ES2201141T3 - Analizador de particulas con filtro de longitudes de onda desdoblado especialmente. - Google Patents

Analizador de particulas con filtro de longitudes de onda desdoblado especialmente.

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ES2201141T3
ES2201141T3 ES96105048T ES96105048T ES2201141T3 ES 2201141 T3 ES2201141 T3 ES 2201141T3 ES 96105048 T ES96105048 T ES 96105048T ES 96105048 T ES96105048 T ES 96105048T ES 2201141 T3 ES2201141 T3 ES 2201141T3
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Abstract

UN ANALIZADOR DE PARTICULA DE FLUORESCENCIA QUE INCLUYE UN TUBO DE FLUJO A TRAVES DEL CUAL LAS PARTICULAS MARCADAS CON DISTINTOS FLUOROCROMOS PASAN DESDE UNA PRIMERA LOCALIZACION A UNA SEGUNDA. LAS EMISIONES DE LA PRIMERA Y SEGUNDA LOCALIZACION SE REPRODUCEN RESPECTIVAMENTE EN ELEMENTOS DE FILTRO PRIMEROS Y SEGUNDOS RESPECTIVOS, DE MANERA QUE LAS EMISIONES QUE ALCANZAN UN FOTODETECTOR DE DICHA PRIMERA LOCALIZACION, SE FILTRAN PRINCIPALMENTE POR EL PRIMER ELEMENTO DE FILTRO, MIENTRAS QUE LAS EMISIONES QUE ALCANZAN EL MISMO FOTODETECTOR DESDE LA SEGUNDA LOCALIZACION, SE FILTRAN PRINCIPALMENTE MEDIANTE UN SEGUNDO ELEMENTO DE FILTRO. EL PRIMER ELEMENTO DE FILTRO SE SELECCIONA PARA TRANSMITIR PREFERENCIALMENTE EMISIONES DESDE UN PRIMER FLUOROCROMO A COSTA DE LAS EMISIONES DE UN SEGUNDO FLUOROCROMO, MIENTRAS QUE EL SEGUNDO ELEMENTO DE FILTRO SE SELECCIONA PARA TRANSMITIR PREFERENCIALMENTE EMISIONES DESDE EL SEGUNDO FLUOROCROMO A COSTA DE LAS EMISIONES DEL PRIMER FLUOROCROMO. LA PRIMERA LOCALIZACION SE ILUMINA MEDIANTE UN LASER QUE EXCITA PREFERENCIALMENTE EL PRIMER FLUOROCROMO A COSTA DEL SEGUNDO, MIENTRAS QUE LA SEGUNDA LOCALIZACION SE ILUMINA MEDIANTE UN LASER QUE EXCITA PREFERENCIALMENTE EL SEGUNDO FLUOROCROMO A COSTA DEL PRIMERO. LA SALIDA DEL FOTODETECTOR INCLUYE UN PRIMER IMPULSO QUE SE CORRESPONDE PREDOMINANTEMENTE CON LA CANTIDAD DEL PRIMER FLUOROCROMO EN LA PARTICULA; SUBSECUENTEMENTE APARECE UN SEGUNDO IMPULSO QUE SE CORRESPONDE PREDOMINANTEMENTE CON LA CANTIDAD DEL SEGUNDO FLUOROCROMO EN LA PARTICULA. EL USO DE LOS DOS FILTROS MINIMIZA LA DIAFONIA ENTRE EMISIONES DE FLUOROCROMO EN LOS IMPULSOS DE SALIDA DEL FOTODETECTOR.

Description

Analizador de partículas con filtro de longitudes de onda desdoblado espacialmente.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a instrumentos ópticos y, más particularmente, a instrumentos para distinguir partículas según los efectos ópticos que ocurren cuando las partículas pasan por localizaciones iluminadas. Un objetivo principal de la presente invención es proporcionar una interferencia de fluorescencia reducida en un analizador de fluorescencia multi-láser.
