CN108776122B - 一种荧光成像方法、实时差分超分辨显微成像方法及装置 - Google Patents

一种荧光成像方法、实时差分超分辨显微成像方法及装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光成像方法，将两种荧光材料结合制备成一复合荧光材料，复合荧光材料在双波长激光激发下产生两道主要部分不重合的荧光信号；成像时，分别采用对应波长的激光激发复合荧光材料，发出相应波段的荧光。根据上述荧光成像方法可进行实时荧光差分超分辨显微成像。本发明通过调制两束波长激光分别形成高斯光和空心光，通过激光扫描显微装置，分别激发同一复合荧光材料两部分不同荧光信号，进一步使用两个探测通道同时记录两种模式图像，进而将两个通道荧光信号直接相减得到超分辨图像。本发明无需控制切换光束，仅单次扫描即可实现超分辨显微成像，可以解决现有STED技术中大功率损耗光和FED技术中两次扫描的缺陷。

Description

一种荧光成像方法、实时差分超分辨显微成像方法及装置
技术领域
本发明属于光学显微技术领域，具体涉及一种实现双波长激励的荧光成像方法，以及利用一次扫描的荧光信号相减实现实时荧光差分超分辨显微成像方法及显微成像装置。
背景技术
基于激光扫描成像的受激发射损耗显微术(Stimulated emission depletionmicroscopy,STED)，采用高斯型聚焦激光扫描样品成像的同时，采用另一束环形光聚焦损耗荧光点周围荧光，得到更小的荧光点，进而扫描得到超分辨荧光图像。由于其实时、快速及超高分辨率等特点，被广泛应用于亚细胞结构及其他细胞生物学问题的研究中。
单STED技术需要应用高功率损耗光，不可避免地带来光损伤等问题，为了克服这个缺陷，有研究小组探索出无需损耗荧光的荧光差分成像(Fluorescence emissiondifference microscopy,FED)方法，通过将一激光束先分离并将其中一束转变为空心光束后再耦合，在低功率激发下，实现适用于多数荧光材料的超分辨成像。这种FED技术仍有其局限，通常需要切换两束光进行两次扫描，局限了成像速度及其应用范围。
发明内容
本发明的一个目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种荧光成像方法，该方法基于一复合荧光材料，采用该材料通过两个不同波长可高效地激发两种不同的荧光，通过将两个通道荧光信号直接相减可实现成像。
本发明的另一个目的在于提供一种采用上述荧光成像方法，仅单次扫描即可实现实时差分超分辨显微成像的方法，可以解决现有STED技术中大功率损耗光和FED技术中两次扫描的缺陷，实现低功率激发的实时超分辨成像。
本发明的另一个目的在于提供一种基于上述超分辨显微成像方法的显微成像装置，该装置利用连续激光器，无需控制切换光束，成本低易实现。
本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种荧光成像方法，将两种荧光材料结合制备成一复合荧光材料，复合荧光材料在双波长激光激发下产生两道主要部分不重合的荧光信号；成像时，分别采用对应波长的激光激发复合荧光材料，发出相应波段的荧光。
具体的，所述复合荧光材料是发光纳米颗粒和/或标记物中两种材料的组合，该组合满足以下条件：两种材料的吸收光谱和荧光光谱都有不重叠部分，一种荧光材料的吸收光谱不与另一荧光材料的荧光发射光谱重合。当然，为了能够实际应用，两种材料需能稳定、均匀地结合在一起。
作为一种优选，所述复合荧光材料的具体结构是两种稀土离子掺杂上转换纳米材料合成核壳结构。
更进一步的，两种稀土离子掺杂上转换纳米材料为两种能够自敏化自发光的稀土离子单掺杂，或者由一种敏化离子搭配一激活离子共掺杂构成。
作为一种优选，所述复合荧光材料是两种荧光分子的一对一结合，所述荧光分子包括有机荧光染料分子、荧光蛋白和荧光素，结合方式可以通过将荧光分子修饰到互补单链DNA上再通过配对形成DNA双链实现，或通过将不同荧光分子分别修饰到一抗、二抗，生物素、链霉亲和素上，通过其特异性结合偶联结合成分子对。
