CN107831147B - 一种多波段荧光损耗方法、多色超分辨成像方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多波段荧光损耗方法、多色超分辨成像方法及装置。多波段荧光指在NaGdF₄:Yb³⁺/Tm³⁺核心外包裹掺杂其他活化离子的壳层，通过Yb³⁺/Tm³⁺敏化、上转换过程，电子到达Tm³⁺高能级，再依次迁移能量到Gd³⁺离子、壳层活化离子X³⁺发出上转换荧光。改变活化离子，借助同样的敏化、上转换、能量迁移过程，发出的上转换荧光不同。荧光损耗过程利用810nm附近波长激光在Tm³⁺匹配能级之间引起受激辐射，使上转换过程中中间能级电子受激辐射跃迁至低能级，从而损耗Tm³⁺高能级的电子数，损耗由Tm³⁺高能级经由Gd³⁺传递到X³⁺发射的多波段荧光。基于该荧光损耗方法，合成不同活化离子的纳米颗粒，用同一对激发光和空心损耗光，实现多色超分辨显微成像。可极大简化光路系统，降低系统成本。

Description

一种多波段荧光损耗方法、多色超分辨成像方法及装置

技术领域

本发明属于光学显微技术领域，具体涉及一种实现单对近红外波长激光激励的多波段荧光损耗方法，以及利用上述损耗方法实现的基于单对激光的多色超分辨成像方法及成像装置。

背景技术

在常规的光学成像过程中，根据阿贝原则，光学系统所能够达到的极限分辨率大小约为入射光波长的一半。为了提高分辨率，科学家们提出了许多种突破衍射极限的方法，统称为超分辨成像方法。其中一种重要方法就是受激辐射损耗术(Stimulated EmissionDepletion,STED)。STED显微术需使用激发光束以及经过相位调制后得到的空心光束。STED中，利用受激辐射的方法，用损耗激光对激发光斑外围的荧光发光强行淬灭回基态，从而达到损耗荧光发光，提高分辨率的目的。相比较其他的超分辨成像方法，STED不仅可以达到纳米级的分辨率，并且能够实现视频速度的快速成像，因此成为了生物学研究中一种重要的方法。不仅如此，结合双光子激励(Two-Photon Excited,TPE)方法，TPE-STED方法将激发波长从紫外、可见波段转移到近红外波段，极大地降低了激光对生物组织损伤的同时，也显著地提高了成像深度。

但目前来说，利用传统染料的TPE-STED技术在深度组织超分辨成像中仍然面临一定的限制和挑战，主要体现在：(1)损耗激光仍然位于可见光波段，在生物组织中散射严重，在较大的深度中很难达到理想的损耗效果。(2)损耗光功率较大，会对生物组织造成严重的热损伤。(3)常用的STED荧光发光染料普遍存在光漂白或者光闪烁的问题，达不到足够的光稳定性，不能满足长时间成像的需要。(4)TPE-STED成像所使用的光源为高功率飞秒光源，价格昂贵且光学系统复杂，难以推广。

为了克服以上困难，申请人已在先开发了使用连续近红外激光激发、损耗的，基于稀土掺杂上转换纳米颗粒的STED显微技术，但目前该技术只实现了单一种纳米颗粒的超分辨成像，应用到成像中得到信息量有限。因此，开发更多具备不同上转换发光并能够高效损耗的材料，通过多通道探测，实现多色超分辨成像意义重大。

发明内容

本发明的一个目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种多波段荧光损耗方法，该方法基于同一对近红外波长激光激发/损耗，突破传统受激辐射发光损耗的局限，使用稀土掺杂上转换纳米材料作为发光染料，通过对上转换过程中多个能级进行受激辐射激励，对多波段荧光同时实现高效率光控损耗。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述多波段荧光损耗方法实现多色超分辨成像的方法，该方法可实现不同纳米颗粒标记的多色超分辨成像。

本发明的另一目的在于提供一种用于实现上述多色超分辨成像方法的成像装置。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种多波段荧光损耗方法，包括以下步骤：