Los laboratorios de ensayos necesitan ser capaces de detectar la presencia de ciertas entidades, por ejemplo, antígenos, que pueden ser difíciles de detectar directamente. En algunos casos, las entidades pueden marcarse con fluorocromos que son detectables. Por ejemplo, el anticuerpo de un antígeno puede modificarse con un fluorocromo. El anticuerpo modificado puede mezclarse con una muestra de sangre. En la medida que un antígeno está presente en una célula, el anticuerpo modificado se une a él haciéndolo fluorescente. Las células marcadas pueden introducirse en un sistema de citometría, en el que luego pueden ser iluminadas con radiación monocromática, por ejemplo, de un láser, que excita el fluorocromo. Entonces un fotodetector puede detectar la intensidad de las emisiones fluorescentes.
A menudo es necesario identificar células con una combinación particular de antígenos. Para este fin, pueden modificarse varios anticuerpos con los fluorocromos respectivos; los anticuerpos modificados se mezclan con la muestra de sangre en condiciones suficientes para que los anticuerpos se unan a los antígenos respectivos. Entonces se iluminan las células y las emisiones fluorescentes que resultan son detectadas y medidas.
En la medida posible, se seleccionan los fluorocromos para que tengan distintos espectros de emisión. Un analizador fluorescente típico puede incluir un láser azul para excitar fluorocromos que emiten respectivamente luz verde, amarilla y roja. Los espejos dicroicos u otros elementos que dispersan la longitud de onda pueden separar las emisiones en rayos verdes, amarillos y rojos que son dirigidos hacia los fotodetectores respectivos. En la práctica es difícil distinguir más de tres fluorocromos sólo por la longitud de onda debido al solape en los espectros de emisión.
Puede aumentarse el número de fluorocromos que pueden distinguirse utilizando más de una longitud de onda de excitación. Este planteamiento se aprovecha del hecho de que los fluorocromos difieren no sólo en sus espectros de emisión, sino también en sus espectros de excitación. En un caso ideal, dos fluorocromos con espectros de excitación que no se solapan podrían distinguirse incluso si los espectros de emisión fueran idénticos. La distinción podría conseguirse iluminando en momentos diferentes con dos láseres los fluorocromos, cada uno seleccionado para excitar únicamente el respectivo fluorocromo. Las emisiones resultantes aparecerían como dos pulsos de señal distintos en la salida de un único fotodetector.
Este planteamiento se implementa en el contexto de un sistema de citometría de flujo iluminando diferentes localizaciones a lo largo del tubo de flujo con diferentes longitudes de onda de láser, cada una de las cuales excita preferentemente un fluorocromo respectivo. Se hacen fluir las células marcadas más allá de las dos localizaciones de manera suficientemente infrecuente de modo que, normalmente, sólo una localización esté ocupada en cualquier momento dado. Cuando una célula está en la primera localización, un pulso de fotodetector se corresponde con el primer fluorocromo; cuando más tarde la célula está en una segunda localización, un pulso de fotodetector se corresponde con el segundo fluorocromo. Como los fluorocromos se pueden distinguir en un dominio de tiempo, un único fotodetector puede utilizarse para detectar las emisiones para ambos fluorocromos.
Los sistemas de citometría en los que se utiliza un único detector para detectar las emisiones que resultan de excitaciones separadas por espacio y longitud de onda se describen o sugieren por: 1) Donna J. Arndt-Jovin, Brian G. Grimwade, y Thomas M. Jovin, "A Dual Laser Flow Sorter Utilizing a CW Pumped Dye Laser" Cytometry Vol. 1, No. 2, 1980, pp. 127-131; 2) Eugene Hamori, Donna J. Arndt-Jovin, Brian G. Grimwade, y Thomas M. Jovin, "Selection of Viable Cells with Known DNA Content" Cytometry Vol. 1, No. 2, 1980, p. 132-1352; y 3) Julianne Meyne, Marty F. Bartholdi, Gayle Travis y L. Scott Cram, "Counterstaining Human Chromosomes for Flow Karyology", Cytometry, No. 5, 1984, pp. 580-583. La última publicación mencionada describe un sistema de Citometría en el que la luz emitida desde cada uno de los dos puntos de iluminación de láser se detecta por un único fotodetector. La luz de excitación se bloquea al bloquear todas las longitudes de onda menores de 495 nm utilizando un filtro de corte simple.