作为一种优选，所述复合荧光材料是发光纳米颗粒表面包覆有机荧光染料分子，所述发光纳米颗粒包括稀土掺杂上转换纳米颗粒、量子点、纳米金颗粒，包覆过程通过共价键结合、化学基团交联或静电吸方法实现。
一种实时差分超分辨显微成像方法，包括以下步骤：
在一路，第一激光器产生稳定的第一波长激光，该激光经过准直后，经高倍物镜聚焦后获得聚焦的高斯型实心光斑；
同时在另一路，第二激光器发出一稳定的第二波长激光，该激光经过准直后，再经过空间相位调制板调制形成空心光束，再经过二分之一玻片、1/4玻片形成右旋的圆偏振光，经高倍物镜聚焦后获得空心光斑；
第一波长激光和第二波长激光通过二向色镜进行共轴耦合，保证聚焦后形成的所述高斯型实心光斑与所述空心光斑三维重合；
经过扫描装置聚焦到样品上的空心光斑和实心光斑分别激发材料不同波段的荧光，这两个波段荧光在波长上可分离；通过带通滤光片，使用两个光电探测器对两部分荧光信号分开探测；扫描装置对耦合光斑进行XYZ扫描的同时，信号采集器记录这两部分信号，传输到计算机处理并显示两个通道的图像，将实心激光束激发的第二通道荧光图像和空心激光束激发的第一通道荧光图像相减即得到实时的超分辨图像。
一种基于上述超分辨显微成像方法的显微成像装置，包括激发光生成模块、激光扫描显微模块、双通道光电探测模块、信号采集器及处理模块；
所述激发光生成模块用于生成用作近红外激发光的双波长耦合近红外稳态激光束，该激光束通过激光扫描显微模块聚焦在载物台上标记了稀土掺杂上转换纳米材料的样品上，双通道光电探测模块用于检测上述样品被双波长激发的双通道荧光信号，由信号采集器采集双通道光电探测模块的电信号后传输到处理模块中，实时显示生成的双通道荧光图像和差分荧光图像。
具体的，所述激发光生成模块，用于生成所需的双波长耦合近红外稳态激光束，包括第一光纤耦合激光器、第二光纤耦合激光器，两个激光器分别产生所需的两个波长单模激光输出，激光分别经二分之一玻片和线偏振器调节光束功率后，利用反射镜和二向色镜使两波长激光完全重合，空间相位调制板将第二光纤耦合激光器产生的激光束转换为空心的拉盖尔高斯光束，经第三二分之一波片调节空心光束的偏振方向后，结合后面光路中四分之一玻片将空心光束转变为圆偏振光。
具体的，所述双通道探测模块，包括荧光二向色镜、第一通道荧光滤光片、第二通道荧光滤光片、第一荧光聚焦透镜、第二荧光聚焦透镜、第一通道光电探测器、第二通道光电探测器，荧光二向色镜将双波长激发光激发的两种不同波段的荧光分离，先分别经第一通道荧光滤光片、第二通道荧光滤光片进行滤光，然后分别由第一荧光聚焦透镜、第二荧光聚焦透镜聚焦到第一通道光电探测器、第二通道光电探测器，将光信号转换为电信号，第一通道光电探测器记录第一光纤耦合激光器产生的实心光斑激发的荧光图像，第二通道光电探测器记录第二光纤耦合激光器产生的空心光斑激发的荧光图像。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
1、本发明提出将两种荧光材料结合制备成一复合荧光材料，使其在双波长激光激发下产生两主要部分不重合的荧光信号，进而可用于荧光成像。基于上述方法，可提升荧光差分超分辨成像的成像速度。在现有的单波长两次扫描实现的荧光差分成像方法基础上，更进一步实现双通道单次扫描得到需要的图像信息，便于软件直接处理同步实时输出超分辨荧光差分图像。
2、本发明中应用材料为上转换纳米材料时，具有非常良好的光学特性，包括无光漂白，无光闪烁，无细胞毒性等。使用的激发波长为连续光，具有穿透深度大，光损伤小，光散射小，不会激发细胞的自发荧光等优点。有利于在多光子超分辨成像中实行长时间的三维成像。
3、本发明中应用材料为量子点或荧光染料分子的组合时，具有寿命短(数纳秒)，成像速度更快等优势。
附图说明
图1为本发明双波长复合材料不同波段荧光并进行差分成像的概念示意图。
