JP2002303622A - 白血球分類用試薬および白血球分類方法 - Google Patents
白血球分類用試薬および白血球分類方法Info
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- JP2002303622A JP2002303622A JP2002083088A JP2002083088A JP2002303622A JP 2002303622 A JP2002303622 A JP 2002303622A JP 2002083088 A JP2002083088 A JP 2002083088A JP 2002083088 A JP2002083088 A JP 2002083088A JP 2002303622 A JP2002303622 A JP 2002303622A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 血液希釈溶液に添加したとき、赤血球を短時
間に溶解するが、白血球に損傷を受けない元のままの状
態またはこれに近い状態に一定時間残し、赤血球を溶解
後、フローサイトメータで前方散乱光と側方散乱光を測
定することにより、白血球を直接リンパ球、単球、好中
球及び好酸球に４分類できる白血球分類試薬を提供す
る。 【解決手段】 本発明の白血球分類試薬は、ポリオキシ
エチレン（３）アルキル（Ｃ12〜Ｃ13）エーテル硫酸ナ
トリウム、ポリオキシエチレン（３）アルキル（Ｃ11〜
Ｃ15）エーテル硫酸ナトリウム、またはポリオキシエチ
レン（３）アルキル（Ｃ11〜Ｃ15）エーテルトリエタノ
ールアミンを含有し、赤血球を溶解し、白血球に作用し
て白血球を分類可能とする。
間に溶解するが、白血球に損傷を受けない元のままの状
態またはこれに近い状態に一定時間残し、赤血球を溶解
後、フローサイトメータで前方散乱光と側方散乱光を測
定することにより、白血球を直接リンパ球、単球、好中
球及び好酸球に４分類できる白血球分類試薬を提供す
る。 【解決手段】 本発明の白血球分類試薬は、ポリオキシ
エチレン（３）アルキル（Ｃ12〜Ｃ13）エーテル硫酸ナ
トリウム、ポリオキシエチレン（３）アルキル（Ｃ11〜
Ｃ15）エーテル硫酸ナトリウム、またはポリオキシエチ
レン（３）アルキル（Ｃ11〜Ｃ15）エーテルトリエタノ
ールアミンを含有し、赤血球を溶解し、白血球に作用し
て白血球を分類可能とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査分野において
血球の分類に使用される試薬に関し、詳しくは、フロー
サイトメータを使用して赤血球を溶解した後の血球を光
学的に測定し、白血球を分類する方法に使用する試薬に
関する。また、その試薬を用いた白血球分類方法に関す
る。
血球の分類に使用される試薬に関し、詳しくは、フロー
サイトメータを使用して赤血球を溶解した後の血球を光
学的に測定し、白血球を分類する方法に使用する試薬に
関する。また、その試薬を用いた白血球分類方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】従来から白血球を分類し、計数する方法
として、血液希釈溶液にカチオン性界面活性剤のうち第
四級アンモニウム塩を主成分とする赤血球の溶解剤（以
後、溶血剤と称する）を添加して赤血球及び白血球の
膜、細胞質を溶解し、残存する白血球の核をコールター
原理によって測定して白血球数を計数する方法があっ
た。この方法では、白血球を縮った状態で観測している
ために白血球の種類を分類するための情報が得られない
という問題点があった。
として、血液希釈溶液にカチオン性界面活性剤のうち第
四級アンモニウム塩を主成分とする赤血球の溶解剤（以
後、溶血剤と称する）を添加して赤血球及び白血球の
膜、細胞質を溶解し、残存する白血球の核をコールター
原理によって測定して白血球数を計数する方法があっ
た。この方法では、白血球を縮った状態で観測している
ために白血球の種類を分類するための情報が得られない
という問題点があった。
【０００３】この問題点を解消すべく、溶血剤の成分と
濃度を改善し、白血球の反応を緩やかにすることで、白
血球細胞のリンパ球、単球、顆粒球の溶解速度の違い及
び電気伝導度の違いより、白血球細胞を３分類する方法
がある。しかしながら、血液中の白血球を種類別に計数
することによって、病気の診断に貢献することができる
ために、できればリンパ球、単球、好中球、好酸球およ
び好塩基球に５分類、少なくとも好塩基球を除く４種に
分類する方法が最近になって強く要望されるようになっ
てきた。
濃度を改善し、白血球の反応を緩やかにすることで、白
血球細胞のリンパ球、単球、顆粒球の溶解速度の違い及
び電気伝導度の違いより、白血球細胞を３分類する方法
がある。しかしながら、血液中の白血球を種類別に計数
することによって、病気の診断に貢献することができる
ために、できればリンパ球、単球、好中球、好酸球およ
び好塩基球に５分類、少なくとも好塩基球を除く４種に
分類する方法が最近になって強く要望されるようになっ
てきた。
【０００４】一方、従来から光の散乱による細胞や微粒
子の識別や分析にフローサイトメータが使用されてい
る。図１０に示すこの細胞測定装置（フローサイトメー
タ）の流動測定器４は、サンプル粒子からの光散乱を測
定するために設計されている。すなわち、測定される粒
子を含んだ試料液が流動測定器４に導かれ、そこでレー
ザー光源１からのレーザー光が照射光集束用レンズ２及
び３を経て照射され、前方散乱光は照射光ストッパを介
し直射光が停止され散乱光のみが前方散乱光検出用レン
ズ８を経て前方散乱光検出器９により測定され、検出器
により測定された電圧レベルが分析器１０に入力され