En una realización que emplea soluciones colorantes de HO y CA_{3}, los fluorocromos tienen espectros de emisión y excitación que se solapan. Así este documento describe todas las características del preámbulo de la reivindicación 1.
La patente de EE.UU. A-4.172.227 describe un microfluorómetro de flujo para medir la intensidad de fluorescencia de una partícula en función de la longitud de onda. Las células que viajan a través del rayo de luz se activan con fluorescencia. Se proyecta la imagen de la célula en un filtro en cuña. La radiación transmitida desde el filtro se focaliza en un tubo fotomultiplicador mediante una lanza colectora. Cuando una célula atraviesa el rayo, partes de longitudes de onda sucesivamente más largas del espectro de emisión se focalizarán en el tubo fotomultiplicador. Por ello se produce una señal que varía con el tiempo, cuyo eje del tiempo es proporcional a la longitud de onda. Este es un método para hacer un barrido de todo el espectro de emisión de fluorescencia de las células.
La patente de EE.UU. A-4.243.318 describe análisis de fluorescencia utilizando dos rayos láser de longitudes de onda diferentes, estando dichos rayos láser atravesados por las partículas que fluyen. Los pulsos de fluorescencia que emanan de los dos puntos basándose en el espacio entre los dos puntos y en la velocidad de flujo de la corriente se utilizan para evaluar sólo aquellos pulsos que se corresponden con el tiempo de viaje de las partículas individuales entre los dos puntos. Esto es una filtración de tiempo de pulsos de detección.
En la práctica, cada fluorocromo puede ser excitado débilmente por la frecuencia de excitación que excita fuertemente el otro fluorocromo. Así, cada fluorocromo puede aportar "interferencia" al pulso eléctrico que ocurre en la franja de tiempo asignado al otro fluorocromo, lo que trae como resultado lecturas erróneas. Esta interferencia puede reducirse utilizando dos fotodetectores, cada uno situado para recibir solamente emisiones de una de las localizaciones de excitación. Sin embargo, esto causa el gasto y el volumen de trabajo considerables asociados a un fotodetector adicional.
Es un objeto de la presente invención proporcionar un sistema analítico que reduzca la interferencia entre fluorocromos que tengan espectros de emisión que se solapen y espectros de excitación que se solapen ligeramente sin que requieran un fotodetector adicional.
Resumen de la invención
El sistema analítico de la presente invención se define por la reivindicación 1.
En lo que sigue, la invención se describe principalmente en el contexto de análisis de fluorescencia de partículas en un sistema de citometría de flujo. Debería tenerse en cuenta, sin embargo, que la invención también se aplica a detecciones de luz de dispersión, detecciones de absorbancia, etc. Más aún, la presente invención se aplica a microscopios de barrido en los que la fuente de iluminación se mueve con relación a partículas estacionarias, así como a sistemas de citometría de flujo que mueven las partículas con relación a fuentes de luz estacionaria.
El filtro dividido del sistema incluye un primer elemento de filtro que preferiblemente pasa fluorescencia de un primer fluorocromo excitado fuertemente por la primera longitud de onda del láser, mientras que atenúa relativamente la fluorescencia de un segundo fluorocromo fuertemente excitado por la segunda longitud de onda del láser. El subsistema óptico dirige la radiación de la primera localización de excitación a través del primer filtro al fotodetector, mientras que dirige la radiación de la segunda localización de excitación de forma que alcance el fotodetector sin atravesar el primer elemento de filtro.
El filtro dividido incluye un segundo elemento de filtro para minimizar la contribución del primer fluorocromo al pulso de salida del fotodetector que corresponde al segundo fluorocromo. Para este fin, el subsistema óptico dirige relativamente más cantidad de la fluorescencia de la segunda localización a través del segundo elemento de filtro y relativamente menos cantidad de la fluorescencia de la primera localización a través del segundo filtro. Esta disposición puede conseguirse utilizando elementos ópticos que representen con una imagen las dos localizaciones de excitación en los elementos de filtro respectivos. Puede disponerse un filtro espacial con aberturas en el plano de imagen o cerca de él para ayudar a aislar las imágenes de las dos localizaciones.
