DE69629750T2 - Teilchenanalysator mit einem aus zwei räumlich getrennten Elementen bestehenden optischen Filter - Google Patents

Teilchenanalysator mit einem aus zwei räumlich getrennten Elementen bestehenden optischen Filter Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft optische Instrumente und insbesondere Instrumente zum Unterscheiden von Partikeln nach optischen Effekten, die auftreten, wenn die Partikel beleuchtete Stellen passieren. Eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Fluoreszenzüberlappungen in einer Multi-Laser-Fluoreszenzanalysevorrichtung zu verringern.
  • Testlabore müssen in der Lage sein, das Vorhandensein bestimmter Einheiten, beispielsweise Antigene, zu erkennen, deren direkte Erkennung schwierig ist. In einigen Fällen können die Einheiten mit erkennbaren Fluorchromen markiert werden. Beispielsweise kann der Antikörper für ein Antigen mit Hilfe eines Fluorchroms derivatisiert werden. Der derivatisierte Antikörper kann mit einer Blutprobe gemischt werden. In dem Maß, in dem ein Antigen in einer Zelle vorhanden ist, bindet sich der Antikörper daran und macht es fluoreszierend. Die markierten Zellen können in ein Zytometriesystem eingeleitet werden, in dem sie mit monochromatischer Strahlung, beispielsweise von einem Laser, beleuchtet werden, welche das Fluorchrom erregt. Ein Photodetektor kann sodann die Intensität der fluoreszierenden Emissionen erkennen.
  • Es ist oft erforderlich, Zellen mit einer bestimmten Kombination von Antigenen zu identifizieren. Zu diesem Zweck können mehrere Antikörper mit jeweiligen Fluorchromen derivatisiert werden; die derivatisierten Antikörper werden mit der Blutprobe unter Bedingungen gemischt, die für das Binden der Antikörper an die jeweiligen Antigene ausreichend sind. Die Zellen werden sodann beleuchtet, und die sich ergebenden fluoreszierenden Emissionen werden erkannt und gemessen.
  • Soweit möglich, sind die Fluorchrome mit unterschiedlichen Emissionsspektren gewählt. Eine typische Fluoreszenzanalysevorrichtung kann einen blauen Laser zum Erregen von Fluorchromen aufweisen, die grünes, gelbes bzw. rotes Licht emittieren. Dichroitische Spiegel oder andere Wellenlängen dispergierende Elemente können die Emissionen in grüne, gelbe und rote Strahlen teilen, welche auf jeweilige Photodetektoren gerichtet werden. In der Praxis ist es aufgrund der Überlappungen der Emissionsspektren schwierig, mehr als drei Fluorchrome allein anhand der Wellenlänge zu unterscheiden.
  • Die Zahl der unterscheidbaren Fluorchrome kann durch Verwenden von mehr als einer Erregungswellenlänge erhöht werden. Dieser Ansatz nutzt die Tatsache, daß Fluorchrome sich nicht nur in ihren Emissionsspektren, sondern auch in ihren Erregungsspektren unterscheiden. In einem Idealfall können zwei Fluorchrome mit nicht-überlappenden Erregungsspektren unterschieden werden, selbst wenn die Emissionsspektren identisch sind. Diese Unterscheidung kann erreicht werden, indem die Fluorchrome zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit zwei Lasern beleuchtet werden, von denen jeder zum Erregen nur eines der Fluorchrome gewählt ist. Die resultierenden Emissionen erscheinen als zwei unterschiedliche Signalimpulse im Ausgang eines einzelnen Photodetektors.
  • Dieser Ansatz wird in Zusammenhang mit einem Durchflusszytometriesystem verwendet, indem verschiedene Stellen entlang des Durchflussrohrs mit unterschiedlichen Laserwellenlängen beleuchtet werden, von denen jede vorzugsweise ein jeweiliges Fluorchrom erregt. Markierte Zellen strömen an den beiden Stellen mit ausreichend geringer Häufigkeit vorbei, so daß üblicherweise jeweils nur eine Stelle zu jedem Zeitpunkt belegt ist. Wenn sich eine Zelle an der ersten Stelle befindet, entspricht der Photodetektorimpuls dem ersten Fluorchrom; wenn sich die Zelle später an der zweiten Stelle befindet, entspricht der Photodetektorimpuls dem zweiten Fluorchrom. Da die Fluorchrome in der Zeitdomäne unterscheidbar sind, kann ein einzelner Photodetektor zum Erkennen der Emissionen beider Fluorchrome verwendet werden.
