CN115372329A - 一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像方法与装置 - Google Patents

一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像方法与装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像方法与装置，光束调制模块产生的近红外激发光和近红外涡旋空心损耗光形成共轴耦合光束。其中近红外激发光可以激发样品荧光，近红外涡旋空心损耗光可以损耗作用区域样品荧光，可实现轴向超分辨(分辨率约～100nm)成像。共轴耦合光束通过半反半透镜引出两路相干光，各自经过柱透镜后共轭至两个物镜后瞳形成的相干光片在成像平面反向传播并干涉形成结构化照明图案照亮样品。成像模块中计算机对收集到的荧光图像进行频谱分离、重构，然后将所有图像取出并进行三维重构，最终实现具有较大成像深度与抗样品散射能力的大视野三维超分辨(分辨率约～100nm)成像。

Description

一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像方 法与装置
技术领域
本发明涉及光学显微的技术领域，具体涉及一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像方法与装置。
背景技术
光学显微成像技术，是现代生命科学中，研究活细胞生命活动的重要手段。光片显微成像技术是一种快速的，高穿透性，低光毒性的三维显微成像技术，结构上它利用两个或多个物镜分别用于照明样品和检测荧光信号，将光束变成薄片从侧面激发样品，在光片的垂直方向接收荧光信号。光片显微技术问世后，如何实现大视野下的三维超分辨成像一直是该领域研究的重点。现有光片成像技术激光光源主要为可见光，但可见光在样品组织中受散射影响较大，组织穿透能力交差，进而其传播视野相对较小。而为了提高成像视野，有研究者提出简单地采用提高激光波长的方案，例如利用近红外光激发，但往往会导致光片轴向分辨率更差，轴向分辨率仅仅能实现1-2μm，无法实现100nm以下的轴向超分辨成像。为提高轴向分辨率，有研究者提出利用更短激发波长的方案，但该方案将牺牲成像视野。同时，也有研究者提出利用结构光技术提高光片横向或者轴向上的分辨率，但所改善的分辨率主要集中于某一方向上，难以实现亚100nm的三维超分辨成像。因此，基于现有光片成像技术存在的问题，亟需一种大视野下的三维超分辨(亚100nm)成像技术及成像装置。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明旨在于提供一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像方法与装置，具体利用光束调制模块、光路模块，成像模块，在结构上同时实现受激辐射损耗与结构光照明，从而实现三维超分辨光片成像。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1光束调制模块产生的近红外激发光和近红外涡旋空心损耗光形成共轴耦合光束。其中近红外激发光可以激发样品荧光，近红外涡旋空心损耗光可以损耗作用区域样品荧光，因此共轴耦合光束通过柱透镜形成的夹心光片具有超薄的有效激发厚度并且近红外具有较大成像深度与抗样品散射能力，可实现大视野轴向超分辨(分辨率约～100nm)成像。
S2共轴耦合光束通过半反半透镜引出两路相干光，各自经过柱透镜后共轭至两个物镜后瞳形成的相干光片在成像平面反向传播并干涉形成结构化照明图案照亮样品。
S3成像模块中计算机对收集到的不同相位不同方向的荧光图像进行频谱分离、重构，得到一个层面的横向超分辨(分辨率约～100 nm)图像，轴向上移动载物台，使得可实现对样品的三维扫描，最后将所有图像取出并进行三维重构，最终得到大视野三维超分辨(分辨率约～100nm)样品图像；
需要说明的是，所述夹心光片在最外一层是损耗光，中间一层是激发光；在照射样品时，损耗光束与激发光束重叠部分照射的荧光被损耗，不产生荧光；仅有中间激发光束照明部分的荧光分子被激发而发出荧光；激发光束有效激发厚度变薄，从而提升了系统的轴向的分辨率；两束夹心光片由于干涉使得在xy平面上呈条纹分布，损耗光由于与激发光波长不同，形成结构条纹分布可能会有微小偏移，无法完全重合的现象，可以通过空间光调制器矫正位移偏差使之一一对应。
需要说明的是，通过载物台控制照明样品相对条纹的相位以及方向变化，从而实现各个方向的频谱平移拓展，从而在xy平面上实现横向超分辨成像。