Mientras que la separación de las emisiones no necesita ser perfecta, deberían ser más las emisiones que pasan desde la primera localización al fotodetector y que atraviesan el primer elemento de filtro que las que no; de igual forma, deberían ser más las emisiones que pasan desde la segunda localización al fotodetector y que evitan el primer elemento de filtro que las que lo atraviesan. Como resultado, la atenuación del segundo fluorocromo con respecto al primer fluorocromo en las emisiones (filtradas por el primer elemento de filtro) de la primera localización al fotodetector, debería ser mayor que la atenuación del segundo fluorocromo con respecto al primer fluorocromo en las emisiones (que evitan el primer elemento de filtro) de la segunda localización al fotodetector.
La presente invención puede aplicarse para distinguir los cuatro fluorocromos APC, PerCP, FITC y RPE, de los cuales PerCP, FITC y RPE se excitan fuertemente por la radiación que tiene una longitud de onda de aproximadamente 488 nm, mientras que el APC se excita fuertemente por la radiación que tiene una longitud de onda de aproximadamente 635 nm. Se utiliza un único detector para detectar APC y PerCP. Los elementos de filtro del filtro dividido minimiza la interferencia entre estos dos fluorocromos. Puede conseguirse una distinción de cinco modos utilizando los fluorocromos APC, PerCP, FITC, CUPE y BPE añadiendo radiación de excitación de 532 nm que excita preferentemente el BPE. Un filtro dividido delante del segundo fotodetector reduce la interferencia entre el CUPE y el BPE.
Los sistemas de la técnica anterior han proporcionado emisiones generadas por rayos de excitación separados espacialmente y detectadas por un único fotodetector para ser distinguidas por el tiempo de detección. Cada uno de los dos fluorocromos que han de ser detectados por el único detector es excitado fuertemente por uno de los rayos láser respectivos y excitado débilmente por el otro rayo láser. Sin embargo, la excitación débil da como resultado la interferencia en la salida del fotodetector. Un analizador de señal puede compensar esta interferencia procesando la señal digital y/o analógica. Sin embargo, hay límites en lo que el procesado posterior puede conseguir, y no hay substituto para comenzar con pulsos que están relativamente libres de interferencias.
La presente invención minimiza la interferencia aplicando filtros de longitud de onda independientes a las emisiones de las dos localizaciones de excitación. Así, la invención distingue tales emisiones tanto por longitud de onda de emisión como por tiempo. Este enfoque puede reducir la necesidad de procesado posterior para acelerar los análisis y/o proporcionar mejores datos de partida al procesador de señal, de modo que los resultados finales son más exactos.
La combinación de tiempo y discriminación de longitud de onda de la fluorescencia que resulta de excitaciones separadas espacialmente mejora la discriminación de las señales resultantes por un único fotodetector. La presente invención proporciona un rechazo mejorado de excitación secundaria donde se utilizan dos o más fluorocromos con espectros de excitación que se solapan débilmente, incluso con espectros de emisión que se solapan (moderadamente). Este rechazo mejorado se consigue económicamente sin requerir un fotodetector adicional. El análisis de la señal de salida del fotodetector no cambia excepto en que es necesario prestar menos atención a las interferencias entre las emisiones de los dos fluorocromos. Éstas y otras características y ventajas de la presente invención quedan claras a partir de la descripción que sigue con referencia a los dibujos siguientes.
Breve descripción de los dibujos
La FIGURA 1 es una vista esquemática de un sistema de citometría de flujo de acuerdo con la presente invención.
