺杂的上转换发光纳米材料后，上转换发光纳米材料产生发射光，发射光经过物镜收集、二色镜反射并通过发射滤光片以滤掉激发光和其它杂散光，相机采集发射滤光片后的发射光以得到全内反射成像。
在上述技术方案，本发明搭建一套基于上转换发光全内反射成像装置；建立基于上转换发光全内反射单颗粒成像方法。稀土掺杂的上转换发光纳米材料作为一种独特的纳米材料，是通过多光子机制，吸收多个光子的能量，跃迁到较高能级，然后通过能量转换，发射出能量较高(与入射光比较)的光，所以其发射光比激发光波长短(长波激发，短波发射)。该装置利用近红外半导体激光器(如808nm，980nm，1064nm等近红外光)作为激发光源，以稀土掺杂的上转换发光纳米材料作为发光对象，结合全内反射专用物镜，采用高速、高灵敏度sCMOS相机作为拍照相机，通过调节激光入射角度，实现全内反射，产生隐失波，实现基于上转换发光全内反射成像。本方法将上转换发光纳米材料和全内反射成像有机地结合起来，可实现基于长波激发，短波发射的全内反射单颗粒成像，应用于单颗粒检测领域；具有对生物样品穿透性好、损害小、信噪比高、灵敏度高、成像速度快等特点。同时，该方法具有抗光漂白性，无“blinking”现象。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是一种基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置图
图2是检测例中NaYF4:Yb,Er@NaYF4上转换纳米材料的发光光谱和透射电镜图(A部分是荧光光谱图，B部分是透射电镜图)；
图3是实施例1中成像过程中光束观察图；
图4是检测例1中样品的成像结果图；
图5是检测例2中样品的成像结果图。
附图标记说明
1、近红外半导体激光器 2、三维可调准直扩束镜
3、激发滤光片 4、二色镜
5、物镜 6、载物台
7、发射滤光片 8、相机
9、样品器皿 10、光路
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，“上、下、内、外”等包含在术语中的方位词仅代表该术语在常规使用状态下的方位，或为本领域技术人员理解的俗称，而不应视为对该术语的限制。
本发明提供了一种基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置，如图1所示，包括：近红外半导体激光器1、三维可调准直扩束镜2、激发滤光片3、二色镜4、物镜5、载物台6、发射滤光片7、相机8、光路10；近红外半导体激光器1与三维可调准直扩束镜2相连接，三维可调准直扩束镜2与光路10相连通且两者之间设置有激发滤光片3；光路10内的通道的中部设置有二色镜4，二色镜4面向激发滤光片3；光路10的的一端由内至外依次设置有物镜5、载物台6，载物台6上设置有样品器皿9，样品器皿9内盛有稀土掺杂的上转换发光纳米材料；光路10的另一端内的通道中设置有发射滤光片7，相机8面向光路10的另一端的尾部。
在本发明中，激发光源的波长可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高成像效果，优选地，近红外半导体激光器1发射的激发光源的波长为808nm、980nm、1064nm中的至少一者。
在本发明中，激发光源的激发功率可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高成像效果，近红外半导体激光器1的激发功率选自200mw、600mw、1000mw中的至少一者。
在本发明中，激发滤光片3的类型可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高成像效果，优选地，激发滤光片3选用窄带通滤光片。
在本发明中，二色镜4的类型可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高成像效果，优选地，二色镜4选用长反短通二色镜。
在本发明中，物镜5的类型可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高成像效果，优选地，物镜5选用牌号N.A.＝1.49全内反射专用物镜。
在本发明中，相机8的类型可以在宽的范围内选择，但是为了进一步相机8的灵敏度以提高成像效果，优选地，相机8选用牌号Photometrics Prime95B背照式sCMOS相机。
在上述实施方式中，为了进一步便于处理数据，优选地，相机8与计算机相连接。
在本发明中，稀土掺杂的上转换发光纳米材料的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高成像效果，优选地，稀土掺杂的上转换发光纳米材料选用NaYF4:Yb,Er@NaYF4上转换纳米粒子、NaGdF4:Yb,Er@NaYF4上转换纳米粒子和NaYF4:Yb,Er@NaYGdF4上转换纳米粒子中的至少一者。
在上述实施方式中，样品器皿9的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了进一步便于操作，优选地，样品器皿9为玻底培养皿或硅烷化过的玻璃片。