  • Zytometriesysteme, bei denen ein einzelner Photodetektor zum Erkennen von Emissionen verwendet wird, die aus räumlich und hinsichtlich der Wellenlänge getrennten Erregungen bestehen, sind offenbart oder vorgeschlagen durch: 1) Donna J. Arndt-Jovin, Brian G. Grimwade, und Thomas M. Jovin, "A Dual Laser Flow Sorter Utilizing a CW Purnped Dye Laser", Cytometry Vol. 1, Nr. 2, 1980, pp 127–131; 2) Eugene Hamori, Donna J. Arndt-Jovin, Brian G. Grimwade und Thomas M. Jovin, "Selection of Viable Cells with Known DNA Content", Cytometry Vol. 1, Nr. 2, 1980, pp 132–1352; und 3) Julianne Meyne, Marty F. Batholdi, Gayle Travis und L. Scott Cram, "Counterstaining Human Chromosomes for Flow Karyology", Cytometry, Nr. 5, 1984, pp 580–583. Die letztgenannte Veröffentlichung offenbart ein Zytometriesystem, bei dem das von jedem von zwei Laserbeleuchtungspunkten emittierte Licht durch einen einzelnen Photodetektor erkannt wird. Das Erregungslicht wird durch Blockieren sämtlicher Wellenlängen, die kleiner als 495 nm sind, unter Verwendung eines einfachen Begrenzungsfilters blockiert.
  • In einem Ausführungsbeispiel, das HO und CA2 Markierungen verwendet, weisen die Fluorchrome überlappende Erregungs- und Emissionsspektren auf. Dieses Dokument offenbart sämtliche Merkmale des Oberbegriffs des Anspruchs 1.
  • US-A-4 172 227 offenbart ein Durchfluss-Mikrolluormeter zum Messen der Fluoreszenzintensität eines Partikels als Funktion der Wellenlänge. Durch den Lichtstrahl laufende Zellen werden fluoreszenzaktiviert. Das Bild der Zelle wird auf ein Keilfilter projiziert. Die von dem Filter übertragene Strahlung wird von einer Sammellinse auf eine Photovervielfältigerröhre fokussiert. Passiert eine Zelle den Strahl, werden sukzessive längere Wellenlängenbereiche des Emissionsspektrums auf die Photovervielfältigerröhre fokussiert. Dadurch wird ein zeitlich variierendes Signal erzeugt, dessen Zeitachse proportional zur Wellenlänge ist. Dies ist ein Verfahren zum Abtasten des gesamten Fluoreszenzemissionsspektrums von Zellen.
  • US-A-4 243 318 offenbart eine Fluoreszenzanalyse unter Verwendung zweier Laserstrahlen mit unterschiedlichen Wellenlängen, wobei die Laserstrahlen von den strömenden Partikel gekreuzt werden. Die Fluoreszenzimpulse, die von den beiden Punkten auf der Basis des Abstands zwischen den beiden Punkten und der Fleißgeschwindigkeit des Stroms ausgehen, werden zum Auswerten lediglich der Impulse verwendet, die der Laufzeit einzelner Partikel zwischen den beiden Punkten entsprechen. Die stellt eine Zeitfilterung von Erkennungsimpulsen dar.
  • In der Praxis kann jedes Fluorchrom durch die Erregungsfrequenz schwach erregt werden, welche ein anderes Fluorchrom stark erregt. Somit kann jedes Fluorchrom "Überlagerung" zum elektrischen Impuls beitragen, der in dem dem anderen Fluorchrom zugewiesenen Zeitschlitz auftritt, was zu falschen Werten führt. Diese Überlagerung kann durch Verwenden zweier Photodetektoren verringert werden, die jeweils zum Empfangen von Emissionen von lediglich einer der Erregungsstellen angeordnet sind. Dies bringt jedoch die erheblichen Kosten und das größere Volumen mit sich, die durch einen zusätzlichen Photodetektor verursacht werden.
  • Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Analysesystem zu schaffen, das Überlagerungen zwischen Fluorchromen, die im wesentlichen überlappende Emissionsspektren und geringfügig überlappende Erregungsspektren aufweisen, zu verringern, ohne einen zusätzlichen Photodetektor zu erfordern.
  • Überblick über die Erfindung
  • Das Analysesystem nach der vorliegenden Erfindung ist durch Anspruch 1 definiert.
  • Im folgenden wird die Erfindung primär im Zusammenhang mit der Fluoreszenzanalyse von Partikeln in einem Durchflusszytometriesystem beschrieben. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die Erfindung auch auf Streulichterkennung, Absorptivitätserkennung, etc. anwendbar ist. Ferner ist die vorliegende Erfindung auf Abtastmikroskope anwendbar, bei denen die Beleuchtungsquelle relativ zu stationären Partikeln bewegt wird, sowie auf Durchflusszytometriesysteme, die Partikel relativ zu stationären Lichtquellen bewegen.
  • Das geteilte Filter des Systems weist ein erstes Filterelement auf, das vorzugsweise Fluoreszenz von einem Fluorchrom leitet, das von der ersten Laserwellenlänge stark erregt wird, während es Fluoreszenz eines von der zweiten Laserwellenlänge stark erregten zweiten Fluorchroms relativ dämpft. Das optische Subsystem richtet Strahlung von der ersten Erregungsstelle durch das erste Filter auf den Photodetektor, während es Strahlung von der zweiten Erregungsstelle derart richtet, daß sie den Photodetektor erreicht, ohne das erste Filterelement zu passieren.
  • Das geteilte Filter weist ein zweites Filterelement auf, um den Beitrag des ersten Fluorchroms zu dem dem zweiten Fluorchrom entsprechenden Photodetektorausgangsimpuls zu minimieren. Zu diesem Zweck richtet das optische Subsystem verhältnismäßig mehr der Fluoreszenz von der zweiten Stelle durch das zweite Filterelement und verhältnismäßig weniger der Fluoreszenz von der ersten Stelle durch das zweite Filter. Die Anordnung kann erreicht werden, indem optische Elemente verwendet werden, welche die beiden Erregungsstellen an den jeweiligen Filterelementen abbilden. Ein Raum filter kann mit Öffnungen an oder nahe der Bildebene angeordnet werden, um die Bilder der beiden Stellen lokalisieren zu helfen.
  • Während die Trennung der Emissionen nicht perfekt sein muss, sollten die meisten der von der ersten Stelle zum Photodetektor laufenden Emissionen das erste Filterelement passieren; gleichermaßen sollten mehr von der zweiten Stelle zum Photodetektor kommende Emissionen am ersten Filterelement vorbei laufen als dieses passieren. Infolgedessen sollte die Dämpfung des zweiten Fluorchroms in bezug auf das erste Fluorchrom in den Emissionen (gefiltert durch das erste Filterelement) von der ersten Stelle zum Photodetektor stärker sein als die Dämpfung des zweiten Fluorchroms relativ zum ersten Fluorchroms in den Emissionen (welche das Filterelement umgehen) von der zweiten Stelle zum Photodetektor.
  • Die vorliegende Erfindung kann zum Unterscheiden der vier Fluorchrome APC, PerCP, FITC und RPE verwendet werden, wobei PerCP, FITC und RPE durch Strahlung mit einer Wellenlänge um 498 nm stark erregt wird, während APC von Strahlung mit einer Wellenlänge um 635 nm stark erregt wird. Es wird ein einziger Photodetektor zum Erkennen von APC und PerCP verwendet. Die Filterelemente des geteilten Filters minimieren die Überlagerung zwischen diesen Fluorchromen. Eine Fünf-Wege-Unterscheidung kann unter Verwendung der Fluorchrome APC, PerCP, FITC, CUPE und BPE erreicht werden, indem 532 nm Erregungsstrahlung hinzugefügt wird, welche vorzugsweise BPE erregt. Ein geteiltes Filter vor dem zweiten Photodetektor verringert die Überlagerung zwischen CUPE und BPE.