Descripción de las realizaciones preferidas
De acuerdo con la presente invención, un sistema de citometría de flujo FCS para caracterizar una célula sanguínea CEL comprende una fuente de excitación EXS con láseres LZ1 y LZ2, un subsistema de flujo FLS, una lente colectora COL, un conjunto de espejos dicroicos DMA, tres conjuntos de detector (rojo, amarillo, verde) DAR, DAY y DAG, y un analizador de señal SGA, como se muestra en la FIG. 1. El conjunto de detector DAR incluye un filtro espacial SPF con dos aberturas AP1 y AP2, un filtro de longitud de onda dividido SWF con un elemento de filtro de paso de banda bajo LBF y un elemento de filtro de paso de banda alto HBF, y un fotodetector PHD. Los conjuntos de detector DAY y DAG incluyen cada uno un filtro espacial con una abertura y un fotodetector. Los tres fotodetectores tienen sus salidas acopladas al analizador de señal SGA.
Una función del sistema de citometría de flujo FCS es determinar cual, si alguno, de los cuatro antígenos son portados por las células sanguíneas, incluyendo la célula CEL. Para este fin, los anticuerpos respectivos de los antígenos se modifican con los fluorocromos respectivos aloficocianin (APC), proteína peridinin clorofil (PerCP), isotiocianato de fluoresceina (FITC) y R-ficoeritrina (RPE). Las células sanguíneas se incuban con una mezcla de estos anticuerpos modificados en condiciones suficientes para que los anticuerpos se unan con sus antígenos respectivos para marcar las células sanguíneas. Los anticuerpos no unidos pueden eliminarse por lavado. Las células sanguíneas marcadas se trasladan a continuación en serie en una corriente que fluye más allá de las localizaciones de excitación LC1 y LC2.
Para excitar las células marcadas con fluorocromo, los láseres LZ1 y LZ2 proporcionan luz altamente monocromática a las respectivas localizaciones de excitación LC1 y LC2, las cuales están separadas aproximadamente 120 micras. El láser LZ1 es un láser de diodos que proporciona radiación roja de 635 nm. De manera alternativa, puede proporcionarse radiación roja de 633 nm por un láser de helio-neón más caro para un rayo de difracción más limitada. El láser LZ2 es un láser de ion argón que proporciona radiación azul de 488 nanómetros (nm). Aunque se muestran de otra forma por propósitos ilustrativos, los láseres LZ1 y LZ2 se dirigen preferiblemente de forma ortogonal a la dirección a lo largo de la cual se detectan las emisiones para minimizar el ruido en las señales de detección.
Cuando la célula CEL llega a la localización de excitación LC1 del subsistema de flujo FLS, la excitación roja incidente del láser LZ1 excita fuertemente cualquier fluorocromo APC presente; cualquiera de los fluorocromos PerCP, RPE y FITC presentes está como mucho débilmente excitado. Cuando la célula CEL llega a la localización de excitación LC2, la excitación azul incidente del láser LZ2 excita fuertemente cualquiera de los fluorocromos PerCP, FITC y RPE presentes y excita débilmente cualquier fluorocromo APC presente.
Las emisiones son recogidas por la lente colectora COL y dirigidas al conjunto de espejos dicroicos DMA. El conjunto de espejos dicroicos DMA incluye básicamente dos espejos dicroicos. El primero transmite la radiación por debajo de 560 nm al conjunto de detectores verde DAG y refleja la radiación por encima de 560 nm al segundo espejo dicroico. El segundo espejo dicroico transmite la radiación por encima de 640 nm al conjunto de detectores rojo DAR, y refleja la radiación por debajo de 640 nm al conjunto de detectores amarillo DAY.
Consecuentemente, la fluorescencia de FITC, que tiene un pico de emisiones a 520 nm se dirige principalmente de la localización LC2 al conjunto de detectores verde DAG; la fluorescencia de RPE, que tiene un pico de emisiones a 570 nm se dirige principalmente de la localización LC2 al conjunto de detectores amarillo DAY; la fluorescencia de PerCP, que tiene un pico de emisiones a 675 nm se dirige principalmente de la localización LC2 al conjunto de detectores rojo DAR; y la fluorescencia de APC, que tiene un pico de emisiones a 660 nm se dirige principalmente de la localización LC1 al conjunto de detectores rojo DAR.
