CN111505817B - 基于偏振编码的相衬显微系统及其成像方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于偏振编码的相衬显微系统及其成像方法，该系统包括光源、载物台、物镜和CCD图像传感器；在所述光源与载物台之间依次设有第一透镜和第一偏振片，在所述物镜与CCD图像传感器之间依次设有第二偏振片、四分之一波片、第二透镜和第三偏振片；所述第二偏振片位于物镜和四分之一波片之间的傅里叶变换平面处，且其中心位置为竖直方向偏振，第二偏振片的外周位置为水平方向偏振。本发明通过调节入射光处的第一偏振片，可以灵活调控参考光和信号光的光强，从而获得最佳对比度的显微图像。还可通过改变入射光偏振，获得样品的暗场显微图像。

Description

基于偏振编码的相衬显微系统及其成像方法
技术领域
本发明涉及相衬显微技术领域，具体地说是涉及一种基于偏振编码的相衬显微系统及其成像方法。
背景技术
显微技术作为连接微观与宏观世界的桥梁，已经被广泛应用在医学、生物、化工等领域。根据实际需求的不同，各式各样的显微手段也已经被研发出来。其中，大多显微技术是对透过物体后的光强信息进行成像。但是，在实际应用中，有很多目标物体是无色透明的(例如大多数生物细胞)，这使得仅依靠强度信息的显微技术难以获得高对比度的图像。
荷兰科学家泽尼克巧妙地提出了相衬显微技术，并因此获得了1953年的诺贝尔物理学奖。相衬显微技术是一种基于光学干涉手段的显微成像技术，其主要的工作原理是：光线在穿过透明物体时，由于介质厚度、折射率的变化会导致光线相位的改变，相位的变化通常也会携带相当多的信息。然而，这个相位变化通过普通显微技术进行测量的时候这部分信息就全部丢弃了。相衬显微技术则可以将穿过物体的光线与参考光源相结合，利用干涉原理把产生的相位差转换为图像中的强度的变化，这样就可以利用光线通过物体的相位差来获得高对比度的图像。相衬显微技术观察物体时不需要进行染色，在观察细胞的时候也就不会对细胞标本产生伤害，进而保证了生物细胞的正常活动和生长，因此这种显微技术通常被用来研究细胞结构。
目前，现有的相衬显微技术存在以下不足：
1、相衬显微技术的参考光和信号光的光强无法做到灵活调控，导致观测图像无法保证是否达到最佳的对比度。
2、相衬显微技术是通过插入±π/2的相移元件来实现调控参考光相位，由于相移元件需要精确控制光的相位延迟量，因此加工复杂且昂贵。而且对于一个相移元件只能调控单一的相位延迟，无法实现灵活调控相位。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于偏振编码的相衬显微系统及其成像方法，以提供一种无需复杂的相移元件，仅通过调节偏振元件，实现灵活的参考光相位移动，并获得高对比度的相衬显微图像的方法。
本发明采用的技术方案是：一种基于偏振编码的相衬显微系统，包括光源、载物台、物镜和CCD图像传感器；在所述光源与载物台之间依次设有第一透镜和第一偏振片，在所述物镜与CCD图像传感器之间依次设有第二偏振片、四分之一波片、第二透镜和第三偏振片；
第一透镜用于将光源发射的入射光形成光强均匀分布的平行光束；所述第一偏振片和第三偏振片均为线偏振片，所述第二偏振片位于物镜和四分之一波片之间的傅里叶变换平面处，所述第二偏振片的中心位置为竖直方向偏振，第二偏振片的外周位置为水平方向偏振，所述第二偏振片用于将焦点处的低频信号和焦点外的高频信号进行偏振调控，使信号具有正交偏振，再利用四分之一波片实现将相位信息编码到偏振态，最后通过第二透镜和第三偏振片后用CCD图像传感器进行记录。
所述光源为单色LED灯光源或者将宽光谱光源利用滤光片得到的光谱宽度为50nm的光源。
一种基于偏振编码的相衬显微成像方法，包括以下步骤：
(a)设置上述的系统；
(b)光源发射的入射光经过第一透镜后形成光强均匀分布的平行光束，之后通过第一偏振片，设第一偏振片的偏转角为θ，角度为θ的线偏振光通过载物台上的样品后，忽略样品对偏振态的影响，可以表示为：
Figure BDA0002476431680000021
