JP5002604B2 - 偏光位相顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、標本を精密に観察するための偏光位相顕微鏡に関し、より詳くは、生体細胞の構成要素を通過する光の位相差を用いて生体細胞の構造および変化を観察することが可能な偏光位相顕微鏡に関する。

光学顕微鏡は、医学および生物学分野における研究を目的として主に用いられてきた。一般的な光学顕微鏡は、標本に光をあてて前記標本を通過した光が対物レンズによって拡大された実像を結び、前記実像を接眼レンズを介して再拡大し、前記再拡大された実像を観察する方式で構成されている。しかしながら、一般的な光学顕微鏡で生体細胞のような生物学的標本を観察しようとする場合には、可視光線領域に対して、透明して周辺部を除けば、どのような光の吸収も起こらないという生体細胞の特性上、観察が適切になされないという問題点があった。したがって、生物学的標本を可視化して観察するための顕微鏡が開発された。

このような顕微鏡の例としては、位相差顕微鏡（Ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）と干渉顕微鏡（ＤＩＣ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）とがある。まず、位相差顕微鏡は、一般的な光学顕微鏡とは異なり、屈折率の差を用いて生物学的標本を観察することが可能なように考案された顕微鏡であり、回折した光線と回折していない光線との間に干渉現象を起こし、発生する位相差をコントラストの差で表現する方式で生物学的標本を観察する。

一方、干渉顕微鏡は、光が物体を通過するとき、前記物体が光の通過速度を遅延させるという特徴を用いて標本を透過した物体光と光源から分離させた干渉光とを重ねるようにする方式であり、光波長に対する干渉現象を用いるため、生物学的標本を観察することが可能な顕微鏡である。

このように、位相差を用いて標本を観察する方法は、薄い無色の標本に理想的な方法である。例えば、試験管の培養細胞は、可視光線領域で殆どいずれの光の吸収が発生しないため、肉眼では観察することが困難である。しかしながら、細胞とその周辺の水性溶液との間の屈折率には極めて微細な差が存在し、細胞質と細胞核との間にも極めて微細な差がある。位相差を用いた方法は、光学装置を用いて上記したような微細な差を観察できるようにするが、その方法は屈折率の差を光の強度の差に変換させるものである。光は、細胞核、細胞質、および水を通過する過程において、屈折率の差による経路の変化が発生する。

このとき、ある物質における屈折率が高くなれば、光の速度は遅くなり、細胞核を通過する光波が前記水を通過する光波よりも遅滞し、後続する現象が発生する。このような現象を位相変化と言い、光が完全に標本内部に進入する前には前記光波が以前として同位相にあるが、標本を通過した後には変化するようになる。したがって、位相変化は、光が経路で通過する物質の種類と透過時に発生する経路の差によって左右される。

位相差顕微鏡と干渉顕微鏡は、従来の光学顕微鏡では観察することができなかった生体細胞のような生物学的標本を、屈折率の差によって変化した位相情報を光の強度分布に変換して観察することが可能であるが、定性的な（ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ）位相情報を提供する段階に留まるため、前記生物学的標本に対する正確な分析を行うのに限界があるという問題点がある。したがって、前記生物学的標本に対する定量的な（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）位相情報を提供することができる装置が開発された。

これのために、生物標本に対する定量的な位相情報をイメージ化することができる方法が研究された。まず、ＯＣＴ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）を用いて生体細胞の位相、位相分散、および複屈折（ｂｉｒｅｆｒｉｎｇｅｎｃｅ）を測定して前記生体細胞に対する定量的な（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）位相情報を抽出して前記生体細胞の内部をイメージ化する装置と、位相敏感（ｐｈａｓｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）ＯＣＴを用いて停止した生体細胞と生体細胞内部の電気的特性を研究する装置などが開発されたが、前記装置は単一地点位相測定方式によって測定速度に限界があり、完成したイメージを実現するためには高速のスキャン装置が求められ、機械的な雑音が発生するという問題点がある。