(1)合成核壳结构的稀土离子掺杂的上转换纳米颗粒，改变其中掺杂的活化离子实现同一波长激发得到不同波长的荧光辐射。每个上转换纳米颗粒核心由敏化离子Yb³⁺，积累离子Tm³⁺，迁移离子Gd³⁺共掺杂的NaF纳米晶构成；壳层由迁移离子Gd³⁺，活化离子X³⁺掺杂的NaF纳米晶构成。其中，上转换纳米颗粒有多种，每种的活化离子X³⁺不同。

敏化离子被用作吸收激发光泵浦光子，随后促进临近的积累离子到达高能级激发态¹I₆，迁移离子将积累离子高能级¹I₆的电子，传递给壳层的活化离子，掺杂不同的活化离子即可发出不同上转换荧光。迁移离子在核心和壳层之间起到了一座能量传递的桥梁作用，将能量从积累离子传递到了活化离子。活化离子X³⁺可以是Tb³⁺、Eu³⁺、Mn²⁺、Sm³⁺、Dy³⁺、Nd³⁺等离子中的一种或两种以上组合。因为Gd³⁺离子的最低辐射能级⁶P_7/2位于紫外光谱区域(310nm)，一方面匹配Tm³⁺高能级，另一方面位于所选用的活化离子吸收带内，所以使用Gd³⁺离子作为迁移离子可以实现从Tm³⁺到活化离子X³⁺之间高效快速的能量迁移。另外一个优点就是Gd³⁺离子的基态和⁶P_7/2之前的能级间隔(～32000cm^-1)，可以使多光子辐射和交叉弛豫引起的能量损失最小化。

(2)使用一连续波近红外激发光激发敏化离子Yb³⁺，例如975nm激光，通过上转换过程使电子传递到Tm³⁺高能级，Tm³⁺的¹D₂能级发出455nm荧光辐射，同时经其³P₂传递能量到Gd^{3 +}离子⁶P_7/2再传递给活化离子X³⁺(Tb³⁺、Eu³⁺、Mn²⁺、Sm³⁺、Dy³⁺、Nd³⁺等)发出其他不同颜色荧光。施加第二近红外损耗激光，波长位于810nm附近，损耗积累离子Tm³⁺辐射的455nm波段蓝光，以及高能级的电子，进而损耗由积累离子高能级电子通过迁移离子Gd³⁺传递能量到活化离子X³⁺所辐射的荧光。

(3)通过改变壳层中掺杂的活化离子X³⁺(Tb³⁺、Eu³⁺、Mn²⁺、Sm³⁺、Dy³⁺、Nd³⁺等)，可以合成使用同一波长激光(975nm)激发，且有着不同波长上转换荧光的纳米颗粒。当第二激光器发出的近红外损耗光(810nm)同时作用到上转换纳米颗粒上时，不同活化离子X³⁺(Tb³⁺、Eu^{3 +}、Mn²⁺、Sm³⁺、Dy³⁺、Nd³⁺等)掺杂的纳米颗粒所发出的不同波长的荧光将同时被损耗。

一种基于上述多波段荧光损耗方法的多色超分辨成像方法，包括以下步骤：

在一路，第一近红外光纤耦合激光器发出一束稳定的975nm波长单模激光，该激光准直后，作为高斯型实心光束；；

同时在另一路，第二近红外光纤耦合激光器产生稳定的810nm波长单模激光，该激光准直后，经过空间相位调制板调制形成中心光强为0的空心光束，从而获得损耗光斑；第二激光器产生的近红外波长激光的波长能量与积累离子中相对应的两个能级的能量间隙相匹配；

所述聚焦的高斯型实心光斑与所述损耗光斑空间上进行共轴耦合，聚焦的高斯型实心光斑激发稀土掺杂上转换纳米材料产生上转换发光，损耗光斑通过引起受激辐射过程，使积累离子中一个或多个涉及上转换过程的特定能级能量被消耗，从而阻断进一步的上转换和能量传递过程，实现对发光能级所产生发光的损耗；

将含不同活化离子的纳米颗粒标记到同一样品的不同部位，用同一近红外激发光和近红外损耗光经物镜聚焦后作用到样品上，并进行XYZ方向扫描，通过二色镜和滤光片分离不同纳米颗粒发出的不同上转换荧光信号，利用多个光电探测器同步对不同波长信号进行探测，从而得到不同纳米颗粒分布图像，将不同通道图像染色后叠加，即得到多色超分辨显微成像。

