CN105572084A - 一种荧光损耗方法、显微成像方法及显微成像装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光损耗方法、显微成像方法及显微成像装置。所述荧光损耗方法利用近红外损耗光在稀土掺杂上转换纳米材料的敏化离子中引起受激吸收，将近红外激发光的能量转移至能量传递离子，从而实现对上转换纳米材料的多光子荧光进行损耗。基于该荧光损耗方法，提出将近红外损耗光利用空间相位调制板调制为空心光束，与激发光束进行准直共轭聚焦后实现对稀土掺杂上转换纳米材料及其标记样品的显微成像。基于该显微成像方法，搭建由激发光生成模块、损耗光生成模块、二向色镜、多光子显微扫描模块和光电探测模块组成的超分辨光学显微成像系统，获得低成本、低复杂度、高分辨率、简便、有效的实时动态三维图像。

Description

一种荧光损耗方法、显微成像方法及显微成像装置

技术领域

本发明属于光学显微技术领域，具体涉及一种实现双近红外波长激励的荧光损耗方法，以及利用上述荧光损耗方法的显微成像方法及显微成像装置。

背景技术

在常规的光学成像过程中，根据阿贝原则，光学系统所能够达到的极限分辨率大小约为入射光波长的一半。为了提高分辨率，科学家们提出了许多种打破衍射极限的方法，统称为超分辨成像方法。其中一种重要方法就是受激辐射损耗术(STimulatedEmissionDepletion,STED)。STED显微术中包括激发光束以及经过相位调制后得到的空心光束。STED中，利用受激辐射的方法，用损耗激光对激发光斑外围的荧光强行淬灭回基态，从而达到损耗荧光，提高分辨率的目的。相比较其他的超分辨成像方法，STED不仅可以达到纳米级的分辨率，并且能够实现视频速度的快速成像，因此成为了生物学研究中一种重要的方法。不仅如此，结合双光子激励(Two-PhotonExcited,TPE)方法，TPE-STED方法将激发波长从紫外、可见波段转移到近红外波段，在极大地降低了激光对生物组织损伤的同时，也显著地提高了成像深度。目前TPE-STED技术已经成为了一项在深度组织中实现超分辨成像的重要方法。

但目前来说，TPE-STED技术在深度组织超分辨成像中仍然面临一定的限制和挑战，主要体现在：(1)损耗激光仍然位于可见光波段，在生物组织中散射严重，在较大的深度中很难达到理想的损耗效果。(2)基于STED原理的损耗光功率较大，会对生物组织造成严重的热损伤。(3)目前常用的STED荧光染料普遍存在光漂白或者光闪烁的问题，达不到足够的光稳定性。不能满足长时间成像时的需要。(4)成像所用的光源为高功率飞秒光源，价格昂贵且光学系统复杂，难以推广。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种荧光损耗方法，该方法突破传统的受激辐射荧光损耗，利用受激吸收的方法，结合稀土掺杂上转换纳米材料中的能量传递离子，实现对上转换纳米材料的荧光进行损耗，可以将荧光损耗波长从可见光波段移至红外波段，从而解决了现有技术中损耗光的散射问题，打破了传统多光子STED的深度限制。

本发明的另一个目的在于提供一种基于上述荧光损耗方法的显微成像方法，该方法结合了多光子超分辨技术及上转换纳米材料本身的优点，实现了激发波长和损耗波长都位于近红外波段，解决了深度组织超分辨成像中损耗波长散射严重的问题，从而达到在较大深度的成像中也可以实现超分辨成像。

本发明的另一个目的在于提供一种基于上述显微成像方法的显微成像装置，该装置中的激发光和损耗光都可用连续光激光器，具有成本低的优点。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种荧光损耗方法，包括以下步骤：

(1)利用近红外激发光激发稀土掺杂上转换纳米材料产生多光子荧光；所述稀土掺杂上转换纳米材料中的稀土离子按照功能不同分为活化离子、敏化离子和能量传递离子三种；

(2)增加一束近红外损耗激光进行激励，这束近红外损耗激光的波长符合敏化离子中相对应的两个能级的能量间隙，这束近红外损耗激光通过引起受激吸收过程，将敏化离子中某一能级的电子激发到更高能级；