  • Bekannte Systeme sehen Emissionen vor, die durch räumlich getrennte Erregungsstrahlen erzeugt und durch einen einzigen Photodetektor erkannt werden, um bei der Erkennung unterschieden zu werden. Jedes der beiden von dem einzigen Photodetektor zu erkennenden Fluorchrome wird von einem jeweiligen Laserstrahl stark erregt und von dem anderen Laserstrahl schwach erregt. Die schwache Erregung resultiert jedoch in Überlagerungen im Photodetektorausgang. Eine Signalanalysevorrichtung kann die Überlagerungen durch digitale und/oder analoge Signalverarbeitung kompensieren. Die Möglichkeiten der Nachbearbeitung sind jedoch begrenzt und es gibt keinen Ersatz für das Beginnen mit Impulsen, die relativ frei von Überlagerungen sind.
  • Die vorliegende Erfindung minimiert die Überlagerungen durch Anwenden separater Wellenlängenfilter auf die Emissionen der beiden Erregungsstellen. Die Erfindung unterscheidet derartige Emissionen sowohl durch die Emissionswellenlänge, als auch durch die Zeit. Dieser Ansatz kann die Notwendigkeit einer Nachbearbeitung verringern, um so die Analyse zu beschleunigen und/oder bessere Anfangsdaten an den Signalprozessor zu liefern, so daß die Endergebnisse genauer sind.
  • Die Kombination der Zeit- und Wellenlängenunterscheidung der aus räumlich getrennten Erregungen resultierenden Fluoreszenz verbessert die Unterscheidung der resultierenden Signale durch einen einzelnen Photodetektor. Die vorliegende Erfindung schafft eine verbesserte Zurückweisung der sekundären Erregung, wenn zwei oder mehr Fluorchrome mit schwach überlappenden Erregungsspektren verwendet werden, selbst bei (mäßig) überlappenden Emissionsspektren. Diese verbesserte Zurückweisung wird ökonomisch erreicht, ohne daß ein zusätzlicher Photodetektor erforderlich wäre. Die Analyse des Photodetektorausgangssignals bleibt unverändert, mit der Ausnahme, daß weniger Aufmerksamkeit auf Überlagerungen zwischen den Emissionen der beiden Fluorchrome gelegt werden muß. Diese und andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Zeichnungen.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Durchflußzytometriesystems.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele
  • Erfindungsgemäß weist ein Durchflußzytometriesystem FCS zum Charaktersieren einer Blutzelle CEL eine Erregungsquelle EXS mit Lasern LZ1 und LZ2, ein Durchflußsubsystem FLS, eine Sammellinse COL, eine dichroitische Spiegelanordnung DMA, drei (rot, gelb, grün) Detektoranordnungen DAR, DAY, DAG und eine Signalanalysevorrichtung SGA auf, wie in 1 dargestellt. Die Detektoranordnung DAR weist ein Raumfilter SFF mit zwei Öffnungen AP1 und AP2, ein geteiltes Wellenlängenfilter SWF mit einem Tiefbandpassfilterelement LBF und einem Hochbandpassfilterelement HBF, und einen Photodetektor PHD auf. Die Detektoranordnungen DAY und DAG weisen jeweils ein Raumfilter mit einer Öffnung und einen Photodetektor auf. Die Augänge der drei Photodetektoren sind mit einer Signalanalysiervorrichtung SGA verbunden.
  • Eine Funktion des Durchflußzytometriesystems FCS ist es, festzustellen, welches, wenn überhaupt eines, von vier Antigenen in Blutzellen, einschließlich der Zelle CEL, vorhanden ist. Zu diesem Zweck werden jeweilige Antikörper für die Antigene mit den jeweiligen Fluorchromen Allophycocyanin (APC), Peridininchlorophyllprotein (PerCP), Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) und R-Phycoerythrin (RPE). Die Blutzellen werden mit eine Mischung dieser derivatisierten Antikörper unter Bedingungen inkubiert, die für ein Binden der Antikörper an die jeweiligen Antigene ausreichend sind, um so die Blutzellen zu markieren. Ungebundene Antikörper können weggewaschen werden. Die markierten Blutzellen werden sodann seriell in einem an den Erregungsstellen LC1 und LC2 vorbeifließenden Strom bewegt.