需要说明的是，用荧光探针标记生物样品，其中荧光探针包括近红外激发的上转换荧光探针、有机染料、量子点中的任意一种。
另一方面，本发明还提供一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像的装置，所述装置包括光束调制模块、光路模块与成像模块，其中光束调制模块由第一激光器、第二激光器、望远镜系统，螺旋相位板、空间光调制器，反射镜组成。第一激光器是一台低功率的连续光或脉冲光激光器用于产生近红外激发光，第二激光器是一台低功率连续光或脉冲光激光器用于产生近红外损耗光；望远镜系统分别置于所述第一激光器、所述第二激光器之后；空间光调制器分别部署在望远镜系统之后，用于激发光与损耗光的整形以及产生实验所需的特殊光束；
光路模块由二向色镜、半反半透镜、反射镜组、柱面透镜、照明物镜组成；由光束调制模块产生调制好的近红外激发光和近红外涡旋空心损耗光通过二向色镜共轴耦合，半反半透镜将复合光束分成两路，分别经过反射镜组将两路光调整至同一光轴上反向传输；之后各自通过相同的柱面透镜以及照明物镜，形成两个反向传输的光片干涉以产生结构化照明图案，并激发样品内的荧光分子发出荧光；
成像模块由载物台、检测物镜、滤色片、镜筒透镜、成像相机和计算机组成；由载物台上的样品发出的荧光，经过检测物镜收集，检测物镜位于光片的垂直方向上；收集的荧光通过滤色片滤除信号光外的其它杂散光，有利于提高信噪比。过滤后的荧光经过镜筒透镜成像于成像相机的感光面，成像相机将拍摄的图像导入计算机；计算机将收集的图像进行频谱的分离重构，最终获得横向超分辨的图像。
需要说明的是，载物台由三维电动平台和样品室组成；三维电动平台可以沿着x，y，z三个方向根据计算机的控制移动并可以沿着支撑轴转动，以实现样本各个位置、各个方向的均匀照明。
需要说明的是，所述望远镜系统由两块透镜组成，用于激光束的扩束与准直。
需要说明的是，在光束调制模块中，螺旋相位板位于空间光调制器之后，用于将产生的特殊光束再次整形，形成近红外涡旋空心光束，经过反射镜进入光路模块。
需要说明的是，所述照明物镜相对于检测物镜光轴镜像分布且共轴用以夹心光片干涉以产生结构化照明图案，如图5所示。
本发明有益效果在于：
1、横向分辨率、轴向分辨率同时提高，实现了三维各向同性亚 100nm超分辨成像
2、由于样品由近红外激发光激发，在光片显微成像时提供了大的视野。
3、该超分辨成像技术具有无光漂白，超长时程成像的优势。
附图说明
图1为本发明的一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像装置示意图；
图2为本发明的关于上转换荧光探针(NaYF4:18％Yb3+,10％ Tm3+)的光谱响应曲线以及实验图像的示意图；
图3为本发明的关于夹心结构光片形态以及如何提升轴向分辨率的示意图；
图4为本发明的关于结构光片如何提高分辨率的示意图；
图5为本发明的关于载物台结构的示意图；
图6为本发明一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像方法的流程图。
具体实施方式
下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
实施例1
本实例一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像方法由以下步骤实现：
1、样品制备：用近红外激发的上转换荧光探针标记样品，并将其置于载物台22中样品室内。
2、通过光束调制模块产生的近红外激发光和近红外涡旋空心损耗光形成的共轴耦合光束通过半反半透镜12引出两个相干光，各自经过柱透镜16、20形成光片后，通过两个照明物镜17、21在成像平面干涉形成结构化照明图案照亮样品。
3、通过光束调制模块产生的近红外激发光可以激发荧光辐射荧光，近红外涡旋空心光可以损耗荧光，使得样品不发光，因此减少了两个光束共光轴形成的夹心光片的有效激发厚度并具有较大成像深度与抗样品散射能力，实现样品大视野轴向超分辨成像。
4、成像模块经过滤色片24接收样品的荧光信号，载物台通过平移、旋转获取不同相位、不同方向的结构光照亮样品的荧光信号。
5、成像模块对收集到的荧光图像进行频谱分离、重构，得到一个层面的横向超分辨图像。
6、成像模块中计算机27控制载物台22移动到下一个成像区域重复步骤(4)、(5)的操作，直至样品所有区域都完成成像工作。
7、成像模块将所有得到的图像取出并进行三维重构，得到三维大视野超分辨样品图像。