本発明は、上記のような問題点を解決するために案出されたものであって、生体細胞の構造および変化に対する高分解能（ｈｉｇｈｔ ｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）と低雑音比（ｌｏｗ ｎｏｉｓｅ）を有する定量的な位相情報を取得することが可能な偏光位相顕微鏡を提供することをその目的とする。

上述した目的を達成するための本発明に係る偏光位相顕微鏡は、観察しようとする標本に対する像を取得する光学イメージ発生部と；前記光学イメージ発生部で取得した像の光線が流入する物体平面、前記物体平面を通過した光線に対する１次フーリエ変換が発生する第１変換レンズ、前記第１変換レンズから前記第１変換レンズの焦点距離だけ離隔して位置したλ／４波長板、前記λ／４波長板を通過した光線に対する２次フーリエ変換が発生する第２変換レンズ、および前記２次フーリエ変換がなされた光線の像が結ばれる光検出器を含む位相イメージ発生部と；を備えることを特徴とする。

また、前記λ／４波長板は、中央部にホールが形成されることができる。
また、前記光学イメージ発生部は、一定の強度の光を照射する光源、標本を載せる載物台、前記載物台を通過した光線を集光させる対物レンズ、前記対物レンズを通過した光線の経路を変換させる反射鏡、および前記反射鏡で反射した光線を集めて中間像を形成するチューブレンズを含むことができる。

また、前記位相イメージ発生部は、前記物体平面を通過した光線を選択的に通過させるために前記第１変換レンズの前端に備えられる偏光子をさらに含むことができる。

また、前記偏光子は、前記偏光子を回転させるための回転部材を結合することができる。
また、前記偏光子は、１回あたりπ／４ずつ回転することができる。

また、前記光検出器は、電荷結合素子（Ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）またはＣＭＯＳであり得る。

本発明によれば、一般的な光学顕微鏡で観察し難い生体細胞のような生物標本に対する高分解能と低雑音比を有する定量的な位相情報を取得し、細胞単位で起こる極微細変化の追跡が可能な効果を有する。

本発明の好ましい実施形態に係る偏光位相顕微鏡の位相イメージ発生部に対する概念図である。 本発明の好ましい実施形態に係る偏光位相顕微鏡の概念図である。 本発明の好ましい実施形態に係る波長板の平面図である。

以下、本発明の好ましい実施形態について、添付の図面を参照しながら詳細に説明する。まず、各図面の構成要素に参照符号を付加することにおいて、同じ構成要素に対しては、たとえ他の図面上に表示されていたとしても、可能な限り同じ符号を有するようにしていることに留意しなければならない。また、本発明の説明において、関連する公知構成または機能に対する具体的な説明が本発明の要旨を不明瞭にし得ると判断される場合には、その詳細な説明は省略する。また、以下で本発明の好ましい実施形態について説明するが、本発明の技術的思想がこれに限定されたり制限されるものではなく、当業者によって多様に実施され得ることは勿論である。

図１は、本発明の好ましい実施形態に係る位相イメージ発生部の概念図である。図１に示すように、位相イメージ発生部１００は、物体平面１１０、第１変換レンズ１２０、変換平面１３０、第２変換レンズ１４０、イメージ平面１５０を含み、ｆ１は第１変換レンズ１２０の焦点距離、ｆ２は第２変換レンズ１４０の焦点距離を意味する。

物体平面１１０は、第１変換レンズ１２０の前焦点距離だけ離隔して位置しており、像が結ばれている平面である。

第１変換レンズ１２０は、物体平面１１０を通過して進行する光線に対する１次フーリエ変換がなされる部分である。

第１変換レンズ１２０の後焦点距離だけ離隔して位置した変換平面１３０は、第１変換レンズ１２０を通過して前記第１次フーリエ変換がなされた光線の像が結ばれる部分である。

第２変換レンズ１４０は、変換平面１３０から第２変換レンズ１２０の前焦点距離だけ離隔して位置し、変換平面１３０を通過して進行する光線に対する２次フーリエ変換がなされる部分である。