る。一方流動測定器４における側方散乱光は側方散乱光
検出用レンズ５を経て側方散乱光検出器６により測定さ
れ、検出器により測定された電圧レベル分析器１０に入
力される。この分析器１０の両電圧レベルに基づいて表
示装置１１に前方および側方散乱光による二次元分布図
（スキャッタグラム）が表示される。
子の識別や分析にフローサイトメータが使用されてい
る。図１０に示すこの細胞測定装置（フローサイトメー
タ）の流動測定器４は、サンプル粒子からの光散乱を測
定するために設計されている。すなわち、測定される粒
子を含んだ試料液が流動測定器４に導かれ、そこでレー
ザー光源１からのレーザー光が照射光集束用レンズ２及
び３を経て照射され、前方散乱光は照射光ストッパを介
し直射光が停止され散乱光のみが前方散乱光検出用レン
ズ８を経て前方散乱光検出器９により測定され、検出器
により測定された電圧レベルが分析器１０に入力され
る。一方流動測定器４における側方散乱光は側方散乱光
検出用レンズ５を経て側方散乱光検出器６により測定さ
れ、検出器により測定された電圧レベル分析器１０に入
力される。この分析器１０の両電圧レベルに基づいて表
示装置１１に前方および側方散乱光による二次元分布図
（スキャッタグラム）が表示される。
【０００５】しかしながら、フローサイトメータで測定
しても、前記の第四級アンモニウム塩型界面活性剤を主
成分とする溶血剤を使用する限りは、かなり白血球細胞
の細胞膜が溶解されているため、白血球数の計数ができ
るだけで３分類も難しいのが実状である。
しても、前記の第四級アンモニウム塩型界面活性剤を主
成分とする溶血剤を使用する限りは、かなり白血球細胞
の細胞膜が溶解されているため、白血球数の計数ができ
るだけで３分類も難しいのが実状である。
【０００６】フローサイトメータを用い前方散乱光と側
方散乱光を測定して白血球を分類する方法では、蓚酸ア
ンモニウムを主成分とした溶血剤を用い血液希釈溶液に
添加し、赤血球のみを溶解し白血球をリンパ球、単球、
顆粒球の３種類に分類していた。しかしながら、この方
法では赤血球の溶解に２０〜３０分必要であり、多数の
検体を処理する方法としては不適当であった。しかもこ
の方法は、各白血球の分布がはっきりしなく、好酸球が
好中球の分布の中に埋もれてしまい、好酸球のみの分布
として分離できなかった。
方散乱光を測定して白血球を分類する方法では、蓚酸ア
ンモニウムを主成分とした溶血剤を用い血液希釈溶液に
添加し、赤血球のみを溶解し白血球をリンパ球、単球、
顆粒球の３種類に分類していた。しかしながら、この方
法では赤血球の溶解に２０〜３０分必要であり、多数の
検体を処理する方法としては不適当であった。しかもこ
の方法は、各白血球の分布がはっきりしなく、好酸球が
好中球の分布の中に埋もれてしまい、好酸球のみの分布
として分離できなかった。
【０００７】上記の問題を解決すべくポリオキシエチレ
ン系アニオン性界面活性剤およびポリオキシエチレン系
ノニオン性界面活性剤よりなる群から選ばれる少なくと
も１種類の界面活性剤を含有する白血球を３〜５分類す
る白血球分類用試薬が提案されている（国際特許出願公
開番号Ｗ０８８／０９５０４参照）。
ン系アニオン性界面活性剤およびポリオキシエチレン系
ノニオン性界面活性剤よりなる群から選ばれる少なくと
も１種類の界面活性剤を含有する白血球を３〜５分類す
る白血球分類用試薬が提案されている（国際特許出願公
開番号Ｗ０８８／０９５０４参照）。
【０００８】しかしながら、これらのポリオキシエチレ
ン系界面活性剤は、アニオン性およびノニオン性の両方
とも次の共通的一般式を有する。
ン系界面活性剤は、アニオン性およびノニオン性の両方
とも次の共通的一般式を有する。
【０００９】
【化１】
【００１０】すなわち、エチレンオキシドの付加モル数
が８〜３０と比較的大きい。エチレンオキシドの付加モ
ル数がこのように大きいと、細胞溶解力が減少する。ま
た、この試薬を使用し、ＰＦ．及びＤＣ法での測定結果
より２次元分布図を得た場合、リンパ球、単球、顆粒球
の分離が悪く、好酸球測定は同時にできないという問題
点が残っている。
が８〜３０と比較的大きい。エチレンオキシドの付加モ
ル数がこのように大きいと、細胞溶解力が減少する。ま
た、この試薬を使用し、ＰＦ．及びＤＣ法での測定結果
より２次元分布図を得た場合、リンパ球、単球、顆粒球
の分離が悪く、好酸球測定は同時にできないという問題
点が残っている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本願発明は、このよう
な従来の課題に鑑みてなされたものであり、血液希釈溶
液に添加したとき、赤血球を短時間で溶解するにもかか
わらず、白血球は溶血剤によるダメージを受けない元の
ままの状態またはこれに近い状態で一定時間残り、赤血
球を溶解後、フローサイトメータで前方散乱光と側方散
乱光を測定することにより、白血球を直接リンパ球、単
球、好酸球、及び好中球に４分類できる白血球分類用試
薬（溶血剤）を提供することを目的とする。
な従来の課題に鑑みてなされたものであり、血液希釈溶
液に添加したとき、赤血球を短時間で溶解するにもかか
わらず、白血球は溶血剤によるダメージを受けない元の
ままの状態またはこれに近い状態で一定時間残り、赤血
球を溶解後、フローサイトメータで前方散乱光と側方散
乱光を測定することにより、白血球を直接リンパ球、単
球、好酸球、及び好中球に４分類できる白血球分類用試
薬（溶血剤）を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
赤血球を溶解し、白血球に作用して白血球を分類可能と
することを特徴とする白血球分類用試薬であって、ポリ
オキシエチレン（３）アルキル（Ｃ12〜Ｃ13）エーテル
硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（３）アルキル
（Ｃ11〜Ｃ15）エーテル硫酸ナトリウム、または、ポリ
オキシエチレン（３）アルキル（Ｃ11〜Ｃ15）エーテル
トリエタノールアミンを含有する。
赤血球を溶解し、白血球に作用して白血球を分類可能と
することを特徴とする白血球分類用試薬であって、ポリ
オキシエチレン（３）アルキル（Ｃ12〜Ｃ13）エーテル
硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（３）アルキル
（Ｃ11〜Ｃ15）エーテル硫酸ナトリウム、または、ポリ
オキシエチレン（３）アルキル（Ｃ11〜Ｃ15）エーテル
トリエタノールアミンを含有する。
【００１３】また請求項２記載の発明は、血液試料液中
の赤血球を溶解して溶血液を生成するために前記血液試
料液に請求項１に記載の試薬を加える第１のステップ
と、前方光散乱と側方光散乱を測定し、それによって白
血球を複数のグループに分類する分布図を作成するため
に、第１のステップで得た溶血液をフローサイトメータ
に導く第２のステップと、を有する白血球分類方法であ
る。
の赤血球を溶解して溶血液を生成するために前記血液試
料液に請求項１に記載の試薬を加える第１のステップ
と、前方光散乱と側方光散乱を測定し、それによって白
血球を複数のグループに分類する分布図を作成するため
に、第１のステップで得た溶血液をフローサイトメータ
に導く第２のステップと、を有する白血球分類方法であ
る。
【００１４】
【作用】白血球分類用試薬に有用なアニオン界面活性剤
及び両性界面活性剤は、血液希釈溶液に添加したとき、
短時間で赤血球を溶解するが、白血球は損傷を受けない
元のままの状態、またはそれに近い状態のままに残すた
めに必要なものである。
及び両性界面活性剤は、血液希釈溶液に添加したとき、
短時間で赤血球を溶解するが、白血球は損傷を受けない
元のままの状態、またはそれに近い状態のままに残すた
めに必要なものである。
【００１５】上記の要件を満足させるために、一般式 Ｒ−Ｏ−ＳＯ2 Ｘ …（１） （式中、Ｒは炭素数８〜１８のアルキルまたはアルキレ
ン基であり、ＸはＮａ、Ｋ、ＮＨ4 またはＨＮ（ＣＨ2
ＣＨ2 ＯＨ）3 である）で表わされるアルキル硫酸塩素
アニオン界面活性剤においては、Ｒは炭素数が８〜１８
であり、また一般式 Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）ｎ−ＳＯ3 Ｘ …（２） （式中、Ｒは炭素数８〜１８のアルキルまたはアルキレ
ン基であり、ｎは１〜５の整数であり、ＸはＮａ、Ｋ、
ＮＨ4 またはＨＮ（ＣＨ2 ＣＨ2 ＯＨ）3 である）で表
わされるポリオキシエチレン系アニオン界面活性剤にお
いては、Ｒは炭素数が８〜１８であり、またエチレンオ
キシドの付加モル数は１〜５であることが必要である。
細胞の溶解にはアルキル基またはアルキレン基Ｒの水素
が大きく関与しており、一般にＲの鎖長が長くなると溶
解力が強くなり、一方短くなると弱くなる。しかしなが
ら、Ｒの鎖長が長くなると水への溶解度が減少し、溶解
困難乃至溶血液を懸濁させることになる。上記の限定範
囲内のＲの炭素数は、両者のバランスがとれて、上記の
要件を満足させるものである。また、ｎが大きくなると
親水性が増すが、細胞溶解力が減少し、上記の限定範囲
が上記の要件を満たす。なお、Ｘは特に細胞への反応に
関係がない。上記のＲの炭素数に関する記述は、一般式
（３）
ン基であり、ＸはＮａ、Ｋ、ＮＨ4 またはＨＮ（ＣＨ2
ＣＨ2 ＯＨ）3 である）で表わされるアルキル硫酸塩素
アニオン界面活性剤においては、Ｒは炭素数が８〜１８
であり、また一般式 Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）ｎ−ＳＯ3 Ｘ …（２） （式中、Ｒは炭素数８〜１８のアルキルまたはアルキレ
ン基であり、ｎは１〜５の整数であり、ＸはＮａ、Ｋ、
ＮＨ4 またはＨＮ（ＣＨ2 ＣＨ2 ＯＨ）3 である）で表
わされるポリオキシエチレン系アニオン界面活性剤にお
いては、Ｒは炭素数が８〜１８であり、またエチレンオ
キシドの付加モル数は１〜５であることが必要である。
細胞の溶解にはアルキル基またはアルキレン基Ｒの水素
が大きく関与しており、一般にＲの鎖長が長くなると溶
解力が強くなり、一方短くなると弱くなる。しかしなが
ら、Ｒの鎖長が長くなると水への溶解度が減少し、溶解
困難乃至溶血液を懸濁させることになる。上記の限定範
囲内のＲの炭素数は、両者のバランスがとれて、上記の
要件を満足させるものである。また、ｎが大きくなると
親水性が増すが、細胞溶解力が減少し、上記の限定範囲
が上記の要件を満たす。なお、Ｘは特に細胞への反応に
関係がない。上記のＲの炭素数に関する記述は、一般式
（３）
【００１６】
【化２】
【００１７】（式中、Ｒは炭素数８〜１８のアルキルま
たはアルキレン基であり、ＸはＣＨ2ＳＯ3 またはＣＯ
Ｏであり、ＹはＮａ、Ｋ、ＮＨ4 またはＨＮ（ＣＨ2 Ｃ
Ｈ2 ＯＨ）3 である）で表わされるやし油脂肪酸系アニ
オン界面活性剤にも当て嵌まり、Ｒの炭素数８〜１８と
いう範囲が、上記の要件を満たすものである。また、上
記と同様に、一般式（３）におけるＸ、Ｙの両方とも特
に細胞への反応に関係がない。
たはアルキレン基であり、ＸはＣＨ2ＳＯ3 またはＣＯ
Ｏであり、ＹはＮａ、Ｋ、ＮＨ4 またはＨＮ（ＣＨ2 Ｃ
Ｈ2 ＯＨ）3 である）で表わされるやし油脂肪酸系アニ
オン界面活性剤にも当て嵌まり、Ｒの炭素数８〜１８と
いう範囲が、上記の要件を満たすものである。また、上
記と同様に、一般式（３）におけるＸ、Ｙの両方とも特
に細胞への反応に関係がない。
【００１８】両性界面活性剤はｐＨ範囲によりアニオン