图2为本发明实施例1中复合材料NaYF4:Nd3+@NaYF4@NaYF4：Yb3+/Ho3+的结构图。
图3为本发明实施例1中复合材料NaYF4:Nd3+@NaYF4@NaYF4：Yb3+/Ho3+的发光原理图。
图4为本发明实施例1中所用不同波长获得的材料荧光光谱图。
图5为本发明实施例1中复合材料NaYF4:Nd3+@NaYF4@NaYF4：Yb3+/Ho3+的透射电镜图。
图6为本发明实施例2中复合材料DAPI-AF568结构示意图。
图7为本发明实施例3中复合材料UCNP-AF532结构示意图。
图8为本发明实施例4中复合材料QD-AF532结构示意图。
图9为本发明实施例5中不同通道荧光成像图以及差分得到超分辨成像效果图。
图10为本发明实施例6显微成像装置的结构示意图。
图10中：1—第一光纤耦合激光器、2—第二光纤耦合激光器、3—第二二分之一玻片，4—第二线偏振片、5—第一二分之一玻片，6—第一线偏振片、7—第一可调反射镜、8—第二可调反射镜、9—第三可调反射镜、10—空间相位调制板、11—第三二分之一波片、12—第一二向色镜、13—扫描振镜组、14—扫描透镜、15—显微镜管镜、16—高反低透二向色镜、17—四分之一波片、18—短通荧光滤光片、19—荧光二向色镜、20—第一通道荧光滤光片、21—第二通道荧光滤光片、22—第一荧光聚焦透镜、23—第二荧光聚焦透镜、24—第一通道光电探测器、25—第二通道光电探测器、26—物镜、27—复合荧光材料标记样品、28—信号采集器、29—处理模块。
具体实施方式
利用双波长激发双荧光的复合材料，实现单次扫描荧光差分超分辨成像如图1所示，具体实现中由所述复合材料组成不同需要相应改变系统中激光器和所用元件。下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例阐明合成两种独立发光的复合上转换纳米颗粒的实现方案。构筑图2所示3层核壳结构上转换纳米颗粒NaYF4:Nd@NaYF4@NaYF4:Yb/Ho，可实现795nm激发Nd3+离子575-600nm的橙色荧光和975nm激发Ho3+离子535-560nm的绿色荧光，激发荧光的能级跃迁示意图如图3所示，图4为975nm和795nm激光激发荧光光谱。
所述材料合成具体步骤如下：
(1)内核NaYF4:Nd(30mol％)上转换纳米颗粒的制备
在油酸/十八烯体系中，加入浓度为0.2mol/L比例为7:3的5mL Y(CH3CO2)3和Nd(CH3CO2)3溶液，在敞口条件下升温到150℃反应40-50分钟，降至室温，加入一定量的氢氧化钠甲醇溶液和氟化铵甲醇溶液，40℃水浴搅拌至少2个小时，在真空条件下加热到100℃反应30分钟除去甲醇，随后在氩气氛围下加热到280℃，在该温度下保持90分钟，结束加热，冷却到约75℃后加入10ml无水乙醇，离心后使用无水乙醇，无水乙醇/环己烷混合液清洗几遍，得到的上转换纳米颗粒溶于8ml环己烷，用于下一步反应。
(2)NaYF4:Nd(30mol％)@NaYF4核-壳上转换纳米颗粒的制备
在油酸/十八烯体系中，加入浓度为0.2mol/L 2.5ml Y(CH3CO2)3溶液，在敞口条件下升温到150℃反应40-50分钟，加入4ml NaYF4:Nd(30mol％)环己烷溶液，80℃水浴搅拌40-50分钟除去环己烷，随后40℃水浴条件下加入一定量的氢氧化钠甲醇溶液和氟化铵甲醇溶液，搅拌至少2个小时，在真空条件下加热到100℃反应20分钟除去甲醇，随后在氩气氛围下加热到285℃，在该温度下保持90分钟，结束加热，冷却到约75℃后加入10ml无水乙醇，离心后使用无水乙醇，无水乙醇/环己烷混合液清洗几遍，得到的上转换纳米颗粒溶于8ml环己烷，用于下一步反应。
(3)NaYF4:Nd(30mol％)@NaYF4@NaYF4:Yb/Ho(18/4mol％)核-壳-壳上转换纳
米颗粒的制备