一种基于上述多色超分辨成像方法的显微成像装置，包括激发光生成模块、损耗光生成模块、二向色镜、多光子显微扫描模块和多通道光电探测模块、信号采集器、计算机，所述激发光生成模块用于生成用作近红外激发光的近红外稳态激光束，所述损耗光生成模块用于生成用作近红外损耗激光的近红外空心光束；所述二向色镜将互相垂直的近红外稳态激光束与近红外空心光束在空间上共轭耦合成一束耦合激光束，该耦合激光束通过多光子显微扫描模块聚焦在载物台上标记了不同稀土掺杂上转换纳米颗粒的样品上；多通道光电探测模块用于分离并探测上述样品中不同纳米颗粒被激发的不同波长超分辨上转换荧光信号，进而由信号采集器采集后，通过计算机软件实时显示多通道荧光分布图像，染色叠加后即得到实时的多色显微成像图。

具体的，所述激发光生成模块包括第一近红外连续光纤耦合激光器及其准直器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第一二分之一波片、第一偏振片，所述第一近红外连续激光器发出的激光束经过第一偏振片及第一二分之一波片调节其功率，该空心光束波长为975nm，与本发明中稀土掺杂上转换纳米材料的激发波长相匹配。

具体的，所述损耗光生成模块包括第二近红外连续光纤耦合激光器及其准直器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第二二分之一波片、第二偏振片、空间相位调制板，所述第二近红外连续激光器发出的激光束经过第二偏振片及第二二分之一波片调节其功率，然后通过空间相位调制板调制成空心光束，该空心光束波长为810nm，与本发明中稀土掺杂上转换纳米材料的积累离子剂中相对应的两个能级的能量间隙匹配。

具体的，所述多光子显微扫描模块包括沿耦合激光束前进方向依次放置的扫描振镜、高反低透二向色镜和物镜，耦合激光束经过扫描振镜、高反低透二向色镜(反射近红外激发光及近红外损耗激光，透射样品荧光)后被物镜聚焦，所述载物台上的样品放置在物镜的焦面上。

具体的，所述多通道光电探测模块包括将荧光分离到垂直两个方向的二向色镜，以及多组依次放置在二向色镜出射方向的带通滤光片、聚焦透镜和光电探测器。所述光电探测器与计算机连接，与扫描振镜同步进行信号采集，记录下每个位置不同上转换纳米颗粒标记的样品在近红外激发、损耗激光的照射下发射的超分辨上转换荧光。每个通道的光电探测器只采集某一种纳米颗粒发出的特殊波长荧光，多个通道同时采集分离的不同纳米颗粒分布图像，通过软件中染色、叠加即可得到实时的多色超分辨显微成像图。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1、有别于常规技术中单对激光只能损耗单一光谱，多色超分辨成像时需要多个激发光/损耗光激光对，本发明多波段荧光损耗方法基于同一对近红外波长激光激发/损耗，大大简化了光路系统，极大地降低了系统成本。

2、本发明方法突破传统受激辐射发光损耗的局限，使用稀土掺杂上转换纳米材料作为发光染料，通过对上转换过程中多个能级进行受激辐射激励，实现对多波段荧光的高效率光控损耗。

3、本发明丰富了上转换STED成像的材料选择，能够实现多通道同步进行的多色成像。

4、本发明使用稀土掺杂上转换纳米材料作为STED发光染料可以将发光损耗波长从可见光波段移至红外波段，从而解决了现有技术中损耗光的散射问题，打破了传统多光子STED技术的成像深度限制，同时，稀土掺杂上转换纳米材料无光漂白、光闪烁，具有传统STED染料所不具备的超级光稳定性。本发明结合了这种材料的光学优势，利于在多光子超分辨成像中实现长时间的三维成像。