(3)处在更高能级的电子将能量传递到能量传递离子，这部分能量通过转换为荧光或者非辐射跃迁的方式损耗掉，从而实现对应能级所产生的荧光的损耗。

优选的，所述步骤(1)中，稀土掺杂上转换纳米材料是一种在纳米晶中掺杂稀土离子的复合型纳米材料，所述纳米晶采用NaYF₄、NaGdF₄、Y₂O₃、ZrO₂等材料，所述稀土离子包括Er³⁺、Tm³⁺、Ho³⁺、Eu³⁺、Nd³⁺、Yb³⁺、Tb³⁺、Sm³⁺、Dy³⁺等镧系元素离子。

更进一步的，所述稀土离子中活化离子、敏化离子和能量传递离子的具体功能如下：

(1)在第一连续激光器激发下，活化离子吸收单个激发光的光子并将能量传递给敏化离子；

(2)敏化离子吸收一个或多个活化离子传递的能量后发生上转换过程并发射出多光子荧光；

(3)在第二激光器激励下，敏化离子中的部分能量通过受激吸收过程转移到能量传递离子中，并通过转换为荧光或者是非辐射跃迁的方式对能量进行消耗。

更进一步的，所述步骤(1)中，所述稀土掺杂上转换纳米材料基于稀土离子丰富的实能级，其活化离子通过基态吸收(GroundStateAbsorption，GSA)对近红外激发光进行吸收后，通过能量传递上转换(EnergyTransferUpconversion，ETU)、激发态吸收(EnergyStateAbsorption，ESA)将能量传递给敏化离子，再由敏化离子通过上转换过程发射出紫外、可见或是近红外波段的荧光，即激发出多光子荧光。

优选的，所述近红外激发光与近红外损耗激光的波长波段均位于760nm-2000nm之间。

一种基于上述荧光损耗方法的显微成像方法，包括以下步骤：

在一路，第一连续激光器发出一稳定的近红外波长激光，该激光经过准直扩束镜、小孔光阑滤波处理后，获得聚焦的高斯型实心光斑；

同时在另一路，第二激光器产生稳定的近红外波长激光，该激光经过准直扩束镜、小孔光阑滤波后，再经过空间相位调制板调制形成空心光束，从而获得受激发射损耗光斑；所述近红外波长激光的波长符合敏化离子中相对应的两个能级的能量间隙；

所述聚焦实心光斑与所述受激发射损耗光斑空间上进行共轴耦合，聚焦实心光斑激发稀土掺杂上转换纳米材料产生多光子荧光，受激发射损耗光斑通过引起受激吸收过程，将敏化离子中某一能级的电子激发到更高能级，处在更高能级的电子将能量传递到能量传递离子，这部分能量通过转换为荧光或者非辐射弛豫过程损耗掉，从而实现对应能级所产生的荧光的损耗；

收集稀土掺杂上转换纳米材料在上述聚焦光斑作用下发出的荧光，利用光电探测器检测上述超分辨多光子荧光信号，进行XYZ方向扫描，得到荧光成像图片。

一种基于上述显微成像方法的显微成像装置，包括激发光生成模块、损耗光生成模块、二向色镜、多光子显微扫描模块和光电探测模块，所述激发光生成模块用于生成用作近红外激发光的近红外稳态激光束，所述损耗光生成模块用于生成用作近红外损耗激光的近红外空心光束；所述二向色镜的临界波长选择由所使用的损耗光与激发光波长决定，与近红外稳态激光束成45°角放置，放置在垂直于近红外稳态激光束且穿过该二向色镜的光轴上，近红外稳态激光束通过二向色镜后偏转90°角；重叠的近红外空心光束与近红外稳态激光束在空间上共轭耦合成一束耦合激光束，该耦合激光束通过多光子显微扫描模块聚焦在载物台上标记了稀土掺杂上转换纳米材料的样品上；光电探测模块用于检测上述样品被激发的超分辨多光子荧光信号。

具体的，所述激发光生成模块包括第一近红外连续激光器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第一滤光片、第一准直扩束镜、第一二分之一波片、第一偏振片，所述第一近红外连续激光器发出的激光束经过第一滤光片、第一准直扩束镜后处理成为一束平行光束，然后利用第一偏振片及第一二分之一波片调节其功率，该光束的波长匹配稀土掺杂上转换纳米材料的激发波长。