在油酸/十八烯体系中，加入浓度为0.2mol/L 2.5ml Y(CH3CO2)3、Yb(CH3CO2)3、Ho(CH3CO2)3溶液，在敞口条件下升温到150℃反应40-50分钟，加入8ml NaYF4:Nd(30mol％)@NaYF4@NaYF4:Yb/Ho(18/4mol％)环己烷溶液，80℃水浴搅拌40-50分钟除去环己烷，随后40℃水浴条件下加入一定量的氢氧化钠甲醇溶液和氟化铵甲醇溶液，搅拌至少2个小时，在真空条件下加热到100℃反应20分钟除去甲醇，随后在氩气氛围下加热到290℃，在该温度下保持90分钟，结束加热，冷却到约75℃后加入10ml无水乙醇，离心后使用无水乙醇，无水乙醇/环己烷混合液清洗几遍，得到的上转换纳米颗粒溶于8ml环己烷。
成功合成的纳米颗粒透射电镜图如图5所示。
实施例2
本实施例阐明将两种荧光分子偶联复合材料的具体实现方案，以DAPI偶联AlexaFluor 568(下简称AF568)为例，DAPI可由405-nm连续或810-nm飞秒激光激发410-505nm波段荧光，AF568可通过561-nm连续或1022-nm飞秒激光激发570-660nm波段荧光，满足激发波长和荧光波长分离的要求。相应地选择合适的二色镜，例如Chroma公司的型号为79003bs的二色镜(透射窗口为455-540nm和570-660nm，其他波段反射)，以及荧光滤光片，即可应用到成像中。
该复合材料制备具体实施过程如下：
将DAPI和AF568通过共价结合分别连接到寡聚核苷酸链末端，将末端偶联有染料1和染料2的寡聚核苷酸链放入90mM的三甲基硅烷基-硼酸盐(Tris-borate，pH 8.3)和25mMNaCl混合溶液混合反应。将分别连有染料1和和染料2的两条互补寡聚核苷酸单链进一步提纯，通过20％的聚丙烯酰胺将双链互补配对的寡聚核苷酸和单链寡聚核苷酸分离开。进一步提纯，得到偶联有两种染料的双链寡聚核苷酸，参见图6。
实施例3
本实施例阐明有机染料包覆上转换发光纳米颗粒复合材料的具体实现方案，以Alexa Fluor 532(下简称：AF532)包覆Yb/Tm掺杂纳米颗粒(下简称:UCNP)为例，AlexaFluor 532可由532-nm连续或1064-nm飞秒激光激发540-600nm波段荧光，Yb/Tm掺杂纳米颗粒可通过975-nm连续激光激发450-485nm波段荧光，满足激发波长和荧光波长分离的要求。
复合材料制备具体实施过程如下：
(1)Alexa Fluor 532(下简称：AF532)修饰氨基
称取0.48g(1mmol)的AF532和0.3g的N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)溶解于15ml的四氢呋喃(THF)中。室温下，混合液在氮气保护下搅拌24小时。过滤去除多余沉淀。然后，0.3g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1.5ml乙二胺加入5ml的THF中，混合充分，再缓慢加入上述过滤后的溶液中。室温下搅拌反应24小时后，加入丙酮沉淀产物，过滤后真空干燥得到最终产物。最终得到氨基修饰的罗丹明B，即AF532-NH2。
(2)UCNP修饰羧基
称取0.1g聚丙烯酸加入8ml二甘醇(DEG)中，在氩气保护下加热至110℃搅拌1小时。然后注射2ml的60mg/ml的UCNP环己烷溶液，抽取真空30分钟以便将挥发的环己烷去除。然后，升温至240℃反应2个小时。反应结束，降至室温，加入10ml的1％的稀盐酸溶液和10ml无水乙醇沉淀产物，搅拌15分钟。15,000rpm离心30分钟，去除上清得到产物，用去离子水清洗3遍，即可获得羧基修饰的UCNPs，记作UCNP-COOH。
(3)将UCNP-COOH与AF532-NH2连接
