CN103154708A - 利用单个发光粒子检测的粒子的扩散特性值的测量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使用利用共焦显微镜或多光子显微镜的光测量的扫描分子计数法来测量发光粒子的扩散特性值(例如扩散系数)的方法。本发明的测量发光粒子的扩散特性值的方法的特征在于通过变更显微镜的光学系统的光路来使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内沿着规定的路径周期性地移动的同时测量光的强度来生成光强度数据，根据在该光强度数据上的与同一发光粒子对应的多个信号的、产生时间的间隔中的与光检测区域的移动周期偏移的偏移时间来计算发光粒子的扩散特性值。

Description

利用单个发光粒子检测的粒子的扩散特性值的测量方法
技术领域
本发明涉及一种光分析方法，该光分析方法能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解于溶液中的原子、分子或者它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”。)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或者它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或者非生物学的粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统个别检测来自单个发光粒子的光并进行各种光分析的方法。此外，在本说明书中，发出光的粒子(以下称为“发光粒子”。)可以是其自身发出光的粒子以及附加有任意的发光标识或发光探针的粒子中的任一个，从发光粒子发出的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。
背景技术
由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(Photon counting)(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或萤光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的计量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在萤光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy：FCS。例如参照专利文献1-3、非专利文献1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚到的焦点区域-共焦区组织(confocal volume))内的荧光分子或被荧光标识的分子(荧光分子等)的萤光强度，基于根据测量得到的该萤光强度的自相关函数的值所决定的在微小区域内的萤光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留的分子的个数的平均值，获取萤光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在萤光强度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：FIDA。例如专利文献4、非专利文献4)、光子计数直方图(PhotonCounting Histogram：PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地计量出的出入共焦区组织内的萤光分子等的萤光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算萤光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统计量出的样本溶液的萤光信号的时间经过来检测萤光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术计量来自在流式细胞仪(flow cytometry)中流通的萤光微粒子或固定在基板上的萤光微粒子的微弱光，来检测流中或基板上的萤光微粒子的存在。
特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的萤光测量技术的方法，进行测量所需要的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量的(在一次测量中使用的量至多为几十μL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中多次反复进行秒级时间的计量)。因而，这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，期待成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力的工具。
专利文献1：日本特开2005-098876
专利文献2：日本特开2008-292371
专利文献3：日本特开2009-281831
专利文献4：专利第4023523号
专利文献5：国际公开2008-080417
专利文献6：日本特开2007-20565
专利文献7：日本特开2008-116440
专利文献8：日本特开平4-337446号公报
非专利文献1：金城政孝，蛋白质核酸酶Vol.44，No.9，1431-1438页 1999年
非专利文献2：F.J.Meyer-Alms，荧光相关谱(FluorescenceCorrelation Spectroscopy)，R.Rigler编，Springer，柏林，2000年，204-224页
非专利文献3：加藤则子及其他4名，遗传医学，Vol.6，No.2，271-277页
非专利文献4：卡斯柯(Kask)及其他3名，美国科学学院纪要，1999年，96卷，13756-13761页(P.Kask,K.Palo,D.Ullmann,K.Gall PNAS 96,13756-13761(1999))
非专利文献5：永井健治及其他1名，生物物理49(4)，181-186页，2009年
非专利文献6：金城政孝及其他1名，日本生物流变学(biorheology)学会杂志第9卷，第2号，1995年，17页
发明内容
发明要解决的问题
在上述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的光学分析技术中，所计量的光是从萤光单分子或多分子发出的光，但在该光的解析中，执行按时间序列测量出的萤光强度数据的自相关函数的运算或对直方图拟合之类的萤光强度的波动的计算等统计性的处理，并非个别地参照或分析来自各个萤光分子等的光的信号。即，在这些光分析技术中，对来自多个萤光分子等的光的信号统计性地进行处理，针对萤光分子等检测统计平均的特性。因而，为了在这些光分析技术中得到统计上有意义的结果，样本溶液中的作为观测对象的萤光分子等的浓度或数密度需要是在平衡状态下一次秒级长度的计量时间内能够进行统计性处理的个数的萤光分子等出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的萤光分子等的水平。实际上，共焦区组织的体积为1fL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液中的萤光分子等的浓度典型的是1nM左右或其以上，在大幅低于1nM时，产生在共焦区组织内不存在萤光分子等的时间而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6～8所记载的萤光分子等的检测方法中，不包括萤光强度的波动的统计性的运算处理，即使样本溶液中的萤光分子等小于1nM也能够检测萤光分子等，但无法达成定量地计算在溶液中随机运动的萤光分子等的浓度或数密度。
