JPH0715437B2 - フローサイトメーター用の生物細胞による散乱光測定装置 - Google Patents

フローサイトメーター用の生物細胞による散乱光測定装置

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JPH0715437B2
JPH0715437B2 JP61503733A JP50373386A JPH0715437B2 JP H0715437 B2 JPH0715437 B2 JP H0715437B2 JP 61503733 A JP61503733 A JP 61503733A JP 50373386 A JP50373386 A JP 50373386A JP H0715437 B2 JPH0715437 B2 JP H0715437B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、照明部に円錐形の暗視野を生成する中央視野
絞り手段を含む高開口数の顕微鏡対物レンズと、該暗視
野内に光開口部を有し、対物面が一次顕微鏡対物レンズ
の対物面と共通となっている二次顕微鏡対物レンズとか
らなるフローサイトメータにおいて生物細胞または生物
微粒子の光散乱の２つの角度成分を同時に測定する装置
に係る。
更に詳細には、本装置は、生物細胞その他の顕微鏡的微
粒子が１つずつフローサイトメータの測定域を通るとき
に２種の異る光散乱角度領域で生物細胞または顕微鏡的
微粒子の光散乱の測定を容易にする。それぞれの角度領
域内での光散乱は、細胞／微粒子の種々の特性、すなわ
ち、或る場合にはサイズ（体積）、また別の場合には超
顕微鏡的構造に依存するので、このような装置はこれら
の特性に関して異なった細胞／微粒子を特徴付け、確認
するのに使用することができる。
フローサイトメトリとは、細胞生物学や医学の種々の分
野ならびにほとんどすべての物質の非生物学的微粒子の
測定にわたって広汎な用途を持つ測定法である。フロー
サイトメータでは、顕微鏡サイズの個々の微粒子からの
測光信号が、微粒子が流体の層流によつて運ばれて高輝
度の励起光の焦点を１つずつ通るときに測定される。こ
れら微粒子はいわゆるハイドロダイナミック・フオーカ
シングによって液体の流れの中に寄せ集められる。測定
され得る測光信号とは、１）細胞／微粒子の蛍光、２）
細胞／微粒子の光散乱、３）細胞／微粒子の光吸収であ
る。特に、これらのタイプの信号のうち前の２つのタイ
プの信号が非常に有益であることが証明されている。
フローサイトメータの代表的な応用例としては、個々の
細胞の種々の成分、たとえば、DNAやタンパク質の含有
量を測定する方法がある。そのために、細胞はそれぞれ
の成分と特別にかつ定量的に結合する蛍光染料で染色す
る。したがって、本装置の励起焦点を通る各細胞は蛍光
パルスを発する。この光が適当な光学機器で集光され、
光検知器で記録される。細胞の染料量に比例し、したが
ってそれぞれの細胞成分に比例したこの検出器からの電
気パルスが測定され、電子メモリ（いわゆる多チャンネ
ル波高分析器）におしてサイズに従って測定、記憶され
る。こうして、１秒間あたり数千個の細胞を高精度で測
定できる。細胞数をそれぞれの成分の含有量の関数とし
て示すヒストグラムが蓄積される。
本装置の焦点を通過するときに細胞によつて散乱される
励起光は２次検知器で記録され得る。散乱角に依存し
て、この信号は細胞の横断面すなわち体積およびその構
造や密度についての情報を伝える。
或る種のフローサイトメータでは、励起光はレーザで発
する。微粒子を運ぶ流体の流れはレーザビームを通過す
る。微粒子の放つ蛍光と散乱光は、レーザビームの側方
に設置した２つの別々の光学系で検知される。或る種の
このようなフローサイトメータでは、流れは空気の噴流
である。他の装置では、流体の流れは密閉室を通る。
