JP4606261B2

JP4606261B2 - 粒子測定方法

Info

Publication number: JP4606261B2
Application number: JP2005204149A
Authority: JP
Inventors: 成幸中田; 弘能林; 益士郎久谷
Original assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Current assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Priority date: 2005-07-13
Filing date: 2005-07-13
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2025-07-13
Also published as: JP2007024569A

Description

本発明は、特にサンプル粒子を安定してフローセル内に供給する粒子測定方法に関する。

工業分野において溶媒中の粒子測定、あるいは医療分野において血液等の診断に用いられている測定・解析手法にフローサイトメータがある。
フローサイトメータは、流体中の粒子や細胞などに蛍光色素でラベルした抗体を結合させて、レーザ光等を照射して、反射する散乱光や蛍光を分析・分離する。より具体的には、例えばバイオサンプルを溶液中に分散させてサンプル液とし、シース液との間で層流を形成させて高速で透光体などのフローセル中を流下させる。そしてフローセルの側面からレーザ光を照射して発光するバイオサンプルの蛍光や散乱光を集光して測定する。
このようなフローサイトメータによれば短時間で多くの情報を測定でき、また特定の粒子を分取できるなどの特徴がある。

ところでフローサイトメータの測定感度、精度を良くするためには、照射するレーザ光を微小に絞込み、サンプル流をできるだけ細くし、レーザと直角方向の位置精度をμｍオーダで厳密に流す必要がある。また振動や温度等様々な圧力変動などが生じると、僅かながら測定値が変動することがある。さらにサンプル粒子の凝集塊はフローセルの目詰まりの原因となることから、サンプル粒子を凝集させることなくサンプル液中に分離・浮遊させる浮遊溶液を用いるなど、測定の高精度化を図っている。

従来このようなサンプル液またはシース液には、測定値に影響を及ぼすことがない、非反応性溶液となる生理食塩水が用いられている。
また特許文献１では生理食塩水を用いたサンプル液と、粘度調整を行ったシース液を用いて層流を形成させてサンプル粒子の正確な分析及び選別を図っていることが開示されている。
特表２００４−５００５６２号公報

上記のように高精度の測定値を得るために、サンプル液とシース液の流体フローは不規則な変動を含まない層流であって一定速度で直線上を流下させることが望ましい。フローセルに振動や粒子の流れに乱流が生じるとレーザビームの中心に一定速度で粒子を通すことができず、測定値にバラツキが生じて精度が得られない。フローサイトメータは精度の高い計測を行う場合、レーザ照射、サンプル液の流速などの調整に加えて、サンプル液とシース液が乱れることなくレーザビームの中心を外れることなく流下させる必要がある。

しかしながら従来のシース液とサンプル液には、測定値に影響を及ぼすことがないように生理食塩水などの非反応性物質を用いている。生理食塩水は水性液である。そうするとシース液とサンプル液は同じ生理食塩水同士となりシース液とサンプル液との間の界面を維持するのが困難となり、シース液とサンプル液どうしで混ざり合う乱流が発生しやすいという問題があった。

さらに特許文献１による粘性の高いシース液と、サンプル液の生理食塩水とはいずれも水性液の溶液を用いているため上記同様に乱流が発生しやすくなる。また粘性の高いシース液は予め適正な濃度に調整しなければならない。
そこで本発明は従来の問題点を改善するため、フローサイトメータにおけるサンプル粒子を安定してフローセルに供給し、測定値の高精度化を図ることを目的としている。

本発明の粒子測定方法は、シース液に包まれて流れるサンプル液に光を照射してサンプル液に含まれた粒子を測定する粒子測定方法において、前記サンプル液を水性液または油性液のいずれか一方で形成し、前記シース液を水性液または油性液のいずれか他方で形成することを特徴としている。この場合において、前記油性液は両親媒性溶液を添加することを特徴としている。前記両親媒性溶液は、界面活性剤、脂質のいずれかであることを特徴としている。

