CN104266956A - 高内涵图像流式生物显微分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高内涵图像流式生物显微分析方法，包括步骤：搭建并利用高内涵图像流式生物显微分析系统对细胞进行检测；高内涵图像流式生物显微分析系统中，液流系统使细胞的聚焦在液流的中心，逐个流过流动室的检测窗口；光学系统包括光源、光路系统、滤光片堆栈；光源包括卤素灯、激光器；通过光路系统和由多个二向色镜构成的滤光片堆栈，所述光学系统产生一个明场细胞图像，一个六通道荧光细胞图像及六个不同波段的PMT光强信号。本发明将流式细胞术与荧光显微成像结合于一身，它具有多个检测通道，能够对通过流动室的细胞逐个采集的细胞图像，并利用分析软件对每个细胞图像进行量化分析，从而提供细胞群的统计数据以及细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的信息。

Description

高内涵图像流式生物显微分析方法

技术领域

本发明涉及流式细胞术，具体地，涉及高内涵图像流式生物显微分析方法。

背景技术

流式细胞术是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球、细菌、小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术。使用传统的流式细胞检测技术，研究人员可以分析成千上万个细胞，获得每个细胞的散射光信号和荧光信号的数值，从而得到细胞群体的各种统计数据，并可以找到稀有的细胞亚群。

但是传统流式细胞检测技术仍然存在局限，那就是获得的细胞信息很有限。细胞对研究人员来说，只是散点图上的一个点，而不是真实的细胞图像，缺乏细胞形态学、细胞结构及亚细胞水平信号分布的相关信息。要想获得细胞图像，研究人员就必须使用显微镜进行观察，但显微镜能够观察的细胞数量是非常有限的，很难提供细胞群体的量化与统计数据。因此，使用传统的细胞分析技术，我们就只能面对这样的两难选择，没有一种技术可以既提供细胞群体的统计数据，又获得细胞图像。

发明内容

针对目前现有技术中单个流式细胞仪存在的缺陷，本发明的目的是设计一个合理的光学成像系统，其中，能高速采集经过鞘液室的单个细胞明场和荧光图像是设计的重点，这样既可以利用明场图像来观察细胞的形态特征，又可以利用荧光来测定细胞中的关键成分，实现流式细胞术和显微成像的有机结合。

根据本发明提供的一种高内涵图像流式生物显微分析方法，包括如下步骤：

步骤1：搭建高内涵图像流式生物显微分析系统；

步骤2：利用所述高内涵图像流式生物显微分析系统对细胞进行检测；

所述高内涵图像流式生物显微分析系统包括：液流系统、光学系统；

液流系统包括流动室，流动室用于接收注入的样本细胞悬液和系统鞘液中，并使样本细胞悬液中的细胞在系统鞘液流的约束下聚焦在液流的中心，逐个流过流动室的检测窗口；

光学系统包括光源、光路系统、滤光片堆栈；

所述光源，用于照射通过检测窗口的细胞，从而产生光信号；光源包括用于产生明场细胞图像的卤素灯、用于产生荧光细胞图像的激光器；

光源照射细胞产生的光信号被物镜收集，通过两组楔形光栅分别收集前向光信号、侧向光信号到两个TDI相机中，然后通过光路系统传递到主要由多个二向色镜构成的滤光片堆栈，光信号在滤光片堆栈处被分成不同波段投射到一个六通道PMT阵列上；进而所述光学系统产生一个明场细胞图像，一个六通道荧光细胞图像及六个不同波段的PMT光强信号。

优选地，所述高内涵图像流式生物显微分析系统还包括激光补光装置，其中，所述激光补光装置用于通过在细胞侧向补光来调整光强度，降低TDI相机延迟积分的时间，减少细胞的高速流动带来的积分时间过短造成光强偏弱的缺陷。

优选地，所述高内涵图像流式生物显微分析系统还包括自动对焦装置，其中，所述自动对焦装置用于利用激光光点法，通过测量弥散斑的边缘和尺寸来计算细胞的聚焦位置。

优选地，所述高内涵图像流式生物显微分析系统还包括速度测量装置，其中，所述速度测量装置用于利用激光测距来测定限定时间内细胞的运动距离，折算出细胞的运动速率。所述TDI相机根据细胞的运动速率捕获在流动室内的单细胞的图像。