第２変換レンズ１４０の後焦点距離だけ離隔して位置したイメージ平面１５０は、前記２次フーリエ変換がなされた光線の像が結ばれる部分である。

光線が位相イメージ発生部１００を通過する過程は次のとおりである。まず、物体平面１１０に位置した像に光源から光線が照射される。物体平面１１０から出発した光線は第１変換レンズ１２０を通過して前記光線に対する１次フーリエ変換がなされる。第１変換レンズ１２０で前記光線に対する１次フーリエ変換がなされれば、第１変換レンズ１２０の後焦点距離に位置した変換平面１３０には、前記光線に対する空間周波数分布形態の像が結ばれるようになる。次に、変換平面１３０を通過した光線は、第２変換レンズ１４０を通過して前記光線に対する２次フーリエ変換が発生するようになる。第２変換レンズ１４０で前記光線に対する２次フーリエ変換がなされれば、第２変換レンズ１４０の後焦点距離に位置したイメージ平面１５０に前記２次フーリエ変換がなされた像が結ばれるようになる。

前記過程は、下記数式１によってなされる。

ここで、ｇ（ｘ，ｙ）は、物体平面１１０に位置した像の一地点の座標を意味し、前記数式１は、イメージ平面１５０に結ばれる像が物体平面１１０に位置した像に対して回転対称した状態で実現されることを示す。

このように、位相イメージ発生部１００の第１変換レンズ１２０と第２変換レンズ１４０とを備える４Ｆシステムは、フーリエ変換を応用して第１変換レンズ１２０の前焦点距離に物体が位置して後焦点距離に像が位置するとき、前記物体と像は空間的にフーリエ変換関係に置かれるようになり、同じ原理によって第２変換レンズ１４０の前焦点距離に位置した前記像は、第２変換レンズ１４０を経て第２変換レンズ１４０の後焦点距離に位置したイメージ平面１５０には同じ空間の像が結ばれるという原理を用いることで、前記４Ｆシステムを用いて拡大した低雑音比を有する像を取得することが可能となる。

図２は、本発明の好ましい実施形態に係る偏光位相顕微鏡の概念図である。図２に示すように、偏光位相顕微鏡１は、光学イメージ発生部１０と位相イメージ発生部１００とを備える。光学イメージ発生部１０は、観察しようとする標本に対する像を取得し、光源２０、載物台３０、対物レンズ４０、反射鏡５０、チューブレンズ６０、および投影レンズ７０を含む。

光源２０は、観察しようとする標本に照射される光線が発生し、前記標本を観察するための光源としては、空間上で高い可干渉性（ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）と十分な照度を確保するために、単一モード光ファイバがカップルリングされている連続波レーザを用いることが好ましい。光源２０の下部に位置した載物台３０は、観察のための標本が置かれる場所であり、載物台３０の下部に位置した対物レンズ４０は、光源２０から照射されて載物台３０を通過した光線を集光させる。反射鏡５０は、対物レンズ４０の下部に位置し、対物レンズ４０で集光された光線を反射して経路を変換させる役割を行い、チューブレンズ６０は、反射鏡で反射した光線を集めて中間像を形成する。最後に、チューブレンズ６０の後側に位置した投影レンズ７０は、チューブレンズ６０を通過して前記中間像を形成した光線を集めて位相イメージ発生部１００側に進むようにする。

位相イメージ発生部１００は、光学イメージ発生部１０を通過した光線から前記標本に対する定量的な位相情報を取得する役割を行い、物体平面１１０、偏光子１１５、回転部材１１８、第１変換レンズ１２０、波長板１３５、第２変換レンズ１４０、光検出器１５５を含み、ｆ１は第１変換レンズ１２０の焦点距離を、ｆ２は第２変換レンズ１４０の焦点距離を意味する。