  • Um die mit Fluorchrom markierten Zelle zu erregen, liefern die Laser LZ1 und LZ2 hoch monochromatisches Licht an die jeweiligen Erregnungsstellen LC1 und LC2, die ungefähr 120 Mikrometer voneinander entfernt sind. Der Laser LZ1 ist ein Diodenlaser, der rote Strahlung mit 635 nm liefert. Alternativ kann rote Strahlung mit 633 nm von einem teureren Helium-Neon-Laser für einen stärker brechungsbegrenzten Strahl geliefert werden. Der Laser LZ2 ist ein Argonionenlaser, der blaue Strahlung mit 488 Nanometer (nm) liefert. Zwar ist es zu Illustrationszwecken anders dargestellt, jedoch sind die Laser LZ1 und LZ2 vorzugsweise senkrecht zu der Richtung gerichtet, in der Emissionen erkannt werden, um Rauschen in den Erkennungssignalen zu minimieren.
  • Wenn die Zelle CEL die Erregungsstelle LC1 des Durchflußsystems FLS erreicht, erregt die einfallende rote Erregungsstrahlung des Lasers LZ1 jegliches vorhandene APC Fluorchrom stark; jedes vorhandene PerCP, RPE und FITC Fluorchrom wird höchst schwach erregt. Wenn die Zelle CEL die Erregungsstelle LC2 erreicht, erregt die blaue Erregungsstrahlung des Lasers LZ2 jedes vorhandene PerCP, FITC und RPE Fluorchrome stark und jedes vorhandene APC Fluorchrom schwach.
  • Die Emissionen werden von einer Sammellinse COL gesammelt und der dichroitischen Spiegelanordnung DMA zugeführt. Die dichroitische Spiegelanordnung DMA weist im Grunde zwei dichroitische Spiegel auf. Der erste lässt Strahlung unter 560 nm an die Grün-Detektoranordnung DAG durch und reflektiert Strahlung über 560 nm an den zweiten dichroitischen Spiegel, der zweite dichroitische Spiegel lässt Strahlung über 640 nm an die Rot-Detektoranordnung DAR durch und reflektiert Strahlung unter 640 nm an die Gelb-Detektoranordnung DAY.
  • Die FITC Fluoreszenz, die eine Emissionsspitze bei 520 nm hat, wird daher primär von der Stelle LC2 an die Grün-Detektoranordnung DAG geleitet; RPE Fluoreszenz, die eine Emissionsspitze bei 570 nm aufweist, wird primär von der Stelle LC2 an die Gelb-Detektoranordnung DAY geleitet; PerCP Fluoreszenz, die eine Emissionsspitze bei 675 nm hat, wird primär von der Stelle LC2 an die Rot-Detektoranordnung DAR geleitet; und APC Fluoreszenz, die eine Emissionsspitze bei 660 nm hat, wird primär von der Stelle LC1 an die Rot-Detektoranordnung DAR geleitet.
  • Die Sammellinse COL ist zum Abbilden der Zelle CEL angeordnet, während sich diese an der Stelle LC1 in der Öffnung AP1 befindet, so daß die rote (primär APC) Fluoreszenz von der Stelle LC1 durch das Tiefbandpassfilterelement LBF gefiltert wird, bevor sie auf den Photodetektor PHD fällt. Gleichermaßen ist die Sammellinse COL derart angeordnet, daß sie die Zelle CEL abbildet, während sich diese an der Stelle LC2 in der Öffnung AP2 befindet, so daß die rote (primär APC) Fluoreszenz von der Stelle LC2 durch das Hochbandpassfilterelement HBF gefiltert wird, bevor sie auf den Photodetektor PHD fällt. Die Sammellinse COL bewirkt eine ungefähr 14-fache Vergrößerung, so daß die Mittelpunkte der Öffnungen AP1 und AP2 1,7 Millimeter (mm) voneinander beabstandet sind. Die Weite der Öffnungen AP1 und AP2 beträgt 1,0 mm.
  • Das Tiefbandpassfilterelement LBF hat eine Ober-Grenzfrequenz von ungefähr 670, nahe dem Übergang der APC und PerCP Emissionsspektren. Daher werden PerCP Emissionen von der Stelle LC1 in bezug auf APC Emissionen von der Stelle LC1 gedämpft. Das Tiefbandpassfilter LBF hat eine Unter-Grenzfrequenz von ungefähr 650 nm, um Streuerregung vom roten Laser LZ1 auszuschließen.