附图说明

图1为多色荧光纳米颗粒发光及损耗原理示意图。

图2为实施例1中NaGdF₄:Yb³⁺/Tm³⁺@NaGdF₄:Tb³⁺结构示意图。

图3为实施例1中NaGdF₄:Yb³⁺/Tm³⁺@NaGdF₄:Tb³⁺核壳结构纳米颗粒电镜图。

图4为实施例1中NaGdF₄:Yb³⁺/Tm³⁺@NaGdF₄:Tb³⁺的发光及损耗原理图。

图5为实施例1中NaGdF₄:Yb³⁺/Tm³⁺@NaGdF₄:Tb³⁺的发光及损耗光谱图。

图6为实施例1中NaGdF₄:Yb³⁺/Tm³⁺@NaGdF₄:Eu³⁺的发光及损耗原理图。

图7为实施例1中NaGdF₄:Yb³⁺/Tm³⁺@NaGdF₄:Mn³⁺的发光及损耗原理图。

图8为实施例1中壳层结构中，同时掺杂Tb³⁺，Eu³⁺，Mn²⁺等活化离子的发光及损耗原理图。

图9(a)为实施例2中3层纳米颗粒结构示意图。

图9(b)为实施例2中3层纳米颗粒发光及损耗光谱图。

图10为实施例4中显微成像装置示意图。

图11为实施例1中NaYF₄：Yb³⁺/Tm³⁺和NaGdF₄：Yb³⁺/Tm³⁺@NaGdF₄：Tb³⁺的双色STED成像图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

参见图1、图2、图3、图4、图5，本实施例荧光纳米颗粒采用Tb³⁺作为活化离子，同时实现Tm³⁺的455nm,475nm和Tb³⁺的490nm/544nm/585nm/620nm等多波段上转换发光及损耗。核壳结构上转换纳米颗粒结构示意图如图2所示，其核心以NaGdF₄为基质，掺杂18mol％的Yb³⁺离子和10mol％的Tm³⁺离子。壳层同以NaGdF₄为基质，掺杂5mol％的Tb³⁺作为活化离子。迁移离子Gd³⁺作为能量传递的媒介，将能量从积累离子Tm³⁺的高能级传递到活化离子Tb³⁺，发出490nm/544nm/585nm/620nm等多波段上转换荧光。采用溶剂热方法合成的纳米颗粒电镜图如图3所示，其核心粒径大约20纳米，包裹壳层后达到35纳米。

参见图4，在本实施例中，材料的核心部分为NaGdF:Yb³⁺/Tm³⁺，壳层部分为NaGdF：Tb³⁺。Yb³⁺作为敏化剂，Tm³⁺的³P₂能级持续积累粒子，Gd³⁺起到了能量传递的作用，Tb³⁺作用为活化剂。NaGdF₄：Yb³⁺/Tm³⁺@NaGdF₄：Tb³⁺核壳结构纳米颗粒在975nm激发光激发下,Tb³⁺所发出的490nm/544nm/585nm/620nm等多波段荧光可以被810nm损耗光损耗。具体能级跃迁过程如下：

在975nm激光激发下，Yb³⁺通过基态吸收GSA过程吸收975nm光子，基态的电子跃迁至能级F_5/2，Yb³⁺把能量传递给Tm³⁺，Tm³⁺中的电子得到能量，经过了三次上转换跃迁过程：H₆→H₅→F₄→F₂→F₃→H₄→G₄，随后，通过能量转移上转换过程G₄+H₄→F₄+D₂与H₄+G₄→F₄+D₂，电子跃迁至发光能级D₂。然后，一部分能量再经过一次上转换过程D₂→P₂，电子跃迁至更高发光能级P₂，然后将能量传递给Gd的P_7/2能级。再进一步，能量传递给Tb³⁺离子，在一系列无辐射弛豫后，Tb³⁺从⁵P₄能级电子跃迁至⁷F₅能级发射出490nm/544nm/585nm/620nm等多波段上转换荧光。

810nm损耗光的加入使D₂能级粒子发生受激辐射，跃迁至F₂；这种情况使D₂能级粒子数急剧下降，从而阻断了从D₂进一步上转换到P2能级的电子跃迁，可观察到Gd³⁺发出的310nm的紫外光强明显减弱，同时Tb³⁺所发出的490nm/544nm/585nm/620nm等多波段荧光实现大幅损耗。

本实施例中的发光损耗结果如图5所示。在975nm激光激发下，材料荧光光谱中在490nm/544nm/585nm/620nm等多波段处有很强的Tb³⁺辐射的荧光信号。在增加了810nm损耗激光后，材料的490nm/544nm/585nm/620nm等多波段荧光同Tm³⁺发出的蓝色荧光一起被急剧损耗，光控损耗效率超过80％。