界面活性剤またはカチオン界面活性剤として作用するも
のであるが、ｐＨが７以上で溶血剤として使用される場
合にはアニオン界面活性剤として作用する。そして一般
式（４）
界面活性剤またはカチオン界面活性剤として作用するも
のであるが、ｐＨが７以上で溶血剤として使用される場
合にはアニオン界面活性剤として作用する。そして一般
式（４）
【００１９】
【化３】
【００２０】（式中、Ｒは炭素数６〜２１のアルキルま
たはアルキレン基である）で表わされるベタイン型両性
活性剤においては、Ｒの炭素数６〜２１の範囲が、上記
の要件を満たすものである。
たはアルキレン基である）で表わされるベタイン型両性
活性剤においては、Ｒの炭素数６〜２１の範囲が、上記
の要件を満たすものである。
【００２１】本発明においては、白血球分類用試薬であ
る溶血剤の添加前に、血液を均一に分散させるための一
般的希釈液により血液を希釈する。この希釈液は、浸透
圧調整剤、緩衝剤、キレート剤及び防黴剤を適量溶解し
た蒸留水からなり、代表的な組成を以下に示す。 希釈液 塩化ナトリウム ９．０ｇ リン酸２水素カリウム ０．９１ｇ リン酸水素２ナトリウム ９．５５ｇ ＥＤＴＡ２Ｎａ ０．３ｇ １−ヒドロキシピリジン−２−チオンナトリウム ０．２５ｇ 蒸留水 １０００ｍＬ
る溶血剤の添加前に、血液を均一に分散させるための一
般的希釈液により血液を希釈する。この希釈液は、浸透
圧調整剤、緩衝剤、キレート剤及び防黴剤を適量溶解し
た蒸留水からなり、代表的な組成を以下に示す。 希釈液 塩化ナトリウム ９．０ｇ リン酸２水素カリウム ０．９１ｇ リン酸水素２ナトリウム ９．５５ｇ ＥＤＴＡ２Ｎａ ０．３ｇ １−ヒドロキシピリジン−２−チオンナトリウム ０．２５ｇ 蒸留水 １０００ｍＬ
【００２２】浸透圧調整剤は、細胞が安定して存在でき
る浸透圧、すなわち血液試料液の浸透圧を２５０〜４０
０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏに調整するものである。この範
囲より浸透圧が高いと溶血力が強くなり、特に赤血球の
溶血が進み、そして好中球が少し収縮する。一方、この
範囲より浸透圧が低いと溶血力が弱まり、特に赤血球ゴ
ースト（赤血球の溶け残り）が多くなる。
る浸透圧、すなわち血液試料液の浸透圧を２５０〜４０
０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏに調整するものである。この範
囲より浸透圧が高いと溶血力が強くなり、特に赤血球の
溶血が進み、そして好中球が少し収縮する。一方、この
範囲より浸透圧が低いと溶血力が弱まり、特に赤血球ゴ
ースト（赤血球の溶け残り）が多くなる。
【００２３】緩衝剤は、血液細胞が安定して存在できる
ために、血液試料液のｐＨを約６．８〜７．６に維持す
る緩衝剤であることが望ましい。しかし、血液試料液に
溶解剤を混合したときに、ｐＨは使用好適範囲でなけれ
ばならい。したがって、目的とする結果をそこなわれな
ければその範囲を越えてもよい。そして本発明に係るア
ニオン界面活性剤ではその種類により使用好適範囲が相
違するものの、一般的にｐＨ３〜１１の範囲であり、ま
た両性界面活性剤はｐＨ７〜１１の範囲で溶血剤として
作用するものである。この範囲よりｐＨが高いと溶血力
が強くなり、白血球も赤血球と同時に溶解してしまう。
一方、この範囲よりｐＨが低いと、溶血力が弱くなり、
白血球の各成分の分布の分離が悪くなる。
ために、血液試料液のｐＨを約６．８〜７．６に維持す
る緩衝剤であることが望ましい。しかし、血液試料液に
溶解剤を混合したときに、ｐＨは使用好適範囲でなけれ
ばならい。したがって、目的とする結果をそこなわれな
ければその範囲を越えてもよい。そして本発明に係るア
ニオン界面活性剤ではその種類により使用好適範囲が相
違するものの、一般的にｐＨ３〜１１の範囲であり、ま
た両性界面活性剤はｐＨ７〜１１の範囲で溶血剤として
作用するものである。この範囲よりｐＨが高いと溶血力
が強くなり、白血球も赤血球と同時に溶解してしまう。
一方、この範囲よりｐＨが低いと、溶血力が弱くなり、
白血球の各成分の分布の分離が悪くなる。
【００２４】キレート剤は、希釈液の長期間の保存、使
用時の金属イオンによる沈殿の発生を防止するために金
属イオンとキレートを形成するために使用するものであ
る。また、防黴剤は、希釈液の長期保存による黴、細菌
の発生を抑制するために使用するものである。
用時の金属イオンによる沈殿の発生を防止するために金
属イオンとキレートを形成するために使用するものであ
る。また、防黴剤は、希釈液の長期保存による黴、細菌
の発生を抑制するために使用するものである。
【００２５】なお、上記の希釈液で希釈された血液希釈
溶液に添加される前記界面活性剤を主成分とする溶血剤
の量は、界面活性剤の種類により変化するものの、一般
に、血液試料液中の界面活性剤濃度が低いと、全ての赤
血球を溶解するのに不十分となり赤血球ゴーストが多く
なる。一方、界面活性剤濃度が高いと白血球も赤血球と
共に溶解するようになる。そしてまた、溶血剤の添加量
によっても溶解時間が変化する。添加量が多いと溶解時
間が短くてすむものの、しかし一方、白血球細胞が安定
している時間が短くなる。したがって、界面活性剤の添
加量範囲を適当に選定する必要がある。
溶液に添加される前記界面活性剤を主成分とする溶血剤
の量は、界面活性剤の種類により変化するものの、一般
に、血液試料液中の界面活性剤濃度が低いと、全ての赤
血球を溶解するのに不十分となり赤血球ゴーストが多く
なる。一方、界面活性剤濃度が高いと白血球も赤血球と
共に溶解するようになる。そしてまた、溶血剤の添加量
によっても溶解時間が変化する。添加量が多いと溶解時
間が短くてすむものの、しかし一方、白血球細胞が安定