具体的，所述损耗光生成模块包括第二近红外连续激光器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第二滤光片、第二准直扩束镜、第二二分之一波片、第二偏振片、空间相位调制板，所述第二近红外连续激光器发出的激光束经过第二滤光片、第二准直扩束镜后处理成为一束平行光束，然后利用第二偏振片及第二二分之一波片调节其功率，然后通过空间相位调制板调制成空心光束，该空心光束波长为0，该光束的波长匹配稀土掺杂上转换纳米材料的敏化离子中相对应的两个能级的能量间隙。

具体的，所述多光子显微扫描模块包括沿耦合激光束前进方向依次放置的扫描振镜、高反低透二向色镜和物镜，耦合激光束经过扫描振镜、高反低透二向色镜后被物镜聚焦，所述载物台上的样品放置在物镜的焦面上。

具体的，所述光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜和光电探测器，聚焦透镜和光电探测器设置在沿耦合激光束前进方向的反方向上，所述光电探测器与外部计算机链连接，稀土掺杂上转换纳米材料标记的样品在近红外损耗激光的激发下发射沿各个方向上的超分辨荧光，一部分荧光信号被物镜收集，经过高反低透二向色镜、聚焦透镜后由光电探测器接收。

优选的，所述扫描振镜设置在一旋转装置上，旋转装置由一计算机控制，该计算机与光电探测器连接。因此在光电探测器接受完一次检测的信号后，就发送信号到计算机，然后该计算机通过旋转装置控制扫描振镜旋转，利用聚焦光斑扫描样品的方式获得一幅二维图像。

更进一步的，所述载物台一侧设有用于驱动载物台沿Z轴方向移动的电机。通过该电机，结合旋转装置可以获得三维图像。

优选的，所述高反低透二向色镜反射波长大于近红外激发光及近红外损耗激光的波长，透过波长小于近红外激发光及近红外损耗光的波长。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1、相比较传统的STED技术，本发明将荧光损耗波长从可见光波段移至红外波段。在较大深度(300微米)的组织中由于可见光波段的损耗光散射严重，和激发光相比不能很好地穿透生物组织，从而使得多光子STED的分辨率严重下降。然而，红外波段的损耗光在生物组织中散射较小，具有较大的穿透深度。本发明可以解决损耗光的散射问题，打破传统多光子STED的深度限制。

2、与传统的STED技术相比，本发明的激发光和损耗光都可用连续光激光器，便于实验室采购，价格低。同时，本发明的成像系统不需要对激发光和损耗光在时间上进行控制，极大地降低了成像系统的复杂度，为推广多光子超分辨技术及其对应的研究具有重要的作用。

3、本发明所应用的材料为上转换纳米材料，具有非常良好的光学特性，包括无光漂白，无光闪烁，超低背景荧光等。本发明结合了这种材料的光学优势，有利于在多光子超分辨成像中实行长时间的三维成像。

附图说明

图1为本发明荧光损耗方法的原理示意图。

图2为本发明实施例1中NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺的发光原理图。

图3为本实施例1中获得的材料激发光谱及损耗光谱。

图4为本实施例1中材料NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺的透射电镜图。

图5为本发明实施例2中NaYF₄:Yb³⁺/Tb³⁺的发光原理图

图6为本发明实施例4显微成像装置的结构示意图。

图6中：1—第一近红外连续激光器、2—第一滤光片、3—第一准直扩束镜(包括第一小孔光阑)、4—第一二分之一波片、5—第一偏振片、6—二向色镜、7—第二近红外连续激光器、8—第二滤光片、9—第二准直扩束镜(包括第二小孔光阑)、10—第二二分之一波片、11—第二偏振片、12—空间相位调制板、13—反射镜、14—扫描振镜、15—高反低透二向色镜、16—物镜、17—稀土掺杂上转换纳米材料或其标记样品、18—聚焦透镜、19—光电探测器。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

参见图1，本实施例荧光损耗方法中采用的近红外激发光与近红外损耗激光的波长波段均位于760nm-2000nm之间，用于激发稀土掺杂上转换纳米材料。稀土掺杂上转换纳米材料中的稀土离子按照功能不同分为活化离子、敏化离子和能量传递离子三种。其步骤是：