其中，Er(x,y)表示参考光，Eo(x,y)表示探测光；
(c)光线在经过物镜后的傅里叶变换平面时，由于放置了第二偏振片，使得焦点处和焦点外的偏振态相互垂直，因此可以得到：
Figure BDA0002476431680000022
其中，PSF(kx,ky)表示点扩散函数；
(d)利用快轴方向为45°角的四分之一波片，可将相位信息编码到偏振态，之后通过控制第三偏振片的旋转角度χ，可以得到光强：
Figure BDA0002476431680000023
其中，
Figure BDA0002476431680000024
由式(3)可以看出，通过改变第一偏振片的偏转角θ，选择合适的入射线偏振光的角度，可以在第二偏振片调整两正交偏振光强达到最佳干涉效果，当参考光与探测光的光强接近时，即|Er|sinθ≈|Eo(x,y)|cosθ时，可以获得最大的对比度。
当θ＝0时，由于第二偏振片的中心位置为竖直方向检偏，仅有携带有样品信息的高频光才可以通过，即
I(x,y,θ＝0)＝|Eo(x,y)|2 (4)，
此时，可以对样品进行暗场显微成像，获得样品的散射强度信息。
本发明由于采取以上技术方案，具有以下优点：
1、通过调节入射光处的第一偏振片，改变入射光偏振，可以灵活调控参考光和信号光的光强，从而获得最佳对比度的显微图像。
2、改变入射光偏振，将参考光强度全部滤除，仅剩信号光，则可以获得暗场显微图像，因此，该技术也可用作暗场显微镜。
3、通过调节目镜(相机)端的第三偏振片，可以实现灵活、准确地调控相位。
附图说明
图1为偏振相衬显微系统的示意图，图中，1、光源；2、第一透镜；3、第一偏振片；4、样品；5、物镜；6、第二偏振片；7、四分之一波片；8、第二透镜；9、第三偏振片；10、CCD图像传感器；θ表示第一偏振片的偏转角，χ表示第三偏振片的偏转角。
图2为第二偏振片的偏振分布图，由图可知，其中心位置为竖直方向偏振，外周位置为水平方向偏振。
图3为本发明相衬显微系统对细胞的成像图，其中，(a)(b)为改变第三偏振片的偏转角χ获得的不同相衬成像图，(c)为将第一偏振片的偏转角调至θ＝0时获得的暗场显微图。
具体实施方式
为了解决现有相衬显微技术的问题，本实施方式提供了一种基于偏振编码的相衬显微技术。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
偏振相衬显微系统示意图如图1所示，包括光源1、用于承载样品4的载物台、物镜5和CCD图像传感器10；在光源1与载物台之间依次设有第一透镜2和第一偏振片3，在物镜5与CCD图像传感器10之间依次设有第二偏振片6、四分之一波片7、第二透镜8和第三偏振片9。显微镜的光源1采用中心波长530nm，半高宽度35nm的绿光LED灯光源，第一透镜2和第二透镜8分别为焦距50mm和100mm的聚焦透镜，入射光经过第一透镜2后形成光强均匀分布的近似平行光束，在通过第一偏振片3后，对样品4进行照明。物镜5的放大倍率为20X，数值孔径NA为0.4，光束通过物镜5后，在其傅里叶变换平面，插入有第二偏振片6，其结构如图2所示，第二偏振片6的中心位置为竖直方向偏振，外部为水平方向偏振。该特殊偏振片制作方法：基于普通线偏振片，利用激光切割技术(或其他镜片切割技术)，对偏振片中心进行0.5mm的圆形切割，获得直径0.5mm的圆形偏振片及对应的环形偏振片，再将内外两部分进行精确的垂直偏振组合，并将其利用胶合方法固定。利用这种特殊的偏振片，可将焦点处的低频信号和焦点外的高频信号进行偏振调控，使其具有正交偏振，再利用四分之一波片就可以实现将相位信息到偏振态的编码。接着，通过第二透镜及第三偏振片检偏后，用CCD图像传感器进行记录。
本发明成像过程包括以下步骤：
(1)光源发射的入射光经过第一透镜后形成光强均匀分布的平行光束，之后通过第一偏振片，设第一偏振片的偏转角为θ，角度为θ的线偏振光通过载物台上的样品后，忽略样品对偏振态的影响，可以表示为：
Figure BDA0002476431680000041
(c)光线在经过物镜后的傅里叶变换平面时，由于放置了第二偏振片，使得焦点处和焦点外的偏振态相互垂直，因此可以得到：