している時間が短くなる。したがって、界面活性剤の添
加量範囲を適当に選定する必要がある。
【００２６】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて説明する。 実施例 １ 溶血剤としてポリオキシエチレン系アニオン界面活性剤
の１種であるポリオキシエチレン（３）アルキル（Ｃ12
〜Ｃ13混合物）エーテル硫酸ナトリウム（化学式Ｃ12〜
Ｃ13−Ｏ−（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）3 −ＳＯ3 Ｎａ）を使用
した例を示す。このアニオン界面活性剤１．７５ｇを蒸
留水１０００ｍｌに溶解して溶血剤を得る（なお、必要
に応じて浸透圧の調整のために塩化ナトリウムを蒸留水
に適量添加してもよい）。血液２５μｌを前記に例示し
た組成の希釈液１ｍｌで希釈し、上記の溶血剤１２５μ
ｌを添加する。１０秒後にフローサイトメータで前方及
び側方散乱光強度を測定し、図１に示す二次元分布図
（スキャットグラム）を得た。図１に示されるように、
白血球はリンパ球（１）、単球（２）、好中球（３）及
び好酸球（４）に明瞭に４分類された。（０）は赤血球
ゴーストである。また、上記の溶血剤（濃度０．１７５
％）は、上記の血液希釈溶液への添加量範囲１００〜１
０００μｌで図１に示したものと同様の二次元分布図が
得られた。また、先に溶血剤を希釈液に添加したり、希
釈液に適量の上記界面活性剤を希釈せずに直接添加した
液を用いても、本発明の目的を達成することができる。
更に、本実施例の界面活性剤はｐＨ範囲３〜１０でも図
１に示したものと同様の結果が得られた。なお、浸透圧
範囲に関しても、２５０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏ
では図１に示したものと同様の結果が得られた。
の１種であるポリオキシエチレン（３）アルキル（Ｃ12
〜Ｃ13混合物）エーテル硫酸ナトリウム（化学式Ｃ12〜
Ｃ13−Ｏ−（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）3 −ＳＯ3 Ｎａ）を使用
した例を示す。このアニオン界面活性剤１．７５ｇを蒸
留水１０００ｍｌに溶解して溶血剤を得る（なお、必要
に応じて浸透圧の調整のために塩化ナトリウムを蒸留水
に適量添加してもよい）。血液２５μｌを前記に例示し
た組成の希釈液１ｍｌで希釈し、上記の溶血剤１２５μ
ｌを添加する。１０秒後にフローサイトメータで前方及
び側方散乱光強度を測定し、図１に示す二次元分布図
（スキャットグラム）を得た。図１に示されるように、
白血球はリンパ球（１）、単球（２）、好中球（３）及
び好酸球（４）に明瞭に４分類された。（０）は赤血球
ゴーストである。また、上記の溶血剤（濃度０．１７５
％）は、上記の血液希釈溶液への添加量範囲１００〜１
０００μｌで図１に示したものと同様の二次元分布図が
得られた。また、先に溶血剤を希釈液に添加したり、希
釈液に適量の上記界面活性剤を希釈せずに直接添加した
液を用いても、本発明の目的を達成することができる。
更に、本実施例の界面活性剤はｐＨ範囲３〜１０でも図
１に示したものと同様の結果が得られた。なお、浸透圧
範囲に関しても、２５０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏ
では図１に示したものと同様の結果が得られた。
【００２７】実施例 ２ 溶血剤成分としてポリオキシエチレン系アニオン界面活
性剤の１種であるポリオキシエチレン（３）アルキル
（Ｃ11〜Ｃ15混合物）エーテル硫酸ナトリウムを使用
し、このアニオン界面活性剤２．５ｇを蒸留水１０００
ｍｌに溶解したものを溶血剤に使用した以外は実施例１
と同じ手順により白血球を分類した結果を図２に示す。
実施例１と同様に白血球は明瞭に４分類された。また、
添加量範囲５０〜３００μｌ（濃度０．２５％の溶血剤
の場合）、ｐＨ範囲６〜１０、及び浸透圧範囲２５０〜
４００ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏでも前記実施例１の場合と
同様に図２に示したものと同様の結果を得た。
性剤の１種であるポリオキシエチレン（３）アルキル
（Ｃ11〜Ｃ15混合物）エーテル硫酸ナトリウムを使用
し、このアニオン界面活性剤２．５ｇを蒸留水１０００
ｍｌに溶解したものを溶血剤に使用した以外は実施例１
と同じ手順により白血球を分類した結果を図２に示す。
実施例１と同様に白血球は明瞭に４分類された。また、
添加量範囲５０〜３００μｌ（濃度０．２５％の溶血剤
の場合）、ｐＨ範囲６〜１０、及び浸透圧範囲２５０〜
４００ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏでも前記実施例１の場合と
同様に図２に示したものと同様の結果を得た。
【００２８】実施例 ３ 溶血剤の有効成分としてエチレンオキシドの付加モル数
が０の場合のポリオキシエチレン系アニオン界面活性剤
であるラウリル硫酸ナトリウム（化学式Ｃ12Ｈ 25ＯＳＯ
3 Ｎａ）を使用し、このアニオン界面活性剤５．０ｇを
蒸留水１０００ｍｌに溶解したものを溶血剤に使用した
以外は実施例１と同じ手順により白血球を分類した結果
を図３に示す。実施例１と同様に白血球は明瞭に４分類
された。また、濃度０．５％の溶血剤の場合、添加量範
囲５０〜２００μｌ、ｐＨ範囲５〜８、浸透圧範囲２５
０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏでも前記実施例１の場
合と同様に、図３に示したものと同様の結果を得た。
が０の場合のポリオキシエチレン系アニオン界面活性剤