在上述实施方式中，针对不同类型的样品器皿9，为了进一步提高成像效果，优选地，在样品器皿9为玻底培养皿时，焦距为2200-2300nm；或，在样品器皿9为硅烷化过的玻璃片时，焦距为3700-3800nm。
在本发明中，为了进一步提高近红外半导体激光器1、三维可调准直扩束镜2之间的激发光的传输效果，优选地，近红外半导体激光器1、三维可调准直扩束镜2通过FC标准接口相连接。
本发明还提供了一种如上述的基于上转换发光全内反射单颗粒成像方法，该基于上转换发光全内反射单颗粒成像方法在上述的基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置中进行，包括：
1)将稀土掺杂的上转换发光纳米材料置于样品器皿9中，接着开启近红外半导体激光器1以发射激发光源进入三维可调准直扩束镜2中，三维可调准直扩束镜2能够准直扩束后的激发光；
2)激发光经过激发滤光片3以能够除去杂散光，纯化后的激发光经过二色镜4反射进入物镜5；通过三维可调准直扩束镜2调节激发光的入射角度，以使得激发光形成以水平方向光束接近消失的临界角度；
3)激发光激发稀土掺杂的上转换发光纳米材料后，上转换发光纳米材料产生发射光，发射光经过物镜(5)收集、二色镜(4)反射并通过发射滤光片7以滤掉激发光和其它杂散光，相机8采集发射滤光片7后的发射光以得到全内反射成像。
以下通过实施例对本发明进一步进行说明。下述实施例中NaYF4:Yb,Er@NaYF4上转换纳米粒子是通过参考文献用共沉淀法制备而得(参考文献Wang H,Lu Y,Wang L,Chen H(2019)Detection of tyramine and tyrosinase activity using red region emissionNaGdF4:Yb,Er@NaYF4upconversion nanoparticles.Talanta 197:558-566.doi:10.1016/j.talanta.2019.01.079)。
制备例1
玻璃片的硅烷化处理：
选用规格为24*50毫米的玻璃片进行硅烷化处理。首先，用家用清洁剂对玻璃片进行超声清洗处理，处理三次，每次10分钟。接着，用超纯水对玻璃片进行超声清洗处理，同样，处理三次，每次10分钟。随后用烘箱烘干玻璃片。再对烘干后的玻璃片进行羟基化处理。用食人鱼溶液(浓硫酸和30％双氧水配比的混合物，重量比为7:3)浸泡玻璃片，80℃加热2小时，直至无气泡产生。然用去离子水超声洗涤玻璃片，处理两次，每次15分钟，后用烘箱烘干玻璃片。随后对玻璃片进行硅烷化处理，即用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)与无水乙醇的混合溶液(重量比为1:1000)浸泡玻璃片，25℃慢速摇晃1小时，后再用乙醇清洗玻璃片。最后用烘箱烘干。
实施例1
1)构建基于上转换发光全内反射成像装置
将近红外半导体激光器1作为激发光源，利用FC标准接口接入三维准直扩束镜2，经过准直扩束后的激光，通过洁净激发滤光片3，除去激发光的杂散光。纯化后的激光经过二色镜4反射进入物镜5。调节激光入射角度，实现全内反射，产生隐失波。利用隐失波激发位于载物台6上的样品-上转换纳米发光材料，所发出的光经过物镜5收集后，通过二色镜4，经过发射滤光片7，进一步滤掉激发光和其它杂散光，进入高灵敏度背照式sCMOS相机8成像，数据采用计算机处理。
2)基于上转换发光全内反射成像装置调试。
在校准装置前先要用浸润无水乙醇的擦镜纸将物镜镜头擦拭干净，以确保后续校准以及拍摄效果最佳。擦拭时注意不可来回反复多方向擦拭，一般按照同一方向，顺时针或逆时针均可。
取用300μL水相的NaYF4:Yb,Er@NaYF4上转换材料溶液(体积可不固定，能在容器里有一定深度即可)，若选用玻底培养皿作为盛放待测对象的容器，调整焦距在2200nm附近。若选用已经硅烷化过的玻璃片，则可搭建简易光束观察装置：剪取离心管的上半部分，倒置在玻璃片上作为盛放容器，再调整焦距在3700nm附近。打开激光器，通过调节三维可调准直扩束镜，同时调节激光功率至能在溶液中看到稳定且具有一定长度的光束(激光功率为600mW)。
检测样品的制备要求：吸取待观察样品(以NaYF4:Yb,Er@NaYF4上转换材料为例)2–3μL滴于硅烷化处理玻璃片中央，用另一块玻璃片覆盖并轻轻按压，排除多余气泡，注意安全，以防被玻璃片割伤
在物镜镜头上滴入镜油，将制备好的样品置于载物台上，通过调节三维可调准直扩束镜，调节激光光束至垂直入射角度，得到宽场成像模式，如图3的A部分所示。通过调节三维可调准直扩束镜，调节激光光束方向由原本竖直向上转变为水平面方向，得到临界角成像模式，如图3的B部分所示。通过调节三维可调准直扩束镜，继续调节激光束入射角度，以水平方向光束接近消失为最佳角度偏置，如图3的C部分所示，此为全内反射成像状态。
3)基于上转换发光全内反射成像装置单颗粒成像方法。
在全内反射成像状态，实现单颗粒成像。调整载物台，得到不同位置单颗粒成像结果。数据采用Image J(https://imagej.nih.gov/ij)程序处理。
检测例1
通过牌号为Hitachi F-4600的荧光仪和透射电镜对实施例1中NaYF4:Yb,Er@NaYF4上转换纳米粒子进行表征，结果见图2，由图可知上转换纳米粒子为六方相，平均粒径为27.70nm。