(1)利用近红外激发光激发稀土掺杂上转换纳米材料，其活化离子通过基态吸收对近红外激发光进行吸收后，通过能量传递上转换、激发态吸收将能量传递给敏化离子，再由敏化离子通过上转换过程发射出紫外、可见或是近红外波段的荧光，即激发出多光子荧光。

(2)增加一束近红外损耗激光进行激励，这束近红外损耗激光的波长符合敏化离子中相对应的两个能级的能量间隙，这束近红外损耗激光通过引起受激吸收过程，将敏化离子中某一能级的电子激发到更高能级。

(3)处在更高能级的电子将能量传递到能量传递离子，这部分能量通过转换为荧光或者非辐射跃迁的方式损耗掉，从而实现对应能级所产生的荧光的损耗。

如图2所示，基于上转换NaYF₄：Yb³⁺/Er³⁺在795nm激发下所发绿光可以被1140nm光所损耗。在本实施例中，Er³⁺充当活化离子及敏化离子，Yb³⁺作为能量传递离子。

具体实施过程如下：在795nm激光激发下，Er³⁺通过GSA吸收了一个795nm的光子，基态的电子跃迁到能级⁴I_9/2，然后通过非辐射跃迁到达能级⁴I_11/2及⁴I_13/2后，分别发射出980nm及1500nm的单光子荧光。同时，Er³⁺离子之间发生了交叉弛豫过程2⁴I_13/2→⁴F_9/2+⁴I_15/2，使得电子跃迁到⁴F_9/2能级。经过多次非辐射跃迁后，电子接连补充到²H_11/2、⁴S_3/2、⁴F_9/2等能级上。²H_11/2、⁴S_3/2能级上的电子可以通过跃迁到基态能级⁴I_15/2发射出绿光，而⁴F_9/2能级上的电子可以通过跃迁到⁴I_15/2发射出红光。从上述发光机制来看，绿光及红光均为双光子荧光。在795nm光激发的基础上，利用1140nm的激光对NaYF₄：Yb³⁺/Er³⁺的绿光进行损耗。1140nm的激光可引起从²H_11/2到²K_15/2的ESA过程，从而使得电子从²H_11/2吸收一个1140nm光子后跃迁到²K_15/2，然后通过多次非辐射跃迁回到²H_11/2.在电子跃迁到⁴G_11/2时，Yb³⁺离子通过能量转移过程⁴G_11/2(Er³⁺)+²F_7/2(Yb³⁺)→⁴F_9/2(Er³⁺)+²F_5/2(Yb³⁺)，将能量转移到⁴F_9/2能级。这个过程导致从²H_11/2受激吸收后到达²K_15/2能级的电子数量大于从²K_15/2能级回到²H_11/2的电子数量，从而使得²H_11/2的电子数量比单独795nm激光激发下的电子数量低，从而达到损耗绿光的目的。

本实施例中的荧光损耗结果如图3所示。可以看出，在795nm激光激发下，材料NaYF₄：Yb³⁺/Er³⁺发出较强的绿光。增加了1140nm激光后，材料的绿光明显下降。图4展示了材料的形状、大小等性质，其颗粒平均直径为20nm，说明本纳米材料非常适合作为荧光标记物并应用于多种场合的生物成像中。

实施例2

本实施例除下述特征外其他结构同实施例1：

如图5所示，基于上转换NaYF₄：Yb³⁺/Tb³⁺在980nm激发下所发射的所有双光子荧光(包括490nm、546nm、585nm、620nm等)可以被另一束近红外光(包括1108nm、1264nm、1374nm、1541nm等)所损耗。在本实施例中，Yb³⁺充当活化离子，Tb³⁺作为敏化离子及能量传递离子。