本实例一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像装置如图1所示，其中1为波长为975nm的半导体激光器，2为波长为810nm的半导体激光器，3、4、5、6为透镜，7、8为空间光调制器，9为螺旋相位板，10、13、14、15、18、19是反射镜， 11是短通二向色镜，12是半反半透镜，16、20是柱面透镜，17、 21是照明物镜，22是载物台，23是检测物镜，24是滤色片，25是镜筒透镜，26是成像相机，27是计算机。
进一步地，一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像的装置通过光束调制模块、光路模块，成像模块三个模块实现。光束调制模块包括半导体连续激光器1、2，透镜3、4、5、6，空间光调制器7、8，螺旋相位板9。光路模块包括短通二向色镜11，半反半透镜12，反射镜10、13、14、15、18、19，柱面透镜16、20，照明物镜17、21。成像模块包括载物台22，检测物镜23，滤色片 24，镜筒透镜25，成像相机26，计算机27。
具体实施时，半导体连续激光器1产生波长为975nm的近红外激发光，经过透镜3、5进行激光的扩束与准直，准直的激光束照射在空间光调制器7上，将近红外激发光调制为贝塞尔光束并反射到短通二向色镜11之上。半导体连续激光器2产生波长为810nm的近红外损耗光，经过透镜4、6进行激光的扩束与准直，准直的激光束照射在空间光调制器8上，将损耗光调制为贝塞尔光束，紧接着光束通过一块螺旋相位板9将损耗光调制为空心光束，经过反射镜10调整位置，将损耗光反射到短通二向色镜11之上。短通二向色镜11 截止频率为900nm，反射975nm激发光并导通810nm空心损耗光，并将两束光耦合共轴，复合光束通过半反半透镜12将复合光束分成两路，其中一路经过反射镜组13、18、19照射到柱面透镜20 并共轭至照明物镜21后瞳，出射的复合光束将形成夹心光片，最外一层是损耗光，中间一层是激发光如图3(a)所示。另一路经过反射镜组14、15照射到柱面透镜16并共轭至照明物镜21后瞳，复合光束同样形成夹心光片。两夹心光片在载物台22中的样品室中进行干涉，产生结构照明图案如图3(b)(仅画出激发部分)、图3(c) 所示。条纹光片激发样品内上转换荧光探针产生荧光，经过检测物镜 23收集，收集的荧光信号经过滤色片24将杂散光都滤除，滤除后的荧光经过镜筒透镜25成像于成像相机26的感光面上，成像相机26 将拍摄的图像序列传递至计算机27进行分析。
具体的，上转换荧光探针的光谱响应曲线由图2所示，其中975 nm的激发光单独作用时，能激发探针发出455nm的荧光，而975nm 和810nm的损耗光共同作用时处能使得已激发的荧光猝灭，原因是 810nm的损耗光使上转换荧光探针发生受激辐射从而损耗荧光。使用上转换荧光探针作为受激辐射损耗超分辨法的荧光探针，能显著降低受激辐射的饱和功率，从而降低光毒性，具有长时程成像的优势。
具体的，两路被分开的复合光束经过反射镜组13、14、15、18、19调整方向的目的是为了使得最终通过两照明物镜17、21出射的光片，能够在样品室内进行干涉，产生结构化照明图案。
进一步的，在成像相机26拍摄完一张图像后，计算机控制载物台22移动两次，每次移动条纹周期的1/3，每移动一次计算机27控制成像相机26拍摄一张图像，移动两次后，计算机27控制载物台 22旋转120度，重复上述位移、旋转操作，直至载物台22转过360 度为止，如图4所示。计算机27将收集到的图像进行计算，得到xy 平面上超分辨的图像，至此完成样品一个位置的成像任务。
更进一步的，在完成每一个位置的成像任务后，计算机27控制载物台22移动，移动的原则是：在光片所在平面的样品成像任务全部完成后，控制样品在轴向移动，并完成下一层的样品成像任务，直至完成样品全部成像任务。最后计算机27对所有图像进行三维重构，得到样品的三维超分辨图像。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1光束调制模块产生的近红外激发光和近红外涡旋空心损耗光形成共轴耦合光束。其中近红外激发光可以激发样品荧光，近红外涡旋空心损耗光可以损耗作用区域样品荧光，因此共轴耦合光束通过柱透镜形成的夹心光片具有超薄的有效激发厚度并且近红外具有较大成像深度与抗样品散射能力，可实现大视野轴向超分辨(分辨率约～100nm)成像。
S2共轴耦合光束通过半反半透镜引出两路相干光，各自经过柱透镜后共轭至两个物镜后瞳形成的相干光片在成像平面反向传播并干涉形成结构化照明图案照亮样品。
