CN114624218B - 一种通过光谱编码技术构建荧光标签的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种通过光谱编码技术构建荧光标签的方法,通过材料制备手段将几种光谱不重叠的荧光聚合物组合,得到复合的荧光材料,并将其作为荧光标签构建荧光探针。每一种复合荧光材料的光谱组成都是唯一的。通过荧光设备对光谱组分进行识别,并根据光谱的不同对荧光探针进行区分。通过该手段可以制备大量光谱组分不重复的复合的荧光材料,可用于同时对几十甚至几百种标识物进行识别分析。所采用的光谱不重叠的聚合物荧光材料单元的光谱都是唯一的,避免组合后的复合荧光材料出现光谱重复导致无法区分。
Description
技术领域
本发明涉及荧光探针的荧光标签构建技术领域,具体涉及一种可高通量的同时识别分析的荧光标签构建方法和光谱编码聚合物量子点的制备方法。
背景技术
免疫治疗的阳性反应通常依赖于肿瘤细胞与肿瘤微环境内免疫调节的相互作用,免疫微环境在抑制或增强免疫应答中发挥着重要的作用。肿瘤免疫微环境中的免疫浸润细胞种类繁多且功能复杂,微环境中细胞的免疫状态不仅与肿瘤的发展、转移等直接关联,更是决定了免疫疗法是否能发挥作用、发挥什么作用。随着组学技术的进步,人们对肿瘤免疫环境的复杂性和多样性以及它对免疫治疗的重要影响的认识越来越深刻。精准的肿瘤免疫微环境分析是帮助临床医生对肿瘤患者进行准确评估并制定个性化治疗方案必须要解决的问题。
免疫组织化学技术是应用免疫学基本原理——抗原-抗体反应,对组织或细胞内抗原或抗体物质定性和定位的技术,是描述肿瘤微环境空间组学信息常见的手段,在临床病理检验诊断中被广泛使用。然而传统的免疫组织化学染色只能在一张组织切片上标记3种颜色,无法进行大量靶标分子的标记,难以处理需要多重染色的细微病理组织。而连续多张切片染色虽然可以增加检测标识物的数量,但是片与片之间存在空间错位容易导致漏检,无法精确描绘微环境中各种细胞的空间位置关系。而且每次都要对大量的切片进行染色,也是极大的医疗资源浪费,尤其是有些组织切片比较稀有。
多重免疫组织化学技术是基于酪酰胺信号放大(Tyramide signalamplification,TSA)技术的多标记免疫组化染色方案,可在同一样本中使用同一种属来源的不同一抗进行多标记复合染色,可实现多达6-8种标识物的同步染色和共定位及定量分析。随着各种新免疫疗法的提出,相应的伴随诊断要求不断提高,对标识物的种类、数量、识别精度要求也越来越高,往往需要通过十几到几十种抗原蛋白的识别才能对患者分型分期等信息做出正确评估。因此,只有发展更高分辨率的标记成像技术才能够满足单张切片上高通量的蛋白分析需求。
商业化的质谱流式技术和DNA条形码技术虽然可以单次分析大量靶标分子,然而高昂的成本导致这些方法难以普及。而且这些方法都需要培训专业的操作人员,分析时间也很长。
因此,目前用于高分辨率的成像技术普遍存在耗时长的缺陷。荧光免疫成像操作更接近于传统的免疫组化技术,无需额外培训专业人员、分析成本也相对较低,但受限于荧光染料本身光谱性能,用于标记的荧光染料的材料存在着广谱宽光谱重叠问题,导致无法同时对大量分子单次标记成像,难以同时分析识别十几到几十种标识物。为提高分析通量,研究人员发展了多种基于不同荧光信号移除技术的循环免疫多色荧光成像的方法,通过在常规切片上进行多轮免疫荧光全景扫描来构建高维信息图像。虽然循环法通过提高循环次数能显著提高分析通量,但每个循环的操作都需要一定量的时间,包括抗体标记处理、成像和信号移除时间。一般非TSA的循环染色的每个循环时间需要2小时左右,涉及到几个循环,就需要将时间乘以几倍,而很多标记场合涉及到一抗的过夜孵育,会导致整个分析往往要几天甚至十几天时间。此外,通过酸、碱、氧化剂反复洗脱移除荧光信号的方法还可能对细胞表面抗原造成损伤,这种损伤会造成后续染色上的误差,导致图片存在“污点”(假阳性信号)和“盲点”(假阴性信号)。
发明内容