具体实施过程如下：在一定功率的980nm激光激发下，两个Yb³⁺离子各自吸收一个980nm光子后发生协同敏化上转换过程(CooperativeSensitizationUpconversion，CSU)，将处于基态⁷F₆的电子激发到⁵D₄能级。在⁵D₄能级的电子会通过辐射出490nm、546nm、585nm、620nm的荧光回到对应的低能级⁷F₆,⁷F₅,⁷F₄,⁷F₃。因此这部分荧光均为双光子荧光。在此发光机制的基础上增加一束近红外损耗激光进行激励，将⁵D₄能级上的电子激发到更高的能级。对应的波长及能级包括但不限于：1108nm激发到能级I，1264nm激发到能级G，1374nm激发到能级E，1541nm激发到能级D。当电子激发到上述能级后，会通过非辐射弛豫的方式回到能级⁵D₃，然后通过发射381nm、415nm、438nm荧光对到对应的低能级⁷F₆,⁷F₅,⁷F₄。这个过程导致⁵D₄上的电子通过受激吸收过程和非辐射跃迁后都聚集到⁵D₃并转换成其他波长的荧光，最终实现对490nm、546nm、585nm、620nm的荧光的损耗。

实施例3

本实施例除下述特征外其他结构同实施例1：

基于实施例1中公开的荧光损耗方法，同样基于上转换NaYF₄：Yb³⁺/Er³⁺在795nm激发下所发绿光可以被1140nm光所损耗。本实施例提供了一种显微成像方法，该方法包括：

在一路，利用波长为795nm的连续激光器发出一稳定的近红外波长激光，作为激发光，该激光经过准直扩束镜、小孔光阑滤波处理后，获得聚焦的高斯型实心光斑；

同时在另一路，利用波长为1140nm的连续激光器产生稳定的近红外波长激光作为近红外损耗激光，该激光经过准直扩束镜、小孔光阑滤波后，经过对应1140nm波长的空间相位调制板调制并形成空心光束，从而获得受激发射损耗光斑；所述近红外损耗激光的波长符合敏化离子中²H_11/2和²K_15/2的能量间隙；

所述795nm聚焦实心光斑与所述1140nm受激发射损耗光斑空间上进行共轴耦合，795nm聚焦实心光斑激发NaYF₄：Yb³⁺/Er³⁺稀土掺杂上转换纳米材料产生多光子荧光，其中包括545nm的绿光。1140nm的受激发射损耗光斑通过引起受激吸收过程，将Er³⁺中²H_11/2的电子激发到²K_15/2，处在²K_15/2的电子将能量传递到能量传递离子Yb³⁺，这部分能量通过转换为荧光或者非辐射弛豫过程损耗掉，从而实现²H_11/2能级所产生的545nm绿色荧光的损耗；

收集NaYF₄：Yb³⁺/Er³⁺材料在上述聚焦光斑作用下发出的荧光，利用光电探测器检测上述超分辨多光子荧光信号，进行XYZ方向扫描，得到荧光成像图片。

同样的，针对实施例2所采用的上转换NaYF₄：Yb³⁺/Tb³⁺，也可以采用上述的显微成像方法，只需要适当调整激发光、近红外损耗激光等部分即可，此处不再赘述。

实施例4

本实施例除下述特征外其他结构同实施例1：

基于实施例1中公开的荧光损耗方法，本实施例提供了一种显微成像装置，该装置的结构参见图6，包括：激发光生成模块、损耗光生成模块、二向色镜、多光子显微扫描模块和光电探测模块。

本实施例采用实施例1中的NaYF₄：Yb³⁺/Er³⁺作为上转换荧光标记物。采用中心波长为795nm的第一近红外连续激光器1，其发出的激光作为荧光标记物的激发光，采用中心波长为1140nm的第二近红外连续激光器7，其发出的激光经过空间相位调制板后形成空心光束作为受激损耗光，探测由上述两激光束准直共轭耦合聚焦扫描照射后所产生的超分辨双光子荧光信号，实现荧光成像。

具体的，本实施例的工作过程如下：激发光生成模块包括第一近红外连续激光器1，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第一滤光片2、第一准直扩束镜(包括第一小孔光阑)3、第一二分之一波片4、第一偏振片5，所述第一近红外激光器发出的激光束经过第一滤光片、第一准直扩束镜(包括第一小孔光阑)后处理成为一束平行光束。损耗光生成模块包括第二近红外连续激光器7，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第二滤光片8、第二准直扩束镜(包括第二小孔光阑)9、第二二分之一波片10、第二偏振片11、空间相位调制板12，所述第二近红外激光器发出的激光束经过第二滤光片、第二准直扩束镜(包括第二小孔光阑)后处理成为一束平行光束，然后利用第二偏振片及第二二分之一波片调节其功率，然后通过空间相位调制板调制成空心光束，该空心光束波长为0。经过950nm高反低通二向色镜后在空间上进行准直共轭耦合。

