JPH08122327A

JPH08122327A - 粒子及び細胞測定用シース液

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Publication number: JPH08122327A
Application number: JP6257832A
Authority: JP
Inventors: Katsuhiro Tsuchiya; 勝寛土屋; Yutaka Nagai; 豊永井; Masami Ikeda; 真美池田
Original assignee: Nippon Koden Corp
Current assignee: Nippon Koden Corp
Priority date: 1994-10-24
Filing date: 1994-10-24
Publication date: 1996-05-17
Anticipated expiration: 2017-10-15
Also published as: JP3334020B2

Abstract

(57)【要約】【目的】単純な溶解操作により気泡の発生及び発生した
気泡の保持を防止でき、その結果粒子及び細胞を再現性
良く測定できるフローサイトメータ用シース液を調製す
る。【構成】ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオ
ン性界面活性剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶
液からなり、細胞測定用には更にシース液の浸透圧を２
６０〜４１０mOsm／kgに調整するための浸透圧調整剤及
びｐＨを６〜８に保つための緩衝剤を添加混合した水溶
液からなる粒子及び細胞測定のためのフローサイトメー
タ用シース液。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、粒子及び細胞測定用シ
ース液に関し、詳しくは、フローサイトメータを使用し
て粒子及び細胞、特に赤血球を溶解処理された血球を光
学的に測定し、白血球を分類する方法に使用するフロー
サイトメータのフローセル内の泡の発生の防止に有用な
シース液に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から光の散乱による細胞又は微粒子
の識別又は分析にフローサイトメータが使用されてい
る。図１に示されるこの細胞測定装置（フローサイトメ
ータ）の流動細胞測定器４は、サンプル粒子からの光散
乱を測定するために設計されている。すなわち、測定さ
れる粒子を含んだ試料液１３が流動細胞測定器４に導か
れ、そこでレーザー光源１からのレーザー光が照射光集
束用レンズ２及び３を経て照射され、前方散乱光は照射
光ストッパ７を介し直射光が停止され散乱光のみが前方
散乱光検出用レンズ８を経て前方散乱光検出器９により
測定され、検出器により測定された電圧レベルが分析器
１０に入力される。一方流動測定器４における側方散乱
光は側方散乱光検出用レンズ５を経て側方散乱光検出器
６により測定され、検出器により測定された電圧レベル
が分析器１０に入力される。この分析器１０の両電圧レ
ベルに基づいて表示装置１１に前方および側方散乱光に
よる二次元分布図（スキャッタグラム）が表示される。

【０００３】この流動細胞測定器４の粒子測定機構を図
２〜４に基づいて説明する。図において測定粒子を含む
サンプル液流１３Ａは、その周囲をシース液流１２によ
り包囲された状態で流動細胞測定器４を構成する流動細
胞測定室１６中へ流動室から液流の太さを狭めつつ導か
れ、流動細胞測定室１６において照射光線（レーザービ
ーム）１４を照射されて前方及び側方散乱光を生じるこ
とになる。このとき、通常は図４に示されるように、測
定される細胞（または微粒子）１５はサンプル液流１３
Ａにより囲撓されていてシース液流１２に直接接触する
ことがない。しかしながら、サンプル流量を減らしシー
ス流量を増加させると図３に示されるように、サンプル
液流１３Ａはしぼられ、測定される細胞１５がシース液
流１２と直接接触する場合も時として生じる。したがっ
て、シース液の組成は細胞１５に分壊、破壊を生じる怖
れのないものでなければならない。

【０００４】このような条件に適合させるものとして、
マイクロフィルターなどの適当なフィルターにより濾過
して粒子を除去した蒸留水または生理的食塩水がシース
液として使用されてきた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな従来の蒸留水または生理的食塩水のみよりなるシー
ス液にあっては、表面張力が大きいためシース液中に気
泡を発生させやすいという欠点があった。図２に示され
るように、サンプル液流１３Ａの出口のシース液流１２
中に気泡が存在すると、気泡が上記両方の液流と共に流
動細胞測定器４を構成する流動細胞測定室１６中へ流入
する。そして流動細胞測定室１６中に気泡が存在する
と、この気泡によりサンプル液流１３Ａの流れが影響を
受けて流動細胞測定室１６の中心からはずれて流動細胞
測定室１６の端部へ蛇行して照射光線１４に照射されて
細胞から散乱される散乱光が弱まったり、極端な場合に
は照射光線光１４の照射経路からサンプル液流１３Ａが
それたり、更に断面が四角形の流動細胞測定室１６の四
隅部に気泡が保持され、この保持気泡によりサンプル液
流１３Ａの流れの方向が変動するなどして測定の再現性
を低下させる原因となっていた。