Figure BDA0002476431680000042
其中，PSF(kx,ky)表示点扩散函数；
(d)利用快轴方向为45°角的四分之一波片，可将相位信息编码到偏振态，之后通过控制第三偏振片的旋转角度χ，可以得到光强：
Figure BDA0002476431680000043
其中，
Figure BDA0002476431680000044
由式(3)可以看出，通过改变第一偏振片的偏转角θ，选择合适的入射线偏振光的角度，可以在第二偏振片调整两正交偏振光强达到最佳干涉效果，当参考光与探测光的光强接近时，即|Er|sinθ≈|Eo(x,y)|cosθ时，可以获得最大的对比度。
此外，如果入射光选取水平线偏振方向，即当θ＝0时，由于第二偏振片的中心位置为竖直方向检偏，仅有携带有样品信息的高频光才可以通过，即
I(x,y,θ＝0)＝|Eo(x,y)|2 (4)，
此时，可以对样品进行暗场显微成像，获得样品的散射强度信息。
利用上述成像方法对细胞样品进行成像，结果如图3所示，其中，(a)(b)为改变第三偏振片的偏转角χ获得的不同相衬成像图，(c)为将第一偏振片的偏转角调至θ＝0时获得的暗场显微图。由图3可以看出，本发明的成像效果显著优于现有相衬显微装置。
应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种基于偏振编码的相衬显微成像方法，其特征是，包括以下步骤：
(a)设置基于偏振编码的相衬显微系统，所述系统包括光源、载物台、物镜和CCD图像传感器；在所述光源与载物台之间依次设有第一透镜和第一偏振片，在所述物镜与CCD图像传感器之间依次设有第二偏振片、四分之一波片、第二透镜和第三偏振片；
第一透镜用于将光源发射的入射光形成光强均匀分布的平行光束；所述第一偏振片和第三偏振片均为线偏振片，所述第二偏振片位于物镜和四分之一波片之间的傅里叶变换平面处，所述第二偏振片的中心位置为竖直方向偏振，第二偏振片的外周位置为水平方向偏振，所述第二偏振片用于将焦点处的低频信号和焦点外的高频信号进行偏振调控，使信号具有正交偏振，再利用四分之一波片实现将相位信息编码到偏振态，最后通过第二透镜和第三偏振片后用CCD图像传感器进行记录；
(b)光源发射的入射光经过第一透镜后形成光强均匀分布的平行光束，之后通过第一偏振片，设第一偏振片的偏转角为θ，角度为θ的线偏振光通过载物台上的样品后，忽略样品对偏振态的影响，表示为：
Figure FDA0003587110400000011
其中，Er(x,y)表示参考光，Eo(x,y)表示探测光；
(c)光线在经过物镜后的傅里叶变换平面时，由于放置了第二偏振片，使得焦点处和焦点外的偏振态相互垂直，因此得到：
Figure FDA0003587110400000012
其中，PSF(kx,ky)表示点扩散函数；
(d)利用快轴方向为45°角的四分之一波片，将相位信息编码到偏振态，之后通过控制第三偏振片的旋转角度χ，得到光强：
Figure FDA0003587110400000013
其中，
Figure FDA0003587110400000014
由式(3)看出，通过改变第一偏振片的偏转角θ，选择合适的入射线偏振光的角度，以在第二偏振片调整两正交偏振光强达到最佳干涉效果，当参考光与探测光的光强接近时，即|Er(x,y)|sinθ≈|Eo(x,y)|cosθ时，获得最大的对比度。
2.根据权利要求1所述的基于偏振编码的相衬显微成像方法，其特征是，所述光源为单色LED灯光源或者将宽光谱光源利用滤光片得到的光谱宽度为50nm的光源。
3.根据权利要求1所述的基于偏振编码的相衬显微成像方法，其特征是，当θ＝0时，由于第二偏振片的中心位置为竖直方向检偏，仅有携带有样品信息的高频光通过，即
I(x,y,θ＝0)＝|Eo(x,y)|2 (4)，
此时，对样品进行暗场显微成像，获得样品的散射强度信息。
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