  • Das Hochbandpassfilterelement HBF hat eine Unter-Grenzfrequenz von ungefähr 670 nm, nahe dem Übergang der APC und PerCP Emissionsspektren. Daher werden APC Emissionen von der Stelle LC2 in bezug auf PerCP Emissionen von der Stelle LC2 gedämpft. Das Hochbandpassfilterelement HBF hat eine Ober-Grenzfrequenz von ungefähr 700 nm, um Hintergrundrauschen bei Wellenlängen, die länger als diejenigen im Emissionsspektum PerCP sind, zu minimieren. In der Praxis ist Rauschen in diesem Bereich schwach, so daß ein Hochpassfllter anstelle des Hochbandpassfilterelements HBF verwendet werden kann.
  • Wenn die Zelle CEL sich an der Erregungsstelle LC1 befindet, wird jede ACP Fluoreszenz durch die Rot-Detektoranordnung DAR erkannt, während jede PerCP Überlagerung durch das Tiefbandpassfilterelement LBF reduziert wird. Befindet sich die Zelle CEL an der Erregungsstelle LC2 wird jede PerCP Fluoreszenz von der Rot-Detektoranordnung DAR stark erkannt, während jede APC Überlappung durch das Hochbandpassfilterelement HBF reduziert wird. Jede FITC oder RPE Emission wird jeweils durch die Detektoranordnungen DAG und DAY erkannt.
  • Die Signalanalysevorrichtung SGA analysiert die Ausgangssignale der Detektoranordnungen DAR, DAY und DAG, um Fluorchrome in vorbeiströmenden Zellen wie der Zelle CEL zu identifizieren und zu quantifizieren. Das Durchflusszytometriesystem FCS weist Streudetektoren an der Stelle LC1 auf, welche das Vorhandensein einer Zelle erkennen, ungeachtet ihrer Fluoreszenz. Diese Erkennung kann von der Signalanalysevorrichtung SGA als Referenz für zeitlich erkannte Impulse verwendet werden, um Impulse zu unterscheiden, die aus der Erregung an den verschiedenen Erregungsstellen resultieren. (Darüber hinaus können die Streuimpulse analysiert werden, um die Größe und die Granularität zu bestimmen). Optional können die Impulse wie im Stand der Technik korrigiert werden, jedoch in geringerem Maß, um Fluorchrom-Überlagerungen zu kompensieren, die durch das geteilte Filter SPW nicht eliminiert wurden.
  • Die vorangehende Beschreibung betrifft eine Vier-Wege-Unterscheidung von Fluorchromen. Mit dem folgenden Modifikationen kann auch eine Fünf-Wege-Unterscheidung durchgeführt werden. Ein dritter Laser LZ3, der stromaufwärts des ersten Lasers LZ1 angeordnet ist, liefert grüne Erregungsstrahlung mit 532 nm an eine dritte Erregungsstelle entlang des Durchflußsubsystems FLS; der Laser LZ3 ist ein frequenzverdoppelter Neodymium-Yttrium- Aluminium-Granat(NdYAG)-Laser. Die fünf Fluorchrome sind FITC, CU-Phycoerythrin (CUPE), B-Phycoerythrin (BPE), APC und PerCP. BPE wird vom grünen Laser LZ3 stark erregt, während CUPE, wie BPE, vom blauen Laser LZ2 stark erregt wird. Ein zweites geteiltes Filter ist vor der Grün-Detektoranordnung DAG angeordnet, um gegenseitige Überlagerung zwischen CUPE und BPE zu verringern. Ein mit zwei Öffnungen versehenes Raumfilter ersetz das eine Öffnung aufweisende Raumfilter vor der Detektoranordnung PDG.