【０００６】このような従来のシース液の気泡保持の問
題点を解決するものとして、例えば、特開昭６２−８７
２３３号公報に記載された末端１級ヒドロキシ基のポリ
オール共重合体であるノニオン性界面活性剤を利用した
シース液が提案された。このシース液によれば、保持気
泡による問題点は解決されるものの、ポリオール共重合
体分子中のプロピレンオキシドおよびエチレンオキシド
の両成分の繰返し単位数が約３９〜約７７と大きく、従
って可成り分子量及び親油性が大きいため水に難溶性で
あるため、シース液を調製する際に溶解撹拌しにくい。
そして、シース液として使用したとき、液の濁りが生
じ、粒子検出に影響することが報告されている。前記問
題点を解決するために、ポリオキシエチレンアルキルフ
ェニルエーテル型のノニオン界面活性剤を利用したシー
ス液が提案されているが、赤血球など細胞に対する溶解
力が強いため、サンプル流中の細胞がシース液と接触す
るような設定の場合、細胞に影響を及ぼすという問題点
が依然として残っていた。

【０００７】本発明は、このような従来の課題に鑑みて
なされたものであり、単純な溶解操作により保持気泡に
よる問題点を確実に解消し、再現性の良い粒子及び細胞
の測定が行えるシース液を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明に係
る粒子測定用シース液は、ポリオキシエチレンアルキル
エーテル系ノニオン性界面活性剤、キレート剤及び防黴
剤を混合した水溶液からなることを特徴とするものであ
る。

【０００９】また請求項２記載の発明に係る細胞測定用
シース液は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノ
ニオン性界面活性剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、キレート
剤及び防黴剤を混合した水溶液からなることを特徴とす
るものである。

【００１０】更に請求項３記載の発明に係るシース液
は、上記構成に加えて、ノニオン性界面活性剤が式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_ｎ−Ｈ［式中、ＲはＣ₈〜Ｃ₂₂のアルキル又はアルキレン基を
表わし、ｎは２５〜３５の整数である］で示されるもの
であることを特徴として成るものである。

【００１１】更にまた請求項４記載の発明に係るシース
液は、上記構成に加えて、浸透圧調整剤の量がシース液
の浸透圧を２６０〜４１０ミリオスモス／キログラム
（mOsm／kg）に調整するための量であり、緩衝剤の量が
シース液のｐＨを６〜８に保つための量であることを特
徴として成るものである。

【００１２】本発明のシース液の調製に有用なポリオキ
シエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤
は、フローサイトメータの流動細胞測定室内の気泡の発
生の防止乃至低減と発生した気泡の流路外への迅速な流
出のために必要なものである。このノニオン性界面活性
剤は、一般式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_ｎ−Ｈ、
［式中、Ｒ及びｎは上記に定義した通りである］により
示されるものである。

【００１３】フローサイトメータによって粒子及び細胞
を測定するとき、サンプル液流、シース液流の流量によ
って図３に示すように粒子や細胞がシース液に接触する
ことがあるので、シース液は粒子、特に細胞に影響を与
えるものであってはならない。一般に、上記の型の界面
活性剤は、細胞を溶解する作用がある。しかしながら、
エチレンオキシドの付加モル数（上記の式のｎ）が多く
なると細胞に対する溶解力が低下する。従って、エチレ
ンオキシドの付加モル数の多い界面活性剤を使用すれ
ば、ノニオン性界面活性剤の表面張力の低下、浸透力の
増大などの作用を十分発揮できる濃度まで添加量を増加
しても細胞を溶解することがない。しかしながら、付加
モル数が多くなり過ぎるとノニオン性界面活性剤の浸透
力、洗浄力が低下し、シース液としての効果が半減す
る。