优选地，所述高内涵图像流式生物显微分析系统还包括分析系统，其中，所述分析系统采用荧光和明场的图像配准方式，校正荧光和明场的成像偏差，使得光斑中心重合，并且通过多光谱PMT光信号和多光谱的荧光图像来校正图像的荧光强度，使得输出的荧光强度与PMT保持一致。

优选地，所述分析系统通过PMT光信号来调节荧光图像的分割阈值，并且通过图像微观结构的分析来确定大量细胞中的异常细胞。

优选地，所述物镜的孔径数值NA大于0.75。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而提供细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的信息。

2、本发明将流式细胞术与荧光显微成像结合于一身，它具有多个检测通道，能够对通过流动室的细胞逐个采集的细胞图像，并利用分析软件对每个细胞图像进行量化分析，从而提供细胞群的统计数据以及细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的信息。

3、本发明可以用于细胞信号转导/通路分析、细胞间相互作用、分子共定位与胞内分子转运、细胞形态学、荧光原位杂交、基因表达分析、细胞凋亡、细胞周期分析、白细胞亚群分析。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的光路设计原理示意图；

图2为本发明的液流系统结构示意图。

图中：

1为多通道激光束；

2为细胞对焦器；

3为聚光镜；

4为分光镜；

5为滤光片；

6为PMT；

7为楔形光栅；

8为TDI相机；

9为分光盘；

10为二色反光镜。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

根据本发明提供的所述高内涵图像流式生物显微分析系统，主要由液流系统、光学系统、电子系统、流动室等几大部分组成。

液流系统包括流动室，液流系统将样本细胞悬液和系统鞘液注入流动室中，流动室用于使细胞在鞘液流的约束下聚焦在液流的中心，逐个流过流动室的检测窗口。流动室具有分选功能，当实验设计中设定了被分选细胞的特性参数时，此类细胞在形成液滴时会被充电，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场，依所带电荷是正或是负而发生向右或向左道偏转，落入指定的收集器中，完成细胞分选的目的。

光学系统包括光源、光路系统、滤光片堆栈。

光源照射通过检测窗口的细胞，从而产生光信号；光源分为两种，一种是用于产生明场细胞图像的卤素灯，另一种是用于产生荧光细胞图像的激光器。

光源照射细胞产生的光信号被具有很大数值孔径(NA：0.75)的物镜收集，通过两组楔形光栅收集前向光信号和侧向光信号到两个TDI相机中，然后通过光路系统传递到主要由二向色镜构成的滤光片堆栈，光信号在这里被分成不同波段投射到一个六通道PMT阵列上，整个成像系统产生一个明场细胞图像，一个六通道荧光细胞图像及六个不同波段的PMT光强信号。该光路系统能够自动调整焦距，并实时测定细胞运动速度，而冷CCD采用时间延迟积分方式进行信号采集，这些手段保证了系统采集到的细胞图像的质量。

进一步地，高内涵图像流式生物显微分析方法的创新点在于光路设计，结合了流式细胞仪和显微成像的优点，充分融合了两者的优势。系统中，设置了分光镜，把前向散射光和侧向散射光一分为二，一路通过光电倍增管(PMT)采集信号，另一路通过楔形光栅分解，利用延时积分CCD(TDI)采集图像信号。实现了宏观和微观的有机结合。

该系统创新性的设计了激光补光装置、自动对焦装置和速度测量装置。

激光补光装置是为了解决激发荧光太弱导致成像不清晰，通过在细胞侧向补光来调整光强度，降低延迟积分的时间，减少细胞的高速流动带来的积分时间过短造成光强偏弱的缺陷。整个补光系统在初次使用时，需要做系统的整体校正，在限定时间内，使得选择的不同波段的光源强度一致。