La lente colectora COL se dispone para formar la imagen de la célula CEL mientras está en la localización LC1 dentro de la abertura AP1 de forma que la fluorescencia roja (principalmente APC) de la localización LC1 se filtra por el elemento de filtro de paso de banda bajo LBF antes de incidir en el fotodetector PHD. De igual forma, la lente colectora COL se dispone para formar la imagen de la célula CEL mientras está en la localización LC2 dentro de la abertura AP2 de forma que la fluorescencia roja (principalmente PerCP) de la localización LC2 se filtra por el filtro de paso de banda alto HBF antes de incidir en el fotodetector PHD. La lente colectora COL proporciona un aumento de aproximadamente 14X de forma que los centros de las aberturas AP1 y AP2 están separados 1,7 milímetros (mm). Las anchuras de las aberturas AP1 y AP2 son de 1,0 mm.
El elemento de filtro de paso de banda bajo LBF tiene un punto de corte alto de aproximadamente 670, cerca de la transición de los espectros de emisión de APC y PerCP. Consecuentemente, las emisiones de PerCP de la localización LC1 se atenúan con respecto a las emisiones de APC de la localización LC1. El filtro de paso de banda bajo LBF tiene un punto de corte bajo de aproximadamente 650 nm, para excluir excitación dispersa del láser rojo LZ1.
El elemento de filtro de paso de banda alto HBF tiene un punto de corte bajo de aproximadamente 670 nm, cerca de la transición de los espectros de emisión de APC y PerCP. Así, las emisiones de APC de la localización LC2 se atenúan con respecto a las emisiones de PerCP de la localización LC2. El elemento de filtro de paso de banda alto HBF tiene un punto de corte alto de aproximadamente 700 nm, para minimizar el ruido de fondo a longitudes de onda más largas que las que están dentro del espectro de emisión de PerCP. En la práctica, el ruido en este intervalo es débil, de modo que puede utilizarse un filtro de paso alto en vez de un elemento de filtro de paso de banda alto HBF.
Así, cuando la célula CEL está en la localización de excitación LC1, cualquier fluorescencia de ACP se detecta de manera sensible por el conjunto de detectores rojo DAR, mientras que cualquier interferencia de PerCP se reduce por un elemento de filtro de paso de banda bajo LBF. Cuando la célula CEL está en la localización de excitación LC2, cualquier fluorescencia de PerCP se detecta fuertemente por el conjunto de detectores rojo DAR, mientras que cualquier interferencia de APC se reduce por un elemento de filtro de paso de banda alto HBF. Cualquiera de las emisiones de FITC o RPE son detectadas respectivamente por los conjuntos de detectores DAG y DAY.
El analizador de señal SGA analiza las salidas de los conjuntos de detectores DAR, DAY y DAG para identificar y cuantificar los fluorocromos en las células que pasan, tales como la célula CEL. El sistema de citometría de flujo FCS incluye detectores de dispersión en la localización LC1 que detectan la presencia de una célula, con independencia de su fluorescencia. El analizador de señal SGA puede utilizar esta detección como una referencia a los pulsos detectados de tiempo para distinguir los pulsos que resultan de la excitación en las diferentes localizaciones de excitación. (Además, los pulsos de dispersión pueden analizarse para determinar tamaño y granulosidad.) Opcionalmente, los pulsos pueden corregirse como en la técnica anterior, pero hasta un alcance menor, para compensar la interferencia de fluorocromo no eliminada por el filtro dividido SPW.
La descripción anterior se refiere a una discriminación de cuatro vías entre fluorocromos. También puede implementarse una discriminación de cinco vías con las siguientes modificaciones. Se utiliza un tercer láser LZ3, colocado corriente arriba del primer láser LZ1, para proporcionar excitación verde de 532 nm a la tercera localización de excitación a lo largo del subsistema de flujo FLS; el láser LZ3 es un láser de neodimio-itrio-aluminio-granate de doble frecuencia (NdYAG). Los cinco fluorocromos son FITC, CU-ficoeritrina (CUPE), B-ficoeritrina (BPE), APC y PerCP. El BPC se excita fuertemente por el láser verde LZ3, mientras que CUPE, como el RPE, se excitan fuertemente por el láser azul LZ2. Se dispone un segundo filtro dividido en frente del conjunto de detectores verde DAG para reducir la interferencia mutua entre el CUPE y el BPE. Un filtro espacial de doble abertura reemplaza el filtro espacial de abertura simple en frente del conjunto de detectores PDG.