【００１４】アルキル基やアルキレン基Ｒの炭素数につ
いても上記と同様の傾向があり、すなわちＲの炭素数と
エチレンオキシドの付加数ｎとは、細胞の溶解力、界面
活性剤の溶解度、曇点などに密接に関係し、本発明に係
るシース液にあっては、Ｒ＝Ｃ₈〜Ｃ₂₂、ｎ＝２５〜３
５の範囲内で、本発明の目的が満足に達成される。界面
活性剤のシース液中の量は、界面活性剤濃度が０．２５
〜２％の範囲の量にて十分な気泡発生の防止、除泡の効
果が得られたが、コスト面から蒸留水１０００ml当り
２．５ｇ使用することが好ましい。

【００１５】本発明のシース液に有用な浸透圧調整剤
は、細胞が安定して存在できる浸透圧、すなわちシース
液の浸透圧を２６０〜４１０mOsm／kgＨ₂Ｏに調整する
ものであり、好ましくは塩素または臭素のアルカリ金属
塩が挙げられ、そして最も好ましくは塩化ナトリウムで
ある。しかして、シース液の浸透圧が低過ぎると細胞が
膨潤し、極端な場合には細胞が破裂し、一方浸透圧が高
過ぎると細胞が収縮し、測定精度が低下するため、シー
ス液を上記の浸透圧に調整するための量が使用され、一
般に蒸留水１０００ml当り９．０ｇの塩化ナトリウムが
使用されることが多い。

【００１６】本発明のシース液に使用するのに適する緩
衝剤は、シース液のｐＨを約６．８〜７．６に維持する
緩衝剤である。適当な緩衝剤としてはリン酸水素二ナト
リウム、リン酸二水素カリウム、ベロナールナトリウム
−塩酸、コリジン−塩酸、トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン一塩酸が例示される。

【００１７】一般に、６〜８のｐＨ範囲からはずれると
細胞形態に影響が生じ、例えば赤血球は上記ｐＨ範囲外
のシース液に接触すると、ｐＨ６未満では正常赤血球か
ら有口赤血球へ変化し、一方８を越えたｐＨでは正常赤
血球から有棘赤血球へ変化する。ｐＨ７．４が細胞のｐ
Ｈと同じであり、細胞形態を変化させることなく再現性
の良い細胞の測定を行うためには、緩衝剤の量としては
ｐＨを６〜８に維持する量が使用される。

【００１８】キレート剤は、本発明のシース液の長期間
の保存、使用上での金属イオンによる沈殿を防止するた
めに金属イオンとキレートを形成するために使用するも
のであって、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩
（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）などの公知のキレート剤が通常シ
ース液中で０．３重量％の濃度にて使用される。

【００１９】本発明のシース液への使用に適する防黴剤
は、シース液の長期保存による黴、細菌の発生を抑制す
ることができるものであって、添加量は防黴剤の種類に
よって異なる。適当な防黴剤としては２−フェノキシエ
タノール、１−ヒドロキシピリジン−２−チオンナトリ
ウム、その他適当な殺菌剤が挙げられる。なお、上記の
薬剤類のうち、ラテックス粒子、例えばポリスチレン粒
子をフローサイトメータにより測定する場合には、浸透
圧調整剤、緩衝剤をシース液中に含まなくても再現性良
く測定できることは言うまでもない。

【００２０】

【実施例】以下、本発明を細胞、具体的には白血球の分
類用シース液を例にとって実施例に基づいて説明する。

【００２１】実施例１以下の組成成分を一度にビーカーに入れ、ゆっくり攪拌
して溶液を調製し、次いで、この溶液を０．２μポアの
ミクロフィルターで濾過して適当な容器に入れた。塩化ナトリウム９．０ｇリン酸２水素カリウム０．９１ｇリン酸水素２ナトリウム（１２水塩）９．５５ｇＥＤＴＡ−２Ｎａ０．３ｇ２−フェノキシエタノール３．３ｇＰＯＥ（３０）ラウリルエーテル２．５ｇ蒸留水１０００ml 上記の組成中、ＰＯＥ（３０）ラウリルエーテルは、Ｃ
₁₂Ｈ₂₅−Ｏ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₃₀−Ｈを意味する。次
に血液の２００倍の希釈液１００mlに上記の界面活性剤
入りのシース液を５％から順次添加率を変更してフロー
サイトメータの流動細胞測定室中へ導入し、添加直後と
添加２分後の体積の相違±２以内をもって合格範囲とし
てシース液の評価を行った。結果を下記に示す。体積（ｆＬ）界面活性剤濃（％）添加直後添加２分後差０．０２５８８．５８９．６ −１．１０．０５０９０．３８９．４０．９０．０９８９０．４９００．４０．１４６８８８８．７ −０．７０．２３８８８．８８８．６０．２０．４５５８８．５８８．５００．４５５９５９４．３０．７０．８３３９３．８９３．８０１．１５４９３．３９３．９ −０．６１．４２９９３．９９３．１０．８１．６６７９２．７９３．７ −１２．５００９９．１１０１．３ −２．２３．５００９８．６１１９．３ −２０．７４．５００１２０．８２６０ −１３９．２５．０００３２０３６０ −４０上記の結果から、このシース液では界面活性剤の濃度が
０．０２５％から１．６６７％までの広い範囲にわたっ
て体積変化が小さく充分使用でき、すなわち、界面活性
剤濃度の可成りの変動があってもシース液の保持気泡に
起因する問題が生じなく、しかもシース液流とサンプル
液流の流量に多少の変動があっても充分に再現性の良い
測定結果が得られることがわかる。