经过准直共轭耦合的耦合激光束经过多光子显微扫描模块聚焦到载物台上的NaYF₄：Yb³⁺/Er³⁺上转换纳米材料标记的样品上，产生超分辨双光子荧光信号。多光子显微扫描模块包括沿耦合激光束前进方向依次放置的扫描振镜14、高反低透二向色镜15、物镜16，上述超分辨双光子荧光信号为波长545nm的荧光信号，所述扫描振镜设置在一旋转装置上，旋转装置由一外部计算机控制，该计算机还与后述光电探测器连接。545nm超分辨双光子荧光信号经过物镜、高反低通二向色镜返回后，由光电探测模块探测该545nm荧光信号。

本实施例中光电探测模块包括依次同轴放置聚焦透镜18和光电探测器19。聚焦透镜和光电探测器设置在沿耦合激光束前进方向的反方向上，所述光电探测器与外部计算机链连接。在光电探测器接收完一次检测信号后，就发送信号到计算机，然后该计算机通过旋转装置控制扫描振镜旋转，利用聚焦光斑扫描样品的方式得到一幅二维图像，所述载物台一侧设有用于驱动载物台沿Z轴方向移动的电机，通过该电机，结合旋转装置可以获得三维图像。

同样的，针对实施例2所采用的上转换NaYF₄：Yb³⁺/Tb³⁺，也可以采用上述的显微成像装置，只需要适当调整激发光、近红外损耗激光及二向色镜等部分即可，此处不再赘述。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光损耗方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用近红外激发光激发稀土掺杂上转换纳米材料产生多光子荧光；所述稀土掺杂上转换纳米材料中的稀土离子按照功能不同分为活化离子、敏化离子和能量传递离子三种；

(2)增加一束近红外损耗激光进行激励，这束近红外损耗激光的波长符合敏化离子中相对应的两个能级的能量间隙，这束近红外损耗激光通过引起受激吸收过程，将敏化离子中某一能级的电子激发到更高能级；

(3)处在更高能级的电子将能量传递到能量传递离子，这部分能量通过转换为荧光或者非辐射跃迁的方式损耗掉，从而实现对应能级所产生的荧光的损耗。

2.根据权利要求1所述的荧光损耗方法，其特征在于，所述步骤(1)中，稀土掺杂上转换纳米材料是一种在纳米晶中掺杂稀土离子的复合型纳米材料，所述纳米晶采用NaYF₄、NaGdF₄、Y₂O₃、ZrO₂中的一种，所述稀土离子包括镧系元素离子Er³⁺、Tm³⁺、Ho³⁺、Eu³⁺、Nd³⁺、Yb³⁺、Tb³⁺、Sm³⁺、Dy³⁺中的至少一种；

所述步骤(1)中，所述稀土掺杂上转换纳米材料基于稀土离子丰富的实能级，其活化离子通过基态吸收对近红外激发光进行吸收后，通过能量传递上转换、激发态吸收方式将能量传递给敏化离子，再由敏化离子通过上转换过程发射出紫外、可见或是近红外波段的荧光，即激发出多光子荧光。

3.根据权利要求1所述的荧光损耗方法，其特征在于，所述稀土离子中活化离子、敏化离子和能量传递离子的具体功能如下：

(1)在第一连续激光器激发下，活化离子吸收单个激发光的光子并将能量传递给敏化离子；

(2)敏化离子吸收一个或多个活化离子传递的能量后发生上转换过程并发射出多光子荧光；

(3)在第二激光器激励下，敏化离子中的部分能量通过受激吸收过程转移到能量传递离子中，并通过转换为荧光或者是非辐射跃迁的方式对能量进行消耗；

所述近红外激发光与近红外损耗激光的波长波段均位于760nm-2000nm之间。

4.一种基于权利要求1-3任一项所述荧光损耗方法的显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

在一路，第一连续激光器发出一稳定的近红外波长激光，该激光经过准直扩束镜、小孔光阑滤波处理后，获得聚焦的高斯型实心光斑；

同时在另一路，第二激光器产生稳定的近红外波长激光，该激光经过准直扩束镜、小孔光阑滤波后，再经过空间相位调制板调制形成空心光束，从而获得受激发射损耗光斑；所述近红外波长激光的波长符合敏化离子中相对应的两个能级的能量间隙；