针对上述现有技术的不足,本发明提出一种可光谱编码的聚合物量子点(Pdots)策略,通过材料制备手段将几种光谱不重叠的荧光材料组合,得到复合的荧光材料。每一种复合荧光材料的光谱组成都是唯一的。将复合荧光材料连接抗体、核酸等生物分子构建荧光探针,用来标记目标标识物。通过对光谱组分进行识别,并根据光谱的不同组成对荧光探针进行区分和标识物的识别。通过该手段可以制备大量光谱组分不重复的复合的荧光材料,可用于同时对几十甚至几百种标识物进行识别分析。
所采用的光谱不重叠的聚合物荧光材料单元的光谱都是唯一的,避免组合后出现重复导致无法区分。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种构建荧光标签的方法,将n种光谱不重叠的荧光聚合物组合,得到复合荧光材料;对每一种复合荧光材料的光谱组分分别进行编码,每一种复合荧光材料的光谱组分都是唯一的,其编码也是唯一的;最后将复合荧光材料作为荧光标签构建荧光探针,根据对荧光探针信号的识别分析荧光探针的标识物。
进一步的,编码的方式为将荧光聚合物用二进制代码标定。
进一步的,编码的方式为将各个荧光材料分别用不同符号表示,每次组合得到一种编码唯一的复合荧光材料。
进一步的,n种光谱不重叠的荧光材料不重复并等比例搭配,通过随机组合可得到:种复合荧光材料。通过改变比例,可进一步丰富复合荧光材料的数量。
进一步的,所述荧光探针是用于抗原抗体识别的荧光探针,或用于核酸识别的荧光探针,或用于其它分子识别。
进一步的,通过荧光成像设备识别分析每种复合荧光材料的荧光组成,进而识别出该探针所标记的标识物。
本发明还提供一种可光谱编码的聚合物量子点的制备方法,包括如下步骤:
1.设计制备大量光谱不重叠的荧光聚合物单元材料,这些荧光聚合物可以是同一激发光激发的,也可以是不同激发光激发的;
2.将聚合物单元材料组合,确保每个组合中的不同聚合物单元材料的光谱不重叠;
3.将聚合物单元材料和双亲性聚合物材料(如PS-PEG)溶解于有机溶剂(如四氢呋喃)中;
4.将纯水盛于容器中,并置于超声清洗机中超声处理,将2中的有机溶剂快速加入超声的纯水中,继续超声5-60分钟;
5.得到复合的聚合物量子点溶液(Pdots);
6.将5中的有机溶剂去除,得到Pdots的水溶液。
7.将Pdots作为荧光标签,偶联生物分子构建荧光探针。
有益效果:本发明可以制备大量光谱组分不重复的复合的荧光材料,可用于同时对几十甚至几百种标识物进行识别分析。所采用的光谱不重叠的聚合物荧光材料单元的光谱都是唯一的,避免组合后出现重复导致无法区分。
附图说明
图1为以四种不同光谱的聚合物组合编码制备复合光谱组分的Pdots策略。
图2基于三种颜色的不同含量的聚合物构建的光谱编码Pdots。(A)PCFDP、PFO-DOF、PFOPV荧光共聚物结构,(B-D)材料激发发射光谱表征结果,(E)11号光谱编码Pdots的透射电镜照片,(F-G)系列光谱编码Pdots的发光单元掺杂比例及相应的荧光照片和色坐标。
具体实施方式
图1所示,以四种不同光谱波长的聚合物为编码单元进行等比例组合,四个聚合物的波长分别为510nm、550nm、610nm、660nm。为方便记录,这4个波长的聚合物分别用二进制代码标定为1000、0100、0010、0001,“1”代表存在光谱信号,“0”代表无信号,且四个聚合物的相对波长示意图在图1展示。将这些聚合物选取2个进行随机组合,那么不重复的组合数为种,对应的光谱二进制代码为:1100、1010、1001、0110、0101、0011;将这些聚合物选取3个进行随机组合,不重复的光谱组合为种,编码分别为1110、1011、1101、0111。再加上4种单色聚合物和1种4色光谱组合得到的Pdots,一共15种光谱可分辨的荧光材料产物。图1右侧展示了4个光谱编码荧光材料的光谱组成示意图。编码组合后各个单色(单一波长)聚合物的波长不会发生明显偏移,因此可以通过荧光设备检测出每种聚合物量子点(Pdots)的光谱组分,进而可以识别出该光谱对应的荧光探针信号。该技术可以将原本只能区分4种颜色的标记技术扩展到可区分15种。假如有n种这样的光谱不重叠的单色聚合物,通过随机组合可得到:种Pdots,经过结构验证和光谱组分筛选,可以得到丰富的Pdots数目,用于单次高通量的标记识别。