本实施例将Tb³⁺掺杂到所述核壳纳米颗粒壳层中，实现了Tb³⁺的490nm/544nm/585nm/620nm等多波段荧光的高效光控损耗，证明了方案的可靠性。

同理，将活化离子改为其他有相似能级机构的稀土离子，能够实现其他波长的荧光损耗。

如图6所示，若采用Eu³⁺作为活化离子的荧光纳米颗粒，经由同样的上转换和能量传递过程，电子到达Eu³⁺的发光能级⁵D₀，跃迁至⁷F₂能级将辐射418nm/490nm/527nm/615nm等多波段荧光。当810nm损耗光作用到纳米颗粒上，借助同样的受激辐射过程，即可实现Tm³⁺的455nm，475nm和Eu³⁺的418nm/490nm/527nm/615nm等多波段上转换荧光的损耗。

若采用Mn²⁺作为活化离子荧光纳米颗粒3，其能级跃迁过程如图7所示，经由同样的上转换和能量传递过程，电子到达Mn²⁺的发光能级⁴T₁，跃迁至⁶A₁能级将辐射530nm蓝绿色荧光。当810nm损耗光作用到纳米颗粒上，借助同样的受激辐射过程，即可实现Mn²⁺的530nm蓝绿色上转换荧光的损耗。

活化离子还可选择Dy³⁺，Sm³⁺，Nd³⁺等，材料结构同上，这里不再赘述。此外，在壳层结构中，除单一掺杂外，也可以同时掺杂两种或多种活化离子(Tb³⁺、Eu³⁺、Mn²⁺、Sm³⁺、Dy³⁺、Nd^{3 +})。如图8，在壳层结构中，可以同时掺杂Tb³⁺，Eu³⁺，Mn²⁺等活化离子。

本实施例通过改变核壳结构上转换纳米颗粒中的活化离子，对单一离子和多离子混掺情况都可以实现基于相同激发光、损耗光作用下的多波段甚至全波段荧光损耗，极大简化了传统多色荧光损耗系统。

实施例2

对于实施例1中的两层核壳结构而言，有些活化离子由于部分能级与积累离子Tm³⁺匹配，容易引起交叉传能，导致活化离子发光效率降低，本实施例提供一种三层结构以避免这类交叉传能，参见图9(a)。相比实施例1，本实施例在核心与活化离子所在壳层之间，加了一层无掺杂的NaGdF₄作为隔离层，参见图9(b)由于Gd³⁺的⁶P_7/2能级高于所用活化离子激发态，隔离层能够有效阻止从活化离子激发态到Tm³⁺中间能级的交叉传能，从而提高多波长荧光的发光效率。

实施例3

基于实施例1中的多色荧光纳米颗粒的合成和多波段荧光损耗方法，本实施例提供一种多色超分辨成像方法。

该方法包括步骤：

在一路，利用波长为975nm的连续光纤耦合激光器发出一稳定的近红外波长激光，作为激发光，该激光经过准直后，获得高斯型实心光束；

同时在另一路，利用波长为810nm的连续光纤耦合激光器产生稳定的近红外波长激光作为近红外损耗激光，该激光经过准直后，经过对应810nm波长的空间相位调制板调制并形成空心光束，从而获得空心损耗光束；所述近红外损耗激光的波长符合Tm³⁺中受激辐射情况对应的能量间隙；

所述975nm实心光束与所述810nm空心损耗光束空间上进行共轴耦合，经激光扫描系统再通过物镜聚焦到样品上。

将掺杂不同活化离子的上转换纳米颗粒，通过生物化学方法，标记样品的不同部位或结构上。将样品置于显微镜物镜焦平面上，975nm聚焦实心光斑扫描样品，激发出不同纳米颗粒的不同颜色上转换荧光。810nm聚焦空心光斑同时作用到975nm激发的荧光点周围，将周围荧光损耗，剩下小于衍射极限的荧光光点。