  • Die Sammellinse COL bildet jeweils die erste Erregungsstelle LC1 und die dritte Erregungsstelle in diesen Öffnungen ab. Somit werden gelbe, vorwiegend BPE Emissionen von der dritten Erregungsstelle durch ein Tiefbandpassfilterelement transmittiert, während gelbe, vorwiegend CUPE Emissionen von der zweiten Erregungsstelle LC2 durch ein Hochbandpassfilter transmittiert werden. Das Tiefbandpassfilter hat einen Bereich von 540, um grüne Erregungsstrahlung zu dämpfen, bis 565, um BPE zugunsten von LUPE zu dämpfen. Das Hochbandpassfilter hat einen Bereich von 565, um CUPE zugunsten von BPE zu dämpfen, bis 620, um Umgebungserregungsstrahlung von roten Laser LZ1 auszufiltern. Somit wird gegenseitige BPE/CUPE Überlagerung auf die gleiche Weise reduziert wie gegenseitige APC/PerCP Überlagerung.
  • Das Durchflußzytometriesystem FCS kann nicht nur für das Erkennen von Antigenen, sondern für das Erkennen jeglicher fluoreszierender Partikel, einschließlich anderer Liganden mit daran haftenden fluorchrom-derivatisierten Ligandenbindern, verwendet werden. Die im Stand der Technik genannten Dokumente geben Beispiele für alternative fluoreszierende Partikel an.
  • Im bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung trennen dichroitische Spiegel Strahlen nach der Wellenlänge. Alternative Ausführungsbeispiele verzichten auf die dichroitischen Spiegel und verwenden die geteilten Filter elemente und andere Bandpassfilter, um Emissionen zurückzuweisen, die für den jeweiligen Photodetektor nicht bestimmt sind.
  • Die Anzahl der Fluorchrome, die durch die vorliegende Erfindung unterschieden werden Können, kann auf verschiedene Weise erhöht werden. Es können im Prinzip mehr Photodetektoren verwendet werden, um mehr Fluorchrome mit nur schwach überlappenden Emissionen unterscheiden zu können. Es können mehr Filterelemente pro geteiltem Filter (und mehr Öffnungen pro Raumfilter) verwendet werden, um mehr Fluorchrome pro Photodetektor zu unterscheiden, wenn zumindest eine gleiche Anzahl von Erregungsquellen mit gleicher oder unterschiedlicher Wellenlänge verwendet wird. Beispielsweise können FITC, BPE und APC durch drei (blaue, grüne, rote) Laser erregt und durch einen einzigen Photodetektor mit einem dreifach geteilten Filter erkannt werden. Ähnlich können FITC, RPE und PerCP können durch drei blaue Laser erregt werden. Ferner kann ein höherer Prozentanteil von Photodetektoren zum Erkennen mehrerer Fluorchrome verwendet werden. Eine größere Auflösung der Fluorchrome kann durch das Korrelieren von Photodetektorausgangssignalen erreicht werden.
  • Anstelle von voluminösen Filterelementen kann Faseroptik zum Leiten von Emissionen zwischen Erregungsstellen und Photodetektoren verwendet werden. Durch Filtern der Emissionen vor dem Eintritt in die Fasern oder durch Filtern unter Verwendung von Fasern mit schmaler Bandweite kann die Erfindung mit einem einzigen Photodetektor für eine beliebige Zahl von Fluorchromen eingesetzt werden.
  • Das bevorzugte Ausführungsbeispiel verwendet mehrere Laser zum Erzeugen verschiedener Erregungswellenlängen, jedoch verwenden andere Ausführungsbeispiele einen einzigen Laser mit Strahlteilung um verschiedene Stellen zu beleuchten. Frequenzverschiebungsvorrichtungen ermöglichen verschiedene Erregungswellenlängen. Die Erregung und die Fluoreszenzerkennung sind im bevorzugten Ausführungsbeispiel orthogonal, jedoch sieht die vorliegende Erfindung "Epi"-Konfigurationen vor, in denen diese nicht orthogonal sind.
  • Anstelle der Verringerung der Überlagerung zwischen Fluorchromen, kann das erfindungsgemäße geteilte Filter zum Reduzieren der Überlagerung zwischen Streulichtdetektoren an zwei Stellen verwendet werden. Ein Filterelement kann vorzugsweise Wellenlängen durchlassen, die mit Beleuchtung an der ersten Stelle verbunden sind, während das andere Filterelement vorzugsweise Wellenlängen durchlässt, die mit Beleuchtung an der zweiten Stelle einhergehen. Alternativ kann ein Filterelement für die Streuerkennung abgestimmt werden, während das andere auf Fluoreszenz abgestimmt ist.