La lente colectora COL forma las imágenes de la primera localización de excitación LC1 y de la tercera localización de excitación respectivamente dentro de estas aberturas. Así, las emisiones amarillas, predominantemente del BPE de la tercera localización de excitación, se transmiten a través de un elemento de filtro de paso de banda bajo, mientras que las emisiones amarillas, predominantemente del CUPE de la segunda localización de excitación LC2, se transmiten a través de un filtro de paso de banda alto. El filtro de paso de banda bajo tiene un intervalo de 540, para atenuar la radiación de excitación verde, a 565, para atenuar el BPE a favor del CUPE. El filtro de paso de banda alto tiene un intervalo de 565, para atenuar el CUPE a favor del BPE, a 620, para filtrar completamente la radiación de excitación ambiental del láser rojo LZ1. Así, la interferencia mutua BPE/CUPE se reduce de la misma forma que la interferencia mutua APC/PerCP.
El sistema de citometría de flujo FCS puede utilizarse, no solo para detectar antígenos, sino cualquier partícula fluorescente, incluyendo otros ligandos que llevan unidos elementos de unión de ligandos modificados por fluorocromos. Las referencias citadas en la parte de antecedentes previa dan ejemplos de partículas fluorescentes alternativas.
En la realización preferente de la invención, los espejos dicroicos separan los rayos por longitud de onda. Realizaciones alternativas prescinden de espejos dicroicos, confiando en elementos de filtro dividido y otros filtros de paso de banda para rechazar las emisiones no previstas para el respectivo fotodetector.
El número de fluorocromos que pueden distinguirse por la presente invención puede aumentarse de diferentes formas. La mayoría de los detectores pueden utilizarse, en principio, para distinguir la mayor parte de los fluorocromos con emisiones que solamente se solapan débilmente. La mayoría de los elementos de filtro por filtro dividido (y la mayoría de las aberturas por filtro espacial) pueden utilizarse para distinguir la mayor parte de los fluorocromos por fotodetector en los que se utilizan al menos un número igual de fuentes de excitación de similares o diferentes longitudes de onda de excitación. Por ejemplo, FITC, BPE y APC pueden ser excitado por tres láseres (azul, verde, rojo) y detectados con un único fotodetector con un filtro dividido de triple vía. De manera similar, FITC, RPE y PerCP pueden ser excitados por tres láseres azules. Más aún, un porcentaje mayor de fotodetectores puede utilizarse para detectar fluorocromos múltiples. Puede conseguirse una resolución mayor de los fluorocromos poniendo en correlación salidas de fotodetectores.
En vez de elementos de filtro voluminosos, puede utilizarse fibra óptica para dirigir las emisiones entre las localizaciones de excitación y los fotodetectores. Filtrando las emisiones antes de la entrada a las fibras, o filtrando las fibras de poca anchura de banda que se utilizan, la invención puede llevarse a la práctica utilizando un único fotodetector para cualquier número de fluorocromos.
Mientras que la realización preferente utilizaba láseres múltiples para producir longitudes de onda de excitación diferentes, otras realizaciones utilizan un único láser con separador de haces para excitar localizaciones diferentes. Los dispositivos de desplazamiento de frecuencias permiten longitudes de onda de excitación diferentes. Mientras que la excitación y la detección de fluorescencia son ortogonales en la realización preferente, la presente invención proporciona configuraciones "epi" en las que no son ortogonales.