因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的光分析技术，能够定量地观测作为观测对象的发光粒子的浓度或数密度低于利用FCS、FIDA等包含统计性处理的光分析技术进行处理的水平的、样本溶液中的发光粒子的状态或特性。在所述新的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则与FCS、FIDA等同样地，在使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的情况下，一边使作为光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”)的位置在样本溶液中移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含有在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子时检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐个地进行个别检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需要的样本可以是微量的(例如几十μL左右)，另外，测量时间短，并且与FCS、FIDA等光分析技术的情况相比，能够检测更低的浓度或数密度的发光粒子的存在，并定量地检测其浓度、数密度或其它特性。
另外，在上述的扫描分子计数法中，在利用光检测区域对样本溶液内进行扫描时，使光检测区域典型地例如在圆形、椭圆形的规定的路径内循环移动。此时，在光检测区域的移动周期比较短时或在发光粒子的扩散平移运动的速度比较慢时，在光检测区域在规定的路径内移动一周的期间，规定的路径上的发光粒子几乎不移动，同一发光粒子被再次检测出。实际上，在利用扫描分子计数法对运动慢的分子进行测量时，观察到以与光检测区域的移动周期大致相等的时间间隔产生的、周期性的表示发光粒子的光的信号(参照图8的(A))。然而，详细地进行检查明确了以下内容：所述周期性的信号的间隔长度与光检测区域的移动周期不完全一致并且相互产生了少许偏差。所述周期性的信号的间隔长度的偏差被认为是发光粒子由于布朗运动而其位置移动所引起的。本发明的发明人发现通过解析所述周期性的信号的间隔长度中的“偏差”，能够对粒子因布朗运动而进行移动的容易度、或粒子的扩散系数进行估计。
因此，本发明的主要课题在于提供一种利用扫描分子计数法的发光粒子的检测方法来测量表示发光粒子因布朗运动而进行移动的容易度的指标值、典型地是发光粒子的扩散系数的新方法。
另外，本发明的另一个课题在于提供一种对表示浓度低于能够通过FCS等光分析技术以良好的精度计量的发光粒子浓度的样本溶液中的、发光粒子因布朗运动而进行移动的容易度的指标值或发光粒子的扩散系数进行测量的方法。
用于解决问题的方案
根据本发明，通过以下的方法来达成上述的课题，该方法使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来对在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的扩散特性值进行测量，该方法的特征在于，包括以下步骤：通过变更显微镜的光学系统的光路，使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内沿着规定的路径周期性地移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动，一边测量来自光检测区域的光的强度来生成光强度数据；在光强度数据上个别检测表示发光粒子的光的信号；抽出所检测出的表示发光粒子的光的信号中的与同一发光粒子对应的多个信号；以及根据所抽出的信号的产生时间的间隔中的与光检测区域的移动周期偏移的偏移时间，来计算与所抽出的信号对应的发光粒子的扩散特性值。在所述结构中，“在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子”是指分散或溶解于样本溶液中的原子、分子或者它们的聚合体等发出光的粒子，只要是不固定在基板等上而自由地在溶液中进行布朗运动的粒子，则可以是任意的粒子。所述发光粒子典型的是萤光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等来发出光的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指在这些显微镜下检测光的微小区域，在从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚到的区域(在共焦显微镜下，特别地根据物镜与针孔之间的位置关系来确定。在发光粒子没有照明光而发光的情况下、例如是通过化学发光或生物发光来发光的粒子的情况下，在显微镜中不需要照明光。)。并且，“扩散特性值”可以是表示粒子因布朗运动而进行移动的容易度的任意的指标值，典型的是粒子的扩散系数，但也可以是其它的物理量、例如平移扩散时间、任意的扩散系数的函数。此外，在本说明书中，在称为“信号”的情况下，只要没有特别限定，是指表示来自发光粒子的光的信号。
在上述的本发明的方法中，与扫描分子计数法同样地，首先，一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边依次进行光的检测。这样，在移动的光检测区域包含了随机运动的发光粒子时，检测到来自发光粒子的光，由此检测出一个发光粒子的存在。在所述结构中，在使光检测区域沿着规定的路径周期性地移动的情况下，在光检测区域在某个位置包含了某个发光粒子之后绕规定的路径循环而到达包含过上述发光粒子的位置附近的期间该发光粒子未离开光检测区域的规定的路径时，该发光粒子被再次包含在光检测区域内，从而检测到其光。然而，发光粒子在光检测区域绕规定的路径循环一周的期间因布朗运动而其位置移动，因此发光粒子最初被检测到的时间与下一次被检测到的时间的间隔、即发光粒子的信号的产生时间的间隔与光检测区域的移动周期不完全一致，与光检测区域的移动周期偏移，从而期待在所述与光检测区域的移动周期偏移的偏移时间中反映出发光粒子因布朗运动而进行移动的容易度。因此，在本发明中，如上述那样抽出在光强度数据上检测出的表示发光粒子的光的信号中的与同一发光粒子对应的多个信号，根据所抽出的那些信号的产生时间的间隔中的与光检测区域的移动周期偏移的偏移时间，对与所抽出的信号对应的发光粒子的扩散特性值进行计算。根据所述结构，如果发光粒子进入光检测区域的规定的路径，则能够个别地测量其扩散特性值，因此不需要FCS等光分析技术中的用于计算荧光强度的波动的统计性的处理，即使在样本溶液中的发光粒子浓度低于通过FCS等获得良好的测量结果所必须的水平的情况下也能够获得发光粒子的扩散特性值，在这一点是有利的。另外，根据本发明的方法，由于根据光强度数据(一维的数据)上的信号的产生时间计算扩散特性值，因此在运算负荷不怎么变大这一点上也是有利的。
此外，根据在光强度数据上作为同一发光粒子的信号而被抽出的信号的产生时间的间隔中的与光检测区域的周期偏移的偏移时间和光检测区域的移动速度来计算通过上述的方法检测出的发光粒子的位移。因而，在上述的扩散特性值的计算中，可以首先计算所述发光粒子的位移，根据该发光粒子的位移来计算发光粒子的扩散特性值。特别地，可以根据在某时间t的粒子的位移x，通过下式对扩散系数D进行定义，
<x(t)>2=2Dt  …(1)
(在此，<x(t)>是位移的平均)
利用所述式(1)的关系，根据发光粒子的位移估算扩散系数D。
另外，在光强度数据上作为同一发光粒子的信号而被抽出的信号的产生时间的间隔并不必须是在时间上相邻的信号的产生时间之差，应该理解为可以是多个连续的被抽出的上述信号中的任意两个信号的产生时间的时间差。例如，在抽出n个信号作为同一发光粒子的信号的情况下，可以对n个信号中的两个信号的组合全部，将两个信号的产生时间的间隔用于计算扩散特性值或扩散系数。即，在抽出了n个信号的情况下，得到n(n-1)/2个信号的产生时间的间隔的值，可以使用这些产生时间间隔的值来计算扩散特性值或扩散系数。根据所述方法，与根据相邻的信号的产生时间之差依次计量粒子的位移的情况相比，能够在较少的测量时间内得到很多的位移值，能够得到可靠性高的计算结果，在这一点上是有利的。