  • Sichtbare Erregung und Emission werden in dem bevorzugten Ausführungsbeispiel verwendet. Die Erfindung sieht jedoch auch die Verwendung von längeren und kürzeren elektromagnetischen Strahlungen für die Erregungsstrahlung und/oder die Emissionsstrahlung vor.
  • Im Kontext eines Durchflußzytometriesystems werden Blutzellen durch stationäre Laserstrahlen hindurchgeleitet. Im Kontext eines Abtastmikroskops können die Laserstrahlen relativ zu stationären fluoreszierenden Partikeln bewegt werden. Diese und andere Modifizierungen und Variationen des bevorzugten Ausführungsbeispiels sind in der vorliegenden Erfindung enthalten, deren Rahmen nur durch die nachfolgenden Ansprüche begrenzt ist.

Claims (2)

  1. Analysesystem, das in der Lage ist, zwischen zwei Fluorochromen zu unterscheiden, wobei das erste der Fluorochrome ein erstes Erregungsspektrum mit einer ersten Spitzenerregungswellenlänge und ein erstes Emissionsspektrum mit einer ersten Spitzenemissionswellenlänge und das zweite der Fluorochrome ein zweites Erregungsspektrum mit einer zweiten Spitzenerregungswellenlänge und ein zweites Emissionsspektrum mit einer zweiten Spitzenemissionswellenlänge aufweist, wobei das erste und das zweite Erregungsspektrum einander überlappen, wobei das erste und das zweite Emissionsspektrum einander überlappen, wobei die erste Spitzenemissionswellenlänge von der zweiten Spitzenemissionswellenlänge verschieden ist, wobei das System aufweist: – eine erste Lasereinrichtung (LZ1) zum Beleuchten einer ersten Stelle (LC1) mit Licht einer ersten Laserwellenlänge innerhalb des ersten und des zweiten Erregungsspektrums, jedoch näher der ersten Spitzenerregungswellenlänge als der zweiten Spitzenerregungswellenlänge; – eine zweite Lasereinrichtung (LZ2) zum Beleuchten einer zweiten Stelle (LC2) mit Licht einer zweiten Laserwellenlänge innerhalb des ersten und des zweiten Erregungsspektrums, jedoch näher der zweiten Spitzenerregungswellenlänge als der ersten Spitzenerregungswellenlänge; – eine Bewegungseinrichtung für die Relativbewegung eines Partikels, das eines der Materialien enthält, zwischen einer ersten Stelle (LC1) und einer zweiten Stelle (LC2); – einen Photodetektor (PHD) zum Erkennen von Licht innerhalb eines Erkennungswellenlängenbereichs, der beide Spitzenemissionswellenlängen umfaßt, wobei die Photodetektoreinrichtung einen Ausgang zum Ausgeben eines elektrischen Signals mit einer Größe aufweist, die in Abhängigkeit von der durch den Photodetektor erkannten Lichtstärke variiert; – eine Filtereinrichtung (SPF) zum Verändern der Wellenlängenverteilung der einfallenden Strahlung, und – eine Signalanalyseeinrichtung (SGA) zum Analysieren des elektrischen Signals, dadurch gekennzeichnet, daß – die Filtereinrichtung ein erstes Filterelement (AP1) aufweist, welches Lichtstärke bei der ersten Spitzenemissionswellenlänge weniger dämpft als bei der zweiten Spitzenemissionswellenlänge, wobei die Filtereinrichtung ein zweites Filterelement (AP2) aufweist, das Strahlung bei der zweiten Spitzenemissionswellenlänge weniger verringert als Strahlung bei der ersten Spitzenemissionswellenlänge; – eine optische Pfadeinrichtung (COL) vorgesehen ist, welche Emissionen von der ersten und der zweiten Stelle derart leitet, daß der größte Teil der von der ersten Stelle (LC1) an den Photodetektor geleiteten Emissionen das erste Filterelement (AP1) passieren und der größte Teil der von der zweiten Stelle (LC2) an den Photodetektor geleiteten Emissionen das zweite Filterelement (AP2) passieren.
  2. System nach Anspruch 1, bei dem die optische Pfadeinrichtung die erste Stelle auf dem ersten Filterelement und die zweite Stelle auf dem zweiten Filterelement abbildet.
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