通过合理设置二色镜将不同纳米颗粒发出的超分辨荧光信号从波长上分离，再通过带通滤光片将不同纳米颗粒发出特殊荧光滤出，经一共轴放置的聚焦透镜聚焦到光电探测器上。视成像目标情况标记不同种纳米颗粒，并设置相应数量的探测通道，每一通道探测得到单一种类纳米颗粒的分布图像，不同通道可同时工作，达到完全同步探测。将不同通道信号通过计算机软件染色、叠加，即可得到实时显示的多色超分辨成像图，进而得到标记了不同纳米颗粒的样品结构的信息。

实施例4

基于实施例3中公开的多色超分辨显微成像方法，本实施例提供了一种多色超分辨显微成像装置，该装置的结构参见图10，包括：激发光生成模块、损耗光生成模块、二向色镜、多光子显微扫描模块、多通道光电探测模块、信号采集器、计算机。

本实施例考虑应用实施例1中介绍的两种不同上转换纳米颗粒作为上转换荧光标记物，即活化离子为Tb³⁺的发544nm荧光的纳米颗粒A、活化离子为Eu³⁺的发615nm荧光的纳米颗粒B。采用中心波长为975nm的第一近红外连续激光器1，其发出的激光作为荧光标记物的激发光，采用中心波长为810nm的第二近红外连续激光器2，其发出的激光经过空间相位调制板后形成空心光束作为损耗光，探测由上述两激光束准直共轭耦合聚焦扫描照射后所产生的超分辨多色荧光信号，实现多色荧光成像。

具体的，本实施例的工作过程如下：

激发光生成模块和损耗光生成模块，包括第一光纤耦合近红外连续激光器1，第二光纤耦合近红外连续激光器2，二分之一玻片3、5，线偏振片4、6，反射镜7、8、9，空间相位调制板10，二分之一玻片11，以及二向色镜12。第一、第二激光器分别产生所需的两个波长单模激光输出，二分之一玻片3、5安装在可旋转安装座上搭配线偏振器4、6用于调节两个光束的功率，沿激光束前进方向45度角放置的反射镜7、8、9和二向色镜12可调节两波长激光完全重合，空间相位调制板10将激光器2产生的激光束转换为空心的拉盖尔高斯光束。二分之一玻片11安装在可旋转安装座上用于调节空心光束的偏振方向，结合后面光路中四分之一玻片17可将空心光束转变为圆偏振光。激发光生成模块生成的双波长耦合近红外稳态激光束将用作近红外激发光，该耦合激光束通过多光子显微扫描模块聚焦在载物台上标记了前述两种纳米颗粒的样品上，双通道光电探测模块用于检测上述样品被975nm波长激光激发的不同颜色荧光信号，由数据采集器采集探测器的电信号后传输到计算机中处理生成实时显示的超分辨荧光图像，不同通道信号染色叠加后显示超分辨多色荧光图像。

本实施例中多光子显微扫描模块，包括扫描振镜对13，扫描透镜14，显微镜管镜15，高反低透二色镜16，显微物镜26，以及置于样品台上的上转换材料标记样品27。扫描振镜对用于偏转所述激发光生成模块生成的双波长耦合激光束，扫描透镜和显微镜管镜将激光束准直扩束到充满显微物镜入瞳的大小，最后将激光聚焦在样品台上的已标记样品上。

本实施例中采用双通道光电探测模块，包括荧光二向色镜19，第一通道荧光滤光片20，第二通道荧光滤光片21，荧光聚焦透镜22、23，第一通道光电探测器24，第二通道光电探测器25。所述荧光二向色镜将975nm激发光和810nm空心损耗光同时作用产生的两种不同纳米颗粒的荧光分离，分别由聚焦透镜聚焦到两个光电探测器将光信号转换为电信号。第一通道记录纳米颗粒A发出的544nm附近的荧光信号，第二通道记录纳米颗粒B发出的波长615nm附近荧光信号。与光电探测器相连的信号采集器能够读取光电探测器的电流信号值。将信号采集器传输到计算机的信号值与扫描坐标匹配得到强度分布图像输出到显示界面；同时将第一通道图像和第二通道图像赋予不同的颜色，将两幅彩色图像叠加，得到双色超分辨图像，并实时显示出来。另外，图像处理软件中可以即时改变探测器电压、图像增益补偿、偏置强度等参数，以便调节得到最佳超分辨成像效果。