并且，在从上述的光强度数据上的信号中抽出与同一发光粒子对应的多个信号的步骤中，可以将在从对所检测出的表示发光粒子的光的信号中的一个信号的产生时间加上光检测区域的周期得到的时间起、根据上述光检测区域的尺寸和移动速度而决定的时间宽度内所产生的信号判断为是与上述一个信号所对应的发光粒子相同的发光粒子的信号。如上所述，在本发明的方法中，(并非连续地跟踪一个发光粒子，)每当光检测区域绕规定的路径循环时都周期性地检测到同一发光粒子，根据其信号的产生时间的间隔或位移来计算扩散特性值或扩散系数。因而，在扩散特性值或扩散系数大到在光检测区域循环的时间(周期)内发光粒子的(平均性的)位移超出光检测区域的大小的情况下，有可能无法周期性地检测到同一发光粒子的信号。即，反过来说，在光检测区域循环的时间内的发光粒子的位移小于光检测区域的大小的情况下，该发光粒子的信号的间隔处于针对光检测区域的周期加上或减去光检测区域移动光检测区域的尺寸所需要的时间宽度的一半所得到的值的范围内。而且，光检测区域移动光检测区域的尺寸所需要的时间宽度基于光检测区域的尺寸和移动速度决定，因此结果是，认为某信号与在产生了该信号之后在针对光检测区域的周期加上或减去基于光检测区域的尺寸和移动速度决定的时间宽度的一半所得到的值的范围内所产生的信号是同一发光粒子的信号。因此，通过如上述那样将在以针对一个信号的产生时间加上光检测区域的周期得到的时间为中心、基于光检测区域的尺寸和移动速度决定的时间宽度内所产生的信号判断为是与上述一个信号所对应的发光粒子相同的发光粒子的信号这种方式，能够抽出同一发光粒子的信号。具体地说，可以根据光检测区域的直径d和移动速度v，来通过
ΔT=d/v  …(2)
给出根据光检测区域的尺寸和移动速度决定的时间宽度ΔT。
并且，在本发明的方法中，在光强度数据上存在表示来自多个发光粒子的光的信号的情况下，可以针对这些多个发光粒子的各个分别计算扩散特性值或扩散系数。根据本发明的方法，在光检测区域绕规定的路径循环的期间，如果在路径上存在多个发光粒子，则这些发光粒子被分别检测到。因而，如果按每个发光粒子抽出这些发光粒子的信号，则能够对各个发光粒子计算扩散特性值或扩散系数。根据所述结构，能够在一个光强度数据上得到多个发光粒子的扩散特性值或扩散系数，能够在较少的测量时间内得到很多的结果，在这一点上是有利的。
关于上述的本发明的结构中的使光检测区域的位置移动的步骤，可以根据发光粒子的特性或者样本溶液中的数密度或浓度，适当地变更在样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度。如本领域技术人员所理解的那样，从发光粒子检测出的光的形态能够根据其特性或者样本溶液中的数密度或浓度的不同而变化。特别当光检测区域的移动速度快时，从一个发光粒子所能得到的光量降低，因此优选的是适当地变更光检测区域的移动速度，使得能够高精度地或高灵敏度地计量来自一个发光粒子的光。
进一步地，关于上述的使光检测区域的位置移动的步骤，优选的是将在样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度(由布朗运动引起的粒子的平均移动速度)高。如上述说明的那样，在本发明的方法中，对从光检测区域所包含的一个发光粒子发出的光进行检测，来个别检测发光粒子。然而，发光粒子由于在溶液中进行布朗运动而随机地移动，在多次出入光检测区域的情况下，有可能从一个发光粒子多次检测到(表示该发光粒子的存在的)信号，难以使检测出的信号与一个发光粒子的存在对应起来。因此，如上述那样，将光检测区域的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度高，由此(在光检测区域绕规定的路径循环一周的期间)能够使一个发光粒子对应一个信号。此外，扩散移动速度因发光粒子的不同而变化，因此如上所述，优选的是根据发光粒子的特性(特别是扩散特性值或扩散系数)适当地变更光检测区域的移动速度。
可以通过任意的方式进行光学系统的光路的变更以移动光检测区域的位置。例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中所采用的检电镜(Galvano-mirror)变更光路，来变更光检测区域的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动路径，例如能够从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择。此外，在本发明中，构成为变更光学系统的光路来使光检测区域的位置移动，由此由于光检测区域的移动迅速并且在样本溶液中实质上不发生机械振动、流体动力的作用，因此样本溶液中的发光粒子不会受到动力的作用的影响而能够在(没有伪像(artifact)的状态且)稳定的状态下进行光的计量(例如在使样本发生流动的情况下，难以始终赋予一样的流速并且装置结构复杂，另外所需要的样本量大幅增加，并且由于流动所造成的流体动力的作用而溶液中的发光粒子或其它物质有可能发生变质或改性。另外，基于流动的液体中的粒子的位移计算其扩散系数很复杂。)。而且，不需要使样本溶液流通的结构，因此能够与FCS等的情况同样地利用微量(1～几十μL左右)的样本溶液进行计量和分析。
本发明的方法典型地被用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或者它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学的对象物在溶液中的状态的用途，也可以用于分析或解析非生物学的粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、金属胶体等)在溶液中的状态，应该理解为这种情况也属于本发明的范围。
发明的效果
总而言之，根据本发明的方法，在共焦显微镜或多光子显微镜中，利用其光检测区域在样本溶液中进行扫描，由此个别地检测发光粒子的存在，并且能够测量该发光粒子的扩散特性值或扩散系数。而且，扩散特性值或扩散系数是反映粒子的大小以及形状的值，因此通过利用本发明的方法进行的测量，能够进行粒子的同定、检测粒子的大小和形状、它们的变化、或者对粒子的结合/离解反映或分散/聚合之类的各种现象进行检测和分析。
上述本发明的方法中的扩散特性值或扩散系数的测量基于新的原理，具有不同于以前的扩散系数的测量或估计方法的几个特征。例如，能够利用FCS计算在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的平移扩散时间，根据该平移扩散时间来估算发光粒子的扩散系数，但是FCS的平移扩散时间是首先运算测量时间中的荧光强度的自相关函数并根据所述自相关函数得到的值，据此估算出的扩散系数是样本溶液中的很多发光粒子的平均的值。因而，在样本溶液中存在种类不同的发光粒子的情况下，运算处理变得复杂，因此例如在对作为观测对象的粒子附加发光探针、通过FCS对所述粒子进行测量的情况下，可能需要用于去除未与观测对象粒子结合的发光探针的细化处理。另外，如已经记述过的那样，为了通过FCS以良好的精度运算荧光强度的自相关函数，需要样本溶液中的发光粒子浓度是在测量时间中始终存在一个以上的发光粒子的水平。与此相对地，根据本发明的方法，能够个别地检测发光粒子的存在及其位置，来计算各粒子的独立的扩散特性值或扩散系数。因而，能够以良好的精度执行测量的样本溶液中的发光粒子浓度也可以大幅地低于FCS的情况，并且在根据信号的特性等区分出发光粒子的种类的情况下，在样本溶液中是否存在种类不同的发光粒子并不怎么影响扩散特性值或扩散系数的计算的难易度，因此能够得到以下优点：在针对附加有发光探针的粒子进行测量的情况下也不用必须去除发光探针。
另外，作为现有技术的能够计算粒子的扩散系数的另一例，根据SMT(Single Molecule tracking：单分子跟踪)、RICS(RasterImaging Correlation Spectroscopy：光栅扫描图像相关光谱)(非专利文献5)，能够在光学显微镜下拍摄到的图像中跟踪溶液中的发光粒子的布朗运动，并根据该二维的粒子的运动来估算扩散系数，但是在这些情况下，需要解析二维数据(图像数据)，并且难以捕捉发光粒子的快的运动(粒子的位移的时间分辨率例如受到视频码率(video rate)限制。)。与此相对地，在本发明的方法中，使用一维数据(时间序列的光强度数据)计算扩散特性值或扩散系数，因此与图像数据的解析运算相比，运算负荷轻，并且通过适当地调节光检测区域的移动速度和/或路径的长度，(与SMT、RICS的情况相比)能够按每个发光粒子个别地测量运动快的粒子的扩散系数。
因此，按照本发明的方法，根据个别地检测发光粒子、个别地计算其扩散特性值或扩散系数的方法，如上述那样，能够获得以前的扩散特性值或扩散系数的测量或估计方法所没有的几个优点。特别地，在本发明中，由于个别地检测发光粒子，因此即使是在样本溶液中浓度相对较低且其光在以前的方法中埋没于来自其它的发光粒子的光的发光粒子，也能够检测出，并能够测量其扩散特性值或扩散系数。
本发明的其它目的以及优点通过以下的本发明的优选实施方式的说明将变得清楚。
附图说明
图1的(A)是执行本发明的方法的光分析装置的内部构造的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。