【００２２】実施例２以下の組成のシース液を実施例１と同様の手順により調
製した。下記の組成中、ＰＯＥ（３０）オレイルエーテ
ルは、Ｃ₁₈Ｈ₃₅−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₃₀−Ｈを意味す
る。塩化ナトリウム９．０ｇトリス（オキシメチル）アミノメタン２．０ｇ塩酸（３５％）１．３４ｇＥＤＴＡ−２Ｎａ０．３ｇ２−フェノキシエタノール３．３ｇＰＯＥ（３０）オレイルエーテル２．５ｇ蒸留水１０００ml 上記のシース液を使用した以外は実施例１と同じ手順を
繰返してシース液の評価を行った。結果を下記に示す。体積（ｆＬ）界面活性剤濃（％）添加直後添加２分後差０．０２５９０．４９０．６ −０．２０．０５０９０．６８９．９０．７０．０９８８８．８８９．１ −０．３０．１４６８９．８８９０．８０．２３８８９．６８９．２０．４０．４５５８８．７８９ −０．３０．４５５９３．７９３．８ −０．１０．８３３９３．２９３．７ −０．５１．１５４９２．７９２．９ −０．２１．４２９９３．５９３．５０１．６６７９４９２．２１．８２．５００９５．７９４．５１．２３．５００１０５．４１０２．７２．７４．５００１０５．９１２０．８ −１４．９５．０００９９．５１１５．３ −１５．８上記の結果から、このシース液では界面活性剤の濃度が
０．０２５％から２．５０％の範囲にわたって、実施例
１と同様に満足な結果が得られることがわかる。

【００２３】実施例３ノニオン性界面活性剤：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_ｎ
−ＨのＲの炭素数８（オクチル）及び２２（ドエイコシ
ル）についてエチレンオキシドの付加モル数ｎ＝３０に
関して上記実施例１及び２と同様の手順を行ったが、Ｃ
₈については実施例１と類似の結果を、Ｃ₂₂については
実施例２と類似の結果を得た。またＲの炭素数１６（ス
テアリル）についてｎを２５及び３５に関して上記の同
様の評価を行い、ｎ＝２５については実施例１より多少
見劣りするものの界面活性剤濃度１．４２９％まで満足
な結果を、ｎ＝３５については実施例２とほぼ同様の結
果を得た。

【００２４】比較例１実施例２におけるエチレンオキシドの付加モル数ｎ＝３
０を１５に変えた以外は実施例２と同様の手順を繰返し
てシース液の評価を行った。結果を以下に示す。体積（ｆＬ）界面活性剤濃（％）添加直後添加２分後差０．００２９４．４９３．８０．６０．００５９３．１９２．８０．３０．０１０９４．１８８．６５．５０．０２５９１．６８２．２９．４０．０３５９１．２７７．０１４．２上記の結果から、界面活性剤濃度が０．００２％から
０．００５％という低濃度のしかも狭い濃度範囲では体
積変化については、満足な結果が得られるものの、アワ
をおさえるシース液としては不十分であり、多少でも濃
度が上昇し、例えば濃度０．０１０％では２分間の間に
大きな体積変化を生じ、実用的にフローサイトメータで
粒子測定を行う際には濃度変動を極めて厳密に抑制しな
ければならなく、シース液として実際に使用することが
困難であることがわかる。