S3成像模块中计算机对收集到的不同相位不同方向的荧光图像进行频谱分离、重构，得到一个层面的横向超分辨(分辨率约～100nm)图像，轴向上移动载物台，使得可实现对样品的三维扫描，最后将所有图像取出并进行三维重构，最终得到大视野三维超分辨(分辨率约～100nm)样品图像。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像方法，其特征在于，所述夹心光片在最外一层是损耗光，中间一层是激发光；在照射样品时，损耗光束与激发光束重叠部分照射的荧光被损耗，不产生荧光；仅有中间激发光束照明部分的荧光分子被激发而发出荧光；激发光束有效激发厚度变薄，从而提升了系统的轴向的分辨率；两束夹心光片由于干涉使得在xy平面上呈条纹分布，损耗光由于与激发光波长不同，形成结构条纹分布可能会有微小偏移，无法完全重合的现象，可以通过空间光调制器矫正位移偏差使之一一对应。
3.根据权利要求1所述的一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像方法，其特征在于，通过载物台控制照明样品相对条纹的相位以及方向变化，从而实现各个方向的频谱平移拓展，从而在xy平面上实现横向超分辨成像。
4.根据权利要求1所述的一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像方法，其特征在于，用荧光探针标记生物样品，其中荧光探针包括近红外激发的上转换荧光探针、有机染料、量子点中的任意一种。
5.实现如权利要求1所述的一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像的装置，其特征在于，所述装置包括光束调制模块、光路模块与成像模块，其中光束调制模块由第一激光器、第二激光器、望远镜系统，螺旋相位板、空间光调制器，反射镜组成。第一激光器是一台低功率的连续光或脉冲光激光器用于产生近红外激发光，第二激光器是一台低功率连续光或脉冲光激光器用于产生近红外损耗光；望远镜系统分别置于所述第一激光器、所述第二激光器之后；空间光调制器分别部署在望远镜系统之后，用于激发光与损耗光的整形以及产生实验所需的特殊光束；
光路模块由二向色镜、半反半透镜、反射镜组、柱面透镜、照明物镜组成；由光束调制模块产生调制好的近红外激发光和近红外涡旋空心损耗光通过二向色镜共轴耦合，半反半透镜将复合光束分成两路，分别经过反射镜组将两路光调整至同一光轴上反向传输；之后各自通过相同的柱面透镜以及照明物镜，形成两个反向传输的光片干涉以生成结构化照明图案，并激发样品内的荧光分子发出荧光；
成像模块由载物台、检测物镜、滤色片、镜筒透镜、成像相机和计算机组成；由载物台上的样品发出的荧光，经过检测物镜收集，检测物镜位于光片的垂直方向上；收集的荧光通过滤色片滤除信号光外的其它杂散光，有利于提高信噪比。过滤后的荧光经过镜筒透镜成像于成像相机的感光面，成像相机将拍摄的图像导入计算机；计算机将收集的图像进行频谱的分离重构，最终获得横向超分辨的图像。
6.根据权利要求5所述的一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像装置，其特征在于，载物台由三维电动平台和样品室组成；三维电动平台可以沿着x，y，z三个方向根据计算机的控制移动并可以沿着支撑轴转动，以实现样本各个位置、各个方向的均匀照明。
7.根据权利要求5所述的一种基于荧光损耗超分辨法的近红外结构光照明光片成像装置，其特征在于，所述望远镜系统由两块透镜组成，用于激光束的扩束与准直。
8.根据权利要求5所述的基于受激辐射损耗和结构光照明的三维超分辨光片显微成像装置，其特征在于，在光束调制模块中，螺旋相位板位于空间光调制器之后，用于将产生的特殊光束再次整形，形成近红外涡旋空心光束，经过反射镜进入光路模块。
9.根据权利要求5所述的基于受激辐射损耗和结构光照明的三维超分辨光片显微成像装置，其特征在于，所述照明物镜相对于检测物镜光轴镜像分布且共轴用以实现夹心光片干涉以产生结构化照明图案。
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CN117030674A (zh) * 2023-10-09 2023-11-10 中国科学院生物物理研究所 结构光照明三维超分辨率成像系统和方法
CN117110267A (zh) * 2023-08-28 2023-11-24 深圳市凯佳光学科技有限公司 可见光至近红外二区的光片显微成像系统及成像方法
CN117368173A (zh) * 2023-12-07 2024-01-09 深圳赛陆医疗科技有限公司 成像系统及成像方法

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