であるラウリル硫酸ナトリウム（化学式Ｃ12Ｈ 25ＯＳＯ
3 Ｎａ）を使用し、このアニオン界面活性剤５．０ｇを
蒸留水１０００ｍｌに溶解したものを溶血剤に使用した
以外は実施例１と同じ手順により白血球を分類した結果
を図３に示す。実施例１と同様に白血球は明瞭に４分類
された。また、濃度０．５％の溶血剤の場合、添加量範
囲５０〜２００μｌ、ｐＨ範囲５〜８、浸透圧範囲２５
０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏでも前記実施例１の場
合と同様に、図３に示したものと同様の結果を得た。
【００２９】実施例 ４ 前記一般式（２）で表わされるポリオキシエチレン系ア
ニオン界面活性剤について、Ｒの炭素数が８及び１８
で、かつｎがそれぞれ３であるものについて上記実施例
１〜３と同様の白血球分類試験を行ったが、両者とも図
１〜図３と類似したリンパ球、単球、好中球及び好酸球
に明瞭に白血球が４分類されたスキャッタグラムを得
た。
ニオン界面活性剤について、Ｒの炭素数が８及び１８
で、かつｎがそれぞれ３であるものについて上記実施例
１〜３と同様の白血球分類試験を行ったが、両者とも図
１〜図３と類似したリンパ球、単球、好中球及び好酸球
に明瞭に白血球が４分類されたスキャッタグラムを得
た。
【００３０】比較例 １ 実施例３と同様に溶血剤の有効成分としてラウリル硫酸
ナトリウムを使用して白血球の分類に対するｐＨの影響
についてｐＨ１０及び３における結果を、それぞれ図４
及び図５に示す。ｐＨ１０では、溶血力が強くなり過ぎ
て白血球と赤血球が同時に溶解してしまうため、殆んど
測定不能な二次元分布図しか得られないことが図４から
分かる。一方、ｐＨ３では溶血力が弱くなり過ぎて、図
５に示すように白血球の分離が悪化して不満足な結果し
か得られなかった。
ナトリウムを使用して白血球の分類に対するｐＨの影響
についてｐＨ１０及び３における結果を、それぞれ図４
及び図５に示す。ｐＨ１０では、溶血力が強くなり過ぎ
て白血球と赤血球が同時に溶解してしまうため、殆んど
測定不能な二次元分布図しか得られないことが図４から
分かる。一方、ｐＨ３では溶血力が弱くなり過ぎて、図
５に示すように白血球の分離が悪化して不満足な結果し
か得られなかった。
【００３１】比較例 ２ 実施例２と同様に溶血剤の有効成分としてポリオキシエ
チレン（３）アルキル（Ｃ11〜Ｃ15混合物）エーテル硫
酸ナトリウムを使用して白血球の分類に対する浸透圧の
影響について４５０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏ及び２２０ｍ
Ｏｓｍ／ｋｇＨ 2 Ｏにおいて試験を行った。浸透圧４５
０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏでは溶血力が強くなり過ぎ、特
に赤血球の溶血が進むが、白血球の溶血も進み、特に好
中球が少し収縮して、図６に示すように図４に示した高
ｐＨの場合と同様の殆んど測定不能な二次元分布図しか
得られなかった。一方２２０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏでは
溶血力が弱くなり過ぎ、特に赤血球ゴーストが多くな
り、図７に示すような不満足な結果しか得られなかっ
た。また、アルキル基Ｒ、エチレンオキシドのモル数ｎ
が請求範囲外の場合も同様であった。
チレン（３）アルキル（Ｃ11〜Ｃ15混合物）エーテル硫
酸ナトリウムを使用して白血球の分類に対する浸透圧の
影響について４５０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏ及び２２０ｍ
Ｏｓｍ／ｋｇＨ 2 Ｏにおいて試験を行った。浸透圧４５
０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏでは溶血力が強くなり過ぎ、特
に赤血球の溶血が進むが、白血球の溶血も進み、特に好
中球が少し収縮して、図６に示すように図４に示した高
ｐＨの場合と同様の殆んど測定不能な二次元分布図しか
得られなかった。一方２２０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏでは
溶血力が弱くなり過ぎ、特に赤血球ゴーストが多くな
り、図７に示すような不満足な結果しか得られなかっ
た。また、アルキル基Ｒ、エチレンオキシドのモル数ｎ
が請求範囲外の場合も同様であった。
【００３２】実施例 ５ 溶血剤としてやし油脂肪酸系アニオン界面活性剤の１種
であるやし油脂肪酸メチルタウリンナトリウム（化学式
Ｒ−ＣＯＮ（ＣＨ3 ）ＣＨ2 ＣＨ2 ＳＯ3 Ｎａ）を使用
した例を示す。このアニオン界面活性剤５．８ｇを蒸留
水（実施例１と同様に浸透圧の調整のために塩化ナトリ
ウムを適量添加してもよい）１０００ｍｌに溶解して溶
血剤を得た。実施例１と同じ手順を繰返して図８に示す
二次元分布図を得た。図８から明らかなように、白血球
はリンパ球（１）、単球（２）、好中球（３）及び好酸
球（４）に明瞭に４分類された。なお、（０）は赤血球
ゴーストを示す。また、実施例１の場合と同様に、上記
の溶血剤は、濃度０．５８％の場合、添加量範囲５０〜
３００μｌ、ｐＨ範囲６〜９、浸透圧範囲２５０〜４０
０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏでも図９に示したものと同様の
結果を得た。
であるやし油脂肪酸メチルタウリンナトリウム（化学式
Ｒ−ＣＯＮ（ＣＨ3 ）ＣＨ2 ＣＨ2 ＳＯ3 Ｎａ）を使用
した例を示す。このアニオン界面活性剤５．８ｇを蒸留
水（実施例１と同様に浸透圧の調整のために塩化ナトリ
ウムを適量添加してもよい）１０００ｍｌに溶解して溶
血剤を得た。実施例１と同じ手順を繰返して図８に示す