图2的(A)、(B)分别是说明构成本发明的方法的一部分的扫描分子计数法中的光检测的原理的示意图和所计量的光强度的时间变化的示意图。
图3是说明通过本发明的方法测量发光粒子的扩散系数的原理的图。(A)是通过显微镜的光检测区域CV在样本溶液内沿着规定的路径的移动而被包含的空间区域的示意性的立体图。(B)是相对于时间示意性地表现在光检测区域规定的路径循环时发光粒子几乎不移动的情况下所检测出的来自发光粒子的光的强度的图表。(C)是在规定的路径循环的光检测区域CV的通过空间区域的一部分的示意性的立体图，示出了发光粒子的移动距离与发光粒子被检测出的时刻之间的关系。(D)是说明光检测区域的尺寸与通过本发明的方法测量出的发光粒子因布朗运动所产生的(光检测区域的每一个周期的)位移之间的关系的光检测区域的示意图。
图4是以流程图的形式示出按照本发明的方法执行的扩散系数测量的处理过程的图。
图5的(A)、(B)分别是表示发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时和由于以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。
图6的(A)是说明用于依照扫描分子计数法根据所计量的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光粒子的存在的处理过程中的检测信号的信号处理过程的例子的图。图6的(B)示出所计量的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域中拟合的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为由噪声或异物造成的信号而被忽略。
图7的(A)是对抽出在时序光强度数据上检测出的发光粒子的信号中的同一发光粒子(α或β)的信号的处理的一个例子进行说明的图。图7的(B)是说明在所抽出的同一发光粒子的信号((i)～(v))中被参照的信号的产生时间间隔的图。图7的(C)是示出针对根据信号的产生时间间隔中的与光检测区域的移动周期偏移的偏移时间所决定的发光粒子的平均平方位移的(产生了位移的)时间的标绘点和针对标绘点的拟合直线的示意性的图表。(拟合直线的斜率是发光粒子的扩散系数D的函数(=2D)。)
图8的(A)是在实施例1中观测周期性强的脉冲状的信号得到的时序光强度数据(光子计数数据)的一部分的实测例，图8的(B)示出将信号4的时间轴放大得到的光子计数数据及其拟合曲线。图8的(C)是表示根据(A)中的信号的产生时间的间隔中的与光检测区域的移动周期偏移的偏移时间所计算出的发光粒子的平均平方位移相对于时间(周期数×移动周期)的标绘点和拟合直线的图表。
图9示出在实施例1中测量出的时序光强度数据(光子计数数据)的整体(2秒钟)。
图10是在现有的计算萤光强度的波动的光分析技术中得到的光子计数(光强度)的时间变化的例子，(A)是样本内的粒子的浓度为能够提供足够的计量精度的程度的情况，(B)是样本内的粒子的浓度相比于(A)的情况大幅降低的情况。
附图标记说明
1：光分析装置(共焦显微镜)；2：光源；3：单模光纤(single-mode optical fiber)；4：准直透镜；5：分色镜；6、7、11：反射镜；8：物镜；9：微板；10：皿(样本溶液容器)；12：聚光镜(condenser lens)；13：针孔；14：屏障滤波器(barrier filter)；15：多模光纤(multi-mode optical fiber)；16：光检测器；17：反射镜偏转器；17a：台位置变更装置；18：计算机。
具体实施方式
下面，详细地说明本发明的优选实施方式。
光分析装置的结构
本发明的方法能够通过光分析装置来实现，该光分析装置是在基本结构中如图1的(A)示意性地例示的那样组合能够执行FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统和光检测器而成的。参照图1的(A)，光分析装置1由光学系统2～17以及用于控制光学系统的各部分的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置1的光学系统可以与普通的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而被发射，通过准直器4成为平行光，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型的是在物镜8的上方配置有微板9，该微板9上排列有注入了1μL～几十μL的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在该样本容器或皿10内的样本溶液中形成焦点，形成光强度强的区域(激励区域)。在样本溶液中分散或溶解有作为观测对象物的发光粒子，典型的是附加有萤光色素等发光标识的分子，当发光粒子进入到激励区域时，在其间发光粒子被激励而释放出光。所释放的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13。此外，如本领域技术人员所了解的那样，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置处，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，遮断来自焦点面以外的光。图1的(B)所例示的激光的焦点区域通常是具有1fL～10fL左右的有效体积的该光分析装置中的光检测区域，被称为共焦区组织。在共焦区组织中，典型的是光强度为以区域中心为顶点的高斯型分布或洛仑兹型分布，其有效体积是将光强度为1/e2的面作为边界的大致椭圆球体的体积。这样，通过了针孔13的光经过分色镜14a，透过屏障滤波器14(在此只选择特定波长频带的光成分)被导入到多模光纤15，到达对应的光检测器16，在被转换成按时间序列的电信号后输入到计算机18，以后面说明的方式进行用于光分析的处理。作为光检测器16，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器，由此，能够检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个或多个萤光色素分子的微弱光。
另外，在上述的光分析装置的光学系统中，还设置有用于变更光学系统的光路来通过光检测区域对样本溶液内进行扫描、即使焦点区域(即，光检测区域)的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的用于使光检测区域的位置移动的机构，例如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17。所述反射镜偏转器17可以与在普通的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。另外，为了实现所期望的光检测区域的位置的移动图案，而在计算机18的控制下与光检测器16所进行的光检测协调地驱动反射镜偏转器17。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择光检测区域的位置的移动路径(可以设为在计算机18中的程序中能够选择各种移动图案。)。此外，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8上下移动来使光检测区域的位置在上下方向上移动。如上所述，根据不是移动样本溶液而是变更光学系统的光路使光检测区域的位置移动的结构，在样本溶液内不会实质地产生机械振动、流体动力作用，能够排除动力作用对观测对象物的影响，实现稳定的计量。
此外，作为追加的结构，也可以在显微镜的台(未图示)处设置用于移动微板9的水平方向位置的台位置变更装置17a以变更所观察的皿10。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。
在发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。在发光粒子通过磷光或散射而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。另外，在发光粒子通过化学发光、生物发光现象而与激励光无关地发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2～5。进一步地，在光分析装置1中可以如图示那样设置多个激励光源2，可以设为能够根据激励发光粒子的光的波长而适当地选择激励光的波长。同样地，也可以具备多个光检测器16，在样本中包含波长不同的多种发光粒子的情况下，可以设为能够根据波长分别检测来自这些发光粒子的光。