本発明の粒子測定方法は、シース液に包まれて流れるサンプル液に光を照射してサンプル液に含まれた粒子を測定する粒子測定方法において、前記サンプル液はサンプル粒子に水性液と油性液と界面活性剤を添加し懸濁させて形成し、前記シース液を水性液で形成することを特徴としている。
この場合において前記油性液は、油、有機溶媒のいずれかであることを特徴としている。前記有機溶媒はオレイン酸、ステアリン酸のいずれかであることを特徴としている。

本発明の粒子測定方法は、サンプル液を水性液または油性液のいずれか一方で形成し、前記シース液を水性液または油性液のいずれか他方で形成している。このため、水性液と油性液は互いに混ざり合うことがなく分離し、サンプル液とシース液との間で界面を形成しやすくなる。そしてフローセル内で上下方向の流れができやすくなりシース液中のサンプル液の流下が安定する。したがってシース液に包み込まれるサンプル液との間で乱流が発生することがなく安定した層流が形成されて、サンプル粒子の高精度な測定が可能となる。

またサンプル液あるいはシース液のいずれか一方に両親媒性溶液を添加した油性液を用いている。両親媒性溶液は一つの分子中に水性液の部分と油性液の部分とを合わせ持つ溶液であり、水性液と油性液との間で単分子膜を形成する。このため、水性液と油性液との間の界面を形成しやすくなる。そしてフローセル内で上下方向の流れができやすくなりシース液中のサンプル液の流下が安定する。したがってシース液に包み込まれるサンプル液との間で乱流が発生することがなく安定した層流が形成されて、サンプル粒子の高精度な測定が可能となる。

さらにサンプル液に水性液と油性液と界面活性剤を用いて懸濁液を形成する。これによりサンプル液中のサンプル粒子と水性液は界面活性剤で包み込まれたエマルジョン状態となり安定した状態を保持することができる。したがってシース液に包み込まれるサンプル液との間で乱流が発生することがなく安定した層流が形成されて、サンプル粒子の高精度な測定が可能となる。

以下本発明に係る粒子測定方法の実施形態を添付の図面を参照しながら詳細に説明する。
図１はフローサイトメータの構成概略を示す説明図である。図示のように、フローサイトメータ１０は、フローチャンバ１２、サンプル容器１４、シース容器１６、を備えた概略構成である。

フローチャンバ１２は、上部に後述するサンプル液１８及びシース液２０の供給管２１ａ，２１ｂが接続し、下部にはフローセル２４が設けられている。フローチャンバ１２の中心には、前記供給管２１ａと接続してサンプル液１８が流れるサンプルチューブ１９が形成してある。フローチャンバ１２は流れ込んだシース液２０がサンプル液１８を包み込むようにして、下部に設けられたフローセル２４に向けて細長い押し出し流を形成させている。

このフローセル２４は、石英ガラスなどの透光体であって上下方向に貫通した試料流路を形成し、その側方からレーザ光２８を照射するものである。このレーザ光２８の照射によって、サンプル粒子２２に予め蛍光色素を付与しておくと、サンプル粒子２２が蛍光を発する。そしてフローセル２４の側方には、レーザ光源２５が配置してある。レーザ光２８をサンプル液１８に照射することによって散乱光や蛍光３０が発生し、図示しない集光レンズで集光したのち検出器２６で計測される。

サンプル容器１４は、サンプル液１８を入れるためのものであり、サンプル液１８は、細胞やビーズ等のサンプル粒子２２を溶媒３４に混ぜたものである。そしてサンプル容器１４には、サンプル液１８をフローチャンバ１２に供給するための供給管２１ａの一端が入れられており、その他端がフローチャンバ１２に接続されている。またサンプル容器１４には、矢印Ａに示すように、サンプル液１８にサンプル圧Ａが加えられるようになっている。

第１実施形態に係るサンプル粒子２２を懸濁したサンプル液１８の溶媒３４には油性液を使用する。実施形態に係る油性液としては、シース液に用いる水性液の生理食塩水と混ざり合わない性質の溶液となる、例えば油、有機溶媒などを用いることができる。また有機溶媒としては、例えばオレイン酸、ステアリン酸などを用いることができる。