二次元分布図を得た。図８から明らかなように、白血球
はリンパ球（１）、単球（２）、好中球（３）及び好酸
球（４）に明瞭に４分類された。なお、（０）は赤血球
ゴーストを示す。また、実施例１の場合と同様に、上記
の溶血剤は、濃度０．５８％の場合、添加量範囲５０〜
３００μｌ、ｐＨ範囲６〜９、浸透圧範囲２５０〜４０
０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏでも図９に示したものと同様の
結果を得た。
【００３３】実施例 ６ 溶血剤としてベタイン型両性界面活性剤の１種である、
次の構造式
次の構造式
【００３４】
【化４】
【００３５】で表わされる２−アルキル（Ｃ8 Ｈ17〜Ｃ
18Ｈ37混合物）−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキ
シエチルイミダゾリニウムベタインを使用した例を示
す。この両性界面活性剤３．６ｇを上記実施例５と同様
に蒸留水１０００ｍｌに溶解して溶血剤を得た。実施例
５と同じ手順を繰返して図９に示す二次元分布図を得
た。図９から明らかなように、白血球は実施例１〜５の
場合と同様に明瞭に４分類された。また、実施例５と同
様に、上記の溶血剤は、濃度０．３６％の場合、添加量
範囲７５〜２００μｌ、ｐＨ範囲７〜１１、浸透圧範囲
２５０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏで図９に示したも
のと同様の結果を得た。
18Ｈ37混合物）−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキ
シエチルイミダゾリニウムベタインを使用した例を示
す。この両性界面活性剤３．６ｇを上記実施例５と同様
に蒸留水１０００ｍｌに溶解して溶血剤を得た。実施例
５と同じ手順を繰返して図９に示す二次元分布図を得
た。図９から明らかなように、白血球は実施例１〜５の
場合と同様に明瞭に４分類された。また、実施例５と同
様に、上記の溶血剤は、濃度０．３６％の場合、添加量
範囲７５〜２００μｌ、ｐＨ範囲７〜１１、浸透圧範囲
２５０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏで図９に示したも
のと同様の結果を得た。
【００３６】実施例 ７ 前記の一般式（３）で表わされるベタイン型両性界面活
性剤に関して、Ｒのアルキル基の炭素数６及び２１につ
いて上記実施例６と同様の白血球分類試験を行ったが、
両者とも図９と類似したリンパ球、単球、好中球及び好
酸球に明瞭に白血球が４分類された二次元分布図を得
た。
性剤に関して、Ｒのアルキル基の炭素数６及び２１につ
いて上記実施例６と同様の白血球分類試験を行ったが、
両者とも図９と類似したリンパ球、単球、好中球及び好
酸球に明瞭に白血球が４分類された二次元分布図を得
た。
【００３７】
【発明の効果】本発明によれば、血液希釈溶液に添加し
たとき、赤血球を短時間で溶解し、かつ白血球を損傷さ
れない元のままの状態またはこれに近い状態に一定時間
維持できるので、白血球を簡単な手順と構成によって、
直接４分類でき、臨床検査上大きな効果を奏することが
できる。
たとき、赤血球を短時間で溶解し、かつ白血球を損傷さ
れない元のままの状態またはこれに近い状態に一定時間
維持できるので、白血球を簡単な手順と構成によって、
直接４分類でき、臨床検査上大きな効果を奏することが
できる。
【図１】溶血剤としてポリオキシエチレン（３）アルキ
ル（Ｃ12〜Ｃ13）エーテル硫酸ナトリウムを用いた場合
の二次元分布図である。
ル（Ｃ12〜Ｃ13）エーテル硫酸ナトリウムを用いた場合
の二次元分布図である。
【図２】溶血剤としてポリオキシエチレン（３）アルキ
ル（Ｃ11〜Ｃ15）エーテル硫酸ナトリウムを用いた場合
の二次元分布図である。
ル（Ｃ11〜Ｃ15）エーテル硫酸ナトリウムを用いた場合
の二次元分布図である。
【図３】溶血剤としてラウリル硫酸ナトリウムを用いた
場合の二次元分布図である。
場合の二次元分布図である。
【図４】溶血剤としてラウリル硫酸ナトリウムを用い、
ｐＨ１０で白血球の分類を行った場合の二次元分布図で
ある。
ｐＨ１０で白血球の分類を行った場合の二次元分布図で
ある。
【図５】溶血剤としてラウリル硫酸ナトリウムを用い、
ｐＨ３で白血球の分類を行った場合の二次元分布図であ
る。
ｐＨ３で白血球の分類を行った場合の二次元分布図であ
る。
【図６】溶血剤としてポリオキシエチレン（３）アルキ
ル（Ｃ11〜Ｃ15）エーテル硫酸ナトリウムを用い、浸透
圧４５０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏで白血球の分類を行った
場合の二次元分布図である。
ル（Ｃ11〜Ｃ15）エーテル硫酸ナトリウムを用い、浸透
圧４５０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏで白血球の分類を行った
場合の二次元分布図である。
【図７】溶血剤としてポリオキシエチレン（３）アルキ
ル（Ｃ11〜Ｃ15）エーテル硫酸ナトリウムを用い、浸透
圧２２０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏで白血球の分類を行った
場合の二次元分布図である。
ル（Ｃ11〜Ｃ15）エーテル硫酸ナトリウムを用い、浸透
圧２２０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ2 Ｏで白血球の分類を行った
場合の二次元分布図である。
【図８】溶血剤としてやし油脂肪酸メチルタウリンナト
リウムを用いた場合の二次元分布図である。
リウムを用いた場合の二次元分布図である。