このようなフローサイトメータでは、光散乱は、レーザ
ビームに対して異なった角度で設置した検知器によって
大小の散乱角の両方で測定され得る。生物細胞（直径１
〜30ミクロン）と同様のサイズおよび屈折率を持つ微粒
子の場合、散乱角の小さい光散乱は微粒子表面からの屈
折力によって支配されるので、微粒子のサイズの尺度を
見なすことができる。一方、約10°より大きい角度での
光散乱は光の波長よりも小さいサイズを有する構造と組
み合わされることになる。このようなフローサイトメー
タにおける大小両散乱角の光散乱を同時に測定すること
は、異つた種類の生物細胞、特に異種白血球細胞を識別
する方法として極めて有用であることは証明されてい
る。
或る異なったタイプのフローサイトメータでは、代表的
には水銀灯を含む高圧アーク灯を用いて励起光を発生し
ている。このような機器は、レーザを用いる機器よりも
安価であるという事実に加えていくつかの重要な利点を
有する。しかしながら、このようなランプベースのフロ
ーサイトメータでは、異なる散乱角領域における光散乱
を測定することはできなかった。これは、励起光が高い
開口数を持つ顕微鏡を通して搬送され、フローチヤンバ
が光散乱の測定を許さないという事実による。
公知のフローチヤンバ（ノルウェー国特許第144002号）
を暗視野検知用の新しいシステム（ノルウェー国特許第
145176号）と組合せたとき、ランプ型フローサイトメー
タにおいても光散乱の測定が可能となる。本発明はこの
システムを更に発展させて２種の異る散乱角領域におけ
る光散乱の同時検知を容易にするものである。
本発明は、生物細胞の光散乱について３つの特性に基づ
くものである。すなわち、１）小さい散乱角（＜10°）
での散乱光の強さが他のすべての角度での合計強さより
も大きいという特性と、２）小さい散乱角の散乱光が主
として細胞表面（輪郭）からの回折によつて発生すると
いう特性と、３）より大きな散乱角（＞15°）での光散
乱が超顕微鏡的構造、すなわち、光の波長より小さい構
造からの散乱では優勢となり、この光散乱が散乱角とは
ほぼ無関係であるという特性とに基づく。
本発明によれば、冒頭に述べた装置は、暗視野が望遠鏡
10によって２次対物レンズ１の結像面の後に再生され、
この暗視野の中央部分の光が鏡によって光検知器に向か
って反射され、それによって、別の光検知器に達する前
記暗視野の周辺部分の光から分離されることを特徴とす
る。
本発明による装置のさらなる特徴は、請求の範囲および
添付図面を参照した以下の説明から明らかとなろう。
第１図は、本発明に基く装置がどのようにして２種の異
なった散乱角領域において検出を可能とするかを示して
いる。
第２図は、異なった散乱角からの光を異つた暗視野部分
がどのようにして阻止するかを示している。
光散乱は、微粒子流６にランプ５からの励起光を合焦さ
える１次顕微鏡対物レンズ４の暗視野形成部３（中央視
野絞り手段）により生じる暗視野内を２次顕微鏡対物レ
ンズ１を通して測定される。この２次顕微鏡対物レンズ
１は微粒子流上に焦点を有し、微粒子流の像がスリット
７上に形成される。スリット７は、対物面の、微粒子流
を含まない部分からの光を排除し、測定値における信号
対ノイズ比を高める。微粒子流６の暗視野像すなわち散
乱光内に見られる微粒子流が接眼れず９を通して観察で
きるようにスリット７の後に45°鏡８を挿入してもよ
い。これらすべてはノルウェー特許第145176号に記載さ
れており、このノルウェー特許はスリット７のすぐ後に
設けた光検知器も記載している。
第２図に示すように、視野絞り３は、微粒子流（６）内
で測って角度α１で広がる暗視野を生じさせ、一方、開
口は角度α２で広がっている。視野絞り（３）の寸法
は、α１がα２よりも１〜２°大きくなるようにしてあ
る。α２は、二次対物レンズ１の開口数によって決ま
る。二次対物レンズ１にとって適当な開口数はN.A.＝0.