またシース容器１６は、シース液２０を入れるためのものである。シース液２０はサンプル液１８を包み込むように支持してフローセル２４に供給する溶液である。シース液２０をフローチャンバ１２に供給するために、供給管２１ｂの一端が入れられており、他端がフローチャンバ１２に接続されている。そしてシース容器１６には、矢印Ｂに示すように、シース液２０にシース圧Ｂが加えられるようになっている。

サンプル液１８を包み込んでサンプル粒子２２の焦点合わせを行うシース液２０には、純水のほか水性液である生理食塩水などの非反応性溶液を使用する。この水性液は前記油性液と混ざり合わない性質を有している。

次に、上記構成によるフローサイトメータ１０の作用について説明する。まずフローサイトメータ１０に、サンプル液１８が入れられたサンプル容器１４がセットされる。そしてサンプル液１８に圧力Ａを加えてサンプル液１８をフローチャンバ１２のサンプルチューブ１９に供給するとともに、シース液２０にシース圧Ｂを加えてシース液２０をフローチャンバ１２に供給する。

そうするとサンプルチューブ１９の先端部からサンプル液１８が流出するとともに、サンプル液１８を中心としてその回りを包み込むようにシース液２０が流出する。このとき油性液のサンプル液１８と水性液のシース液２０とは相互に混ざり合わず分離した状態となり容易に溶液間の境界面となる界面が形成される。油性液と水性液は分離して混ざり合うことがないため溶液の流れに不規則な変動となる乱流が発生しにくくなる。界面を維持することによって安定した層流を形成させることができる。このためフローチャンバの軸心方向に１列に並んだサンプル粒子２２を１個ずつ順番にフローセル２４内のレーザ照射スポットを流下させることができる。

なおサンプル液１８に加える圧力Ａまたはシース液２０に加える圧力Ｂを調整することにより、サンプル粒子２２がフローセル２４内を通過する速さを調整することが可能である。

そしてレーザ光源２５からは、フローセル２４を通過しているサンプル液１８に対してレーザ光２８を照射する。そうするとサンプル粒子２２がフローセル２４内に照射されているレーザ光２８を通過することによって散乱された散乱光や、サンプル粒子２２に標識した蛍光色素から蛍光３０を発光する。集光された散乱光あるいは蛍光は検出器２６により計測される。計測結果は図示しないデータ処理器に出力され、データ処理器で散乱光や蛍光３０を解析することによってフローセル２４を通過した個々のサンプル粒子２２の特性を得ることができる。

なお油性液はサンプル液１８あるいはシース液２０のいずれか一方に用いることができる。しかしサンプル液１８に油性液を用いた場合、試料の粒子の大きさ等にもよるが例えばその必要量は数１０μｍ／ｍｉｎ以下であるのに対し、シース液２０に用いた場合には２５ｍｌ／ｍｉｎとなり、シース液２０の方が相対的に必要量が多くなる。よって油性液をサンプル液１８に用いるとともに水性液をシース液２０に用いた方が油性液の必要量を少なくすることができ、測定の低コスト化を図ることができる。

このようなフローサイトメータ１０では、サンプル液１８に油性液を用いているので、水性液のシース液２０と界面を維持しながら、乱流が発生することがなく層流を形成することができる。

次に第２実施形態に係るフローサイトメータについて説明する。第２実施形態に係るフローサイトメータは基本的に第１実施形態と同様の装置構成であり、第１実施形態と異なるのはサンプル液１８の溶媒３４に用いた油性液に加えてさらに両親媒性溶液を添加している点である。

前記両親媒性溶液とは、親水基と疎水基の両方を有する溶媒であり、交じり合わない水性液と油性液の間に存在する界面の性質を変える作用を備えている。両親媒性溶液には例えば界面活性剤、脂質を用いることができる。界面活性剤としては、例えば石鹸、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどの陰イオン界面活性剤、またはアルキルアンモニウムクロリド、トリメチルアルキルアンモニウムブロミド、アルキルピリジニウムクロリドなどの陽イオン界面活性剤、またはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルなどの非イオン界面活性剤、またはアルキルアミノ酸などの両性界面活性剤を用いることができる。