取20mg的UCNP-COOH分散溶解于20ml的0.1mol/L(pH 6.0)2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中分别加入20mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和30mgN-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化羧基EDC/NHS室温下搅拌活化5小时。然后，将合成好的AF532-NH2加入活化好的UCNP-COOH中，室温下避光搅拌48小时。最后，15,000rpm离心半小时，获得最终产物UCNP-AF532,参见图7。
实施例4
本实施例阐明有机染料分子包覆量子点复合材料的具体实现方案，以有机染料Alexa Fluor 532(下简称AF532)包覆量子点Qdot 625(下简称QD625)为例，同实施例3所述，Alexa Fluor 532可由532-nm连续或1064-nm飞秒激光激发540-600nm波段荧光，Qdot625可由450nm以下波长激光激发610-630nm荧光。
该复合材料制备具体实施过程如下：
(1)AF532先与谷胱甘肽(下简称：GSH)偶联
0.2g的GSH溶解于1ml的甲醇溶液，超声分散30s。将AF532溶解于二甲基亚砜，配制成1mM的AF532溶液待用。然后将10μl的GSH溶液加入30μl的1mM的AF532溶液中。混合溶液在室温下，避光反应12h。反应得到AF532-GSH复合物。
(2)QD625的预处理
将购买来的QD625加入甲醇沉淀，5,000rpm离心10分钟，然后重新分散于环己烷中，配制200μl的4μM的QD625溶液。
(3)QD625与AF532充分反应
取50μL的4μM的QD625溶液至1.5ml离心管中，向离心管中加入步骤(1)中所制备好的AF647-GSH复合物。溶液混合后振荡1分钟，是两者充分混合。接着加入50μl的1mM的氢氧化钠溶液。溶液持续振荡反应至少2h。
(4)QD625-A532复合物
将步骤(3)的反应溶液进一步提纯，将步骤(4)的反应溶液加入超滤管(截留分子量为：50kDa)中6,000rpm离心10分钟。最后，提纯得到QD625-AF532复合物，参见图8。
实施例5
基于实施例1中公开的复合材料构筑方法，以及上转换纳米材料NaYF4:Nd3+@NaYF4@NaYF4：Yb3+/Ho3+在795nm激发下所发橙色荧光不同于975nm激发下所发绿色荧光，本实施例提供了一种显微成像方法，该方法包括：
在一路，单模975nm激光器发出一稳定的975nm激光，该激光经过准直后，经高倍物镜聚焦获得聚焦的高斯型实心光斑；
同时在另一路，单模795nm激光器产生稳定的795nm激光，该激光经过准直扩束，再经过空间相位调制板调制形成空心光束，再经过半玻片、1/4玻片形成右旋的圆偏振光，经高倍物镜聚焦后获得空心光斑；
795nm和975nm通过二向色镜进行共轴耦合，保证聚焦后形成的所述实心光斑与所述空心光斑三维重合。经过扫描装置聚焦到样品上的975nm实心光斑和795nm空心光斑分别激发材料535-560nm的绿色荧光和575-600nm的橙色荧光，这两个波段荧光可用二向色镜分离，搭配合适的带通滤光片，使用两个光电探测器对两部分荧光信号分开探测。扫描装置对耦合光斑进行XYZ扫描的同时，数据采集器记录这两部分信号，传输到计算机处理并显示两个通道的图像，计算机软件可进一步调节两个图像的增益、偏置等参数，对绿光通道和橙光通道两个图像相减即可得到实时的超分辨图像，同时在屏幕上呈现出来，两个通道及差分图像如图9所示，从强度分布曲线可知，差分图像分辨率大大提高以至于原本无法分辨的两个点能够被完全分辨开来。
同样的，针对实施例2、3、4中其他双波长激发两种不同荧光的复合材料，只需要适当调整实心激发光、空心激发光的波长以及高反低透二向色镜和探测通道前荧光滤光片即可，此处不再赘述。
实施例6
基于实施例1中公开的材料构筑方法，本实施例提供了一种显微成像装置，该装置的结构参见图10，包括：激发光生成模块、激光扫描显微模块、双通道光电探测模块、信号采集器及处理模块。