【図９】溶血剤として２−アルキル（Ｃ8 〜Ｃ18）−Ｎ
−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリ
ニウムベタインを用いた場合の二次元分布図である。
−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリ
ニウムベタインを用いた場合の二次元分布図である。
【図１０】本発明の白血球分類用試薬を使用するフロー
サイトメータの光学系の説明図である。
サイトメータの光学系の説明図である。
０ 赤血球ゴースト １ リンパ球 ２ 単球 ３ 好中球 ４ 好酸球
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 池田 真美 東京都新宿区西落合１丁目31番４号 日本 光電富岡株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA03 AA04 BB52 CA11 CA12 CA15 CA16 CA17 CA20 CA25 FA11 FA14 GB00 JA01
Claims (2)
- 【請求項１】 赤血球を溶解し、白血球に作用して白血
球を分類可能とすることを特徴とする白血球分類用試薬
であって、 ポリオキシエチレン（３）アルキル（Ｃ12〜Ｃ13）エー
テル硫酸ナトリウム、 ポリオキシエチレン（３）アルキル（Ｃ11〜Ｃ15）エー
テル硫酸ナトリウム、または、 ポリオキシエチレン（３）アルキル（Ｃ11〜Ｃ15）エー
テルトリエタノールアミンを含有する試薬。 - 【請求項２】 血液試料液中の赤血球を溶解して溶血液
を生成するために前記血液試料液に請求項１に記載の試
薬を加える第１のステップと、 前方光散乱と側方光散乱を測定し、それによって白血球
を複数のグループに分類する分布図を作成するために、
第１のステップで得た溶血液をフローサイトメータに導
く第２のステップと、を有する白血球分類方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002083088A JP3505621B2 (ja) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | 白血球分類用試薬および白血球分類方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002083088A JP3505621B2 (ja) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | 白血球分類用試薬および白血球分類方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26657394A Division JP3324050B2 (ja) | 1994-10-31 | 1994-10-31 | 白血球分類用試薬および白血球分類方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002303622A true JP2002303622A (ja) | 2002-10-18 |
| JP3505621B2 JP3505621B2 (ja) | 2004-03-08 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002083088A Expired - Fee Related JP3505621B2 (ja) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | 白血球分類用試薬および白血球分類方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP3505621B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013205205A (ja) * | 2012-03-28 | 2013-10-07 | Nippon Koden Corp | 白血球分類用試薬およびこれを用いた白血球分類方法 |
| WO2013150910A1 (ja) * | 2012-04-04 | 2013-10-10 | シャープ株式会社 | 計数チップ、計数方法、および計数装置 |
| CN109735484A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-05-10 | 重庆中元汇吉生物技术有限公司 | 一种细胞保护剂、一种试剂及试剂的用途 |
-
2002
- 2002-03-25 JP JP2002083088A patent/JP3505621B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
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| WO2013150910A1 (ja) * | 2012-04-04 | 2013-10-10 | シャープ株式会社 | 計数チップ、計数方法、および計数装置 |
| CN109735484A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-05-10 | 重庆中元汇吉生物技术有限公司 | 一种细胞保护剂、一种试剂及试剂的用途 |
| CN109735484B (zh) * | 2018-12-12 | 2022-07-12 | 中元汇吉生物技术股份有限公司 | 一种细胞保护剂、一种试剂及试剂的用途 |
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