本发明的方法的原理
如“发明内容”一栏所记载的那样，根据本发明的方法，如果清楚地进行描述，则如下，即，“扫描分子计数法”一边使共焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的位置在样本溶液内沿规定的路径周期性地移动一边检测在样本溶液中分散的发光粒子被包含在光检测区域内时所释放出的光，从而个别地检测发光粒子的存在，在该“扫描分子计数法”中，根据在发光粒子的信号的产生时间间隔中的与光检测区域的移动周期偏移的偏移时间来计算该发光粒子的移动容易度、即发光粒子的扩散特性值或扩散系数，该偏移时间反映出光检测区域绕规定的路径循环的期间的发光粒子的位置偏移。根据所述的结构，个别地检测样本溶液中的各个发光粒子，并个别地测量其扩散特性值或扩散系数，因此即使在样本溶液中的发光粒子浓度低于能够通过FCS等需要用于计算荧光波动的大小的统计性处理的光谱分析技术良好地进行测量的浓度的情况下，也能够测量发光粒子的扩散特性值或扩散系数。下面，针对扫描分子计数法以及本发明的扩散特性值或扩散系数的测量方法的原理进行说明。
1．扫描分子计数法的原理
FCS等光谱分析技术与现有的生物化学的分析技术相比，其优点在于所需要的样本量极少且能够迅速地执行检查。然而，在FCS等光谱分析技术中，在原理上，根据萤光强度的波动来估算发光粒子的特性，因此为了得到高精度的测量结果，要求如图10的(A)示意性地描绘的那样样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度为在计量萤光强度的过程中在光检测区域CV内始终存在一个左右发光粒子的水平，如该图的右侧所示那样在计量时间中始终检测到有意义的光强度(光子计数)。如果发光粒子的浓度或数密度更低、例如是图10的(B)所描绘的那样发光粒子只是偶尔进入到光检测区域CV内的水平的情况下，如该图的右侧所例示的那样，只在计量时间的一部分出现有意义的光强度的信号(光子计数)，难以高精度地估算光强度的波动。另外，在与计量过程中在光检测区域内始终存在一个左右的发光粒子的水平相比发光粒子的浓度大幅降低的情况下，在光强度的波动的运算中，容易受到背景的影响，为了得到足够进行运算的量的有意义的光强度数据而计量时间变长。
因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的“扫描分子计数法”，即使在发光粒子的浓度低于如上所述的在FCS、FIDA等光谱分析技术中要求的水平的情况下也能够检测发光粒子的特性。
作为在扫描分子计数法中执行的处理，如果清楚地描述，则驱动用于使光检测区域的位置移动的机构(反射镜偏转器17)来变更光路，如在图2中示意性地描绘的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域CV对样本溶液内进行扫描，一边执行光检测。这样，例如图2的(A)那样，在光检测区域CV移动的期间(图中为时间t0～t2)，在通过存在一个发光粒子的区域时(t1)，从发光粒子释放出光，如在图2的(B)中所描绘的那样，在按时间序列的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。通过这样执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，逐个地检测在其间出现的如图2的(B)所例示的脉冲状的信号(有意义的光强度)，由此能够个别检测发光粒子，获取与发光粒子的特性有关的信息。在所述扫描分子计数法的原理中，不进行如萤光强度的波动的计算那样的统计性的运算处理，而是逐个地检测发光粒子，因此即使在要观测的粒子的浓度低至通过FCS、FIDA等无法以足够的精度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的特性有关的信息。
2．本发明的发光粒子的扩散特性值的测量原理
在上述的扫描分子计数法中，如图3的(A)示意性地描绘的那样，光检测区域(CV)在样本溶液中以通过规定的路径(例如半径R的圆环)的方式循环。在所述的光检测区域移动的期间发光粒子由于布朗运动而位置移动时，如果被检测过一次的发光粒子(在光检测区域中包含过一次的发光粒子)在光检测区域绕规定的路径循环的期间未离开光检测区域所通过的空间区域的情况下，该发光粒子被再次检测到。特别是在发光粒子的布朗运动的速度比较慢时，被检测过一次的发光粒子在一段时间内在光检测区域每次循环时都被包含在光检测区域中，因此在光强度数据上，表示发光粒子的光的信号如图3的(B)示意性地例示的那样每隔大致光检测区域绕规定的路径一周的时间(移动周期)tcycle被周期性地检测到。然而，被周期性地检测到的所述信号的产生时间间隔与光检测区域的移动周期不完全一致，与光检测区域绕规定的路径循环的时间中发光粒子因布朗运动而位置移动相关地相对于光检测区域的移动周期增减，即产生与移动周期偏移的偏移时间。因此，在本发明中，尝试根据上述的被周期性地检测出的信号的产生时间的间隔中的与光检测区域的移动周期偏移的偏移时间，计算发光粒子因布朗运动进行移动的容易度、即扩散特性值。此外，下面针对计算扩散系数作为扩散特性值的例子进行说明，但是应该理解为关于其它的扩散特性值也能够根据信号的产生时间的间隔中的与移动周期偏移的偏移时间适当地进行计算，应该理解为这种情况也属于本发明的范围。
被周期性地检测到的发光粒子的信号的产生时间和发光粒子的扩散系数具体地说被赋予如下的关系。首先，如图3的(C)的左边所示的那样，在时刻t=to某个发光粒子被包含在光检测区域内，在产生了该发光粒子的信号之后光检测区域以移动周期tcycle绕规定的路径循环k次(k为正整数)后包含同一发光粒子并检测出其信号时，如图3的(C)的右边所示的那样，发光粒子移动了位置，因此通过
t=tk=to+k×tcycle+Δt  …(3)
给出信号的产生时间t=tk。在此，Δt是由于发光粒子的位置的移动而产生的、发光粒子被包含在光检测区域中的时刻的偏移，即两个信号的产生时间的间隔中的与光检测区域的移动周期偏移的偏移时间(Δt能够是正数或负数。)。因而，对于在k×tcycle(k周期)中的沿着光检测区域的移动方向的发光粒子的位置的位移x(k×tcycle)，使用光检测区域的移动速度v，通过
x(k×tcycle)=vΔt  …(4)
给出。另外，粒子的扩散系数D与时间t时的粒子的一维的位移x(t)之间的关系基于爱因斯坦-斯莫洛科夫斯基(Einstein-Smoluchowski)公式，通过
<x(t)>2=2Dt  …(5)
给出。这样，利用式(3)、(4)，根据被周期性地检测出的信号的产生时间的间隔中的与光检测区域的移动周期偏移的偏移时间计算发光粒子的位置的位移x(k×tcycle)，使用这些位移，通过式(5)能够估算扩散系数D。
另外，在扩散系数大到在某个光检测区域的移动周期tcycle中发光粒子的(平均性的)位移超出光检测区域的大小这种程度的情况下，难以在光检测区域的每一个循环中都捕捉到同一发光粒子的信号。原因在于由光检测区域包含过一次的发光粒子如果其移动方向偶然地沿着光检测区域的通过区域(规定的路径)，则在光检测区域循环之后再次由光检测区域包含，但是发光粒子在随机的方向上进行运动，因此在光检测区域的一个周期内的发光粒子的(平均性的)位移大到超出光检测区域的大小这种程度时，发光粒子在由光检测区域包含过一次之后离开光检测区域的通过区域，在光检测区域循环之后不再被光检测区域包含的可能性高。因而，为了捕捉周期性的信号以可靠地实现上述的扩散系数D的估算，而优选如图3的(D)所例示的那样调整光检测区域的移动周期tcycle以避免在光检测区域的移动周期tcycle内的发光粒子的(三维的)位移l超过光检测区域的直径2r。即，在通过本发明的方法进行扩散系数的测量的情况下，优选调整光检测区域的移动周期tcycle以满足
(2r)2>2δ×D×tcycle  …(6)
(在此，δ是维，此处δ=3。)。
此外，在实际的测量中，可以在要检查的发光粒子的所预想的扩散系数中调整光检测区域的移动周期tcycle以使上述的式(6)的条件成立。
处理操作过程
在使用图1的(A)所例示的光分析装置1的依照本发明的方法的发光粒子的扩散系数的测量方法的实施方式中，具体地说，执行以下的过程，(1)包含发光粒子的样本溶液的调制过程，(2)样本溶液的光强度的测量处理过程，以及(3)测量出的光强度的分析处理过程。图4示出用流程图的形式表示的本实施方式中的处理过程。