【００２５】比較例２実施例１におけるアルキル基Ｒの炭素数を１６（ステア
リル）に増加したが、代わりにエチレンオキシドの付加
モル数ｎを１５に減少した以外は実施例１と同じ手順を
繰返してシース液の評価を行った。結果を以下に示す。体積（ｆＬ）界面活性剤濃（％）添加直後添加２分後差０．００２８７．５８７．８ −０．３０．００５８７．９８４．１３．８０．０１０８７．５７５．４１２．１０．０２５８６．７５１．８３４．９０．０５０８６．４５２．０３４．４上記の結果から、界面活性剤濃度が０．００２％という
低濃度だけで満足な結果が得られるものの、多少でも濃
度が上昇し、例えば濃度０．００５％では２分間の間に
大きな体積変化が生じ、このような低濃度での厳密な管
理は実際上困難であり、しかも界面活性剤濃度がこれを
下回ると気泡の発生防止、気泡離脱性能とも低下し、実
用性に乏しいことがわかる。

【００２６】比較例３比較例２におけるエチレンオキシドの付加モル数ｎ＝１
５を２０に増加した以外は比較例２と同じ手順を繰返し
てシース液の評価を行った。結果を以下に示す。体積（ｆＬ）界面活性剤濃（％）添加直後添加２分後差０．０２５９４．４１００ −５．６０．０５０９７．２１０１ −３．８０．０９８９４．３９８．５ −４．２０．１４６９２．９９８．７ −５．８０．２３８９３．３９８ −４．７０．４５５９３．７１００ −６．３０．４５５９３．３９６．４ −３．１０．８３３９６．７９７．５ −０．８１．１５４９２．７９６．３ −３．６１．４２９９２．９９５．８ −２．９１．６６７９２．３９６．８ −４．５２．５００９１．８９４ −２．２３．５００９１．７９４．３ −２．６４．５００１０８．９１０２．２６．７５．０００８５．１８７．９ −２．８上記の結果から、実施例１及び２と同様の実用的な界面
活性剤濃度でのシース液の評価試験においては、期待し
た実用的な性能が得られないことがわかる。

【００２７】

【発明の効果】本発明によれば、フローサイトメータを
使用する粒子及び細胞の測定用シース液にノニオン性界
面活性剤を用いているので、細胞溶解を引き起こすこと
なく、気泡の発生及び保持を防止することができる。し
かも、請求項３記載の特定のポリオキシエチレンアルキ
ル系ノニオン性界面活性剤であれば、単純な溶解操作で
シース液が調製できるだけでなく、広範な界面活性剤濃
度にわたって経時的な体積も小さいまま維持でき、測定
の再現性も一段と向上する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のシース液を使用するフローサイトメー
タの光学系の説明図である。

【図２】流動細胞測定器の流動細胞測定室付近の拡大説
明図である。

【図３】流動細胞測定室内の流れの説明図（サンプル液
流の太さが細胞に比べて小さい場合）である。

【図４】流動細胞測定室内の流れの説明図（サンプル液
流の太さが細胞に比べて大きい場合）である。

【符号の説明】

１レーザ光源２レンズ（照射光
集束用）３レンズ（照射光集束用）４流動細胞測定器５レンズ（側方散乱光検出用）６側方散乱光検出
器７照射光ストッパ８レンズ（前方散
乱光検出用）９前方散乱光検出器１０分析器１１表示装置１２シース液流１３…試料液１３Ａサンプル液
流１４照射光線（レーザービーム）１５細胞１６流動細胞測定室

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリオキシエチレンアルキルエーテル系
ノニオン性界面活性剤、キレート剤及び防黴剤を混合し
た水溶液からなる粒子測定用シース液。
【請求項２】ポリオキシエチレンアルキルエーテル系
ノニオン性界面活性剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、キレー
ト剤及び防黴剤を混合した水溶液からなる細胞測定用シ
ース液。
【請求項３】ノニオン性界面活性剤が式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_ｎ−Ｈ［式中、ＲはＣ₈〜Ｃ₂₂のアルキル又はアルキレン基を
表わし、ｎは２５〜３５の整数である］で示されるもの
である請求項１又は２記載のシース液。
【請求項４】浸透圧調整剤の量がシース液の浸透圧を
２６０〜４１０ミリオスモス／キログラムに調整するた
めの量であり、緩衝剤の量がシース液のｐＨを６〜８に
保つための量である請求項２または３に記載のシース
液。