本实施例采用实施例1中的NaYF4:Nd3+@NaYF4@NaYF4：Yb3+/Ho3+作为上转换荧光标记物。采用中心波长为975nm的第一光纤耦合激光器1，其发出的激光束作为实心激发光，采用中心波长为795nm的第二光纤耦合激光器2，其发出的激光经过空间相位调制板后形成空心激发光，探测由上述两激光束耦合聚焦照射扫描后所产生的荧光信号，通过处理模块实时处理得到差分超分辨荧光图像。
具体的，本实施例的工作过程如下：
激发光生成模块，包括第一光纤耦合激光器1，第二光纤耦合激光器2，第二二分之一玻片3，第二线偏振片4、第一二分之一玻片5，第一线偏振片6、第一可调反射镜7、第二可调反射镜8、第三可调反射镜9、空间相位调制板10、第三二分之一波片11、第一二向色镜12。第一、第二光纤耦合激光器分别产生所需的两个波长单模激光输出，第二二分之一玻片3、第一二分之一玻片5安装在可旋转安装座上搭配线偏振器第二线偏振片4、第一线偏振片6用于调节第二光束和第一光束的功率，沿激光束前进方向45度角放置的三个反射镜和第一二向色镜12可调节两波长激光完全重合，空间相位调制板10将第二光纤耦合激光器产生的激光束转换为空心的拉盖尔高斯光束。第三二分之一玻片11安装在可旋转安装座上用于调节空心光束的偏振方向，结合后面光路中四分之一玻片17可将空心光束转变为圆偏振光。
本实施例中激光扫描显微模块，包括扫描振镜组13，扫描透镜14，显微镜管镜15，高反低透二向色镜16，物镜26，以及置于样品台上的上转换材料标记样品27。扫描振镜组用于偏转所述激发光生成模块生成的双波长耦合激光束，扫描透镜和显微镜管镜将激光束准直扩束到充满显微物镜入瞳的大小，最后将激光聚焦在样品台上的已标记样品上。
本实施例中双通道光电探测模块，包括荧光二向色镜19，第一通道荧光滤光片20，第二通道荧光滤光片21，第一荧光聚焦透镜22、第二荧光聚焦透镜23，第一通道光电探测器24、第二通道光电探测器25。所述荧光二向色镜将双波长激发光激发的两种不同波段的荧光分离，分别由聚焦透镜聚焦到两个光电探测器将光信号转换为电信号。第一通道光电探测器记录第一光纤耦合激光器产生的空心光斑激发的荧光图像，第二通道光电探测器记录第二激光器产生的实心光斑激发的荧光图像。与光电探测器相连的信号采集器能够读取光电探测器的电流信号值。将信号采集器传输到计算机的信号值与扫描坐标匹配得到强度分布图像输出到显示界面；同时将通道1强度值与通道2强度值相减，得到差分超分辨图像，如图1所示，并实时显示出来。另外，图像处理软件中可以即时改变探测器电压、图像增益补偿、偏置强度等参数，以便调节得到最佳超分辨成像效果。
同样的，针对实施例2、3、4中其他双波长激发两种不同荧光的复合材料，只需要适当调整实心激发光、空心激发光的波长以及高反低透二向色镜16和探测通道前荧光滤光片即可，此处不再赘述。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种荧光成像方法，其特征在于，将两种荧光材料结合制备成一复合荧光材料，复合荧光材料在双波长激光激发下产生两道主要光谱成分不重叠的荧光信号；所述复合荧光材料是发光纳米颗粒和/或标记物中两种材料的组合，该组合满足以下条件：两种材料的吸收光谱和荧光光谱都有不重叠部分，一种荧光材料的吸收光谱不与另一荧光材料的荧光发射光谱重合；
复合荧光材料的具体结构是两种稀土离子掺杂上转换纳米材料合成核壳结构，构筑三层核壳结构上转换纳米颗粒；
成像时，分别采用对应波长的双波长激光激发复合荧光材料，在一路，第一激光器产生稳定的第一波长激光，该激光经过准直后，经高倍物镜聚焦后获得聚焦的高斯型实心光斑，同时在另一路，第二连续激光器发出一稳定的第二波长激光，该激光经过准直后，再经过空间相位调制板调制形成空心光束，再经过二分之一玻片、1/4玻片形成右旋的圆偏振光，经高倍物镜聚焦后获得空心光斑，第一波长激光和第二波长激光通过二向色镜进行共轴耦合，经过扫描装置聚焦到样品上的空心光斑和实心光斑分别激发材料不同波段的荧光，这两个波段荧光在波长上可分离；通过带通滤光片，使用两个光电探测器对两部分荧光信号分开探测；扫描装置对耦合光斑进行XYZ扫描的同时，信号采集器记录这两部分信号，传输到计算机处理并显示两个通道的图像，将实心激光束激发的第二通道荧光图像和空心激光束激发的第一通道荧光图像相减即得到实时的超分辨图像。