(1)调制样本溶液
在本发明的方法中，作为观测对象的粒子只要是溶解的分子等在样本溶液中分散并在溶液中随机运动的粒子，则可以是任意的，例如可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞、或金属胶体、其它非生物学粒子等(样本溶液典型的是水溶液，但不限于此，也可以是有机溶剂之类的其它任意的液体。)。另外，作为观测对象的粒子可以是其自身发光的粒子，或者也可以是以任意的方式附加了发光标识(萤光分子、磷光分子、化学/生物发光分子)的粒子。
(2)测量样本溶液的光强度
在利用本实施方式的扫描分子计数法进行的光强度的测量处理过程中，一边驱动反射镜偏转器17进行光检测区域的位置在样本溶液内的移动(样本溶液内的扫描)，一边进行光强度的测量(图4的步骤100)。在操作处理中，典型的是在向微板9的皿10注入样本溶液并载置在显微镜的台上后，在使用者向计算机18输入开始测量的指示时，计算机18依照存储在存储装置(未图示)中的程序(为了使光检测区域的位置在样本溶液内移动而变更光路的过程以及在光检测区域的位置的移动中检测来自光检测区域的光的过程)，开始进行样本溶液内的光检测区域处的激励光的照射和光强度的计量。在开始计量时，首先在计算机18依照程序进行的处理动作的控制下，从光源2射出样本溶液中的发光粒子的激励波长的光，并且反射镜偏转器17驱动反射镜7(检电镜)，在皿10内执行光检测区域的位置的移动，与此同时，光检测器16将依次检测出的光转换为电信号并发送到计算机18，计算机18按照任意的方式根据所发送的信号生成按时间序列的光强度数据并保存。典型的是光检测器16是能够检测一个光子的到来的超高灵敏度光检测器，因此光的检测是以在规定时间内每隔规定的单位时间(BIN TIME)、例如每隔10μs依次计量来到光检测器的光子的个数的方式执行的光子计数，按时间序列的光强度的数据可以是按时间序列的光子计数数据。
关于光检测区域的位置的移动速度，在扫描分子计数法中，一般为了定量地高精度地根据计量出的按时间序列的光强度数据个别检测发光粒子，优选的是将光强度的计量中的光检测区域的位置的移动速度设定为比发光粒子的随机运动、即布朗运动的移动速度快的值。在光检测区域的位置的移动速度比粒子因布朗运动而进行的移动慢的情况下，如图5的(A)示意性地描绘的那样，粒子在区域内随机移动，由此光强度随机地变化(光检测区域的激励光强度以区域的中心为顶点向外方降低。)，难以确定与各个发光粒子对应的有意义的光强度的变化(表示来自发光粒子的光的信号)。因此，优选的是将光检测区域的位置的移动速度设定得比粒子的布朗运动的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得如图5的(B)所描绘的那样，粒子大致直线地横穿光检测区域，由此，在按时间序列的光强度数据中与各个粒子对应的光强度的变化的曲线大致相同(在粒子大致直线地通过光检测区域的情况下，光强度的变化的曲线与激励光强度分布大致相同。参照图6的(A)的上部)，能够容易地确定各个发光粒子与光强度之间的对应。
具体地说，具有扩散系数D的发光粒子由于布朗运动而通过半径r的光检测区域(共焦区组织)时所需要的时间Δτ根据以下的平均平方位移的关系式，
(2r)2=6D×Δτ  …(7)
而成为
Δτ=(2r)2/6D  …(8)，
因此发光粒子因布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif大致为
Vdif=2r/Δτ=3D/r  …(9)。
因此，光检测区域的位置的移动速度可以参照所述的Vdif设定为比其充分快的值。例如在预想发光粒子的扩散系数是D=2.0×10-10m2/s左右的情况下，在设r为0.62μm左右时，Vdif为1.0×10-3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为其10倍以上的15mm/s。此外，在发光粒子的扩散系数未知的情况下，可以设定各种光检测区域的位置的移动速度，反复执行用于找到光强度的变化的曲线为预想的曲线(典型的是与激励光强度分布大致相同)的条件的预备实验，来决定适合的光检测区域的位置的移动速度。
并且，在本发明的方法中，如已经记述的那样，针对要检查的发光粒子的扩散系数D，优选的是对光检测区域的移动周期tcycle进行设定以使式(6)的条件成立。例如图3的(A)所例示的那样，在光检测区域的移动路径是圆形时，通过下式给出光检测区域的移动周期tcycle、移动速度v以及移动路径的半径R之间的关系，
2πR=v×tcycle  …(10)
因此基于式(6)，设定光检测区域的移动速度v使得
v>(3πR/r2)×D  …(11)
也成立。
(3)分析光强度
在通过上述的处理得到样本溶液中的发光粒子的按时间序列的光强度数据时，在计算机18中，通过依照存储在存储装置中的程序的处理，来执行光强度数据上的与来自发光粒子的光对应的信号的检测、同一发光粒子的信号的抽出、扩散系数的计算。
(i)检测与发光粒子对应的信号
在按时间序列的光强度数据中，在一个发光粒子通过光检测区域时的轨迹如图5的(B)所示那样是大致直线状的情况下，与该粒子对应的信号的光强度的变化具有反映(由光学系统决定的)光检测区域内的光强度分布的大致吊钟状的曲线(参照图8的(B))。因而，在扫描分子计数法中，基本上在超过适当设定的阈值的光强度所持续的时间宽度处于规定的范围内时，判定为具有该光强度的曲线的信号与一个粒子通过光检测区域的情况对应，可以进行一个发光粒子的检测。而且，超过阈值的光强度所持续的时间宽度不在规定的范围内的信号被判定为是噪声或异物的信号。另外，在能够将光检测区域的光强度分布假定为高斯分布时，即
I=A×exp(-2t2/a2)  …(12)
在使式(12)拟合有意义的光强度的曲线(能够明确地判断为不是背景的曲线)而计算出的强度A和宽度a处于规定的范围内时，判定为该光强度的曲线与一个粒子通过光检测区域的情况对应，可以进行一个发光粒子的检测(强度A和宽度a处于规定的范围外的信号被判定为是噪声或异物的信号，可以在其后的分析等中忽略)。
作为根据时序光强度数据进行发光粒子的统一检测的处理方法的一个例子，首先对时序光强度数据(图6的(A)、最上部“检测结果(未处理)”)进行平滑(平滑化)处理(图4的步骤110、图6的(A)的中上部(平滑))。发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生数据值的缺失，因此通过所述平滑处理，能够忽略如上所述的数据值的缺失。例如可以通过移动平均法等进行平滑处理。此外，也可以根据获取光强度数据时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)、BIN TIME来适当地设定执行平滑处理时的参数，例如在移动平均法中进行一次平均的数据个数、移动平均的次数等。
接着，在平滑处理后的时序光强度数据中，为了检测有意义的脉冲状的信号(以下称为“脉冲信号”)所存在的时间区域(脉冲存在区域)，对平滑处理后的时序光强度数据的时间计算一次微分值(步骤120)。时序光强度数据的时间微分值如图6的(A)的中下部“时间微分”所例示的那样，信号值变化时刻的值的变化变大，因此通过参照所述时间微分值，能够有利地决定有意义的信号的起点和终点。
然后，在时序光强度数据中，依次检测有意义的脉冲信号，判断检测出的信号是否是与发光粒子对应的信号。具体地说，首先在时序光强度数据的按时间序列的时间微分值数据上，依次参照时间微分值来搜索并决定一个脉冲信号的起点和终点，确定脉冲存在区域(步骤130)。在确定了一个脉冲存在区域时，针对该脉冲存在区域中的平滑后的时序光强度数据进行吊钟型函数的拟合(图6的(A)的下部的“吊钟型函数拟合”)，计算吊钟型函数的脉冲的峰值(最大值)的强度Ipeak、脉冲宽度(半峰全宽)Wpeak、拟合时的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。此外，拟合的吊钟型函数典型的是高斯函数，但也可以是洛仑兹型函数。而且，判断计算出的吊钟型函数的参数是否处于针对一个发光粒子通过了光检测区域时检测出的脉冲信号所描绘的吊钟型的曲线的参数所设想的范围内，即脉冲的峰值强度、脉冲宽度、相关系数是否分别处于规定范围内等(步骤150)。这样，如图6的(B)的左边所示的那样，将如下信号判定为是与一个发光粒子对应的信号，即该信号的计算出的吊钟型函数的参数被判定为处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内，由此，检测出一个发光粒子。另一方面，如图6的(B)的右边所示那样，计算出的吊钟型函数的参数不在设想的范围内的脉冲信号作为噪声而被忽略。上述的步骤130～150的处理中的脉冲信号的搜索和判断可以在时序光强度数据的整个区域内反复执行(步骤160)。另外，根据时序光强度数据个别检测发光粒子的信号的处理并不限于上述过程，可以通过任意的方法执行。