物体平面１１０は、第１変換レンズ１２０の前焦点距離だけ離隔して位置し、光学イメージ発生部１０で処理された光線の像が結ばれる部分である。偏光子１１５は、物体平面１１０と第１変換レンズ１２０との間に位置し、物体平面１１０を通過した光線を選択的に通過させる役割を行う。回転部材１１８は、偏光子１１５と結合して偏光子１１５を回転させる役割を行うが、回転部材１１８はモータであることが好ましい。第１変換レンズ１２０は、偏光子１１５を通過した光線が通過して１次フーリエ変換がなされる部分である。第１変換レンズ１２０の後焦点距離だけ離隔して位置する波長板１３５は、中央部に微細ホールが形成されており、λ／４波長板を用いることが好ましい。第２変換レンズ１４０は、波長板１３５を通過した光線が通過して２次フーリエ変換がなされる部分である。第２変換レンズ１４０の後焦点距離だけ離隔して位置する光検出器１５５は、前記２次フーリエ変換がなされた光線の像が結ばれる部分であり、前記像を用いて前記標本に対する定量的な位相情報を取得するようになるが、光検出器１５５は、電荷結合素子（Ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ：ＣＣＤ）またはＣＭＯＳであることが好ましい。

偏光位相顕微鏡１の動作原理は次のとおりである。光学イメージ発生部１０の光源２０から平行な光線が載物台３０に結合している標本に垂直に入射するようになれば、前記入射した光線は、前記標本の断面形状に沿って前記入射した光線と同じ方向に進む第１光線と、入射方向に対して微細に逸脱しながら進行する第２光線とに分けられる。

前記第１光線と第２光線は対物レンズ４０によって集光され、反射鏡５０を介して位相イメージ発生部１００側に経路が変更された後、チューブレンズ６０と投影レンズ７０とを経て位相イメージ発生部１００の物体平面１１０を通過するようになる。物体平面１１０を通過した前記第１光線と前記第２光線は、偏光子１１５を介して必要な成分だけ選択的に透過され、偏光子１１５を通過した前記第１光線と第２光線は、第１変換レンズ１２０の後焦点距離だけ離隔して位置する波長板１３５の互いに異なる位置に像が結ばれるようになる。

波長板１３５の中心部に像が結ばれる前記第１光線は、波長板１３５の前記中心部に形成された微細ホール１３８をそのまま通過し、空間周波数成分を有する前記第２光線は、波長板１３５を通過するようになるため、前記第１光線は位相の変化が発生せず、前記第２光線は偏光子１１５がπ／４の定数倍で回転するたびにπ／２の定数倍で位相が印加される。

このように、偏光子１１５の入射面軸と波長板１３５のｘ軸またはｙ軸を一致させた後に偏光子１１５を回転させれば、変化した位相に対する複数の像を光検出器１５５で得ることが可能となるため、下記の数式２を用いて位相がπ／２ずつ増加した４枚の像で位相値を計算する。

ここで、Φ（ｘ，ｙ）は２次元座標ｘ，ｙの位相値であり、Ｉ_１（ｘ，ｙ）は偏光子が回転しなかったときの像の２次元座標ｘ，ｙに対する像であり、Ｉ_２（ｘ，ｙ）は偏光子がπ／２だけ回転したときの像の２次元座標ｘ，ｙに対する像であり、Ｉ_３（ｘ，ｙ）は偏光子がπだけ回転したときの像の２次元座標ｘ，ｙに対する像であり、Ｉ_４（ｘ，ｙ）は偏光子が３π／２だけ回転したときの像の２次元座標ｘ，ｙに対する像である。

このように、位相イメージ発生部１００に進んだ光線は、偏光子１１５と波長板１３５とを備えた４Ｆシステムによって前記光線の不必要な成分が除去され、空間周波数成分を有する前記光線に対する位相値を取得することが可能となるため、前記位相値を用いて観察しようとする標本に対する高分解能と低雑音比の定量的な位相情報を得ることが可能となる。