同样的，若成像中应用更多发射不同荧光的纳米颗粒进行样品标记，只需根据探测荧光波段增设探测通道，按同样的采集、图像处理方法进行多色超分辨成像。

实施例5

以NaYF₄：18％Yb³⁺/10％Tm³⁺和NaGdF₄：40％Yb³⁺/10％Tm³⁺@NaGdF₄：15％Tb³⁺材料为例，基于实施例3和4，本发明实现了双色超分辨成像，如图11所示。具体方法如下：将NaYF₄：18％Yb³⁺/10％Tm³⁺溶液和NaGdF₄：40％Yb³⁺/10％Tm³⁺@NaGdF₄：15％Tb³⁺溶液以同样浓度比混合并且旋涂涂覆在玻璃片上进行成像。分别在975nm波长的激光下激发、975nm和810nm波长的激光下共同激发，以及810nm波长的损耗激光作用下激发。本实施例中采用双通道光电探测模块，在975nm和810nm波长的激光共同激发下，打开第一光电探测通道，使用蓝光带通滤光片，上转换荧光成像只能显示出含有NaGdF₄：40％Yb³⁺/10％Tm³⁺@NaGdF₄：15％Tb³⁺的上转换纳米颗粒的定位和形状，通过图像染色，观察到455nm波段的蓝色荧光成像。与此同时，打开第二光电探测通道，使用绿光带通滤光片，上转换荧光成像只能显示出含有NaYF₄：18％Yb³⁺/10％Tm³⁺的上转换纳米颗粒的定位和形状，通过图像染色可以观察到544nm波段的绿色荧光成像。因此，Tb³⁺-UCNPs的荧光图像可以通过455nm波长的荧光成像减去544nm波长的荧光成像即可获得，从而实现双色超分辨成像，并实时显示出来。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种多波段荧光损耗方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)通过稀土掺杂合成不同的核壳结构上转换纳米颗粒，利用同一近红外激发光激发不同核壳结构上转换纳米颗粒产生不同的多光子荧光，激发光的波长为975nm；所述核壳结构上转换纳米颗粒，其核是敏化离子、积累离子和迁移离子共同掺杂的纳米晶体，具体地其核以NaGdF₄为基质，其中的Gd³⁺作为迁移离子，并掺杂有Yb³⁺作为敏化离子和Tm³⁺作为积累离子；壳层是迁移离子、活化离子共同掺杂的纳米晶体，不同的上转换纳米颗粒包括的活化离子不同，具体地壳层同以NaGdF₄为基质，其中的Gd³⁺作为迁移离子；敏化离子被用作吸收激发光泵浦光子，随后促进临近的积累离子到达激发态，迁移离子将积累离子高能级的电子传递给活化离子，不同的活化离子发出不同上转换荧光；(2)增加一束近红外损耗激光进行损耗，这束近红外损耗激光的波长与积累离子中相对应的两个能级的能量间隙匹配，通过引起受激辐射损耗过程，阻断了特定能级的进一步上转换过程，从而实现单对激光的作用下，同时损耗来自积累离子、迁移离子和活化离子的多波段的上转换发光；具体地，所述近红外损耗激光波长位于810nm附近，能够损耗积累离子Tm³⁺辐射的455nm波段蓝光，以及高能级的电子，进而能够损耗由积累离子高能级电子传递能量到活化离子所辐射的荧光。

2.根据权利要求1所述的多波段荧光损耗方法，其特征在于，步骤(1)中所述近红外激发光为能够有效激发Yb³⁺的波长。

3.根据权利要求1所述的多波段荧光损耗方法，其特征在于，所述的活化离子是Tb³⁺、Eu³⁺、Mn²⁺、Sm³⁺、Dy³⁺、Nd³⁺稀土离子中的一种或两种以上组合，它们有不同的荧光辐射能级。

4.根据权利要求1所述的多波段荧光损耗方法，其特征在于，所述核壳结构上转换纳米颗粒，在核与壳层之间加了一层NaGdF₄作为隔离层。

5.一种基于权利要求1-4任一项所述多波段荧光损耗方法的多色超分辨成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