(ii)抽出同一发光粒子的信号(图4的步骤170)
当进行时序光强度数据上的发光粒子的脉冲信号的检测时，从这些脉冲信号中抽出同一发光粒子的信号。如从到上述为止的说明中所理解的那样，同一发光粒子的信号以与光检测区域的移动周期(虽然不完全一致但)大致相等的周期连续出现。因此，可以通过任意的方法或算法选择以与光检测区域的移动周期大致相等的周期连续出现的信号来进行同一发光粒子的信号的抽出。例如最简单地，可以由实验者通过目视在时序光强度数据上确定以与光检测区域的移动周期大致相等的周期连续出现的信号，来抽出同一发光粒子的信号。
另外，如已经提及的那样，在本发明的方法中，为了能够捕捉周期性的信号以有意义地计算发光粒子的扩散系数，优选调整光检测区域的移动周期以使观测对象的发光粒子的每个光检测区域的循环的(平均性的)位移都为不超过光检测区域的大小的程度(参照式(6))。在这种情况下，期待检测出一次的发光粒子在光检测区域循环之后的位置处于光检测区域的范围内。即，对于在以检测出某一个发光粒子的信号之后经过光检测区域的一个周期的时间为中心、与光检测区域移动其移动方向上的大小(直径d)的时间相当的时间宽度
ΔT=d/v  …(2)
的范围内所产生的信号，能够判断为是与上述一个发光粒子相同的发光粒子的信号。因此，作为同一发光粒子的信号的抽出方法之一，可以采用在时序光强度数据上将在如下的时间宽度ΔT的范围内产生的信号判断为是与对应一个信号的发光粒子相同的发光粒子的信号，该时间宽度ΔT是以对上述一个发光粒子的信号的产生时间加上光检测区域的周期得到的时间为中心的宽度。更具体地说，如图7的(A)示意性地例示的那样，例如在选择了某个发光粒子的信号α(i)之后，在以从所选择的该信号α(i)的产生时刻(可以是峰时。)起经过光检测区域的一个周期的时间为中心的时间宽度ΔT的范围内存在信号α(ii)的情况下，该信号α(ii)作为与信号α(i)相同的发光粒子的信号而被选择。然后，进一步在以从所选择的信号α(ii)的产生时刻起经过光检测区域的一个周期的时间(tcycle)为中心的时间宽度ΔT的范围内存在信号α(iii)的情况下，该信号α(iii)作为与已经选择的信号α(i)、α(ii)相同的发光粒子的信号而被选择。这样，每次新选择信号时都依次反复地执行选择在以从所选择的该信号的产生时刻起经过光检测区域的一个周期的时间为中心的时间宽度ΔT的范围内存在的信号的处理，由此能够在时序光强度数据上抽出同一发光粒子的一系列的信号(信号群)。(此外，也可以将最初选择的信号的产生时刻作为基准，每次经过光检测区域的移动周期(tcycle)时，都将在以各周期结束的时间为中心的时间宽度ΔT的范围内存在的信号选择为与最初选择的信号相同的发光粒子的信号。)
另外，在多个发光粒子进入光检测区域的通过区域的情况下，如图7的(A)所例示的那样，在某个周期性出现的信号的群(α)之间出现其它的周期性出现的信号的群(β)。在这种情况下，关于该其它的周期性出现的信号的群，也可以按照与上述相同的算法依次抽出信号。即，在一个时序光强度数据上存在多个周期性出现的信号的群的情况下，这些信号群可以分别被个别地抽出。在实际的抽出处理中，例如在时序光强度数据上最初选择一个信号(α(i))，以该一个信号为基准，在以如上所述的方式抽出了一群周期性的信号之后，以没有被选择到所抽出的信号群的一个信号(β(i))为基准，如上述那样抽出一个周期性的信号的群(β(ii)、…)。通过重复进行所述处理，可以在一个时序光强度数据上抽出多个信号群。对于上述的信号抽出方法，特别是在时序光强度数据上检测出很多发光粒子的信号的情况下，在由计算机自动抽出信号时是有利的。
(iii)计算发光粒子的位移(图4的步骤180)
当如上述那样(按每个发光粒子)抽出同一发光粒子的信号群时，根据各信号的产生时间的间隔中的与光检测区域的移动周期偏移的偏移时间来估计发光粒子的位移。如已经提及的那样，对于光检测区域绕规定的路径循环k周的时间(k×tcycle)的发光粒子的位移，使用光检测区域的k次循环中的最初的信号的产生时间to与最后的信号的产生时间tk之间的、与相当于k个周期的时间k×tcycle偏移的偏移时间
Δt=tk-to-k×tcycle  …(13)
通过式(4)来计算。因而，在计算发光粒子的位移时，典型地说，可以针对所抽出的信号群的信号中的两个信号的组合的全部，通过式(13)计算偏移时间Δt，使计算出的Δt乘以光检测区域的移动速度v(通过式(4))，来计算在各信号的产生时间的间隔中的发光粒子的位移x。例如图7的(B)那样，假设检测出五个大致周期性的信号，产生与光检测区域移动的一个周期、两个周期、三个周期以及四个周期相当的时间中的偏移时间(粒子的位移)的信号的组合数分别为4组(1、5、8、10)、3组(2、6、9)、2组(3、7)以及1组(4)，计算全部10个偏移时间以及粒子的位移的数据。而且，在发光粒子的信号群的信号数是n个时，针对与1～n-1个周期相当的各个时间得到偏移时间以及粒子的位移的数据，数据的总数为n(n-1)/2个。
(iv)计算扩散系数(图4的步骤190)
这样，当通过上述的步骤180的处理计算一个发光粒子的、在光检测区域的各个移动时间(循环数×移动周期)中的粒子的位移时，利用式(5)的关系计算该发光粒子的扩散系数D。例如在一个方式中，如图7的(C)示意性地例示的那样，针对通过步骤180得到的粒子的位移的平方值x2相对于时间(循环数×移动周期)的曲线，通过最小二乘法等拟合出直线，根据该直线的斜率(=2D)可以计算出扩散系数D(在直线拟合时，可以针对粒子的位移的平方值x2(图中为×)拟合出直线、或者针对每个周期的粒子的位移的平方值x2的平均值(图中为●)拟合出直线。)。另外，针对各个粒子的位移x，计算
D=x2/(2k×tcycle)  …(14)，
也可以将计算出的D的平均值设为该发光粒子的扩散系数。
这样，根据上述的本发明的方法，在通过光检测区域在样本溶液中进行扫描来个别检测发光粒子的扫描分子计数法中，能够“测量”发光粒子的扩散系数。如已经记述的那样，扩散系数是反映粒子的大小、形状的物理量，因此根据本发明，通过对任意的想要观测的粒子赋予发光标识而形成发光粒子，并对所述发光粒子的扩散系数进行测量，能够得到想要观测的粒子的大小、构造或它们的变化、或者与各种分子间相互作用相关的信息。特别地，在本发明中，通过调整光检测区域的移动周期，使能够测量的扩散系数的大小可变，因此期待能够测量比较大范围的种类的粒子的扩散系数。在实际的测量中，可以通过预备实验将光检测区域的移动周期调整为合适的值以能够获得观测对象粒子的周期性的信号。
为了验证上述说明的本发明的有效性而进行了如下的实验。此外，下面的实施例例示了本发明的有效性，应该理解为并非限定本发明的范围。
实施例1
测量发光粒子的扩散系数
验证了通过本发明的方法来测量发光粒子的扩散系数的情形。
作为样本溶液，调制出将质粒(pBR322、Takara Bio株式会社、Cat.No.3035)作为观测对象粒子以其浓度为1pM的方式溶解于包含10nM的SYTOX Orange(Invitrogen公司、Cat.No.S-11368)的磷酸缓冲液(包含0.05%Tween20)中所得到的溶液。此外，SYTOX Orange是与DNA(质粒)结合时荧光强度增大大约500倍的荧光色素。在光的测量中，作为光分析装置，使用具备共焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量装置MF20(奥林巴斯株式会社)，依照在上述的“(2)测量样本溶液的光强度”中说明的方式，针对上述样本溶液获取时序光强度数据(光子计数数据)。此时，激励光使用633nm的激光，使用带通滤波器测量660nm-710nm的波长频带的光，生成时序光强度数据。使样本溶液中的光检测区域以10m秒的移动周期和15mm/秒的移动速度在圆形(半径为大约23.9μm)的路径上循环。另外，将BIN TIME设为10μ秒、将测量时间设为2秒钟。在测量光强度之后，依照上述的“(3)(i)检测与发光粒子对应的信号”所记载的处理过程，对针对样本溶液获取到的时序光强度数据实施平滑处理，在平滑后的数据中确定出脉冲信号的起点和终点，之后通过最小二乘法使高斯函数拟合各脉冲信号，确定(高斯函数中的)峰值强度、脉冲宽度(半峰全宽)、相关系数。然后，只将满足下述的条件的脉冲信号判定为与发光粒子对应的信号，