図２はシース液２０にサンプル液１８を包み込んで流下させるフローセル２４の拡大図を示す。フローチャンバ１２のサンプルチューブ１９からは、シース液２０に包まれたサンプル液１８が細長い押し出し流となってフローセル２４に供給される。このとき界面活性剤３５の親水基３６は馴染みやすい水性液のシース液２０側に向き、界面活性剤３５の疎水基３８は馴染みやすい油性液のサンプル液１８側に向く。そして界面活性剤３５は図示のようなフローチャンバ１２の軸心方向に層状に積み重なった薄層の単分子膜を形成する。すなわち油性液のサンプル液１８と水性液のシース液２０との間に境界面となる界面が形成される。これによりサンプル液１８とシース液２０との混合による流れの乱れが軽減される。その結果としてサンプル液１８のサンプル粒子２２を安定して極細い流路範囲に層流として流すことができる。

なおサンプル液１８に加える圧力Ａまたはシース液２０に加える圧力Ｂを調整することにより、サンプル粒子２２がフローセル２４内を通過する速さを調整することが可能である。
このようなフローサイトメータ１０では、サンプル液１８に油性液と両親媒性溶液を用い、シース液２０に水性液を用いているので、両親媒性溶液が水性液のシース液２０との間で単分子膜を形成し界面を維持しながら、フローセル２４内で乱流が発生することがなく層流を形成することができる。なおサンプル液１８に水性液を用い、シース液２０に油性液と両親媒性溶液を用いる構成とすることもできる。

ところでサンプル液に油性液を添加した場合、細胞など生体サンプルの粒子が油性液から悪影響を受け性状が変化することがある。
そこでサンプル液に界面活性剤と油性液とサンプル粒子と水性液を用い懸濁させる。ここで油性液は油、有機溶媒を用い、水性液は生理食塩水などの非反応性水溶液を用いている。両者は互いに混ざり合わない性質を有し、振り混ぜても一時的に懸濁するが暫らくすると２層に分離してしまう。

そこで両親性の界面活性剤を添加して振り混ぜると水性液と油性液の懸濁液を形成することができる。この懸濁液はサンプル粒子と水性液を界面活性剤で包み込み均一に分散した状態、いわゆるエマルジョン状態となり、サンプル液中でサンプル粒子を安定した状態に保持することになる。

なお有機溶媒にオレイン酸、ステアリン酸を用いた場合、いずれも疎水基と親水基を有している。よってオレイン酸あるいはステアリン酸を油性液としてのみシース液あるいはサンプル液のいずれか一方に使用するように構成してもよい。この場合、界面活性剤を用いる必要がない。

フローサイトメータの構成概略を示す説明図である。シース液にサンプル液を包含する拡大図を示す。

符号の説明

１０………フローサイトメータ、１２………フローチャンバ、１４………サンプル容器、１６………シース容器、１８………サンプル液、１９………サンプルチューブ、２０………シース液、２１………供給管、２２………サンプル粒子、２４………フローセル、２５………レーザ光源、２６………検出器、２８………レーザ光、３０………蛍光、３４………溶媒、３５………界面活性剤、３６………親水基、３８………疎水基。

Claims

シース液に包まれて流れるサンプル液に光を照射してサンプル液に含まれた粒子を測定する粒子測定方法において、
前記サンプル液を水性液または油性液のいずれか一方で形成し、前記シース液を水性液または油性液のいずれか他方で形成することを特徴とする粒子測定方法。
前記油性液に両親媒性溶液を添加することを特徴とする請求項１記載の粒子測定方法。
前記両親媒性溶液は、界面活性剤、脂質のいずれかであることを特徴とする請求項２に記載の粒子測定方法。
シース液に包まれて流れるサンプル液に光を照射してサンプル液に含まれた粒子を測定する粒子測定方法において、
前記サンプル液はサンプル粒子に水性液と油性液と界面活性剤を添加し懸濁させて形成し、前記シース液を水性液で形成することを特徴とする粒子測定方法。
前記油性液は、油、有機溶媒のいずれかであることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の粒子測定方法。
前記有機溶媒はオレイン酸、ステアリン酸のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載の粒子測定方法。