4であり、これはα２＝18°を与える。第２図からわか
るように、暗視野の異なった部分は異なった散乱角の光
を阻止する。暗視野の周辺部分は、α０−α１からα０
＋α１の角度範囲にわたって散乱した光を阻止し、暗視
野の中央部分（光軸のすぐまわりの領域、α３）はα１
からα０の角度に散乱した光りを阻止する。
スリット７の背後に設けた望遠鏡10は、対物レンズ１の
開口（瞳孔）の像を無限遠のところに生成する。このこ
とは、望遠鏡10を出た円錐形の光線12が暗視野２を再生
することを意味する。したがって、光線12内の光の強さ
の角度分布が暗視野２の角度分布と一致することにな
る。約15°よりも大きい角度に散乱した光を含む光束12
の中央部分が対物レンズ１の光軸と45°の角度をなす鏡
13によって光束12の残部から分離される。この鏡上に達
した光は光検知器14に向かって反射され、この光検知器
14は約15°よりも大きい角度に散乱した光を測定する。
同時に、残りの光は他の検知器15に達し、この検知器は
主として小さい角度に散乱した光を検知する。フローサ
イトメータの測定域を通る各細胞／微粒子は、こうし
て、２つの検知器14、15のそれぞれからの電気パルスを
生じさせることになる。これらのパルスは本発明の目的
である散乱光の２つの成分を表わしている。
図面の簡単な説明 第１図は、本発明に基く装置がどのようにして２種の異
なった散乱角領域において検出を可能とするかを示して
いる。
第２図は、異なった散乱角からの光を異つた暗視野部分
がどのようにして阻止するかを示している。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生物細胞または微粒子からの光散乱の２つ
    の角度成分を同時に測定するフローサイトメータ装置で
    あって、高い開口数の一次顕微鏡対物レンズ（４）を包
    含し、この対物レンズがその照明視野内に暗視野（２）
    を生成する中央視野絞り手段（３）を包含し、さらに、
    前記暗視野内に開口（瞳孔）を有しかつ一次顕微鏡対物
    レンズ（４）の対物面と共通の対物面を有する二次顕微
    鏡対物レンズ（１）を包含するフローサイトメータ装置
    において、前記暗視野（２）が望遠鏡（10）によって二
    次顕微鏡対物レンズ（１）の結像面の背後に再生され、
    前記暗視野の中央部が鏡（13）によつて第１光検知器
    （14）に向かって反射され、別の光検知器（15）上に達
    した前記暗視野の周辺部における光から分離されるよう
    にしたことを特徴とするフローサイトメータ装置。
  2. 【請求項２】請求の範囲第１項に記載されたフローサイ
    トメータ装置において、暗視野部（２）が顕微鏡対物レ
    ンズ（１、４）の光軸と共通の対称軸を持ち、暗視野部
    （２）がこの対称軸のまわりに少なくとも15°の角度で
    広がっていることを特徴とするフローサイトメータ装
    置。
  3. 【請求項３】請求の範囲第１項に記載されたフローサイ
    トメータ装置において、顕微鏡対物レンズ（４）が、流
    体の顕微鏡的層流によって運ばれる生物細胞または微粒
    子が通る対物面に向かって強い光源（５）からの光を合
    焦することを特徴とするフローサイトメータ装置。
  4. 【請求項４】請求の範囲第１項に記載されたフローサイ
    トメータ装置において、調節可能なスリット（７）が前
    記対物レンズ（１）の結像面に設けてあり、このスリッ
    ト（７）が、微粒子流の像を含む対物レンズ（１）によ
    って生じた像の部分を引き受けるように設定してあり、
    微粒子流が対物レンズ（１、４）の共通の光軸を通過す
    ることを特徴とするフローサイトメータ装置。
  5. 【請求項５】請求の範囲第１項に記載されたフローサイ
    トメータ装置において、前記顕微鏡対物レンズ（１）の
    対物面から見て入射側の開口（瞳孔）（11）が、暗視野
    （２）によつて拡大される角度よりも１〜２°小さい角
    度（α２）にわたって広がり、この角度（α２）が前記
    暗視野（２）内に完全に納まっていることを特徴とする
    フローサイトメータ装置。
  6. 【請求項６】請求の範囲第１項に記載されたフローサイ
    トメータ装置において、望遠鏡（10）がスリット（７）
    の背後に位置し、拘束（12）が発する望遠鏡内後の無限
    遠点のところに対物レンズ（１）の開口（瞳孔）の像を
    生成し、光の強さの角度分布が暗視野部（２）内に観察
    され得る角度分布と正確に一致するようにしたことを特
    徴とするフローサイトメータ装置。
JP61503733A 1985-07-16 1986-07-11 フローサイトメーター用の生物細胞による散乱光測定装置 Expired - Fee Related JPH0715437B2 (ja)

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NO852836A NO156917C (no) 1985-07-16 1985-07-16 Anordning for maaling av biologiske cellers lysspredning i vaeskestroemsfotometere.
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JPS63500334A JPS63500334A (ja) 1988-02-04
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