20μs<脉冲宽度<400μs
峰值强度>1.0[pc/10μs]  …(A)
相关系数>0.95，
另一方面，将不满足上述条件的脉冲信号作为噪声而忽略。
图8的(A)示出在通过上述两秒钟的测量所得到的光强度数据中的1.5～1.6秒的数据中以(作为光检测区域的移动周期的)大约10m秒周期性出现的表示发光粒子的光的信号1～5的例子。当观察将时间方向放大后的图时，如图8的(B)所示那样，所有的信号都大致是吊钟状的脉冲状的信号。上述的各信号的峰值时刻如下面那样(单位是m秒)。
Figure BDA00003044360500341
这些一系列的信号的周期与光检测区域的移动周期大致相等，被认为是同一发光粒子的信号。因此，使用上述信号的峰值时刻，通过“(iii)计算发光粒子的位移”所记载的要领，针对五个信号中的两个信号的组合的全部，通过式(13)计算信号的产生时间的间隔中的与相当于移动周期的时间(周期数×移动周期)偏移的偏移时间Δt，再通过式(4)计算出发光粒子的位移x。图8的(C)是相对于时间(周期数×移动周期)绘制这样计算出的位移x的平方值(x2)得到的图(各点是在各时间的位移x的平方值的平均值。)。如从图中理解的那样，位移x的平方值x2的平均值与时间大致成比例。该情形表示在位移x的平方值x2的平均值与时间之间用式(5)表示的关系成立，能够根据上述的信号的产生时间的间隔中的与相当于移动周期的时间偏移的偏移时间Δt估算因布朗运动产生的发光粒子的位移x。此外，根据针对图8的(C)的标绘点通过最小二乘法拟合直线得到的直线的斜率(=2D)而得到的扩散系数D是3.89×10-11[m2/s]。
并且，从通过上述的两秒钟的测量所获得的所有光强度数据(图9)中的发光粒子的信号中分别抽出与同一发光粒子对应的信号的所有组，针对每个发光粒子估算扩散系数。在信号的抽出中，如“(ii)抽出同一发光粒子的信号”中所记载的那样，通过重复进行下面的处理来抽出一群信号：在光强度数据上最初选择了一个发光粒子的信号之后，将在以从所选择的该信号的峰值产生时刻起经过光检测区域的移动周期(tcycle)的时间为中心、通过式(2)提供的时间ΔT的范围内存在的信号选择为与最初选择的信号相同的发光粒子的信号，进一步选择在以从新选择的信号的峰值产生时刻起经过光检测区域的移动周期(tcycle)的时间为中心、通过式(2)提供的时间ΔT的范围内存在的信号。接着，以没有被选择到前一信号群的一个信号为基准，如上述那样重复进行抽出一个周期性的信号的群的处理，从而在一个时序光强度数据上抽出了多个信号群。在图9的例子中，将通过式(2)提供的时间ΔT设定为ΔT=53μs(使用d=0.8μm、v=15mm/秒进行运算。)。其结果，在图9的光强度数据上发光粒子的信号的总数是7188个时，按光检测区域的各移动周期而周期性地产生两次以上的信号的组的个数是1708组(周期性地产生的信号的总数是4156个。)。所述信号的组的个数对应发光粒子的个数，因此在本实施例的情况下，在通过两秒钟的测量得到的一个光强度数据上，能够得到1708个发光粒子的扩散系数的值。这样，针对检测出的1708组的各个信号群，在按照式(13)计算出信号的产生时间的间隔中的与相当于移动周期的时间偏移的偏移时间Δt，之后根据按照式(4)基于Δt计算出的位移x的平方值x2和光检测区域的移动时间(循环数×移动周期)，利用式(5)的关系计算出扩散系数，此时扩散系数平均为9.9×10-12[m2/s]。
针对包含10nM的上述观测对象粒子(质粒pbr322)的溶液进行FCS的测量(使用单分子荧光测量装置MF-20)而得到的观测对象粒子的扩散系数是4.0×10-12[m2/s]。另外，在将观测对象粒子的比容设为1.0cm3/g、假设观测对象粒子是球状的情况下，基于斯托克-爱因斯坦(Stokes-Einstein)公式(D=κBT/6πηr)，在理论上估算出的扩散系数为2.2×10-11[m2/s]，假设观测对象粒子是棒状的情况下(假设直径4nm、长度680nm)的理论上估算出的扩散系数为4.2×10-12[m2/s](使用了通过非专利文献6的式(8)进行的校正。)。这样，上述的本实施例中的扩散系数的结果值的数量级与FCS的方法和理论值大致一致，该情形表示通过本发明的方法能够进行粒子的扩散系数的测量。
这样，如从上述的实施例的结果理解的那样，根据上述的本发明的方法，在扫描分子计数法中能够进行发光粒子的扩散系数的测量。特别地，本发明的方法构成为个别检测在光强度数据上周期性地产生的发光粒子的信号，根据该信号的产生时刻计算扩散系数，因此根据本发明的方法，即使样本溶液中的发光粒子浓度低于FCS等光分析技术所要求的浓度范围，也能够进行发光粒子的扩散系数的测量，所述特征在对医学/生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下是有利的。另外，在本发明的方法中，根据在一维的光强度数据上的周期性产生的发光粒子的信号的产生时刻来计算扩散系数，运算负荷比较低，期待计算一个发光粒子的扩散系数所需要的运算量或时间与SMT等使用图像处理的方法相比减少。
此外，在上述内容中，详细地说明了利用扫描分子计数法来测量扩散系数的例子，但是应该理解为能够根据信号的产生时间的间隔中的与光检测区域的移动周期偏移的偏移时间来计算扩散系数以外的扩散特性值，这种情况也属于本发明的范围。也可以例如计算粒子的位移的平方值相对于根据“信号的产生时间的间隔中的与光检测区域的移动周期偏移的偏移时间”计算出的时间的曲线的斜率、平移扩散时间，用于粒子的大小或构造变化、分子间相互作用的评价。

Claims (7)

1.一种使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来对在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的扩散特性值进行测量的方法，该方法的特征在于，包括以下步骤：
通过变更上述光学系统的光路，使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内沿着规定的路径周期性地移动；
一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动，一边测量来自上述光检测区域的光的强度来生成光强度数据；
在上述光强度数据上个别检测表示发光粒子的光的信号；
抽出所检测出的上述表示发光粒子的光的信号中的与同一发光粒子对应的多个信号；以及
根据所抽出的上述信号的产生时间的间隔中的与上述光检测区域的移动周期偏移的偏移时间，来计算与所抽出的上述信号对应的发光粒子的扩散特性值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
在计算上述扩散特性值的步骤中，根据与所抽出的上述信号对应的发光粒子的位移来计算上述扩散特性值，该发光粒子的位移是根据所抽出的上述信号的产生时间的间隔中的与上述光检测区域的移动周期偏移的偏移时间和上述光检测区域的移动速度计算出的。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所抽出的上述信号的产生时间的间隔是多个连续的所抽出的上述信号中的任意两个信号的产生时间的时间差。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
在抽出与上述同一发光粒子对应的多个信号的步骤中，将在以对所检测出的上述表示发光粒子的光的信号中的一个信号的产生时间加上上述光检测区域的周期得到的时间为中心、根据上述光检测区域的尺寸和移动速度而决定的时间宽度内所产生的信号判断为是与上述一个信号所对应的发光粒子相同的发光粒子的信号。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
在上述光强度数据上存在表示来自多个发光粒子的光的信号的情况下，针对上述多个发光粒子的各个发光粒子分别计算上述扩散特性值。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其特征在于，
上述扩散特性值是扩散系数。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，其特征在于，
上述光检测区域的位置以比上述样本溶液中的发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
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