光路分为两条光路，在第一条光路中，第一近红外光纤耦合激光器发出一束稳定的975nm波长单模激光，该激光准直后，作为高斯型实心光束，从而获得高斯型实心光斑；

同时在另一条光路中，第二近红外光纤耦合激光器产生稳定的810nm波长单模激光，该激光准直后，经过空间相位调制板调制形成中心光强为0的空心光束，从而获得损耗光斑；第二近红外光纤耦合激光器产生的近红外波长激光的波长能量与积累离子中相对应的两个能级的能量间隙相匹配；

所述高斯型实心光斑与所述损耗光斑空间上进行共轴耦合，高斯型实心光斑激发稀土掺杂合成的上转换纳米颗粒产生上转换发光，损耗光斑通过引起受激辐射损耗过程，使积累离子中涉及上转换过程的特定能级能量被消耗，从而阻断进一步的上转换和能量传递过程，实现对产生的上转换发光的损耗；

将掺杂不同活化离子的上转换纳米颗粒，通过生物化学方法，标记在样品的不同部位或结构上，用同一近红外激发光和近红外损耗激光经物镜聚焦后作用到样品上，并进行XYZ方向扫描，通过二色镜和滤光片分离不同纳米颗粒发出的不同波长的上转换荧光信号，利用多个光电探测器同步对不同波长信号进行探测，从而得到不同纳米颗粒的分布图像，将不同纳米颗粒分布图像染色后叠加，即实现多色超分辨显微成像。

6.一种基于权利要求5所述多色超分辨成像方法的显微成像装置，其特征在于，所述显微成像装置使用一束激发光和一束损耗光实现多色超分辨成像，包括激发光生成模块、损耗光生成模块、二向色镜、多光子显微扫描模块、多通道光电探测模块、信号采集器、计算机，所述激发光生成模块用于生成用作近红外激发光的近红外稳态激光束，所述损耗光生成模块用于生成用作近红外损耗激光的近红外空心光束；所述二向色镜将互相垂直的近红外稳态激光束与近红外空心光束在空间上共轭耦合成一束耦合激光束，该耦合激光束通过多光子显微扫描模块聚焦在载物台上的、标记了不同上转换纳米颗粒的样品上，所述不同上转换纳米颗粒为掺杂不同活化离子的上转换纳米颗粒；多通道光电探测模块用于分离并探测上述样品中不同上转换纳米颗粒被激发的、不同波长的超分辨上转换荧光信号，进而由信号采集器采集后，通过计算机软件实时显示多通道荧光分布图像，将不同上转换纳米颗粒分布图像染色叠加后即得到实时的多色显微成像图。

7.根据权利要求6所述的显微成像装置，其特征在于，所述多光子显微扫描模块包括沿耦合激光束前进方向依次放置的扫描振镜、高反低透二向色镜和物镜，耦合激光束经过扫描振镜、高反低透二向色镜后被物镜聚焦，高反低透二向色镜反射近红外激发光及近红外损耗激光，透射样品荧光，载物台上的样品放置在物镜的焦面上；所述多通道光电探测模块包括将荧光分离到垂直两个方向的二向色镜，以及多组依次放置在二向色镜出射方向的带通滤光片、聚焦透镜和光电探测器；所述光电探测器与计算机连接，与扫描振镜同步进行信号采集，记录下每个位置不同上转换纳米颗粒标记的样品在耦合激光束照射下发射的超分辨上转换荧光；每个通道的光电探测器只采集某一种上转换纳米颗粒发出的特定波长荧光。

8.根据权利要求7所述的显微成像装置，其特征在于，

所述激发光生成模块包括第一近红外连续光纤耦合激光器及其准直器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第一二分之一波片、第一偏振片，所述第一近红外连续光纤耦合激光器发出的激光束经过第一偏振片及第一二分之一波片调节功率，第一近红外连续光纤耦合激光器发出的实心光束波长为975nm，与上转换纳米颗粒的激发波长相匹配；

所述损耗光生成模块包括第二近红外连续光纤耦合激光器及其准直器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第二二分之一波片、第二偏振片、空间相位调制板，所述第二近红外连续光纤耦合激光器发出的激光束经过第二偏振片及第二二分之一波片调节功率，然后通过空间相位调制板调制成空心光束，该空心光束波长为810nm，与上转换纳米颗粒的积累离子中相对应的两个能级的能量间隙匹配。

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