图4是实施例1中同一样品的不同位置成像结果图，A-C为第一位置，D-F为第二位置；其中图4的A、D部分为宽场模式；图4的B、E部分为临界角模式；图4的C、F部分为全内反射模式，图中的箭头表示的是激发光的角度。
从两组照片中可以清楚看出，与宽场模式对比，在全内反射状态下，上转换纳米颗粒亮度更加均匀且拍摄出的光斑面积明显减小，颗粒轮廓更加分明，故选择在全内反射状态下对上转换纳米材料进行单颗粒成像，可以大大降低背景光噪声，提高成像照片的分辨率从而减弱观测干扰。
检测例2
为了研究激光功率大小对上转换纳米材料在单颗粒成像方面的影响，我们也进行了在调整不同功率的同时，记录上转换纳米材料的单颗粒成像效果。如图5所示，图5中所有图片为同一样品的同一位置的单颗粒成像照片，A、B和C成像时所用的激光功率分别为200mW、600mW和1000mW，展示的均是在全内反射状态下的拍摄效果图。从图5中可以明显看出，当激光功率逐渐增大时，全内反射状态下所拍摄的样品单颗粒成像照片分辨率显著增强，信噪比明显提升，背景光噪声明显降低。故提高成像时所采用的激光功率可以在一定程度上提高成像照片的质量，从而提升对上转换发光的全反射单颗粒成像效果。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置，其特征在于，包括：近红外半导体激光器(1)、三维可调准直扩束镜(2)、激发滤光片(3)、二色镜(4)、物镜(5)、载物台(6)、发射滤光片(7)、相机(8)、光路(10)；所述近红外半导体激光器(1)与三维可调准直扩束镜(2)相连接，所述三维可调准直扩束镜(2)与光路(10)相连通且两者之间设置有所述激发滤光片(3)；所述光路(10)内的通道的中部设置有二色镜(4)，所述二色镜(4)面向所述激发滤光片(3)；所述光路(10)的一端由内至外依次设置有物镜(5)、载物台(6)，所述载物台(6)上设置有样品器皿(9)，所述样品器皿(9)内盛有稀土掺杂的上转换发光纳米材料；所述光路(10)的另一端内的通道中设置有发射滤光片(7)，所述相机(8)面向所述光路(10)的另一端的尾部。
2.根据权利要求1所述的基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置，其中，所述近红外半导体激光器(1)发射的激发光源的波长为808nm、980nm、1064nm中的至少一者。
3.根据权利要求1所述的基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置，其中，所述激发滤光片(3)选用窄带通滤光片；
优选地，所述二色镜(4)选用长反短通二色镜；
更优选地，所述物镜(5)选用牌号N.A.＝1.49全内反射专用物镜；
进一步优选地，所述相机(8)选用牌号Photometrics Prime95B背照式sCMOS相机。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置，其中，所述相机(8)与计算机相连接。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置，其中，所述稀土掺杂的上转换发光纳米材料选用NaYF4:Yb,Er@NaYF4上转换纳米粒子、NaGdF4:Yb,Er@NaYF4上转换纳米粒子和NaYF4:Yb,Er@NaYGdF4上转换纳米粒子中的至少一者。
6.根据权利要求1-3中任意一项所述的基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置，其中，所述样品器皿(9)为玻底培养皿或硅烷化过的玻璃片。
7.根据权利要求6所述的基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置，其中，在所述样品器皿(9)为玻底培养皿时，焦距为2200-2300nm；
或，在所述样品器皿(9)为硅烷化过的玻璃片时，焦距为3700-3800nm。
8.根据权利要求6所述的基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置，其中，所述近红外半导体激光器(1)、三维可调准直扩束镜(2)通过FC标准接口相连接。
9.一种基于上转换发光全内反射单颗粒成像方法，其特征在于，所述基于上转换发光全内反射单颗粒成像方法在如权利要求1-8中任意一项所述的基于上转换发光全内反射单颗粒成像装置中进行，包括：
1)将稀土掺杂的上转换发光纳米材料置于样品器皿(9)中，接着开启近红外半导体激光器(1)以发射激发光源进入三维可调准直扩束镜(2)中，所述三维可调准直扩束镜(2)能够准直扩束激发光；
2)所述激发光经过所述激发滤光片(3)以能够除去杂散光，纯化后的激发光经过所述二色镜(4)反射进入物镜(5)；通过所述三维可调准直扩束镜(2)调节激发光的入射角度，以使得激发光形成以水平方向光束接近消失的临界角度；
3)激发光激发稀土掺杂的上转换发光纳米材料后，所述上转换发光纳米材料产生发射光，所述发射光经过物镜(5)收集、二色镜(4)反射并通过发射滤光片(7)以滤掉激发光和其它杂散光，所述相机(8)采集发射滤光片(7)后的发射光以得到全内反射成像。
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