自动对焦装置解决的是在细胞的高速流动中，选择最佳的对准位置触发拍照，此处用的是激光光点法，通过测量弥散斑的边缘和尺寸来计算最佳的聚焦位置。

速度测量装置利用的激光测距来测定限定时间内细胞的运动距离，折算出细胞的运动速率。配合TDI延迟积分相机，可以准确的捕获在流动室内的单细胞的图像。

进一步地，高内涵图像流式生物显微分析方法设计了一套强大的分析软件，该分析软件采用荧光和明场的图像配准技术，校正荧光和明场的成像偏差，使得光斑中心重合，另外通过多光谱PMT光信号和多光谱的荧光图像来校正图像的荧光强度，使得输出的荧光强度与PMT保持一致。该软件采用荧光图像和PMT光信号融合分析法，通过PMT光信号来调节荧光图像的分割阈值，使得荧光图像的生成结果与流式细胞仪的结果保持一致性，并且可以通过图像微观结构的分析来确定大量细胞中的异常细胞。该软件可以对每个细胞分析超过500种量化参数。这些参数不仅包括细胞整体的散射光和荧光信号强度，还包括对细胞形态，细胞结构及亚细胞信号分布的分析。通过在细胞群体中对这些参数进行统计，分析软件可以生成细胞群体的散点图和柱状图，而这些统计数据与细胞图像是完全整合的，比如点击散点图上的点，就可以直观的看到这个点代表的细胞的图像。另外，使用者还能够根据自身研究的特殊需要，进行自定义参数的设定，进行更深入的分析。系统可以生成多通道荧光的混合图像，也可以生成单通道荧光的独立图像，并且可以通过软件选择所需的荧光通道。

整个系统可以用于细胞信号转导/通路分析、细胞间相互作用、分子共定位与胞内分子转运、细胞形态学、荧光原位杂交、基因表达分析、细胞凋亡、细胞周期分析、白细胞亚群分析。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种高内涵图像流式生物显微分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：搭建高内涵图像流式生物显微分析系统；

步骤2：利用所述高内涵图像流式生物显微分析系统对细胞进行检测；

其中，所述高内涵图像流式生物显微分析系统包括液流系统、光学系统；

液流系统包括流动室，流动室用于接收注入的样本细胞悬液和系统鞘液中，并使样本细胞悬液中的细胞在系统鞘液流的约束下聚焦在液流的中心，逐个流过流动室的检测窗口；

光学系统包括光源、光路系统、滤光片堆栈；

所述光源，用于照射通过检测窗口的细胞，从而产生光信号；光源包括用于产生明场细胞图像的卤素灯、用于产生荧光细胞图像的激光器；

光源照射细胞产生的光信号被物镜收集，通过两组楔形光栅分别收集前向光信号、侧向光信号到两个TDI相机中，然后通过光路系统传递到主要由多个二向色镜构成的滤光片堆栈，光信号在滤光片堆栈处被分成不同波段投射到一个六通道PMT阵列上；进而所述光学系统产生一个明场细胞图像，一个六通道荧光细胞图像及六个不同波段的PMT光强信号。

2.根据权利要求1所述的高内涵图像流式生物显微分析方法，其特征在于，所述高内涵图像流式生物显微分析系统还包括激光补光装置，其中，所述激光补光装置用于通过在细胞侧向补光来调整光强度，降低TDI相机延迟积分的时间，减少细胞的高速流动带来的积分时间过短造成光强偏弱的缺陷。

3.根据权利要求1所述的高内涵图像流式生物显微分析方法，其特征在于，所述高内涵图像流式生物显微分析系统还包括自动对焦装置，其中，所述自动对焦装置用于利用激光光点法，通过测量弥散斑的边缘和尺寸来计算细胞的聚焦位置。

4.根据权利要求1所述的高内涵图像流式生物显微分析方法，其特征在于，所述高内涵图像流式生物显微分析系统还包括速度测量装置，其中，所述速度测量装置用于利用激光测距来测定限定时间内细胞的运动距离，折算出细胞的运动速率，所述TDI相机根据细胞的运动速率捕获在流动室内的单细胞的图像。

5.根据权利要求1所述的高内涵图像流式生物显微分析方法，其特征在于，所述高内涵图像流式生物显微分析系统还包括分析系统，其中，所述分析系统采用荧光和明场的图像配准方式，校正荧光和明场的成像偏差，使得光斑中心重合，并且通过多光谱PMT光信号和多光谱的荧光图像来校正图像的荧光强度，使得输出的荧光强度与PMT保持一致。

6.根据权利要求5所述的高内涵图像流式生物显微分析方法，其特征在于，所述分析系统通过PMT光信号来调节荧光图像的分割阈值，并且通过图像微观结构的分析来确定大量细胞中的异常细胞。

7.根据权利要求1所述的高内涵图像流式生物显微分析方法，其特征在于，所述物镜的孔径数值NA大于0.75。