2.根据权利要求1所述的荧光成像方法，其特征在于，两种稀土离子掺杂上转换纳米材料为两种能够自敏化自发光的稀土离子单掺杂，或者由一种敏化离子搭配一激活离子共掺杂构成。
3.根据权利要求1所述的荧光成像方法，其特征在于，所述复合荧光材料是两种荧光分子的一对一结合，所述荧光分子包括有机荧光染料分子、荧光蛋白和荧光素，结合方式可以通过将荧光分子修饰到互补单链DNA上再通过配对形成DNA双链实现，或通过将不同荧光分子分别修饰到一抗、二抗，生物素、链霉亲和素上，通过其特异性结合偶联结合成分子对。
4.根据权利要求1所述的荧光成像方法，其特征在于，所述复合荧光材料是发光纳米颗粒表面包覆有机荧光染料分子，所述发光纳米颗粒包括稀土掺杂上转换纳米颗粒、量子点、纳米金颗粒，包覆过程通过共价键结合、化学基团交联或静电吸方法实现。
5.一种实时差分超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
在一路，第一激光器产生稳定的第一波长激光，该激光经过准直后，经高倍物镜聚焦后获得聚焦的高斯型实心光斑；
同时在另一路，第二连续激光器发出一稳定的第二波长激光，该激光经过准直后，再经过空间相位调制板调制形成空心光束，再经过二分之一玻片、1/4玻片形成右旋的圆偏振光，经高倍物镜聚焦后获得空心光斑；
第一波长激光和第二波长激光通过二向色镜进行共轴耦合，保证聚焦后形成的所述高斯型实心光斑与所述空心光斑三维重合；
经过扫描装置聚焦到样品上的空心光斑和实心光斑分别激发材料不同波段的荧光，这两个波段荧光在波长上可分离；通过带通滤光片，使用两个光电探测器对两部分荧光信号分开探测；扫描装置对耦合光斑进行XYZ扫描的同时，信号采集器记录这两部分信号，传输到计算机处理并显示两个通道的图像，将实心激光束激发的第二通道荧光图像和空心激光束激发的第一通道荧光图像相减即得到实时的超分辨图像。
6.一种用于实现权利要求5所述超分辨显微成像方法的显微成像装置，其特征在于，包括激发光生成模块、激光扫描显微模块、双通道光电探测模块、信号采集器及处理模块；
所述激发光生成模块用于生成用作近红外激发光的双波长耦合近红外稳态激光束，该激光束通过激光扫描显微模块聚焦在载物台上标记了稀土掺杂上转换纳米材料的样品上，双通道光电探测模块用于检测上述样品被双波长激发的双通道荧光信号，由信号采集器采集双通道光电探测模块的电信号后传输到处理模块中，实时显示生成的双通道荧光图像和差分荧光图像；
所述激发光生成模块，用于生成所需的双波长耦合近红外稳态激光束，包括第一光纤耦合激光器、第二光纤耦合激光器，两个激光器分别产生所需的两个波长单模激光输出，激光分别经二分之一玻片和线偏振器调节光束功率后，利用反射镜和二向色镜使两波长激光完全重合，空间相位调制板将第二光纤耦合激光器产生的激光束转换为空心的拉盖尔高斯光束，经第三二分之一波片调节空心光束的偏振方向后，结合后面光路中四分之一玻片将空心光束转变为圆偏振光。
7.根据权利要求6所述的显微成像装置，其特征在于，所述双通道探测模块，包括荧光二向色镜、第一通道荧光滤光片、第二通道荧光滤光片、第一荧光聚焦透镜、第二荧光聚焦透镜、第一通道光电探测器、第二通道光电探测器，荧光二向色镜将双波长激发光激发的两种不同波段的荧光分离，先分别经第一通道荧光滤光片、第二通道荧光滤光片进行滤光，然后分别由第一荧光聚焦透镜、第二荧光聚焦透镜聚焦到第一通道光电探测器、第二通道光电探测器，将光信号转换为电信号，第一通道光电探测器记录第一光纤耦合激光器产生的实心光斑激发的荧光图像，第二通道光电探测器记录第二光纤耦合激光器产生的空心光斑激发的荧光图像。
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