図３は、本発明の好ましい実施形態に係る波長板の平面図である。図３に示すように、波長板１３５は、中央部に微細ホール１３８が形成され、前記中心部に像が結ばれる光線のＤＣ成分領域は、前記微細ホール１３８を介してそのまま通過され、空間周波数成分を有する光線の領域は波長板１３５を通過するため、偏光子１１５を回転させて得られる回転した角度に対する変化した位相を用いて光検出器１５５で定量的な位相イメージを取得することが可能となる。

以上の説明は、本発明の技術思想を例示的に説明したものに過ぎず、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者であれば、本発明の本質的な特性から逸脱しない範囲内で多様な、修正、変更、および置換が可能であろう。したがって、本発明に開示された実施形態および添付の図面は、本発明の技術思想を限定するためものではなく説明するためのものであるため、このような実施形態および添付の図面によって本発明の技術思想の範囲が限定されることはない。本発明の保護範囲は添付の請求範囲によって解釈されなければならず、これと同等な範囲内にあるすべての技術思想は、本発明の権利範囲に含まれるものとして解釈されるべきである。

本発明によれば、観察しようとする標本に対する定量的な位相情報を取得することが可能であるため、一般的な光学顕微鏡では観察し難い細胞単位の極微細変化の追跡が可能であることから、生物学研究分野で用いることができる。

１：偏光位相顕微鏡
１０：光学イメージ発生部
２０：光源
３０：載物台
４０：対物レンズ
５０：反射鏡
６０：チューブレンズ
７０：投影レンズ
１００：位相イメージ発生部
１１０：物体平面
１１５：偏光子
１１８：回転部材
１２０：第１変換レンズ
１３０：変換平面
１３５：波長板
１３８：微細ホール
１４０：第２変換レンズ
１５０：イメージ平面
１５５：光検出器

Claims (6)

1. 偏光位相顕微鏡であって、
   観察対象の標本の像を取得する光学イメージ発生部であり、標本上に入射した光線を光学イメージ発生部内で第１の光線と第２の光線とに分割する光学イメージ発生部と、
   位相イメージ発生部とを備え、その位相イメージ発生部は、
   前記光学イメージ発生部で取得した像の第１及び第２の光線が流入する物体平面と、
   前記物体平面を通過した第１及び第２の光線を選択的に通過させる偏光子と、
   この偏光子を通過した第１及び第２の光線に対する１次フーリエ変換が発生する第１変換レンズと、
   第１変換レンズから第１変換レンズの焦点距離だけ離隔して位置したλ／４波長板であり、このλ／４波長板の中央部に一つのホールを有するλ／４波長板と、
   このλ／４波長板を通過した第１及び第２の光線に対する２次フーリエ変換が発生する第２変換レンズと、
   前記２次フーリエ変換がなされた第１及び第２の光線の像が結ばれ、前記像を通じて標本に関する定量的位相情報を取得する光検出器とを含み、
   λ／４波長板は、第１の光線は前記ホールを通過させ、空間周波数成分を有する第２の光線はλ／４波長板を通過させる偏光位相顕微鏡。
2. 第１の光線は変化しない位相を有し、第２の光線は、偏光子がπ／４の定数倍で回転するたびにπ／２の定数倍で位相が変化する請求項１の偏光位相顕微鏡。
3. 前記光学イメージ発生部は、
   一定の強度の光を照射する光源と、標本を載せる載物台と、この載物台を通過した光線を集光させる対物レンズと、この対物レンズを通過した光線の経路を変換させる反射鏡と、この反射鏡で反射した光線を集めて中間像を形成するチューブレンズとを含む請求項１の偏光位相顕微鏡。
4. 前記偏光子には、この偏光子を回転させるための回転部材が結合される請求項１の偏光位相顕微鏡。
5. 前記偏光子は、１回あたりπ／４ずつ回転する請求項１の偏光位相顕微鏡。
6. 前記光検出器は、電荷結合素子またはＣＭＯＳである請求項１の偏光位相顕微鏡。

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