所述聚焦实心光斑与所述受激发射损耗光斑空间上进行共轴耦合，聚焦实心光斑激发稀土掺杂上转换纳米材料产生多光子荧光，受激发射损耗光斑通过引起受激吸收过程，将敏化离子中某一能级的电子激发到更高能级，处在更高能级的电子将能量传递到能量传递离子，这部分能量通过转换为荧光或者非辐射弛豫过程损耗掉，从而实现对应能级所产生的荧光的损耗；

收集稀土掺杂上转换纳米材料在上述聚焦光斑作用下发出的荧光，利用光电探测器检测上述超分辨多光子荧光信号，进行XYZ方向扫描，得到荧光成像图片。

5.一种基于权利要求4所述显微成像方法的显微成像装置，其特征在于，包括激发光生成模块、损耗光生成模块、二向色镜、多光子显微扫描模块和光电探测模块，所述激发光生成模块用于生成用作近红外激发光的近红外稳态激光束，所述损耗光生成模块用于生成用作近红外损耗激光的近红外空心光束；所述二向色镜与近红外稳态激光束成45°角放置，放置在垂直于近红外稳态激光束且穿过该二向色镜的光轴上，近红外稳态激光束通过二向色镜后偏转90°角；重叠的近红外空心光束与近红外稳态激光束在空间上共轭耦合成一束耦合激光束，该耦合激光束通过多光子显微扫描模块聚焦在载物台上标记了稀土掺杂上转换纳米材料的样品上；光电探测模块用于检测上述样品被激发的超分辨多光子荧光信号。

6.根据权利要求5所述的显微成像装置，其特征在于，所述激发光生成模块包括第一近红外连续激光器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第一滤光片、第一准直扩束镜、第一二分之一波片、第一偏振片，所述第一近红外连续激光器发出的激光束经过第一滤光片、第一准直扩束镜后处理成为一束平行光束，然后利用第一偏振片及第一二分之一波片调节其功率，该光束的波长匹配稀土掺杂上转换纳米材料的激发波长。

7.根据权利要求5所述的显微成像装置，其特征在于，所述损耗光生成模块包括第二近红外连续激光器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第二滤光片、第二准直扩束镜、第二二分之一波片、第二偏振片、空间相位调制板，所述第二近红外连续激光器发出的激光束经过第二滤光片、第二准直扩束镜后处理成为一束平行光束，然后利用第二偏振片及第二二分之一波片调节其功率，然后通过空间相位调制板调制成空心光束，该空心光束波长为0，该光束的波长匹配稀土掺杂上转换纳米材料的敏化离子中相对应的两个能级的能量间隙。

8.根据权利要求5所述的显微成像装置，其特征在于，所述多光子显微扫描模块包括沿耦合激光束前进方向依次放置的扫描振镜、高反低透二向色镜和物镜，耦合激光束经过扫描振镜、高反低透二向色镜后被物镜聚焦，所述载物台上的样品放置在物镜的焦面上。

9.根据权利要求5所述的显微成像装置，其特征在于，所述光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜和光电探测器，聚焦透镜和光电探测器设置在沿耦合激光束前进方向的反方向上，所述光电探测器与外部计算机链连接，稀土掺杂上转换纳米材料标记的样品在近红外损耗激光的激发下发射沿各个方向上的超分辨荧光，一部分荧光信号被物镜收集，经过高反低透二向色镜、聚焦透镜后由光电探测器接收。

10.根据权利要求8所述的显微成像装置，其特征在于，所述扫描振镜设置在一旋转装置上，旋转装置由一计算机控制，该计算机与光电探测器连接；

所述载物台一侧设有用于驱动载物台沿Z轴方向移动的电机；

所述高反低透二向色镜反射波长大于近红外激发光及近红外损耗激光的波长，透过波长小于近红外激发光及近红外损耗光的波长。