上述为几种聚合物单元等量组合,如果改变其中某一个的组分,比如相对其它组分加倍。以图1中四种为例,510nm、550nm、610nm、660nm四种的比例分别为1:1:0:2组合(不含610nm的),得到的复合荧光材料编码为1102,通过三种材料的强度比值就可以跟1101相区分。按照此种逻辑,改变一个或多个的组分又可以得到大量的Pdots。
选取三种发光波长的荧光共轭聚合物PCFDP、PFO-DOF、PFOPV分别作为红、蓝、绿三基色,通过调控掺杂比例得到系列光谱编码的多色荧光Pdots验证本申请方案的可行性。如图2所示,选取3种红、绿、蓝颜色单元进行不同比例组合。图2A为三种聚合物的分子结构和颜色示例,图2B显示3种单色聚合物的吸收-发射光谱结果,2D为三种单色聚合物制备的Pdots和白色Pdots(虚线标注)的光谱结果,E为制备的Pdots的典型的透射电镜照片,表明制备的纳米材料尺寸为10-30纳米。将三种聚合物单元进行组合,并将制备的Pdots溶液的荧光信号进行拍照记录。图2F展示的是11种不同光谱组分聚合物含量的荧光信号照片。其中1、2、3分别为蓝、绿、红三种单色的Pdots的激发光溶液,4-11为混合色,G图为三种聚合物颜色单元组合的色坐标结果。根据实验结果表明,本专利申请的策略可行。
本发明只列举了四种聚合物等组分情况改变1个或多个组分的结果,也包括更多不同单色、其它波长的聚合物的编码组合结果。材料不限于聚合物材料,也包括基于其它荧光材料,且尚未进行光谱编码组合的、也适用于本发明方法的材料。
Claims (8)
1.一种通过光谱编码技术构建荧光标签的方法,其特征在于,将n种光谱不重叠的荧光聚合物组合,得到复合荧光材料,n≥2;对每一种复合荧光材料的光谱组分分别进行编码,每一种复合荧光材料的光谱组分都是唯一的,其编码也是唯一的;最后将复合荧光材料作为荧光标签构建荧光探针,根据对荧光探针信号的识别分析荧光探针的标识物。
2.根据权利要求1所述的一种通过光谱编码技术构建荧光标签的方法,其特征在于,编码的方式为将荧光聚合物用二进制代码标定。
3.根据权利要求1所述的一种通过光谱编码技术构建荧光标签的方法,其特征在于,编码的方式为将各个荧光聚合物分别用不同符号表示,每次组合得到一种编码唯一的复合荧光材料。
4.根据权利要求1所述的一种通过光谱编码技术构建荧光标签的方法,其特征在于,n种光谱不重叠的荧光聚合物不重复搭配,通过随机选取1、2、3···n种聚合物并等比例组合可得到:种复合荧光材料;通过改变比例,可进一步丰富复合荧光材料的数量。
5.根据权利要求1所述的一种通过光谱编码技术构建荧光标签的方法,其特征在于,所述荧光探针是可用于抗原抗体识别的荧光探针,或用于核酸识别的荧光探针,或用于其它分子识别的探针。
6.根据权利要求1所述的一种通过光谱编码技术构建荧光标签的方法,其特征在于,通过荧光成像设备识别分析每种复合荧光材料的荧光组成,进而识别出该探针所标记的标识物。
7.一种可光谱编码的聚合物量子点的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:制备若干光谱不重叠的荧光聚合物单元材料,这些荧光聚合物可是同一激发光激发的,也可是不同激发光激发的;
步骤2:将荧光聚合物单元材料组合,确保每个组合中的荧光聚合物单元材料的光谱不重叠;将荧光聚合物单元材料和双亲性聚合物材料溶解于有机溶剂中;
步骤3:将纯水盛于容器中,并置于超声清洗机中超声处理,将步骤2中的有机溶剂快速加入超声的纯水中,继续超声5-60分钟,得到复合的荧光材料聚合物量子点Pdots溶液;
步骤4:将Pdots作为荧光标签,偶联生物分子构建荧光探针。
8.根据权利要求7所述的一种可光谱编码的聚合物量子点的制备方法,其特征在于,所述双亲性聚合物材料为PS-PEG,所述有机溶剂为四氢呋喃。
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