En lugar de reducir las interferencias entre los fluorocromos, el filtro dividido empleado en la presente invención puede emplearse para reducir la interferencia entre los detectores de luz dispersa en dos localizaciones. Un elemento de filtro puede preferiblemente dejar pasar longitudes de onda asociadas con la iluminación en la primera localización, mientras que otro elemento de filtro puede preferiblemente dejar pasar longitudes de onda asociadas con la iluminación en la segunda localización. De forma alternativa, un elemento de filtro puede ajustarse para la detección de la dispersión mientras que el otro se ajusta para la fluorescencia.
En la realización preferente se utilizan la excitación y la emisión visibles. Sin embargo, la invención proporciona el uso tanto de radiaciones electromagnéticas más largas como más cortas para una o ambas de las radiaciones de excitación y de emisión.
En el contexto de un sistema de citometría de flujo, a las células sanguíneas se les hace pasar a través de rayos láser estacionarios. En el contexto de un microscopio de barrido, los rayos láser pueden trasladarse con relación a partículas fluorescentes estacionarias. La presente invención proporciona estas y otras modificaciones y variaciones de las realizaciones preferentes, cuyo alcance se limita sólo por las siguientes reivindicaciones.

Claims (2)

1. Un sistema analítico capaz de distinguir entre dos fluorocromos, el primero de los cuales tiene un primer espectro de excitación con una primera longitud de onda de excitación máxima y un primer espectro de emisión con una primera longitud de onda de emisión máxima, el segundo de los cuales tiene un segundo espectro de excitación con una segunda longitud de onda de excitación máxima y un segundo espectro de emisión con una segunda longitud de onda de emisión máxima, solapándose los citados primer y segundo espectros de excitación, solapándose los citados primer y segundo espectros de emisión, siendo diferente la citada primera longitud de onda de emisión máxima de la citada segunda longitud de onda de emisión máxima, comprendiendo el sistema
un primer medio láser (LZ1) para iluminar una primera localización (LC1) con luz que tiene una primera longitud de onda de láser dentro de los citados primer y segundo espectros de excitación, pero más próxima a la citada primera longitud de onda de excitación máxima que a la citada segunda longitud de onda de excitación máxima;
un segundo medio láser (LZ2) para iluminar una segunda localización (LC2) con luz que tiene una segunda longitud de onda de láser dentro de los citados primer y segundo espectros de excitación, pero más próxima a la citada segunda longitud de onda de excitación máxima que a la citada primera longitud de onda de excitación máxima;
medios de desplazamiento para mover relativamente una partícula que incluye uno de los citados materiales entre una primera localización (LC1) y una segunda localización (LC2);
un fotodetector (PHD) para detectar luz en un intervalo de longitud de onda de detección que incluye ambas de las longitudes de onda de emisión máxima citadas, teniendo los medios del citado fotodetector una salida para dar salida a una señal eléctrica que tiene una magnitud que varía en función de la intensidad de la luz detectada por dicho fotodetector;
medios de filtro (SFC) para alterar la distribución de la longitud de onda de la radiación incidente, caracterizado porque dichos medios de filtro incluyen un primer elemento de filtro (AP1) que atenúa la intensidad de la luz en la citada primera longitud de onda de emisión máxima menos que en la citada segunda longitud de onda de emisión máxima, incluyendo los citados medios de filtro un segundo elemento de filtro (AP2) que disminuye la radiación en la citada segunda longitud de onda de emisión máxima menos que la radiación en la citada primera longitud de onda de emisión máxima;
medios de camino óptico (COL) para dirigir las emisiones de las citadas primera y segunda localizaciones de modo que la mayoría de las emisiones dirigidas desde la citada primera localización (LC1) al citado fotodetector atraviesan el citado primer elemento de filtro (AP1) y de modo que la mayoría de las emisiones dirigidas desde la citada segunda localización (LC2) al citado fotodetector atraviesan el citado segundo elemento de filtro (AP2); y
medios de analizador de señal (SGA) para analizar la citada señal eléctrica.
2. Un sistema como se describe en la reivindicación 1, en el que los citados medios de camino óptico dan imágenes de la citada primera localización en el citado primer elemento de filtro y da imágenes de la citada segunda localización en el citado segundo elemento de filtro.
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